Statine werden zur Senkung eines hohen Cholesterinspiegels eingesetzt. Aufgrund sich zusätzlich abzeichnender antiinflammatorisch/immunmodulatorischer Effekte werden sie als Therapeutikum bei der Multiplen Sklerose (MS) diskutiert. Bei einer MS-Therapie ist allerdings neben der Immunmodulation auch eine Remyelinisierung zu bedenken, der Statine nicht entgegenstehen sollten. Statine hemmen die HMG-CoA Reduktase, was zur Reduktion von Mevalonat sowie den Folgeprodukten FPP und GGPP führt. Diese Intermediate sind für die Prenylierung und Funktion kleiner G-Proteine, die am Remyelinisierungsprozess beteiligt sind, wichtig. In vitro führte die Behandlung von Schweine-Oligodendrozyten (OL) mit Simvastatin (Sst) zu einer Fortsatzretraktion. Nach 72 h war eine beginnende Apoptose über Aktivierung von Caspase-3 und SAPK/JNK nachweisbar. Eine Störung der Membranassoziation durch fehlendes FPP und GGPP wurde für p21Ras, RhoA und RhoG gezeigt. Über Reduktion des Anteils an p21Ras-GTP kam es unter Sst zur Hemmung des p21Ras-MAPK-Signalweges, was sich in einer verminderten Aktivierung von ERK1/2 bemerkbar machte. Neben der Fortsatzretraktion ging dies mit einer verringerten Synthese von Myelinproteinen einher. Im Gegensatz zu p21Ras und RhoG kam es unter Sst zu einer unerwarteten Zunahme von RhoA-GTP, Rac1-GTP sowie Cdc42-GTP. Über RhoA fand in OL unter Sst eine Aktivierung von ROCK statt. Die in vitro Befunde implizierten einen negativen Sst-Effekt auf die Myelinsynthese durch OL. Eine damit verbundene Relevanz auf die Remyelinisierung in vivo wurde an Mäusen analysiert, die eine durch Cuprizon hervorgerufene Demyelinisierung aufwiesen. Eine nach Absetzen von Cuprizon stattfindende Remyelinisierung wurde durch Behandlung mit Sst deutlich verzögert. Biochemisch fand unter Sst eine Reduktion der exprimierten Myelinproteine MBP, PLP und CNP statt. In Anbetracht der in vitro und in vivo aufgezeigten Daten erscheint ein Langzeit-Einsatz von Sst bei der MS nicht empfehlenswert.

In einer doppelt verblindeten Studie untersuchten wir über mehrere Trainingssitzungen hinweg den Einfluss von transkranieller Gleichstromstimulation auf das motorische Lernen bei Personen mit progredienter Multipler Sklerose (PMS). Motorisches Lernen wurde dabei anhand eines Paradigmas gemessen, welches die Ausführung von aus fünf Elementen bestehenden Fingerbewegungssequenzen umfasst. Diese sollten dabei mit den Fingern der rechten Hand auf einer Tastatur so schnell und fehlerfrei wie möglich eingegeben werden. Die Teilnehmenden übten die Ausführung von zwei unterschiedlichen Sequenzen in Trainingseinheiten an den Tagen eins, drei und fünf. An Tag acht stellten sie ihr erreichtes Können in einem finalen Test unter Beweis. Die 3 Trainingseinheiten bestanden dabei aus je 14 Blöcken zu jeweils 60 Tastenanschlägen. Da eine Sequenz aus jeweils 5 Elementen bestand konnten somit im 25 Optimalfall pro Block 12 korrekt ausgeführte Sequenzen eingegeben werden. Der finale Test bestand aus nur vier Blöcken der Trainingsaufgabe. Jeweils im Anschluss an jede der drei Trainingseinheiten erfolgte die Applikation der transkraniellen Gleichstromstimulation (tDCS) oder einer Scheinstimulation (englisch: sham tDCS). Bei der transkraniellen Gleichstromstimulation handelt es sich um eine Form der nicht-invasiven Hirnstimulation. Sie zeichnet sich neben einer guten Verträglichkeit und vergleichsweise einfachen Anwendbarkeit dadurch aus, dass sie die Erregbarkeit des Kortex verändern und über diesen Weg Lernprozesse und die Induktion von Plastizität des Kortex beeinflussen kann. Die Stimulation in der vorliegenden Studie erfolgte für 15 min mit der Anode über dem linken (trainierten) primären Motorcortex (M1) und der Kathode supraorbital auf der gegenüberliegenden Seite. Alle Teilnehmenden absolvierten einen Durchlauf, bestehend aus den drei Trainingseinheiten und dem finalen Test, mit aktiver-tDCS sowie einen weiteren Durchlauf mit der Scheinstimulation. Zwischen den beiden Abschnitten lagen jeweils mindestens 4 Wochen, wobei die Verteilung der Startmodalität doppelt verblindet und balanciert auf die Teilnehmenden erfolgte. Die beiden unterschiedlichen Sequenzen wurden balanciert auf die beiden Durchläufe verteilt. Die Studienpopulation bestand aus 16 Personen im Alter zwischen 33 und 64 Jahren (Mittelwert ± Standardabweichug 51,19 ± 10,56 Jahre). Sechs der teilnehmenden Personen waren weiblich, die Übrigen männlich. Merkliche Unterschiede innerhalb der Studienpopulation bestanden in der bisherigen Krankheitsdauer der PMS, die zwischen einem und 32 Jahren lag (13,13 ± 9,57 Jahre). Alle Teilnehmenden erhielten eine neurologische Untersuchung und wurden mit Hilfe der Expanded Disability Status Scale (EDSS) hinsichtlich ihrer Krankheitsschwere eingeordnet. Die Untersuchungen führten zu Werten zwischen 1,5 und 6,0 (4,38 ± 1,37). Zur Beobachtung der Gehgeschwindigkeit, der Feinmotorik und der kognitiven Auffassungsgabe über die beiden Versuchsabschnitte, wurden an den Tagen eins und acht ein Multiple Sclerosis Functional Composite (MSFC) bestehend aus dem Timed 25 Foot Walk (T25W) und dem Nine Hole Peg Test (9HPT) sowie ein gesprochener Symbol Digit Modalities Test (SDMT) durchgeführt. Die Quantifizierung der motorischen Leistungen erfolgte durch Betrachtung der Geschwindigkeit, konkret der durchschnittlichen Zeit pro Block, die zur korrekten Eingabe einer Sequenz notwendig war, sowie der Genauigkeit, gemessen an der Anzahl an richtig eingegebenen Sequenzen pro Block. Alle 16 Teilnehmenden absolvierten alle Trainingseinheiten und beide finalen Tests. Die Ergebnisse der Fragebögen und Funktionstests der Teilnehmenden zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen dem aktive-tDCS- und Scheinstimulationsabschnitt (alle p > 0.26). Die Verblindung der Teilnehmenden hinsichtlich der aktiven bzw. Scheinstimulation erfolgte zufriedenstellend, da bei einer Befragung am Ende der Studie nur die Hälfte aller Teilnehmenden 26 korrekt zuordnen konnten, welche der Interventionen sie bei der ersten und zweiten Trainingsreihe erhalten hatten. Die Datenanalyse erfolgte mittels Messwiederholungs-Varianzanalysen (ANOVA) unter Berücksichtigung der Innersubjekt-Faktoren Intervention (aktive-tDCS, Scheinstimulation), Block (B1, B2..., B14) und Trainingssitzung (T1, T2, T3). Hinsichtlich des primären Endpunkts (Sequenz-Performanz an Tag 8, finaler Test) ergab sich für den Faktor Intervention (akive tDCS vs. sham tDCS) kein signifikanter Unterschied bei der Geschwindigkeit (F(1,15) = 0.974, p = 0.339) oder der Genauigkeit (F(1,15 = 0.622, p = 0.443). Das bedeutet, dass unabhängig von der tDCS Intervention bei beiden Durchgängen das erreichte Leistungsniveau nicht signifikant unterschiedlich war. Über die drei vorherigen Trainingssitzungen hinweg ergaben sich bezüglich der Geschwindigkeit signifikante Haupteffekte für die Faktoren Trainingssitzung (F(1.3,19,4) = 32.054, p < 0.001) und Block (F(2.5,37.6) = 5.039, p < 0.007). Auch für die Genauigkeit der Sequenzausführung zeigte sich ein signifikanter Effekt für den Faktor Training (F(1.3,19.7)=10.385, p=0.002). Diese waren getrieben durch eine Zunahme der Geschwindigkeit sowohl während der einzelnen Trainings als auch von einer Trainingsitzung zur nächsten Sitzung. Während die Genauigkeit der Sequenzausführung sich nicht innerhalb einer Trainingssitzung sondern nur über die 3 Trainingssitzungen hinweg bzw. offline zwischen diesen besserte. Die Messwiederholungs ANOVA zeigte über die drei Trainingssitzungen hinweg bezogen auf die Geschwindigkeit, jedoch keinen signifikanten Effekt für den Faktor Intervention (F(1,15) = 0.670, p = 0.426) und auch keine signifikante Interaktion mit den beiden anderen Faktoren (beide p ≥ 0.563). Ebenso bezogen auf die Genauigkeit der Sequenzausführung zeigte sich kein Effekt des Faktors Intervention (F(1,15) = 1.000, p = 0.333) und ebenfalls keine signifikante Interaktion mit den anderen Faktoren (alle p ≥ 0.433). Dies zeigt, dass die teilnehmenden Personen mit PMS in der Lage waren, die Ausführung der Aufgabe signifikant im Verlauf der wiederholten Trainingssitzungen zu verbessern. Es ergaben sich jedoch auch hier keine Hinweise dafür, dass die offline tDCS einen Einfluss auf die Leistungsparameter der motorischen Aufgabe, genauer die Geschwindigkeit oder die Genauigkeit, hatte. Die Berechnung der Konsolidierung erfolgte als Differenz zwischen der durchschnittlichen Geschwindigkeit oder Genauigkeit der Sequenzausführung in den ersten zwei Blöcken eines Trainings und der durchschnittlichen Geschwindigkeit oder Genauigkeit der Sequenzausfühunrg in den letzten zwei Blöcken am Ende des vorangegangenen Trainings. Die Differenz wurde dabei so berechnet, dass positive Werte eine Verbesserung anzeigten, während negative Konsolidierungswerte eine Verschlechterung der Sequenzausführung im Vergleich mit der 27 Performanz am Ende der vorangegangenen Sitzung bedeuteten. Eine Messwiederholungs ANOVA mit den Faktoren Intervention und Training für diese Konsolidierungswerte ergab weder bezogen auf die Geschwindigkeit noch auf die Genauigkeit signifikante Werte (alle p ≥ 0.275). Dies zeigt, dass die tDCS nicht in der Lage war die offline Konsolidierung signifikant zu beeinflussen. Des weiteren spricht das Fehlen eines signifikanten Haupteffektes des Faktors Trainingssitzung dafür, dass der Erfolg bei der Konsolidierung nach jeder einzelnen Session vergleichbar war und sich nicht über die Zeit änderte. In Zusammenschau zeigen diese Ergebnisse, dass Personen mit PMS trotz ihrer krankheitsbedingten funktionellen Einschränkungen in der Lage sind, die Ausführung einer motorischen Sequenzlernaufgabe durch wiederholtes Üben signifikant zu verbessern. Hinsichtlich der Frage, ob motorisches Lernen durch offline-tDCS bei Personen mit PMS relevant unterstützt werden kann, zeigen die Ergebnisse, dass die tDCS keinen relevanten zusätzlichen Nutzen, weder auf die Fähigkeit, neue motorische Fertigkeiten online zu verbessern noch diese offline zu konsolidieren, hatte. Ziel zukünftiger Forschung sollte es sein, den zugrunde liegenden Mechanismus des fehlenden Ansprechens bei PMS auf tDCS genauer zu untersuchen, um so die Möglichkeit für die nächsten Schritte in Richtung neuer therapeutischer Optionen zu schaffen.

Multiple Sklerose (MS) ist eine chronisch-entzündliche Erkrankung des Zentralen Nervensystems. Die Bedeutung der B-Zellen bei der MS-Pathogenese ist in den letzten Jahren zunehmend in den Vordergrund gerückt. Das Wirkprinzip des humanisierten monoklonalen Antikörpers Ocrelizumab beruht auf der selektiven Depletion CD20-exprimierender B-Zellen. Ocrelizumab ist seit 2018 für die schubförmig remittierende und primär progrediente Verlaufsform der MS zugelassen. Bisher ist wenig über die Medikamenteneffekte unmittelbar nach den Infusionen bekannt. Das Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der akuten Veränderungen von immunologischen und Routine-Laborparametern und deren klinische Relevanz in Gegenüberstellung zu den langfristigen Veränderungen. Wir überwachten die infusionsassoziierten Reaktionen und die Vitalparameter Temperatur, Blutdruck und Herzfrequenz von 68 MS-Patientinnen und Patienten (Pat.) während der Ocrelizumab-Infusionen im ersten Behandlungsjahr. Es wurden jeweils Routine-Laborparameter wie Blutbild, Leberenzyme, Nierenfunktion, Akute-Phase-Proteine und die Komplementaktivierung erhoben und eine umfangreiche durchflusszytometrische Analyse der peripheren Immunzellen vor und nach der Prämedikation mit Methylprednisolon und nach der Ocrelizumab-Gabe durchgeführt. Darüber hinaus wurden zu jedem Untersuchungszeitpunkt 13 Serumzytokine mittels eines Bead-basierten Assays quantifiziert. In unserer Studie traten vorwiegend milde infusionsassoziierte Reaktionen am häufigsten im Rahmen der ersten Infusion (35 %) auf. Zwei Pat. erlitten eine akute Überempfindlichkeitsreaktion. Die Vitalparameter veränderten sich während der Infusionen nicht signifikant. Die pro-inflammatorischen Serumzytokine IL-6 und TNF-α stiegen nach der ersten Infusion deutlich an. Auch IL-1ß, IL-4, IL-12, IL-17A und IFN-ɣ wiesen bei den ersten Infusionen höhere Konzentrationen auf als im Verlauf. Eine direkte Korrelation zwischen den Zytokinanstiegen und der klinischen Symptomatik ließ sich nicht herstellen. Leber- und Nierenwerte wurden durch die Ocrelizumab-Therapie nicht signifikant beeinflusst, ebenso wie die Akute-Phase-Proteine CRP und PCT. Unmittelbar nach den Infusionen stiegen die Leukozyten und neutrophilen Granulozyten jeweils an, während die eosinophilen und basophilen Granulozyten und die Monozyten abfielen. Langfristig blieben diese Zellzahlen jedoch stabil. Weitere Zellen des angeborenen Immunsystems wie die natürlichen Killerzellen und die dendritischen Zellen zeigten unspezifische Veränderungen. Obwohl in unserer Studienpopulation nur von wenigen und leichten Infektionen berichtet wurde, wiesen 80 % der Pat. nach der ersten Medikamentengabe eine Lymphopenie auf. Allerdings war die Lymphozytenzahl unserer Pat. im Durchschnitt bereits zu Beginn der Therapie niedrig. Zwischen den Infusionszyklen beobachteten wir eine Erholung der Lymphozyten. Aufgrund des Wirkmechanismus von Ocrelizumab fiel die durchschnittliche B-Zellzahl nach der ersten Infusion auf Werte nahe 0 Gpt/l. Auch alle anderen CD20-positiven B-Zellsubpopulationen wurden sofort depletiert. Unter fortlaufender Therapie blieb die B-Zellzahl weiterhin sehr gering, die Zusammensetzung des BZ-Kompartiments änderte sich im Therapieverlauf aber nicht. Die Zahl der zirkulierenden T-Zellen nahm bei jedem Infusionszyklus ebenfalls signifikant ab. Funktionelle Veränderungen in weiteren untersuchten T-Zellpopulationen fanden sich nicht, die T-Zell-Zusammensetzung blieb stabil. Die T-Zellen erholten sich zwischen den Infusionszyklen, langfristig kam es nicht zu einer Abnahme der Zellzahl. Wie wir zeigen konnten, führt die Therapie mit Ocrelizumab zu einem unmittelbaren Eingriff in das Immunsystem. Die Zusammensetzung der Immunkompartimente bleibt dabei weitestgehend erhalten, von einer dauerhaften zellulären Immunsuppression ist basierend auf unseren immunologischen und klinischen Ergebnissen nicht auszugehen. Die zellulären Veränderungen sind bei der Überwachung der Routine-Laborparameter und der Lymphozytensubpopulationen zu beachten, während die Akute-Phase-Proteine weiterhin zuverlässige Aussagen liefern. Die infusionsassoziierten Reaktionen fallen moderat aus, möglicherweise liegt ihnen der mäßig ausfallende Zytokinanstieg zugrunde. Da die Vitalparameter die infusionsassoziierten Reaktionen nicht zuverlässig anzeigen konnten, empfehlen wir in erster Linie eine klinische Überwachung der Patienten.:Inhaltsverzeichnis III Tabellenverzeichnis V Abbildungsverzeichnis VI Abkürzungsverzeichnis IX 1. Einleitung 1 1.1 Multiple Sklerose: Definition und Epidemiologie 1 1.2 Ätiologie 2 1.3 Immunpathogenese 2 1.3.1 Angeborene Immunabwehr 3 1.3.2 Erworbene Immunabwehr 5 1.4 Klinik 8 1.5 Diagnostik 10 1.6 Therapie 13 1.6.1 Schubtherapie 13 1.6.2 Verlaufsmodifizierende Therapie 13 1.6.3 Symptomatische Therapie 18 2. Zielsetzung 19 3. Material und Methoden 21 3.1 Material 21 3.1.1 Chemikalien 21 3.1.2 Grundmedien und Medienzusätze 21 3.1.3 Lösungen und Puffer 22 3.1.4 Antikörper 22 3.1.5 Sonstige Materialien 24 3.1.6 Geräte 25 3.2 Methoden 26 3.2.1 Patientinnen und Patienten 26 3.2.2 Medikamentengabe 26 3.2.3 Infusionsassoziierte Reaktionen und Vitalwerte 27 3.2.4 Blutuntersuchungen 27 3.2.5 Statistische Auswertung 31 4. Ergebnisse 33 4.1 Patientinnen- und Patientencharakteristika 33 4.2 Infusionsassoziierte Reaktionen, Nebenwirkungen und Infektionen 34 4.3 Vitalparameter während der Infusion 35 4.4 Routine-Laborparameter 36 4.4.1 Blutbild 36 4.4.2 Klinische Chemie 40 4.4.3 Akute-Phase-Proteine 42 4.4.4 Komplement und LDH 43 4.4.5 Immunstatus und Lymphozyten-Subtypisierung 45 4.5 Immunphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie 47 4.5.1 B-Zellen 48 4.5.2 T-Zellen 52 4.5.3 Natürliche Killerzellen 58 4.5.4 Monozyten 60 4.5.5 Dendritische Zellen 62 4.6 Apoptose 65 4.6.1 B-Zellen 65 4.6.2 T-Zellen 66 4.6.3 Weitere Zelltypen 67 4.7 Zytokine 67 4.7.1 Pro-inflammatorische Zytokine 68 4.7.2 Anti-inflammatorische Zytokine 71 4.7.3 T-Zell-spezifische Zytokine 72 5. Diskussion 75 6. Zusammenfassung 87 7. Summary 89 Literaturverzeichnis XI Anlage 1 XXVIII Anlage 2 XXIX / Multiple sclerosis is a chronic inflammatory disease of the central nervous system. The role of B cells in the pathogenesis of multiple sclerosis has increasingly come to the fore in recent years. Ocrelizumab, a humanized monoclonal antibody, selectively depletes CD20-expressing B cells. The drug was approved for the relapsing-remitting and primary progressive forms of multiple sclerosis in 2018. Up to now, little is known about the effects immediately following the infusion of ocrelizumab. The aim of this study was to investigate acute changes in immunologic and routine laboratory parameters and their clinical relevance in comparison to long-term changes. Therefore, we monitored infusion-associated reactions and the vital signs temperature, blood pressure, and heart rate of 68 multiple sclerosis patients during ocrelizumab infusion in the first year of treatment. Routine laboratory parameters such as blood count, liver enzymes, renal function, acute phase proteins, and complement activation were measured. Additionally, a detailed flow cytometric analysis of peripheral immune cells was performed before and after premedication with methylprednisolone and after ocrelizumab administration. At each time point, 13 serum cytokines were quantified using a bead-based assay. In our study, infusion-associated reactions were mainly mild and occurred most frequently (35 %) during the first administration of ocrelizumab. Two patients suffered from an acute hypersensitivity reaction. There were no relevant changes in vital signs. Proinflammatory serum cytokine levels of IL-6 and TNF-α clearly rose after the first ocrelizumab infusion. The levels of IL-1ß, IL-4, IL-12, IL-17A and IFN-ɣ were also detected higher after the first few infusions compared to follow up. However, serum cytokine levels of our patients did not directly correlate with clinical symptoms. Liver enzymes and kidney function remained stable. Neither immediately after infusion nor in the course of ocrelizumab therapy, the acute-phase proteins CRP and PCT were significantly affected. Leukocytes and neutrophil granulocytes rose immediately after each infusion, while eosinophil and basophil granulocytes and monocytes decreased. In the long term, these parameters remained stable. Natural killer cells and dendritic cells showed nonspecific changes. Although infrequent and only mild infections were reported in our study population, 80 % of our patients presented lymphopenia after the first ocrelizumab administration. The lymphocyte count of our patients was already low on average at the start of therapy. Between infusion cycles, we mostly observed a recovery of the lymphocyte count. Due to the mechanism of action of ocrelizumab, B cells dropped close to 0 Gpt/l after the first infusion and remained very low. All observed CD20+ B cell subpopulations showed similar behaviour and the constitution of the B cell compartment did not change over time. Circulating T cells also decreased significantly with each infusion cycle. However, T cells recovered between infusion cycles and no long-term decrease in cell number could be detected. We could not report on functional changes in T cell subpopulations and the constitution of T cell compartment remained stable over time. In summary, ocrelizumab therapy leads to a significant change in the immune system. The constitution of the immune compartments is mostly preserved. Based on our immunological and clinical results, a relevant cellular immunosuppression cannot be assumed. Cellular changes with ocrelizumab therapy need to be considered during monitoring of routine laboratory parameters and lymphocyte subpopulations, while acute-phase proteins can continue to provide reliable predictions. Ocrelizumab leads only to mild infusion-associated reactions. These reactions could be due to cytokine release, as a moderate increase in serum cytokine levels could be measured. Since vital signs did not reliably reflect infusion-related reactions, we mainly recommend to focus on clinical monitoring.:Inhaltsverzeichnis III Tabellenverzeichnis V Abbildungsverzeichnis VI Abkürzungsverzeichnis IX 1. Einleitung 1 1.1 Multiple Sklerose: Definition und Epidemiologie 1 1.2 Ätiologie 2 1.3 Immunpathogenese 2 1.3.1 Angeborene Immunabwehr 3 1.3.2 Erworbene Immunabwehr 5 1.4 Klinik 8 1.5 Diagnostik 10 1.6 Therapie 13 1.6.1 Schubtherapie 13 1.6.2 Verlaufsmodifizierende Therapie 13 1.6.3 Symptomatische Therapie 18 2. Zielsetzung 19 3. Material und Methoden 21 3.1 Material 21 3.1.1 Chemikalien 21 3.1.2 Grundmedien und Medienzusätze 21 3.1.3 Lösungen und Puffer 22 3.1.4 Antikörper 22 3.1.5 Sonstige Materialien 24 3.1.6 Geräte 25 3.2 Methoden 26 3.2.1 Patientinnen und Patienten 26 3.2.2 Medikamentengabe 26 3.2.3 Infusionsassoziierte Reaktionen und Vitalwerte 27 3.2.4 Blutuntersuchungen 27 3.2.5 Statistische Auswertung 31 4. Ergebnisse 33 4.1 Patientinnen- und Patientencharakteristika 33 4.2 Infusionsassoziierte Reaktionen, Nebenwirkungen und Infektionen 34 4.3 Vitalparameter während der Infusion 35 4.4 Routine-Laborparameter 36 4.4.1 Blutbild 36 4.4.2 Klinische Chemie 40 4.4.3 Akute-Phase-Proteine 42 4.4.4 Komplement und LDH 43 4.4.5 Immunstatus und Lymphozyten-Subtypisierung 45 4.5 Immunphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie 47 4.5.1 B-Zellen 48 4.5.2 T-Zellen 52 4.5.3 Natürliche Killerzellen 58 4.5.4 Monozyten 60 4.5.5 Dendritische Zellen 62 4.6 Apoptose 65 4.6.1 B-Zellen 65 4.6.2 T-Zellen 66 4.6.3 Weitere Zelltypen 67 4.7 Zytokine 67 4.7.1 Pro-inflammatorische Zytokine 68 4.7.2 Anti-inflammatorische Zytokine 71 4.7.3 T-Zell-spezifische Zytokine 72 5. Diskussion 75 6. Zusammenfassung 87 7. Summary 89 Literaturverzeichnis XI Anlage 1 XXVIII Anlage 2 XXIX

Glia, once considered as mere ‘glue’ for the central nervous system (CNS), have now emerged as active participants in almost every aspect of nervous system development, homeostasis, and even disease. Among these, oligodendroglia, comprising of oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) and mature oligodendrocytes (OLs) are responsible for myelinating the CNS. Additionally, recent discoveries have implicated these cells in other processes including phagocytosis, synaptogenesis, ability to influence neural activity, and even animal behaviour. OPCs originate during embryogenesis from neural stem cells, establish a non-overlapping grid-like pattern across CNS, and persist throughout life. They are also one of the most proliferative cell types within the brain, which differentiate into OLs. Given their widespread presence and multifaceted functions, it is not surprising that oligodendroglia are implicated in the pathogenesis of diseases such as Multiple Sclerosis (MS). MS is a highly prevalent demyelinating disease, characterised by a severe loss of OLs, neuronal atrophy, and disrupted neural circuits. Furthermore, the endogenous mechanisms of repair and regeneration fail, leading to progressive deterioration, including motor deficits and cognitive decline. Current clinical therapies mainly focus on slowing disease progression and alleviating symptoms. Therefore, there is an urgent need for the development of novel and improved regenerative therapies. My doctoral research focused on OPCs as a therapeutic avenue due to their stem-cell-like properties. By leveraging established links between cell cycle regulation and proliferation, my study aimed to specifically target G1 phase shortening through Cdk4 and CyclinD1 (4D) overexpression. To first evaluate its effect under physiological conditions, I employed a sophisticated triple transgenic mouse line that allows for spatiotemporal control of 4D overexpression in oligodendroglia. This approach led to an increase in OPC proliferation in the white and grey matter of the brain, effectively enhancing oligodendrogenesis. Subsequently, I tested the efficacy of 4D in a preclinical model of MS using cuprizone-induced demyelination. While no significant improvements in learning and memory functions were evident, a comprehensive analysis of cellular and functional effects of 4D will shed light on its mechanisms of action. Additionally, it is plausible that 4D might have positive outcomes on other aspects of behaviour; however, this requires further investigation. Altogether, the findings presented in this thesis introduce a novel tool aimed at augmenting endogenous oligodendrogenesis under physiological conditions and represent a significant step toward developing innovative therapeutic strategies for demyelinating disorders.:Table of Contents CHAPTER 1: INTRODUCTION 1.1. HISTORY OF OLIGODENDROGLIA 1 1.2. OLIGODENDROGLIA DURING DEVELOPMENT 4 1.3. OLIGODENDROGLIA IN ADULTHOOD 7 1.3.1. OPCS – DENSITY AND FUNCTIONS 7 1.3.2. OLS – DENSITY AND FUNCTIONS 8 1.4. OLIGODENDROGLIAL HETEROGENEITY 11 1.4.1. OPCS 11 1.4.2. OLS 12 1.5. OPC CELL CYCLE DYNAMICS 14 1.5.1. QUANTIFICATION OF OPC CELL CYCLE LENGTH 15 1.5.2. FACTORS INFLUENCING OPC CELL CYCLE 16 1.6. MYELIN AND MYELINATION 19 1.6.1. STRUCTURE AND COMPOSITION 19 1.6.2. FUNCTIONS 20 1.7. OLIGODENDROGENESIS AND BEHAVIOUR 21 1.7.1. LEARNING AND MEMORY 21 1.7.2. OTHERS 23 1.8. OLIGODENDROGLIA IN DISEASE AND REGENERATION 24 1.9. MS 26 1.9.1. MOUSE MODELS OF MS 28 1.10. CURRENT THERAPIES FOR DEMYELINATING DISEASES 31 1.11. AIM OF THE PROJECT 33 CHAPTER 2: MATERIALS AND METHODS 2.1. MATERIALS 36 2.1.1. MOUSE STRAINS 36 2.1.2. GENOTYPING PRIMERS 36 2.1.3. BUFFERS AND SOLUTIONS 37 2.1.4. CHEMICALS AND KITS 38 2.1.5. ANTIBODIES 39 2.2. METHODS 40 2.2.1. ANIMALS 40 2.2.2. GENOTYPING 40 2.2.3. DRUG TREATMENTS 40 2.2.4. BEHAVIOUR TESTS 41 2.2.4.1. OFT 41 2.2.4.2. EPM 42 2.2.4.3. ROTAROD 42 2.2.4.4. RW/CW 42 2.2.4.5. MWM 43 2.2.4.6. BM 44 2.2.5. IMMUNOHISTOCHEMISTRY 46 2.2.6. IMAGE ACQUISITION AND CELLULAR QUANTIFICATION 46 2.2.8. STATISTICS 47 CHAPTER 3: RESULTS - PART I CELLULAR AND BEHAVIOURAL EFFECTS OF GENETIC MANIPULATION OF CELL CYCLE OF OLIGODENDROCYTE PROGENITORS VIA CDK4/CYCLIND1 (4D) OVEREXPRESSION 3.1. CHARACTERISATION OF 4D OVEREXPRESSION MEDIATED BY TRIPLE TRANSGENIC MICE 48 3.2. 4D OVEREXPRESSION IN ADULT MICE INCREASES OPC PROLIFERATION IN CC AND CTX 49 3.3. 4D-INDUCED INCREASE IN OPC PROLIFERATION IS AGE-DEPENDENT 51 3.4. 4D OVEREXPRESSION INCREASES DENSITY OF OLS AND MYELIN IN CC AND CTX 52 3.5. 4D-INDUCED INCREASE IN OPC PROLIFERATION IS TEMPORALLY CORRELATED TO ACTIVATION OF 4D 53 3.6. 4D OVEREXPRESSION DOES NOT AFFECT ANXIETY-LIKE BEHAVIOUR ON THE OPEN FIELD AND ELEVATED PLUS MAZE TEST 55 3.7. 4D OVEREXPRESSION LEADS TO IMPAIRED LEARNING ON THE MORRIS WATER MAZE TEST 57 3.8. 4D OVEREXPRESSION NEGATIVELY IMPACTS RUNNING SPEEDS ON THE RUNNING/COMPLEX WHEEL TEST 59 3.9. 4D OVEREXPRESSION HAS A LONG-TERM NEGATIVE EFFECT ON RUNNING SPEEDS ON THE RUNNING/COMPLEX WHEEL TEST 61 CHAPTER 4: RESULTS - PART II CELLULAR AND BEHAVIOURAL CHARACTERISATION OF CUPRIZONE-INDUCED DEMYELINATION MODEL OF MULTIPLE SCLEROSIS 4.1. CUPRIZONE DIET LEADS TO OLIGODENDROCYTE LOSS AND DEMYELINATION ACROSS BRAIN REGIONS 64 4.2. TERMINATION OF CUPRIZONE DIET TRIGGERS SPONTANEOUS REGENERATION ACROSS BRAIN REGIONS 66 4.3. CUPRIZONE-INDUCED DEMYELINATION IMPAIRS LEARNING ON THE MORRIS WATER MAZE TEST 68 4.4. CUPRIZONE-INDUCED DEMYELINATION ADVERSELY AFFECTS BODY WEIGHT AND PERFORMANCE ON THE RUNNING/COMPLEX WHEEL TEST 70 CHAPTER 5: RESULTS - PART III BEHAVIOURAL EFFECT OF 4D-INDUCED OLIGODENDROGENESIS IN THE MODEL OF CUPRIZONE-INDUCED DEMYELINATION 5.1. 4D OVEREXPRESSION BEFORE THE ONSET OF CUPRIZONE-INDUCED DEMYELINATION DOES NOT RESCUE COGNITIVE PERFORMANCE ON BARNES MAZE 73 5.2. 4D OVEREXPRESSION BEFORE THE ONSET OF CUPRIZONE-INDUCED DEMYELINATION DOES NOT RESCUE MOTOR PERFORMANCE ON THE RUNNING/COMPLEX WHEEL TEST 75 5.3. SIMULTANEOUS 4D OVEREXPRESSION AND CUPRIZONE-INDUCED DEMYELINATION DOES NOT RESCUE MOTOR PERFORMANCE ON THE RUNNING/COMPLEX WHEEL TEST 78 CHAPTER 6: DISCUSSION 6.1. CELLULAR IMPLICATIONS OF 4D OVEREXPRESSION UNDER PHYSIOLOGICAL CONDITIONS 81 6.2. BEHAVIOURAL IMPLICATIONS OF 4D OVEREXPRESSION UNDER PHYSIOLOGICAL CONDITIONS 85 6.3. 4D AS A THERAPEUTIC TOOL 88 6.4. CONCLUSIONS AND OUTLOOK 90 REFERENCES 93 ACKNOWLEDGEMENTS 124 APPENDIX I 125 APPENDIX II 126

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Background: Fingolimod is the first oral immunomodulatory therapy approved for highly active relapsing remitting multiple sclerosis. Based on the distribution pattern of fingolimod interacting sphingosine-1-phosphat receptors in organism including immune system and cardiovascular system clinical monitoring of patients and evaluation of adverse events are recommended. Despite extensive data on cardiovascular safety, experience with fingolimod in patients with concomitant cardiological disease, especially within the pulmonary circulation, is rare. Case presentation: We report the case of a 46-year-old woman presented with relapsing remitting multiple sclerosis and severe idiopathic pulmonary arterial hypertension. Fingolimod was initiated because of disease activity of multiple sclerosis with two relapses and gadolinium-enhancing lesions in MRI. The patient demonstrated stable disease course of idiopathic pulmonary arterial hypertension when fingolimod was started. Fingolimod therapy did not alter or even worsen the pulmonary or cardiovascular conditions during first dose application as well as follow up of nine months. Conclusion: In this report, we present the first case of fingolimod treatment in a patient with highly active multiple sclerosis and severe idiopathic pulmonary arterial hypertension. We suggest an interdisciplinary approach with detailed cardiopulmonary monitoring for safety in such patients.

In der Pathogenese der Multiplen Sklerose (MS) wird autoantigenspezifischen proinflammatorischen T-Helferzellen eine entscheidende Rolle zugeschrieben. Das am meisten untersuchte Autoantigen ist das Myelin Basic Protein (MBP). Bisher waren zum Nachweis autoantigenspezifischer T-Zellen deren Kultur über Tage bis Monate unumgänglich. In dieser Arbeit wurden Methoden zum direkten ex vivo-Nachweis autoreaktiver T-Helferzellen etabliert, die die reaktive Sekretion der proinflammatorischen Zytokine Interferon gamma und Tumor Nekrose Faktor alpha nach sechsstündiger Stimulation nachweisen. Die durchflusszytometrische Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen wies eine Sensitivität von 1/10.000 in mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) auf. Es konnten damit bei 34 untersuchten MS-Patienten und 25 gesunden Kontrollpersonen keine MBP-reaktiven T-Helferzellen detektiert werden, während sich die Reaktion auf die beiden Kontrollantigene Tetanus Toxoid und Cytomegalie Virus-Antigen in den beiden Gruppen nicht relevant unterschied. Deshalb wurde in einer anderen Methode reaktiv sezerniertes Zytokin extrazellulär auf lebenden Zellen gebunden und durch einen anschließenden magnetischen Anreicherungsschritt die Sensitivität auf 2/100.000 erhöht. Bei einem von acht MS-Patienten wurde so eine Population MBP-spezifischer Zellen mit einer Ausgangsfrequenz von 2,15/100.000 nachgewiesen. Im Liquor von drei MS-Patienten ließen sich keine MBP-reaktiven proinflammatorischen T-Helferzellen detektieren. Diese Ergebnisse implizieren, dass die Frequenz MBP-spezifischer T-Helferzellen im peripheren Blut und im Liquor der meisten MS-Patienten und Kontrollpersonen geringer ist als die Sensitivität der etablierten Methoden, diese Zellen jedoch bei einigen Patienten in höheren Frequenzen nachgewiesen werden können. / Autoantigen-specific proinflammatory T-helper cells are assumed to play an important role in the pathogenesis of Multiple Sclerosis (MS). The most extensively studied autoantigen is Myelin Basic Protein (MBP). To detect autoantigen-specific T-cells, so far these had to be cultured for several days or months. In this work methods for the direct ex vivo detection of autoreactive T-helper cells have been established by detecting the reactive secretion of the proinflammatory cytokines Interferon gamma and Tumor Necrosis Factor alpha after six hour stimulation. The flow cytometric analysis of antigen-reactive cytokine expression in fixed cells showed a sensitivity of 1/10.000 in peripheral blood mononuclear cells (PBMC). With this method there could not be detected any MBP-reactive T-helper cells in 34 MS-patients and 25 healthy controls, whereas the reaction after stimulation with the two control antigens Tetanus Toxoid and Cytomegalovirus antigen did not differ relevantly between the two groups. Therefore in another method the reactively secreted cytokine was bound on the surface of living cells and the sensitivity was then increased to 2/100.000 by following magnetic enrichment. With that, there could be detected a population of MBP-specific cells in one of eight MS-patients with a frequency of 2,15/100.000 in PBMC. There could not be found any MBP-reactive proinflammatory T-helper cells in the cerebrospinal fluid of three MS-patients. Our results suggest that the frequency of MBP-specific T-helper cells in peripheral blood and cerebrospinal fluid is below the employed methods' detection limit in most MS-patients, but seldom these cells can be detected in higher frequencies.