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Leukotriene A4 hydrolase : studies of structure-function relationships by site-directed mutagenesis and X-ray crystallography /

Rudberg, Peter C., January 2004 (has links)
Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2004. / Härtill 4 uppsatser.
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Investigation of antiviral and anticancer nucleoside analog substrate recognition of drosophila melanogaster and herpes virus deoxyribonucleoside kinases /

Solaroli, Nicola, January 2006 (has links)
Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2006. / Härtill 4 uppsatser.
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Examining the role of MalG in the assembly and function of the maltose transport complex in Escherichia coli : implications for the study of integral membrane proteins /

Nelson, Bryn D. January 1998 (has links)
Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1998. / Vita. Includes bibliographical references (leaves [100]-113).
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Characterization of a serine/threonine phosphatase-kinase pair in Bacillus anthracis

Shakir, Salika Mehreen. January 2010 (has links) (PDF)
Thesis (Ph. D.)--University of Oklahoma. / Bibliography: leaves 116-129.
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Virulence and required genes in the fish pathogen Vibrio anguillarum

McMillan, Stuart January 2016 (has links)
Vibrio anguillarum infects many fish species in aquaculture, reducing farm productivity and negatively impacting fish welfare. Deeper understanding of the biology of V. anguillarum, particularly during infections in vivo, will help to improve disease prevention and control. Thus, the aim of this thesis was to provide further insight into the infection biology of V. anguillarum with a view to identifying better ways to reduce the impact of this pathogen in aquaculture. Conventional studies on virulence, particularly those aiming to identify novel virulence factors, often employ transposon mutagenesis where the functions of individual genes in the bacterium are disrupted. These mutant libraries are screened to identify those with attenuated virulence, allowing subsequent identification of the gene responsible. Usually the native fish host would be used but such studies are increasingly difficult to perform due to regulations on vertebrate experiments and ethical concerns. As a result, alternative invertebrate hosts are now an important means to studying microbial infections, but few models have been assessed for bacterial pathogens of fish. In this thesis, larvae of the greater wax moth Galleria mellonella were evaluated as an alternative host to investigate V. anguillarum virulence. Wild-type V. anguillarum isolates killed larvae in a dose-dependent manner, replicated in the haemolymph, and larvae infected with a lethal dose of bacteria could be rescued by antibiotic therapy, thus indicating that V. anguillarum established an infection in G. mellonella. Crucially, virulence of 11 wild-type V. anguillarum isolates correlated significantly between larva and Atlantic salmon infection models, and studies with isogenic mutants knocked out for various virulence determinants revealed conserved roles for some in larva and fish infections, including the pJM1 virulence plasmid and rtxA toxin. Thereafter, 350 strains from a V. anguillarum random transposon insertion library were screened for attenuated virulence in G. mellonella. In total, 12 strains had reduced virulence and in these mutants the transposon had inserted into genes encoding several recognised and putative virulence factors, including a haemolytic toxin (vah1) and proteins involved in iron sequestration (angB/G and angN). Importantly, the transposon in one strain had inserted into an uncharacterised hypothetical protein. Preliminary investigations found this putative novel virulence factor to contain a GlyGly-CTERM sorting domain motif, with sequence similarity to VesB of Vibrio cholerae which is involved in post-translational processing of cholera toxin. Finally, three transposon insertion libraries were mass sequenced on a MiSeq platform to identify V. anguillarum genes lacking transposon insertions. These genes were assumed to be ‘required’ for viability in the conditions under which the mutants were selected, in this case tryptone soya agar. In total, 248 genes lacked a transposon insertion and were the putative ‘required’ genes, and these may be important chemotherapeutic targets for new approaches to combat V. anguillarum infections. This thesis has furthered our understanding of the biology of the important fish pathogen V. anguillarum using an ethically acceptable approach, and the findings may assist with new ways to reduce the burden of this bacterium in aquaculture.
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Caracterização de transglicosilases líticas de mureína em xanthomonas citri subsp. citri 306 e estudo funcional das lts mltb2.1 e mltb2.2 associadas ao elemento Tnxax1 / Characterization of lytic murein transglycosylases in xanthomonas citri subsp. citri 306 and functional study of Tnxax1 element lts mltb2.1 and mltb2.2

Oliveira, Amanda Carolina Paulino de [UNESP] 04 July 2018 (has links)
Submitted by Amanda Carolina Paulino de Oliveira (amanda@posgrad.fcav.unesp.br) on 2018-07-30T23:45:45Z No. of bitstreams: 1 Dissertação final - ACPO - Versão online.pdf: 8789441 bytes, checksum: a845ac98a1435e414423acdc29c30ff5 (MD5) / Approved for entry into archive by Karina Gimenes Fernandes null (karinagi@fcav.unesp.br) on 2018-07-31T11:04:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 oliveira_acp_me_iabo.pdf: 8789441 bytes, checksum: a845ac98a1435e414423acdc29c30ff5 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-31T11:04:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 oliveira_acp_me_iabo.pdf: 8789441 bytes, checksum: a845ac98a1435e414423acdc29c30ff5 (MD5) Previous issue date: 2018-07-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Xanthomonas citri subsp. citri 306 (XccA) é o agente causal do cancro cítrico (CC), doença endêmica que afeta a citricultura. Durante a interação patógeno-hospedeiro o sistema de secreção tipo três (SST3) codificado pela XccA age na translocação de efetores e no estabelecimento da doença. A montagem do aparato de SST3 depende da síntese, remodelagem e degradação da parede celular bacteriana, sendo este processo realizado pela ação enzimática de transglicosilases líticas de mureína (LTs). XccA codifica diversas LTs, porém, pouco é conhecido sobre a diversidade de famílias e relação com a virulência. Dentre as LTs com provável relação com a virulência, duas ORFs parálogas presentes no cromossomo e plasmídeo pXAC64, respectivamente; são genes passageiros do TnXax1, um transposon da família Tn3, relacionado a evolução e emergência da patogenicidade nas Xanthomonadales. Portanto, este estudo objetivou elucidar o provável papel e diversidade das LTs presentes no genoma de XccA, caracterizando funcionalmente as LTs presentes em TnXax1 pela técnica de mutação sítio dirigida. Foram identificadas no genoma de XccA 13 LTs, sendo 12 pertencentes às famílias: 1A, 1B, 1C, 1D, 1F, 1G, 3A, 3B (2 cópias), 5A e 6A, e uma não classificada. A LT não classificada, é exclusiva do gênero Xanthomonas e relacionada à família 3B, porém contém um domínio adicional relacionado ao metabolismo de carboidratos. As LTs classificadas em famílias apresentam provável função relacionada com a remodelagem da parede celular para inserção de sistemas de secreção tipo 3, 4 e 6, inserção de flagelo, divisão celular, reciclagem da parede celular e degradação e controle da produção do peptidoglicano. As LTs do TnXax1 pertencem a família 3B, não são essenciais para XccA e desenvolvimento do CC, porém estão relacionadas ao aumento da virulência, diminuição da formação de biofilme, agregação e aumento na produção de goma xantana, corroborando o papel do TnXax1 como agente propagador da patogenicidade e virulência em Xanthomonadales. Em resumo, os resultados lançam novos conhecimentos frente ao papel das LTs com o metabolismo do peptidoglicano e relação com os mecanismos de transferência lateral, virulência e patogenicidade de XccA. / Xanthomonas citri subsp. citri 306 (XccA) is a causal agent of type A citrus canker (CC), one of the most devastating citriculture diseases. Type 3 Secretion Systems (T3SS) play a fundamental role in XccA pathogenicity. T3SS components are embedded in the bacterial inner and outer membrane and act as a channel for injection of effector proteins directly into the plant host cell cytosol. T3SS assembly and installation relies on bacterial cell wall synthesis, remodeling and degradation. Murein lytic transglycosylases (LT) are important in this process and are responsible for peptidoglycan cleavage and its remodeling. Information about the XccA LT arsenal is scarce: little is known about family diversity, their exact role and their connection to virulence in this bacterium. Among the LTs with probable relation to virulence, two paralogue ORFs (one in chromosome, one in pXAC64 plasmid) are passenger genes of the Tn3 family transposon TnXax1, known to play a significant role for evolution and emergence of pathogenicity in Xanthomonadales. This study addresses LT diversity in the XccA genome and examines the role of plasmid and chromosomal TnXax1 LT passenger genes using site-directed deletion mutagenesis and functional characterization. We identified 13 XccA LTs: 12 belong to families 1A, 1B, 1C, 1D (2 copies), 1F, 1G, 3A, 3B (2 copies), 5A, 6A and one which is non-categorized. This noncategorized gene, is exclusive to the Xanthomonas genus and related to the 3B family but contains an additional domain linked to carbohydrate metabolism, whilst the other catalyzes peptidoglycan biosynthesis, and is widely distributed in gammaproteobacteria. The categorized LTs are probably involved in cell wall remodeling to allow insertion of type 3, 4 and 6 secretion systems, flagellum assembly, division and recycling of cell wall and degradation and control of peptidoglycan production. The TnXax1 passenger LTs (3B family) are not essential to XccA and CC development but are implicated in virulence, biofilm production and aggregation decrease and xanthan gum production increase, corroborating the role of TnXax1 transposon as a virulence and pathogenicity propagating agent in XccA. These findings also suggest that LTs acquisition by horizontal gene transfer mediated by TnXax1 improved bacterial fitness, bringing adaptive advantages to the plant-pathogen interaction process. / 33004102070P6
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Patogênese da leptospirose: estudo sobre os fatores envolvidos na virulência e disseminação do agente durante a infecção no modelo animal de hamster / Patogênese da leptospirose: estudo sobre os fatores envolvidos na virulência e disseminação do agente durante a infecção no modelo animal de hamster

Wunder Júnior, Elsio Augusto January 2010 (has links)
Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-07-16T21:26:49Z No. of bitstreams: 1 Elsio Augusto Wunder Júnior Patogênese da leptospirose...pdf: 2609622 bytes, checksum: aa34c959355bc105a6e849e74258cf78 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-16T21:26:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Elsio Augusto Wunder Júnior Patogênese da leptospirose...pdf: 2609622 bytes, checksum: aa34c959355bc105a6e849e74258cf78 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A leptospirose é uma zoonose de importância global e um importante problema de saúde pública principalmente em países em desenvolvimento. É causada por bactérias do gênero Leptospira, uma espiroqueta móvel e de alta morbidade capaz de se disseminar nos tecidos e causar doença crônica em animais hospedeiros. Uma barreira importante para o controle e prevenção da doença tem sido o pouco conhecimento da patogênese do agente, em parte pela falta de ferramentas disponíveis e eficazes de manipulação genética. Um dos objetivos desse estudo foi caracterizar duas cepas mutantes de Leptospira interrogans. A interrupção do gene lipl32, que codifica para a proteína LipL32, a mais abundante proteína no gênero Leptospira e expressa somente na superfície das leptospiras patogênicas, foi realizada através da inserção do transposon Himar1 no sorovar Manilae. A cepa mutante não apresentou nenhuma diferença de crescimento ou de aderência em componentes da matriz celular, comparada com a cepa parental. O mutante foi capaz de produzir doença aguda no modelo animal de hamster e causar colonização crônica no modelo animal de rato, mostrando que LipL32 não possui um papel nestes modelos de infecção. A interrupção do gene ligB foi realizada com a utilização, pela primeira vez em leptospiras patogênicas, da técnica de recombinação homóloga por mutagênese dirigida, onde o gene que codifica para a proteína LigB teve uma parte substituída por um cassete de resistência de espectinomicina (Spcr). Essa proteína, identificada como um possível fator de virulência, reconhecida pelo soro de pacientes infectados e importante para a aderência em componentes da matriz celular, mostrou não ser importante para a infecção aguda ou crônica, quando testada frente aos modelos animais, além de não ser necessária para a aderência em cultura de células. Outro objetivo desse trabalho foi estudar a cinética de disseminação da Leptospira interrogans no modelo animal de hamster, utilizando uma dose alta (108 leptospiras) e baixa (250 leptospiras) de inóculo, além de diferentes rotas de infecção. Nossos resultados demonstraram que leptospiras se disseminam rapidamente em todos os tecidos 01 hora após a infecção com uma alta dose de inóculo e que possivelmente a carga do agente nos tecidos é mais importante para a patogênese do que a sua habilidade para a disseminação. Também demonstramos que a motilidade não é essencial para disseminação, mas pode ser essencial para a carga nos tecidos e letalidade. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis and a major public health problem especially important in developing countries. Caused by bacteria of Leptospira genus, a motile lifethreatening spirochete which is able to disseminate to tissues and causes chronic carriage in animal hosts. A significant barrier to the control and prevention of leptospirosis has been the limited understanding of its pathogenesis, due in part to the lack of tools available for the genetic manipulation of this pathogen. One of the purposes of this study was to characterize two mutant strains of Leptospira interrogans. Interruption of lipL32 gene, encoding LipL32, the most abundant protein of pathogenic leptospires and its major outermembrane lipoprotein, was achieved in serovar Manilae using transposon mutagenesis with Himar1. The mutant had normal morphology and growth rate compared to the wild type and was equally adherent to extracellular matrix. The mutant was able to cause acute severe disease manifestations in the hamster model and chronic colonization in the rat model, showing that LipL32 doesn’t play a role in neither of those models of infection. Interruption of ligB gene was achieved using the homologous recombination by target mutagenesis for the first time in pathogenic leptospires and a spectinomycin resistance (Spcr) gene replaced a portion of the ligB coding sequence. This Lig protein, previously identified as a putative virulence factor, recognized by the sera of infected patients and important for the adherence in extracellular matrix components, showed not to be important for acute or chronic infection when tested with animal models and it’s not required to mediate bacterial adherence to cultured cells. Another purpose of this study was to determine and analyze the kinetics of dissemination of Leptospira interrogans in the hamster model, using a high (108 leptospires) and low (250 leptospires) dose of inoculum and different routes of infection. Our results demonstrated that leptospires can rapidly disseminate through all tissues after 1 hour post-challenge with a high inoculum dose and that perhaps the load of the agent in target tissues is more important for pathogenesis than its ability for dissemination. We also demonstrate that motility is not essential for dissemination but can be essential for tissue load and lethality.
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Padronização da técnica de mutagênese marcada com assinatura para obtenção de mutantes de Escherichia coli patogênica aviária com virulência atenuada

Pavanelo, Daniel Brisotto January 2013 (has links)
Escherichia coli patogênica aviária (APEC) é o agente etiológico da colibacilose, doença que acomete galinhas, patos, perus e outras aves, principalmente entre a 2ª e a 12ª semana de vida. Existem diversos estudos sobre genes associados à virulência de APEC, mas eles ainda não são capazes de explicar todos os fenótipos de APEC. Portanto, outros genes associados à virulência – ainda não descritos – devem estar presentes em APEC. Para descobrir novos genes associados à virulência em APEC, uma cepa invasiva foi usada para a construção de uma biblioteca de 1.800 mutantes, através da técnica de mutagênese marcada com assinatura, que insere transposons aleatoriamente no genoma da bactéria. Os mutantes foram selecionados em um ensaio de invasão in vitro a fibroblastos aviários da linhagem CEC-32. A sequência dos transposons inseridos nos mutantes permite a identificação daqueles mutantes que não foram capazes de invadir os fibroblastos. Até agora, 11 de 20 pools de 90 mutantes cada foram analisados, e 48 mutantes parecem ter perdido a capacidade invasiva, ou seja, tiveram sua virulência atenuada. Os demais pools já foram selecionados e terão seu DNA analisado. Todos mutantes que possivelmente perderam sua capacidade invasiva serão testados novamente para confirmar seu fenótipo de virulência atenuada. Depois, a região contendo a sequência do transposon será sequenciada para que se descubra qual gene foi interrompido e é essencial para a virulência in vitro de APEC. Essa biblioteca de mutantes também pode ser testada em modelos de seleção in vivo, de modo que é possível identificar, através da análise dos mutantes ausentes na seleção, genes de virulência essenciais para APEC em diferentes condições. / Avian pathogenic E. coli (APEC) is the causative agent of colibacillosis, a disease that affects poultry and other birds, mainly between two and twelve weeks of age. There are many studies about virulence-associated genes in APEC, but they do not fully explain all the APEC phenotypes. Therefore, other virulence-associated genes – not yet described – must be present in APEC strains. In order to find out new virulence genes, we made 1,800 random-transposons mutants of an APEC invasive strain using the signature-tagged mutagenesis method. The mutants were selected using an in vitro invasion assay to fibroblast cells. The sequence of the inserted transposons allows us to identify mutants that have lost the capacity of invade the cells. Until now, we tested eleven out of twenty pools of ninety mutants each, and forty-eight mutants appeared to have lost the invasive capacity. The other nine pools will be analyzed, and all the possible non-invasive mutants will be tested again to confirm the phenotype. Then, they will have the transposon-inserted region sequenced in order to find out which gene has been disrupted and is essential to APEC in vitro invasiveness. The attenuated mutants can also be selected in vivo, so we would identify essential virulence genes to APEC under different conditions.
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A trealase periplasmática e o operon de metabolismo de β-glicosídeos afetam a virulência in vivo na cepa Escherichia coli patogênica extraintestinal MT78

Pavanelo, Daniel Brisotto January 2017 (has links)
Escherichia coli patogênicas extraintestinais (ExPEC) causam colibacilose aviária, infecções do trato urinário e meningite neonatal em humanos. A cepa ExPEC MT78 é virulenta in vitro e in vivo, e possui a habilidade de invadir células eucarióticas. Para melhor entender o fenótipo invasivo dessa cepa, foi criada uma biblioteca de mutantes aleatórios pela técnica de mutagênese marcada com assinatura, e os mutantes foram selecionados negativamente em ensaio de invasão a fibroblastos aviários. Mutantes atenuados apresentaram mutação em genes do operon da fímbria do tipo 1 e nos genes de metabolismo de açúcares treA e bglB. Foram feitos mutantes específicos para o gene que codifica a enzima trealase periplasmática (TreA) e para o operon de metabolismo de β-glicosídeos (bgl). O mutante MT78ΔtreA apresentou, frente à cepa selvagem, diminuição na capacidade de adesão e invasão a fibroblastos aviários, na expressão da fímbria do tipo 1 e na capacidade de colonizar a bexiga de camundongos em modelo de infecção urinária. O mutante MT78Δbgl também apresentou, frente à cepa selvagem, diminuição na capacidade de adesão e invasão a fibroblastos aviários e na capacidade de colonizar a bexiga de camundongos em modelo de infecção urinária, mas não mostrou alteração na expressão da fímbria do tipo 1, medida por aglutinação de leveduras. Os resultados deste trabalho mostraram que a trealase periplasmática afeta a expressão da fímbria do tipo 1 e a virulência in vivo da cepa ExPEC MT78, enquanto o operon do metabolismo de β-glicosídeos afeta a virulência in vivo da cepa ExPEC MT78 por um mecanismo ainda não-elucidado. / Extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC) cause colibacillosis in birds, urinary tract infections and neonatal meningitis in humans. The ExPEC strain MT78 is virulent in vitro and in vivo, and is able to invade eukaryotic cells. In order to better understand the invasive phenotype of this strain, a library of random mutants was made using the signature-tagged mutagenesis approach. The mutants were negatively selected in invasion assays of avian fibroblasts. Attenuated mutants presented mutation in the type 1 fimbria operon and in the genes of sugar metabolism treA and bglB. Specific mutants were created for the periplasmic trehalase (TreA) gene and for the β-glycosides metabolism operon (bgl). The MT78ΔtreA mutant displayed, in comparison with the wild type strain, a reduction on the capacity of adhesion and invasion to avian fibroblastos, on type 1 fimbriae expression and on the capacity to colonize the bladder in a murine model of urinary tract infection. The MT78Δbgl mutant, compared to the wild type strain, also displayed a reduction on the capacity of adhesion and invasion to avian fibroblastos and on the capacity to colonize the bladder in a murine model of urinary tract infection, but did not show any difference on type 1 fimbriae expression as detected by yeast agglutination. Taken together, our results show that the periplasmic trehalase affects type 1 expression and in vivo virulence of the ExPEC strain MT78, and the operon for β-glycosides metabolism affects in vivo virulence by an as yet unidentified mechanism.
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Interactions des protéines du complexe de transduction du signal transmembranaire CnrYXH chez Cupriavidus metallidurans CH34 / Interactions of the transmembrane signal transduction proteins complex CnrYXH from Cupriavidus metallidurans CH34

Ziani, Widade 18 December 2014 (has links)
Chez Cupriavidus metallidurans CH34, le complexe CnrYXH contribue à réguler l'expression des gènes de régulation et de résistance au cobalt et au nickel en fonction de la concentration environnementale de ces cations. La fixation de cobalt ou de nickel sur le domaine périplasmique senseur de CnrX induit des modifications conformationnelles à l'origine de la transduction du signal transmembranaire. Cela conduit à rendre le facteur sigma CnrH disponible pour sa liaison à l'ARN polymérase (ARNP) dans le cytoplasme. Le complexe CnrH:ARNP se fixe alors spécifiquement sur les promoteurs des gènes cnrY et cnrC pour initier la transcription des gènes de régulation (cnrYXH) et de résistance (cnrCBAT). Dans le but de déterminer la nature de ce signal, mon projet de thèse visait à cartographier les interactions protéine:protéine au sein du complexe CnrYXH dans les trois compartiments concernés : le périplasme, la membrane plasmique et le cytoplasme. La documentation des déterminants d'interaction entre CnrX, CnrY et CnrH a permis d'élaborer un modèle structural et fonctionnel pour le complexe CnrYXH et ses homologues soulevant des hypothèses nouvelles sur le fonctionnement du système Cnr. / The CnrYXH complex contributes to regulate the expression of the regulatory genes and resistance genes involved in cobalt and nickel resistance in Cupriavidus metallidurans CH34. The binding of nickel or cobalt to CnrX in the periplasm induces conformational modifications that could trigger transmembrane signal transduction. As a result, CnrH is made available in cytoplasm for binding to RNA polymerase. The CnrH:RNA polymerase complex binds specifically the cnr promoters and initiates transcription of both the regulatory genes (cnrYXH) and resistance genes (cnrCBAT). In order to delineate the mechanism of signal transduction through the membrane, I studied the interactions between the three partners in the different cellular compartments: periplasm, plasmic membrane and cytoplasm. The identification of the interaction determinants between CnrX, CnrY and CnrH allowed us to propose a structural and functional model for the CnrYXH complex and its homologues. This model brings up new hypothesis on the function of Cnr system.

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