La cartographie optique est une technique qui permet de mesurer l'activité électrique transmembranaire dans les tissus excitables avec une haute résolution spatiale et temporelle et d'une manière non invasive en utilisant des sondes fluorescentes sensibles au potentiel membranaire. Récemment, les cellules souches pluripotentes induites (hiPSC) ont été introduites et adoptées par plusieurs laboratoires comme un modèle puissant pour l'étude des maladies affectant des tissus inaccessibles. La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie héréditaire neuromusculaire incurable qui touche plusieurs organes, notamment le cœur. Dans ce projet de maitrise, des monocouches de hiPSC dérivées en cardiomyocytes ont été générées à partir d'un individu sain (CTRL), un patient DM1-1300 et un patient DM1-300, afin d'étudier les manifestations de la DM1 au niveau cardiaque. Les monocouches de hiPSC-CM ont été marquées par une sonde sensible au voltage (di-4-ANEPPS). Le potentiel membranaire a été ensuite cartographié à l'aide d'un macroscope à épifluorescence de haute résolution spatiale et temporelle. Des cartes isochrones de l'activation ont été générées. Les durées des potentiels d'action (DPA₉₀, ₅₀), les vitesses de conduction (CV) ainsi que le temps de dépolarisation (TRise) ont été mesurés. De plus, plusieurs tests pharmacologiques ont été effectués afin de valider nos résultats obtenus par notre système d'imagerie, ainsi que la fiabilité de notre modèle in vitro. Nous avons produit un tissu cardiaque qui a démontré les mêmes caractéristiques que les cardiomyocytes natifs à différentes drogues. Ce modèle in vitro s'est avéré un bon candidat pour de futures études sur les propriétés électrophysiologiques et pharmacologiques des cellules cardiaques. L'étude effectuée sur la DM1 a révélé une réduction de la CV chez les patients DM1-1300, ainsi qu'une augmentation des TRise comparativement au CTRL. La DM1 altère l'excitabilité des cardiomyocytes, probablement en affectant le fonctionnement des différents canaux ioniques et jonctions intercellulaires indispensables à la conduction cardiaque. / Optical mapping is an imaging technique widely used to measure membrane potential of excitable tissues with high spatial and temporal resolution and in a non-invasive manner using voltage sensitive dyes (VSD). Recently, human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have been introduced and adopted by several laboratories as a powerful model to study many diseases affecting inaccessible tissues. Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is an incurable hereditary neuromuscular disease that affects several organs, including the heart. In this project, monolayers of hiPSC-derived cardiomyocytes were generated from a healthy individual (CTRL) and from two DM1 patients (DM1-1300 and DM1-300), in order to study the cardiac manifestations of DM1. The hiPSC-CM monolayers were loaded with the VSD di-4-ANEPPS, and the membrane potential was then mapped using a high spatial and temporal resolution epifluorescence macroscope. Isochronal activation maps were generated. The action potential durations (APD₉₀, ₅₀), the conduction velocities (CV) as well as the depolarization rise times (TRise) were measured. In addition, several known drugs were tested in order to validate the results obtained using our optical mapping system, as well as the reliability of our in vitro model. We were able to produce a cardiac tissue that has demonstrated the same characteristics as native cardiomyocytes to different drug tests. This in vitro model has proven to be an excellent candidate for future studies on the electrophysiological and pharmacological properties of the heart. The optical mapping of DM1 cardiomyocytes monolayers has revealed a reduction of CV in hiPSC-CM DM1-1300, as well as a prolonged TRise compared to CTRL. DM1 appears to alter the excitability of cardiomyocytes probably by affecting the functioning of various ion channels and gap junctions involved in the cardiac conduction.

A Pseudoartrose Congênita da Tíbia (PCT) é uma das doenças mais desafiantes da ortopedia pediátrica pela dificuldade em obter a união óssea e, quando esta ocorre, em mantê-la. É uma doença muito rara, difícil de tratar devido à sua falta de conhecimento sobre a patogênese. As Células estromais mesenquimais multipotentes (CMM) podem desempenhar um papel na patogênese do PCT, possivelmente devido à falha da diferenciação osteogênica. O estudo das CMM pode ajudar a compreender a patogênese da doença e desenvolver novas estratégias terapêuticas baseados no uso desta célula no futuro próximo. Frente ao exposto, este trabalho teve como objetivo a análise das características biológicas das CMM isoladas de diferentes regiões anatômicas de medula óssea de pacientes com PCT. Para isto, amostras de medula óssea foram coletas a partir de locais afetados e não afetadas pela doença: Crista ilíaca do membro não afetada (CINA), crista ilíaca do membro afetada (CIA), tíbia não afetada (TNA), e tíbia afetada (TA). O numero de pacientes incluídos no estudo foi três: PCT1, PCT2 e PCT3. Os resultados mostraram que todas as células isoladas de pacientes com PCT apresentavam características compatíveis com as CMM. A taxa de formação de unidades formadoras de colônias das células da TA tanto no PCT2 quanto no PCT3 foi significativamente menor em relação às células da TNA e CINA respectivamente (p<0.05). A quantidade de células positivas para o marcador CD146 foi menor nas células da TA do PCT1 e PCT2, A análise estatística mostrou que não há uma diferença significativa. Este marcador esta relacionado com a capacidade multipotente e formação óssea in vivo. No PCT1 observou-se que formação de matriz mineralizada das CMM isoladas da CIA foi significativamente maior em relação a TA. Além disso, as células da TA do PCT1 observou-se um uma secreção significativa de alguns citocinas envolvidas no processo de formação óssea, como CCL2, CCL3, CCL4, TNA-alfa, PDGF-BB, e GM-CSF. A alteração destas citocinas pode levar a situações complicadas como o caso de não consolidação óssea. Com os resultados obtidos, se há demonstrado que as CMM da tíbia afetada tenta formar osso, mas no local da lesão é insuficiente, por tal motivo é preciso realizar estudos focados no mecanismo molecular. / Congenital pseudoarthrosis of the tibia (CPT) is one of the most challenging orthopedic diseases because of the difficulty in obtaining bone union and, when it happens, in maintaining it. It is a rare disease, difficult-to-treat due to the lack of knowledge about to pathogenesis. Multipotent mesenchymal stromal cells (MSC) may play a role in the pathogenesis of PCT, possibly due to a failure in the osteogenic differentiation. Studying these cells can help to better understand the pathogenesis of the disease and develop new therapeutic strategies based on the use of MSC in the near future. In view of the above, this work had the objective of analyzing the biological characteristics of CMM isolated from different anatomic regions of bone marrow of patients with PCT. For this, bone marrow samples were collected from sites affected and unaffected by the disease: unaffected limb iliac crest (CINA), affected limb iliac crest (CIA), unaffected tibia (TNA), and affected tibia (TA). The number of patients included in the study was three: PCT1, PCT2 and PCT3. The results showed that all cells isolated from PCT patients had characteristics compatible with CMM. The rate of formation of colonyforming units of TA cells in both PCT2 and PCT3 was significantly lower in TNA and CINA cells respectively (p <0.05). The amount of cells positive for the CD146 marker was lower in the TA cells of PCT1 and PCT2. Statistical analysis showed no significant difference. This marker is related to the multipotent capacity and bone formation in vivo. In PCT1 it was observed that the formation of mineralized matrix of CMCs isolated from CIA was significantly higher in relation to AT. In addition, PCT1 TA cells showed a significant secretion of some cytokines involved in the bone formation process, such as CCL2, CCL3, CCL4, TNA-alpha, PDGF-BB, and GM-CSF. The alteration of these cytokines can lead to complicated situations such as the case of non-consolidation of bone. With the results obtained, if the CMM of the affected tibia has been shown to try to form bone, but at the site of the lesion is insufficient, it is necessary to carry out studies focused on the molecular mechanism.

A cicatrização de feridas crônicas e de defeitos complexos representam desafios para a cirurgia plástica reconstrutiva. Novos tratamentos emergiram com a utilização de células tronco mesenquimais, com especial interesse para as derivadas de tecido adiposo (CTMs-TA), por possuir algumas vantagens em relação às derivadas da medula óssea. Algumas doenças poderiam se beneficiar com o uso das CTMs-TA, em particular, as feridas de pacientes portadores de anemia falciforme que ainda representam um desafio terapêutico. Neste estudo, investigou-se a existência de possíveis áreas doadoras preferenciais de CTMs-TA no tecido adiposo (TA) por meio da comparação de aspectos qualitativos e quantitativos das CTMs-TA derivadas de cinco diferentes áreas corporais. Posteriormente, analisou-se a influência do sobrenadante dessas células, rico em citocinas e fatores de crescimento, sobre a migração de fibroblastos de indivíduos normais e de portadores de anemia falciforme in vitro. Não foram observadas diferenças qualitativas entre as CTMs-TA das cinco áreas analisadas. A região do dorso apresentou número maior de CTMs, com diferença significativa em relação à região das coxas. A adição de sobrenadante produzido por CTMs-TA demonstrou aumento da velocidade de migração dos fibroblastos de forma similar para os normais e os falciformes. O microambiente desfavorável presente nas feridas falciformes parece exercer importante influência sobre esses fibroblastos, pois uma vez corrigido o microambiente com os meios de cultivo apropriados, as células apresentaram taxa de duplicação e velocidade de migração semelhante à dos fibroblastos normais in vitro. / The healing of chronic wounds and complex defects represents challenges for reconstructive plastic surgery. New treatments have emerged with the use of multipotent mesenchymal cells, with special interest for the adipose-derived stem cells (ADSCs) as it has some advantages over the bone marrow-derived. Some diseases could benefit from the use of ADSCs, in particular, the wounds of patients with sickle cell anemia that still represent a therapeutic challenge. In this study, we investigated the existence of possible preferential donor areas of ADSCs in adipose tissue by comparing qualitative and quantitative aspects of ADSCs derived from five different body areas. Later, we analyzed the influence of the supernatant of these cells, rich in cytokines and growth factors, on the migration of fibroblasts from healthy individuals and from patients with sickle cell anemia in vitro. No qualitative differences were observed among the ADSCs of the five areas analyzed. The dorsum presented a higher number of ADSCs, with a significant difference in relation to the thigh. Addition of supernatant produced by ADSCs has been shown to increase the rate of migration of fibroblasts in a similar way to healthy and sickle cells. The unfavorable microenvironment present in sickle wounds seems to exert a significant influence on these fibroblasts because once the microenvironment was corrected with the appropriate culture media, the cells had a doubling rate and migration rate similar to normal fibroblasts in vitro.

A interação entre células tumorais e células estromais tem um papel central na progressão neoplásica. As células estromais mesenquimais multipotentes (MSCs) podem se integrar ao microambiente tumoral onde modulam o crescimento dos tumores por meio de distintos mecanismos. Entretanto, pouco se sabe sobre o papel das MSCs na metástase, a principal causa de morte em pacientes com câncer. Utilizando um modelo de melanoma murino ortotópico, nós demonstramos que MSCs obtidas da medula óssea de camundongos (MO-MSCs) ocupam o nicho perivascular nos tumores primários e aumentam 2,5 vezes a incidência de micrometástases pulmonares quando co-infundidas com células de melanoma B16. Observamos ainda que o meio condicionado das MO-MSCs não altera o potencial de colonização pulmonar das células B16 infundidas sistemicamente. Isto indica que as MO-MSCs modulam as fases iniciais da cascata metastática, durante a qual ocorrem os processos de invasão e intravasão nos vasos sangüíneos. Em correlação com estes efeitos pró-metastáticos, o secretoma das MO-MSCs induziu a transição epitélio-mesenquimal (EMT) nas células de melanoma in vitro. Após cultivo em meio condicionado das MO-MSCs, as células B16 adquiriram uma morfologia evidentemente fibroblástica. Ao mesmo tempo, houve o rearranjo dos filamentos de actina e o aumento da expressão de marcadores mesenquimais como fibronectina, vimentina, FSP1, N-caderina e ZEB2, acompanhado da repressão transcricional de E-caderina. A ativação da EMT pelo secretoma das MO-MSCs resultou na aquisição de propriedades metastáticas nas células de melanoma. Após cultivo em meio condicionado de MO-MSCs, as células B16 tiveram seu potencial de ancoragem à fibronectina reduzido, ao passo que houve o aumento na mobilidade e no potencial de invasão em matrizes tridimensionais. Utilizando inibidores competitivos de ATP contra o receptor tirosina-cinase Met, demonstramos que a aquisição de todas as propriedades metastáticas avaliadas e a ativação da EMT nas células de melanoma é mediada pela ativação da via HGF/Met. Estes dados destacam o papel das MOMSCs no microambiente tumoral como fonte perivascular de moléculas indutoras da EMT, cuja ativação leva a aquisição de traços metastáticos nas células de melanoma. Além disso, a inibição da via HGF/Met pode neutralizar os efeitos das MO-MSCs sobre as células tumorais, contribuindo para a repressão de propriedades fundamentais que sustentam a progressão e a disseminação neoplásica. Estas informações são importantes para o desenvolvimento seguro das MO-MSCs como ferramenta terapêutica e demonstram a importância da sinalização entre MSCs e células tumorais na disseminação metastática. Mais especificamente, estas observações reforçam a inibição da via HGF/Met como uma abordagem promissora para o tratamento da metástase. / The crosstalk between tumor cells and stromal cells can profoundly impact tumor progression. Multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) have been reported to integrate the tumor microenvironment where they are described to modulate tumor growth by distinct mechanisms. However, little is known about the impact of MSCs on metastasis, the main cause of death in patients with cancer. Using an orthotopic mouse melanoma model, we showed that mouse bone marrow-derived MSCs (BMMSCs) occupy the perivascular niche within primary tumors and increased by 2.5-fold the incidence of lung micrometastases after co-infusion with B16 melanoma cells. Also, MO-MSCs conditioned medium did not affect the lung colonization ability of systemically infused B16 cells. This indicates that MO-MSCs induces the initial steps of the metastatic cascade, during which the invasion and intravasion occurs. Correlating with these metastatic effects, the BM-MSCs\' secretome activated the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) in B16 cells in vitro. After culture in BMMSCs\' conditioned medium, B16 cells acquired an evident fibroblastic morphology. Simultaneously, we observed the rearrangement of actin filaments and the upregulation of mesenchymal markers such as fibronectin, vimentin, FSP1, Ncadherin and ZEB2. In agreement with the loss of epithelial phenotype, BM-MSCs\' secretome also suppressed E-cadherin expression in B16 cells. The activation of EMT by BM-MSCs leaded to the acquisition of metastatic traits in melanoma cells. After culture in BM-MSCs\' conditioned medium, B16 cells displayed reduced anchorage to fibronectin and increased motility and invasiveness in threedimensional matrix plugs. Inhibition of Met receptor with competitive ATP inhibitors demonstrated that the induction of EMT and the resultant acquisition of metastatic traits are driven by activation of HGF/Met signaling pathway. Taken together, these evidences highlight the role of BM-MSCs as a perivascular source of EMT-inductive signals, whose activation leads to acquisition of metastatic traits in melanoma cells. Furthermore, inhibition of HGF/Met signaling pathway can neutralize the effects of BM-MSCs on tumor cells, thereby allowing the repression of fundamental properties which support tumor progression and metastasis. This information is useful to safely develop BM-MSCs as therapeutic tool and demonstrate the relevance of the signaling between MSCs and tumor cells during metastasis. More specifically, it reinforces that inhibition of Met signaling can be a promissory approach for the treatment of metastasis.

INTRODUÇÃO: As células-tronco mesenquimais (CTM) são células adultas multipotentes capazes de se diferenciarem em várias linhagens celulares. Estudos com CTM derivadas do cordão umbilical humano (CUh), mais especificamente da Geleia de Wharton (GW), tem demonstrado um grande potencial para a terapia de reposição celular e regeneração tecidual. O papel dos genes de resistência a múltiplas (MDR) drogas, tais como ABCB1 e LRP é bem conhecido nos processos de regulação, fisiologia e defesa. Entretanto, nenhum estudo demonstrou ainda a presença desses genes nas CTM da GW do CUh. Assim, o objetivo do presente estudo foi analisar a expressão de Pg-p e LRP em CTM derivadas da GW. MATERIAIS E MÉTODOS: CTMs da GW isoladas de CUh (n = 20) foram caracterizadas quanto ao seu estado indiferenciado por: citometria de fluxo; expressão de genes Oct-4 e Nanog por RT-PCR e capacidade de diferenciação adipogênica e osteogênica in vitro. Foi analisado ainda a expressão dos genes ABCB1 e LRP por RT-PCR em tempo real de células indiferenciadas. A resistência a doxorrubicina (DOX) foi determinada através do ensaio de MTT nessas mesmas amostras. RESULTADOS: As CTM da GW do CUh apresentaram positividade para marcadores de superfície presentes nas CTM, tais como, CD29, CD44, CD90 e CD105. Os genes de indiferenciação celular Oct-4 e Nanog foram expressos em todas as amostras, que também foram capazes de se diferenciar em adipócitos e osteócitos, comprovando assim que essas células são CTM. Com relação à Pg-p, o gene ABCB1 não amplificou em 18 amostras sendo que somente 2 apresentaram baixa expressão gênica. O gene LRP amplificou de forma intensa em todas as amostras analisadas. CONCLUSÃO: Concluímos que as CTM derivadas da GW do CUh apresentam um elevado nível de expressão de LRP, sugerindo que este gene pode estar envolvido no processo de regulação das células-tronco mesenquimais, bem como na fisiologia e defesa celular / INTRODUCTION: Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent adult cells that can differentiate into various cell lineages. Studies with MSC derived from human umbilical cord (hUC), more specifically from Wharton jelly (WJ), have shown great potential for cellular replacement therapy and tissue regeneration. The role of multidrug resistance genes, such as ABCB1 and LRP is well known in the regulation, physiology and cellular defense. However, the presence of these genes in the MSC of the WJ from hUC was not demonstrated yet. The aim of this study was to analyze the expression of Pg-p and LRP in MSCs derived from WJ. MATERIALS AND METHODS: The MSC from WJ were isolated from hUC (n = 20) and were characterized by: flow cytometry; Oct-4 and Nanog gene expression by RT-PCR and adipogenic and osteogenic in vitro differentiation capability of these cells. It was also analyzed gene expression of ABCB1 and LRP by real time RT-PCR of undifferentiated cells. Doxorubicin (DOX) resistance was determined by MTT assay in all the samples. RESULTS: MSC WJ from hUC was positive for MSC surface markers, such as CD29, CD44, CD90 and CD105. The undifferentiated cell genes Oct-4 and Nanog were expressed in all samples, which were also capable to differentiate into adipocytes and osteocytes, proving that these cells are MSC. Concerning to Pgp, the ABCB1 gene, 18 samples didn\'t show any amplification product (no expression) while 2 showed little gene expression. The LRP gene amplified intensely in all samples. CONCLUSION: We conclude that MSC derived from the WJ hUC have a high level of LRP expression, suggesting that this gene may be involved in the regulation of mesenchymal stem cells as well as in physiology and cellular defense

A Pseudoartrose Congênita da Tíbia (PCT) é uma das doenças mais desafiantes da ortopedia pediátrica pela dificuldade em obter a união óssea e, quando esta ocorre, em mantê-la. É uma doença muito rara, difícil de tratar devido à sua falta de conhecimento sobre a patogênese. As Células estromais mesenquimais multipotentes (CMM) podem desempenhar um papel na patogênese do PCT, possivelmente devido à falha da diferenciação osteogênica. O estudo das CMM pode ajudar a compreender a patogênese da doença e desenvolver novas estratégias terapêuticas baseados no uso desta célula no futuro próximo. Frente ao exposto, este trabalho teve como objetivo a análise das características biológicas das CMM isoladas de diferentes regiões anatômicas de medula óssea de pacientes com PCT. Para isto, amostras de medula óssea foram coletas a partir de locais afetados e não afetadas pela doença: Crista ilíaca do membro não afetada (CINA), crista ilíaca do membro afetada (CIA), tíbia não afetada (TNA), e tíbia afetada (TA). O numero de pacientes incluídos no estudo foi três: PCT1, PCT2 e PCT3. Os resultados mostraram que todas as células isoladas de pacientes com PCT apresentavam características compatíveis com as CMM. A taxa de formação de unidades formadoras de colônias das células da TA tanto no PCT2 quanto no PCT3 foi significativamente menor em relação às células da TNA e CINA respectivamente (p<0.05). A quantidade de células positivas para o marcador CD146 foi menor nas células da TA do PCT1 e PCT2, A análise estatística mostrou que não há uma diferença significativa. Este marcador esta relacionado com a capacidade multipotente e formação óssea in vivo. No PCT1 observou-se que formação de matriz mineralizada das CMM isoladas da CIA foi significativamente maior em relação a TA. Além disso, as células da TA do PCT1 observou-se um uma secreção significativa de alguns citocinas envolvidas no processo de formação óssea, como CCL2, CCL3, CCL4, TNA-alfa, PDGF-BB, e GM-CSF. A alteração destas citocinas pode levar a situações complicadas como o caso de não consolidação óssea. Com os resultados obtidos, se há demonstrado que as CMM da tíbia afetada tenta formar osso, mas no local da lesão é insuficiente, por tal motivo é preciso realizar estudos focados no mecanismo molecular. / Congenital pseudoarthrosis of the tibia (CPT) is one of the most challenging orthopedic diseases because of the difficulty in obtaining bone union and, when it happens, in maintaining it. It is a rare disease, difficult-to-treat due to the lack of knowledge about to pathogenesis. Multipotent mesenchymal stromal cells (MSC) may play a role in the pathogenesis of PCT, possibly due to a failure in the osteogenic differentiation. Studying these cells can help to better understand the pathogenesis of the disease and develop new therapeutic strategies based on the use of MSC in the near future. In view of the above, this work had the objective of analyzing the biological characteristics of CMM isolated from different anatomic regions of bone marrow of patients with PCT. For this, bone marrow samples were collected from sites affected and unaffected by the disease: unaffected limb iliac crest (CINA), affected limb iliac crest (CIA), unaffected tibia (TNA), and affected tibia (TA). The number of patients included in the study was three: PCT1, PCT2 and PCT3. The results showed that all cells isolated from PCT patients had characteristics compatible with CMM. The rate of formation of colonyforming units of TA cells in both PCT2 and PCT3 was significantly lower in TNA and CINA cells respectively (p <0.05). The amount of cells positive for the CD146 marker was lower in the TA cells of PCT1 and PCT2. Statistical analysis showed no significant difference. This marker is related to the multipotent capacity and bone formation in vivo. In PCT1 it was observed that the formation of mineralized matrix of CMCs isolated from CIA was significantly higher in relation to AT. In addition, PCT1 TA cells showed a significant secretion of some cytokines involved in the bone formation process, such as CCL2, CCL3, CCL4, TNA-alpha, PDGF-BB, and GM-CSF. The alteration of these cytokines can lead to complicated situations such as the case of non-consolidation of bone. With the results obtained, if the CMM of the affected tibia has been shown to try to form bone, but at the site of the lesion is insufficient, it is necessary to carry out studies focused on the molecular mechanism.

A cicatrização de feridas crônicas e de defeitos complexos representam desafios para a cirurgia plástica reconstrutiva. Novos tratamentos emergiram com a utilização de células tronco mesenquimais, com especial interesse para as derivadas de tecido adiposo (CTMs-TA), por possuir algumas vantagens em relação às derivadas da medula óssea. Algumas doenças poderiam se beneficiar com o uso das CTMs-TA, em particular, as feridas de pacientes portadores de anemia falciforme que ainda representam um desafio terapêutico. Neste estudo, investigou-se a existência de possíveis áreas doadoras preferenciais de CTMs-TA no tecido adiposo (TA) por meio da comparação de aspectos qualitativos e quantitativos das CTMs-TA derivadas de cinco diferentes áreas corporais. Posteriormente, analisou-se a influência do sobrenadante dessas células, rico em citocinas e fatores de crescimento, sobre a migração de fibroblastos de indivíduos normais e de portadores de anemia falciforme in vitro. Não foram observadas diferenças qualitativas entre as CTMs-TA das cinco áreas analisadas. A região do dorso apresentou número maior de CTMs, com diferença significativa em relação à região das coxas. A adição de sobrenadante produzido por CTMs-TA demonstrou aumento da velocidade de migração dos fibroblastos de forma similar para os normais e os falciformes. O microambiente desfavorável presente nas feridas falciformes parece exercer importante influência sobre esses fibroblastos, pois uma vez corrigido o microambiente com os meios de cultivo apropriados, as células apresentaram taxa de duplicação e velocidade de migração semelhante à dos fibroblastos normais in vitro. / The healing of chronic wounds and complex defects represents challenges for reconstructive plastic surgery. New treatments have emerged with the use of multipotent mesenchymal cells, with special interest for the adipose-derived stem cells (ADSCs) as it has some advantages over the bone marrow-derived. Some diseases could benefit from the use of ADSCs, in particular, the wounds of patients with sickle cell anemia that still represent a therapeutic challenge. In this study, we investigated the existence of possible preferential donor areas of ADSCs in adipose tissue by comparing qualitative and quantitative aspects of ADSCs derived from five different body areas. Later, we analyzed the influence of the supernatant of these cells, rich in cytokines and growth factors, on the migration of fibroblasts from healthy individuals and from patients with sickle cell anemia in vitro. No qualitative differences were observed among the ADSCs of the five areas analyzed. The dorsum presented a higher number of ADSCs, with a significant difference in relation to the thigh. Addition of supernatant produced by ADSCs has been shown to increase the rate of migration of fibroblasts in a similar way to healthy and sickle cells. The unfavorable microenvironment present in sickle wounds seems to exert a significant influence on these fibroblasts because once the microenvironment was corrected with the appropriate culture media, the cells had a doubling rate and migration rate similar to normal fibroblasts in vitro.

As células estromais mesenquimais (CMMs) se tornaram de grande interesse para a terapia celular devido ao seu potencial de se diferenciar e reconstituir tecidos especializados. Mais recentemente, este interesse tem aumentado significativamente devido à descoberta de que as CMMs são capazes de secretar uma infinidade de mediadores para estimular a regeneração in situ de tecidos lesados. Dessa forma, CMMs podem ser consideradas tanto como um produto terapêutico em si, quanto uma biofábrica de diversas proteínas relevantes do ponto de vista terapêutico. Para atender a estas crescentes demandas, ambas as aplicações requerem o desenvolvimento de processos de expansão celular com alto rendimento, sob condições de cultivo definidas, reprodutíveis, escalonáveis, permitindo a obtenção de produtos com adequada identidade, potência, pureza, segurança e viáveis economicamente. Frente ao exposto, este trabalho teve como objetivos principais o estabelecimento de um processo de expansão de CMMs baseado em biorreatores e a caracterização do secretoma destas células visando aplicações terapêuticas. Para isto, a expansão de CMMs do cordão umbilical (MCUs) foi realizada em frascos multicamadas (MC) e nos biorreatores de leito fixo (LF), tanque agitado com microcarregadores (TA) e fibrasocas (FO). Os resultados mostraram que a taxa de proliferação específica das células foi maior (< tempo de duplicação) no biorreator de FO (36,8 ± 1,7 horas), bem como o fator de expansão (9,8 ± 1,0) e a eficiência na recuperação celular (100%). Um nível similar de produção celular foi observado para o TA, MC e LF com elevado fator de expansão celular (8,8 ± 0,39, 8,7 ± 0,90, 6,9 ± 1,3, respectivamente). No entanto, em termos de eficiência na recuperação celular (%), LF apresentou a menor taxa de recuperação dentre todos os sistemas (18% (± 0,77)), acompanhado pelo TA (61% (± 15,7)). As células mantiveram suas características imunofenotípicas e o potencial de diferenciação em adipócitos, osteócitos e condrócitos em todos os sistemas de cultivo avaliados. Foi também realizada a análise de custos (COG) e avaliação da viabilidade econômica para produção de CMMs visando tratamento da doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH) em escala comercial, utilizando os sistemas de cultivo avaliados experimentalmente sob diferentes estratégias de reembolso. Apesar dos resultados experimentais satisfatórios para o biorreator FO, o COG revelou que este sistema tem o maior custo devido aos elevados custos dos consumíveis requeridos e do custo do equipamento. O frasco MC foi considerado como a tecnologia mais rentável e robusta no cenário avaliado e o biorreator TA obteve a segunda posição. O biorreator TA foi escolhido como o mais adequado analisando de maneira conjunta os dados experimentais obtidos, a análise dos custos dos diferentes sistemas de cultivo e a escalonabilidade de cada sistema. Assim, esse biorreator foi eficientemente utilizado para o cultivo de MCUs em condições isentas de SFB e xenoantígenos, sendo possível a produção de uma grande quantidade de células, representando um passo importante no desenvolvimento de um bioprocesso em conformidade com as normas das agências regulatórias. Por fim, com a análise do secretoma das CMMs por espectrometria de massas foi possível a identificação de uma gama enorme de proteínas interessantes (aprox. 2400) envolvidas em importantes processos biológicos. O futuro monitoramento dessas proteínas em biorreatores poderá representar um método inovador e original de produção de produtos livres de células para uso na terapia celular. / Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) have become of great interest for cell therapy because of its potential to differentiate and reconstitute specialized tissues. More recently, such interest has significantly increased due to the discovery that MSC are capable of secreting a plethora of mediators to stimulate the in situ regeneration of injured tissues. Thus, MSC can be considered as a therapeutic product itself and as a biofactory of various relevant therapeutic proteins. To meet these increasing demands, both applications require the development of high-yield, reproducible, scalable and cost-effective bioprocesses under defined culture conditions, obtaining products with proper identity, purity and safety. Based on these, the main goal of this work was the establishment of a MSC expansion process based on bioreactors and secretome characterization of these cells targeting therapeutic applications. The MSC expansion was performed using multi-layered flasks (ML) and fixed bed (PB), stirred tank (STR) and hollow fiber (HF) bioreactors. The results showed that the proliferation rate of the cells was higher (< doubling time) in the HF bioreactor (36.8 ± 1.7 hours), as well as the expansion fold-increase (9.8±1.0) and harvesting efficiency (100%). A similar level of cell production was observed for STR, ML and PB with high fold-increase (8.8±0.39, 8.7±0.90, 6.9±1.3, respectively). However, in terms of harvesting efficiency (%), PB bioreactor presented the lowest retrieval rate across all the technologies (18% (±0.77)), followed by STR (61% (±15.7)). The cells retained their functional properties after culture in all the culture systems evaluated. This study was then extended through the use of a bioprocess economics tool for the evaluation of the economic feasibility of producing MSC-based treatment for acute graft vs. host disease (aGvHD) at commercial scale, using the culture systems experimentally evaluated under different reimbursement strategies. Despite the advantageous experimental results of HF bioreactors, the COG analysis has revealed that this is the least cost effective cell culture system to be used, due to its high consumable and equipment costs. ML flasks ranked first as the most cost effective and robust technology in this scenario and microcarrier-based technologies (STR) ranked in second position. The STR bioreactor was chosen as the most suitable for MSC expansion analyzing the experimental data, COG analysis and scalability of each culture system. Thus, STR bioreactor was efficiently tested for MSC expansion under serum and xeno-free conditions and it was possible to produce a large amount of cells. The development of a scalable microcarrier-based stirred culture system using xeno-free culture medium that suits the intrinsic features of UCM-derived MSC represents an important step towards a GMP compliant large-scale production platform for these promising cell therapy candidates. Finally, with the MSC secretome analysis by mass spectrometry it was possible to identify a wide range of interesting proteins (approx. 2400) involved in important biological processes. The future monitoring of these proteins in bioreactors may represent a novel and unique method of producing cell-free products for use in cellular therapy.

A manutenção do estado progenitor durante o cultivo de células mesenquimais progenitoras derivadas do tecido adiposo (MSCs-TA), caracterizado pelo potencial de diferenciação e da capacidade de autorrenovação, é atualmente um dos maiores desafios da terapia celular. Sabendo da influência da angiogênese no desenvolvimento de tecidos de origem mesenquimal, avaliamos se um ambiente pro-angiogênico mimetizado em cultura forneceria condições para manutenção de um estado progenitor durante o processo de expansão celular. Utilizando como modelo de um ambiente pró-angiogênico o cultivo no meio EGM-2, o qual é suplementado pelos fatores de crescimento EGF, FGF-2, IGF e VEGF, nós demonstramos que a presença de tais fatores pró-angiogênicos é fundamental para a manutenção do estado progenitor de MSCs-TA em cultura. Verificamos que a presença de tais fatores de crescimento possibilitaram às MSCs-TA apresentarem um alto potencial de diferenciação adipogênico e osteogênico em comparação ao meio convencional DMEM/F12 e ao meio EBM, ausente de fatores. Além disso, o cultivo na presença de fatores pró-angiogênicos aumentou o potencial clonogênico das MSCs-TA, ao mesmo tempo em que aumentou a capacidade proliferativa destas células. Dentre os fatores de crescimento, EGF e FGF-2 foram responsáveis pelos efeitos mais robustos. Ao mesmo tempo, células cultivadas nas presença destas citocinas foram capazes de manter a morfologia fibroblastóide e apresentaram alta expressão do fator de pluripotência Klf-4. Em concordância com estes achados, o transplante subcutâneo de MSCs-TA cultivadas nestas condições mostrou que aquelas mantidas em EGM-2 geram um tecido semelhante ao tecido formado pela fração estromal vascular não cultivada. Estes resultados reforçam o papel do ambiente pró-angiogênico na manutenção do estado progenitor de MSCs-TA, e que tal estado foi proporcionado pela ação dos fatores de crescimento pró-angiogênicos EGF, FGF-2, IGF e VEGF nas células em cultivo, com destaque para as citocinas EGF e FGF-2. Em conclusão, o uso do ambiente pró-angiogênico no cultivo de MSCs-TA mostrou-se como uma abordagem promissora para a manutenção do estado progenitor destas células in vitro. / The maintenance of the progenitor state in the culture of adipose tissue derived- mesenchymal progenitor cell (TA-MSCs), characterized by the differentiation potential and self-renewal capability, is currently one of the major challenges of cell therapy. The information that the angiogenesis influences the development of mesenchymal tissues, has led us to evaluate how a pro-angiogenic environment mimicked in culture would provide conditions for maintaining a progenitor state during the cell expansion process. We designe a model for a pro-angiogenic environment in which cells grown in EGM-2 supplemented with the following growth factors: EGF, FGF-2, IGF and VEGF, and demonstrated that the presence of such pro-angiogenic growth factors was crucial for maintenance of the progenitor of AT-MSCs in culture. We observed that the presence of such growth factors allowed to AT-MSCs a high potential of adipogenic and osteogenic differentiation compared to conventional DMEM/F12 medium and the EBM medium, in the absence of the factors. Furthermore, the culture in presence of pro-angiogenic growth factors increased the clonogenic potential of AT-MSCs and increased the proliferative capability of these cells. Among the growth factors, EGF and FGF-2 were responsible for most robust effects. At the same time, cells cultured in the presence of these cytokines were able to maintaining the fibroblastoid morphology and presented high expression levels of Klf-4 pluripotency factor. In agreement with these observations, the subcutaneous transplantation of AT-MSCs cultured under these conditions showed that those cells kept in EGM-2 generated a tissue-like to tissue formed by the stromal vascular fraction uncultivated. These results reinforce the role of the pro-angiogenic environment in the maintenance of the progenitor state of AT-MSCs, and that such a state was provided by the action of the pro-angiogenic growth factors EGF, FGF-2, IGF and VEGF in cultured cells, highlighting EGF and FGF-2 cytokines. In conclusion, we showed that the use of a pro-angiogenic environment in AT-MSCs culture is a promising approach to the maintain the progenitor state of these cells in vitro.

Orientador: Rogerio Martins Amorim / Resumo: Estudos com células estromais mesenquimais multipotentes (MSCs) estão em crescente progresso devido às suas propriedades imunomoduladoras, antiinflamatórias, antiapoptóticas e de regeneração tecidual, tornando essa modalidade de terapia celular promissora no tratamento de diversas doenças. Devido à limitada capacidade regenerativa do sistema nervoso central (CNS), causando sequelas funcionais, as MSCs estão sendo investigadas como uma alternativa terapêutica para condições neurológicas inflamatórias, vasculares, traumáticas e degenerativas em diversas espécies animais. A Mieloencefalite protozoária equina (EPM) causada por ambos os protozoários do filo Apicomplexa, Sarcocystis neurona e Neospora hughesi, permanece como uma importante doença neurológica dos equinos nas Américas, embora a maioria dos casos seja devida à infecção por S. neurona. A aplicação da proteômica com sua gama de ferramentas na clínica de equinos pode contribuir significativamente para o entendimento de processos patológicos e facilitar a descoberta de novos alvos terapêuticos ou marcadores diagnósticos. Neste contexto, os objetivos deste estudo foram avaliar o perfil proteômico do líquido cefalorraquidiano (CSF) antes e após múltiplos transplantes intratecal de MSCs em equinos hígidos e o perfil proteômico do CSF de equinos cronicamente afetados pela EPM. Doze cavalos adultos clinicamente saudáveis foram divididos aleatoriamente em três grupos experimentais: grupo DPBS (DPBS ou control; n = 4) onde a sol... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Multipotent mesenchymal stromal cell (MSCs) studies are under increasing progress because of their immunomodulatory, anti-inflammatory, antiapoptotic and tissue regeneration properties, making this modality of cell therapy promising in the treatment of various diseases. Due to the limited regenerative capacity of the central nervous system (CNS), causing functional sequelae, MSCs are being investigated as a therapeutic alternative for inflammatory, vascular, traumatic and degenerative neurological conditions in various animal species. Equine protozoal myeloencephalitis (EPM) caused by both protozoa of the Apicomplexa phylum, Sarcocystis neurona and Neospora hughesi, remains an important neurological disease in horses in the Americas, although most cases are due to S. neurona infection. The application of proteomics with its range of tools in the equine clinic can contribute significantly to the understanding of pathological processes and facilitate the discovery of new therapeutic targets or diagnostic markers. In this context, the objectives of this study were to evaluate the proteomic profiling of cerebrospinal fluid (CSF) before and after multiple intrathecal transplantations of MSCs in healthy horses and the CSF proteomic profiling of horses chronically affected by EPM. Twelve clinically healthy adult horses were randomly divided into three experimental groups: DPBS (DPBS or control; n = 4), in which intrathecal "transplants" with Dulbecco's phosphate buffered saline (DPB... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor