A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença granulomatosa sistêmica, causada por Paracoccidioides spp., (P. brasiliensis e P. lutzii), geograficamente, limita-se a América Latina com as áreas endêmicas estendendo-se desde o México até a Argentina, constituindo uma das micoses sistêmicas de maior incidência na região, afetando principalmente trabalhadores rurais. O maior número de pacientes com PCM tem sido reportado principalmente no Brasil, Colômbia e Venezuela. A incidência real desta micose encontra-se subestimada no Brasil e pouco se conhece em relação a nova espécie descrita - P. lutzii. A maioria dos estudos em P. lutzii foram focados em genética, especiação e na geração de novos antígenos para melhorar a especificidade e sensibilidade dos testes sorológicos. Atualmente, as preparações antigênicas tradicionais, preparadas a partir de isolados de P. brasiliensis, são ineficientes. Raros são os trabalhos focados na biologia de P. lutzii e nos fatores de virulência que podem ser comparados com P. brasiliensis nos modelos experimentais. A nossa proposta de estudo foi avaliar alguns aspectos in vitro e in vivo relacionados com a patogenicidade e destacamos: a fagocitose e a morte intracelular de P. lutzii por macrófagos, peritoneais, de camundongos Knockouts (KO) e selvagens para PRRs (TLR2, TLR4 e Dectina) e ativadores intracelulares (MyD88 e NALP3). Paralelamente a este estudo, animais foram infectados com leveduras de P. lutzii e comparados com os modelos de infecção já estabelecidos com leveduras (Pb18) e conídios (ATCCPb60855) de P. brasiliensis. Nossos dados indicam que similar ao que ocorre com P. brasiliensis a fagocitose de P. lutzii depende de TLR2, TLR4 e Dectina- 1, resultados semelhantes também foram observadas na expressão de moléculas envolvidas na co-estimulação e a apresentação de antígenos (MHC II, CD80 e CD86). Contudo, a morte intracelular de leveduras de P. lutzii é claramente dependente de TLR4, e a produção de citocinas IL-6, MIP-2, IFN- e IL-12p40 são importantes para o controle das leveduras pelos macrófagos. No modelo experimental de P. lutzii, camundongos machos C57BL/6 (6-7 semanas) foram infectados intratraquealmente como 1x106 leveduras viáveis do isolado de P. lutzii Pb01. Encontramos duas fases da doença, a primeira de 0 hora até 2 a 4 semanas pós-infecção, e a segunda de 4 até 12 semanas. As leveduras parecem ser contidas na primeira semana de infecção e posteriormente não encontramos leveduras nos macerados de pulmão, diferente do modelo de BALB/c infetado com conídios de ATCC-Pb60855 no qual as UFC são recuperadas até a semana 16 pós-infeção. Como relação aos níveis de citocinas, encontramos que na lavagem broncoalveolar e macerado de pulmão um perfil misto Th1/Th2 porém, marcado por citocinas próinflamatórias no primeiro período e citocinas regulatórias tipo Th2 no segundo período (IL-12p70, IL-23, IL-10); similar ao descrito nos modelos de P. brasiliensis infectados tanto com conídios como com leveduras. No entanto, no primeiro período da doença, em camundongos C57BL/6, parece ter uma carga inflamatória maior que reflete nas citocinas que mantém seus níveis até o período crônico: TNF-alfa, MIP-2 e GM-CSF está última, regulada positivamente tanto em experimentos in vitro como in vivo. Também observamos que a partir das 48horas pós-infecção encontramos níveis aumentados de IL-12p70 até o período crônico onde junto com a IL-23 parecem ser as responsáveis pela diminuição da infecção no período tárdio. Esta é a primeira vez que se descreve um modelo experimental com P. lutzii (isolado Pb01) indicando o perfil imunopatológico com pequenas diferenças comparados ao P. brasiliensis porém, de importância na patogenicidade da doença auxiliando a compreender as diferentes formas da doença no modelo experimental / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease caused by Paracoccidioides spp. (P. brasiliensis and P. lutzii), geographically, is limited to Latin America with endemic areas from Mexico to Argentina, as one of the systemic mycoses with the highest incidence in the region, mainly affecting rural workers. The largest number of patients with PCM has been mainly reported in Brazil, Colombia and Venezuela. The true incidence of this mycosis is underestimated in Brazil and little is known about the new species described - P. lutzii. Most studies in P. lutzii were focused on genetics, speciation and the generation of new antigens to improve the specificity and sensitivity of serological tests. Currently, traditional antigenic preparations, prepared with isolates of P. brasiliensis, are inefficient. There are few studies focused on P. lutzii biology and virulence factors that can be compared with P. brasiliensis in experimental models. Our study aimed to evaluate some in vitro and in vivo aspects related to pathogenicity: phagocytosis and intracellular killing of P. lutzii by peritoneal macrophages from knockouts (KO) for PRRs (TLR2, TLR4 and Dectin) and intracellular activators (MyD88 and NALP3). In addition, animals were infected with P. lutzii yeast and compared with the well-established models of infection with yeast cells (Pb18) and conidia (ATCC Pb60855) from P. brasiliensis. Our data indicate that similarly to what happens with the phagocytosis of P. brasiliensis, P. lutzii phagocytosis is dependent on TLR2, TLR4 and Dectin-1. Other molecules, involved in co-stimulation and presentation of antigens such as MHC II, CD80 and CD86 were also shown to participate in the P. lutzii-host interaction. However, intracellular killing of P. lutzii yeast cells was clearly dependent on TLR4, and the production of cytokines as IL-6, MIP-2, IFN- and IL-12p40 were important for the control of the yeast by macrophages. In the experimental model of P. lutzii, male C57BL/6 mice (6-7 weeks) were infected intratracheally with 1x106 viable yeasts of the isolate Pb01like. We found two phases of the disease, the first from the inoculation to 2 or 4 weeks after infection and the second from 4 to 12 weeks. Yeast appear to be contained within the first week of infection and subsequently are also absent from macerated lung, differently from the model of BALB/c mice infected with ATCC Pb60855 conidia in which CFUs were detected up to week 16 post-infection. We found a mixed Th1/Th2 pattern (IL-12p70, IL-23, IL-10) in bronchoalveolar lavage and lung, with the predominance of proinflammatory cytokines in the first phase and predominance of regulatory Th2 cytokines in the second phase, reproducing findings of P. brasiliensis infection models produced with both conidia and yeast. However, in the first period of the disease in C57BL/6 mice there was a higher inflammatory burden, reflected by the high cytokine levels (TNF-alpha, MIP-2 and GM-CSF), the latter in particular because it was positively regulated both in vitro and vivo), that persisted through the chronic period. We also observed that starting from 48 hours postinfection to the chronic period there were increased levels of IL-12p70, which together with IL-23 appeared to be responsible for the reduction of infection in the late period. This is the first time that an experimental model with P. lutzii (Pb01) is described, showing an immunological profile with only slight differences compared to the P. brasiliensis model. The present study details important aspects of the pathogenesis of the disease due to different species of Paracoccidioides and helps to understand the different forms of presentation in experimental models

Para investigar o papel dos linfócitos T no modelo de Paracoccidioidomicose pulmonar, depletamos in vivo os linfócitos TCD4+ e TCD8+ de camundongos resistentes (A/J) e susceptíveis (B10.A) infectados intratraquealmerite com um milhão de leveduras de isolado virulento do Paracoccidioides brasiliensis. Quando comparados ao grupo não depletado de linfócitos TCD4+, após 4 semanas de infecção, camundongos A/J apresentaram aumento da disseminação de leveduras ao fígado; na 8ª semana, contudo, houve redução na carga fúngica pulmonar destes animais. Ao contrário, a depleção de células TCD4+ não alterou a gravidade da doença de animais B10.A em ambos os períodos de infecção. O tratamento com o AcM anti-CD4, em ambos os tempos de infecção, diminuiu as reações de HTT dos animais A/J, mas não alterou a anergia cutânea dos camundongos B10.A. Em adição, ambas as linhagens depletadas tiveram a produção específica de anticorpos diminuída na 4ª e 8ª semanas. Quanto às citocinas pulmonares, após 4 semanas de infecção, os animais A/J depletados apresentaram redução nos níveis de IL-12 pulmonar e na 8ª semana da infecção, esta linhagem apresentou redução nos níveis de IL-10, IL-4, IL-5,IL-2 e GM-CSF pulmonar, e os animais B10.A mostraram aumento nos níveis de IL-12. Por outro lado, verificamos que ambas as linhagens depletadas com o AcM anti-CD8, apresentaram aumento da gravidade da doença após a semanas de infecção, pois camundongos A/J tratados apresentaram aumento da carga fúngica pulmonar, e animais B10.A apresentaram aumento do crescimento fúngico no pulmão e fígado. Animais B10.A depletados de células TCD8+ apresentaram ainda um incremento nas suas reações de HTT específicas. Esses dados sugerem que na linhagem susceptível há a presença de duas subpopulações celulares de TCD8+, uma subpopulação protetora que controla o crescimento fúngico e outra inibidora de reações de HTT. A depleção dos linfócitos TCD8+ não levou a grandes alterações na produção de anticorpos específicos em ambas as linhagens; no entanto, levou a alterações significativas nos níveis das citocinas pulmonares; os animais A/J apresentaram aumento de IL-4, IL-12, IL-3 e GM-CSF, e diminuição de IL-2. Por outro lado, os animais B10.A apresentaram aumento nos níveis de IL-10, IL-12, IL-3 e IFN-γ. Estes resultados demonstraram que nos animais B10.A as células TCD4+ têm pouca ou nenhuma participação no controle da infecção. No entanto, nos animais A/J há duas subpopulações, uma protetora (4ª semana) e outra exacerbadora (8ª semana) dependendo do estágio da doença. Contudo, em ambas as linhagens a subpopulação TCD8+ apresentou-se importante no controle da doença. Além disso, na PCM experimental, tanto as respostas de HTT como a produção de anticorpos específicos, são mecanismos que dependem de células TCD4+ e na linhagem B10.A há uma subpopulação TCD8+ que regula negativamente as reações de HTT. / To investigate the role of T lymphocytes in the pulmonary model of Paracoccidioidomycosis (PCM), resistant and susceptible mice were in vivo depleted of T CD4+ and T CD8+ cells by intraperitoneal injection of specific monoclonal (mAb) antibodies and infected intratracheally with one million yeast cells of a virulent isolate of Paracoccidioides brasiliensis. When compared with the non-depleted group, at week 4 after infection A/J mice presented increased dissemination of yeasts to liver; however, at week 8 A/J-depleted mice showed decreased fungal loads in the lungs. In contrast, depletion of TCD4+ cells of B10.A mice did not alter the severity of disease at any periods of infection assayed. Treatment with anti-CD4 mAb diminished the delayed-type hypersensitivity reactions (DTH) of resistant mice but the cutaneous anergy of B10.A mice was not modified. In addition, CD4-depleted A/Sn and B10.A mice presented decreased titers of P.brasiliensis specific antibodies at both the 4th and 8th week postinfection. Regarding pulmonary cytokines, at week 4 of infection A/J-depleted mice presented diminished levels of IL-12 but at week 8 IL-10, IL-4, IL-S, IL-2 and GM-CSF appeared in lower levels. Only IL-12 was detected in lower levels in the lungs of B10.A-depleted mice at week 8 after infection. Depletion of CD8+ cells led to a more severe disease in both mouse strains. A/J-treated mice presented increased fungal burdens in the lungs whereas in the B10.A strain increased number of yeast cells was detected in the lungs and liver. Importantly, neutralization of CD8+ cells reverted the DTH anergy of susceptible mice. These data suggest the existence of two T CD8+ subpopulations in B10.A mice, a protective that controls fungal growth and another one that suppresses DTH reactions. The production of P.brasiliensis specific antibodies by resistant and susceptible mice depleted of CD8+ T cells was similar to that of mice given control antibody. Neutralization of CD8+ cells, however, induced significant alterations in the concentrations of pulmonary cytokines. In A/J-treated mice, higher levels of IL-4, IL-12, IL-3 and GM-CSF were concomitant with reduced amounts of IL-2. B10.A mice depleted of CD8+ cells presented higher levels of pulmonary IL-10, IL-12, IL-3 and IFN-γ than their controls. As a whole, our results demonstrate that CD4+ T cells have no influence on the control of disease severity of B10.A mice. Depending on the period of the infection, A/J mice develop two subpopulations of CD4+ T cells: one protective subset which appeared early in the infection, followed by a subpopulation that lead to disease exacerbation. Moreover, in both mouse strains CD8+ T cells are protective and able to control fungal growth. It was also verified that DTH reactions and antibody production in murine PCM are CD4+ T cells mediated. Finally, only in B10.A mice a regulatory CD8+ T cell subpopulation was characterized by its ability to suppress DTH reactions

The trimorphic fungus Candida albicans is the leading cause of systemic candidiasis, a disease with poor prognosis affecting immunocompromised patients. The capacity to switch between growth morphologies is tightly coupled to its ability to cause life-threatening infection. Recently, the molecular chaperone Heat Shock Protein 90 (Hsp90) has been implicated as a major regulator of C. albicans morphogenesis via the Ras1-PKA pathway. In model organisms from plant, animal and fungal kingdoms, Hsp90 stabilizes regulators of cell signaling and participates in many important cellular processes. Hsp90’s roles in C. albicans are beginning to be dissected. This thesis represents a comprehensive overview of the morphological response of C. albicans to compromised Hsp90 function, illuminating previously unidentified roles for this chaperone in cell cycle progression, cytokinesis and vacuole maintenance. This work sheds light on the importance of Hsp90 in fungal development and the therapeutic potential of Hsp90 inhibitors in the treatment of fungal infections.

The trimorphic fungus Candida albicans is the leading cause of systemic candidiasis, a disease with poor prognosis affecting immunocompromised patients. The capacity to switch between growth morphologies is tightly coupled to its ability to cause life-threatening infection. Recently, the molecular chaperone Heat Shock Protein 90 (Hsp90) has been implicated as a major regulator of C. albicans morphogenesis via the Ras1-PKA pathway. In model organisms from plant, animal and fungal kingdoms, Hsp90 stabilizes regulators of cell signaling and participates in many important cellular processes. Hsp90’s roles in C. albicans are beginning to be dissected. This thesis represents a comprehensive overview of the morphological response of C. albicans to compromised Hsp90 function, illuminating previously unidentified roles for this chaperone in cell cycle progression, cytokinesis and vacuole maintenance. This work sheds light on the importance of Hsp90 in fungal development and the therapeutic potential of Hsp90 inhibitors in the treatment of fungal infections.

Saccharomyces cerevisiae is an excellent experimental model organism to study various biological processes owing to its versatile genetics, biochemistry, and standard laboratory conditions. S. cerevisiae shows distinct biological responses under nutritional starvation conditions. S. cerevisiae undergoes dimorphic transition from a unicellular yeast form to a multicellular pseudohyphae (Gimeno et al., 1992) under nitrogen starvation, but in the complete absence of a fermentable carbon source, it undergoes gametogenesis called sporulation (Mitchell, 1994). While the signal transduction cascades and regulatory controls under nutritional starvation conditions are studied to great extent, the role of S. cerevisiae core RNA polymerase II (pol II) is not much understood. S. cerevisiae core RNA pol II consists of 12 subunits (Woychik and Hampsey, 2002), which is organized into a ten-subunit core and the Rpb4/7 subcomplex (Edwards et al., 1991). Rpb4/7 subcomplex is known to play important roles in stress survival (Choder 2004; Sampath and Sadhale, 2005.). S. cerevisiae rpb4 null diploid strains show reduced sporulation levels but exhibits a predisposition to pseudohyphal morphology (Pillai et al., 2003). Overexpression of Rpb7 partially rescues some of these defects (Sharma et al., 1999; Sheffer et al., 2001). Rpb7 is a highly conserved protein but Rpb4 is the least conserved amongst all RNA pol II subunits at the sequence level. Rpb4 and Rpb7 also affect different cellular functions, which are not directly dependent on each other. (a) Relative levels of RNA pol II subunits Rpb4 and Rpb7 differentially affect starvation response in Saccharomyces cerevisiae S. cerevisiae rpb4 null diploid strains show reduced sporulation levels as compared to wild type but exhibits pseudohyphal predisposition. Overexpression of RPB7 partially rescues the sporulation defect but results in an exaggeration of the pseudohyphae phenotype. We generated S. cerevisiae strains expressing different levels of Rpb4 and Rpb7 proteins in the same strains and analyzed their effect on sporulation and pseudohyphal morphology. We observed that sporulation is dependent on Rpb4 because sporulation level gradually increases with an increase in the Rpb4 protein level in the strain. Rpb7 reduces sporulation level but enhances pseudohyphal exaggeration in a dose-dependent manner. Rpb4 is dominant over Rpb7 in both the starvation responses because strain expressing an equimolar ratio of Rpb4 and Rpb7 protein exhibits RPB4+ phenotypes. (b) Domainal organization of Saccharomyces cerevisiae Rpb7 orthologs reflects functional conservation Rpb7 orthologs are known in eukaryotes and archaebacteria. The primary structure of Rpb7 is conserved. We chose Rpb7 orthologs from Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe and Homo sapiens sapiens to investigate whether Rpb7 orthologs are also functionally conserved. We observed that all the orthologs tested are functionally conserved because they can complement the absence of RPB7 in S. cerevisiae. However, we uncovered functional differences amongst Rpb7 orthologs with respect to its function in rpb4 null strain and ess1 ts strain. Furthermore, we made N and C-terminal chimeric RPB7 constructs from these orthologs with S. cerevisiae Rpb7. These chimeras also can replace ScRpb7 in S. cerevisiae. However, functional differences were observed with each chimera pair in rpb4 null strain and ess1 ts strain, showing that the N and C-terminal domains of Rpb7 protein can be genetically dissected. The genetic observation on the domainal organization of Rpb7 orthologs is strengthened by the crystal structure of Rpb7 (Armache et al., 2005), which shows that Rpb7 is structurally organized into an N terminal RNP domain and a C terminal OB fold domain. (c) The Rpb7 subunit of Candida albicans RNA polymerase II induces lectin-mediated flocculation in Saccharomyces cerevisiae The Rpb7 ortholog of C. albicans is a conserved functional ortholog of ScRpb7. We observed that CaRpb7 induces Ca2+-dependent flocculation and agar-invasive growth in S. cerevisiae. CaRpb7 overexpression induces very high transcript levels of FLO1 and FLO11. We believe that the observed flocculation and agar-invasive phenotypes are due to Flo1 and Flo11 respectively, because Flo1 and Flo11 contribute mainly to cell-cell adhesion while Flo11 contributes mainly to cell-substrate adhesion (Verstrepen and Klis, 2006; Lo et al., 1998; Guo et al., 2000). Pathway analysis revealed that CaRpb7-induced flocculation is dependent on Mss11 transcriptional activator. Two-hybrid analysis revealed that CaRpb7 does not physically interact with transcriptional repressors known to repress FLO gene transcription, however genetic analysis revealed that CaRpb7 is epistatic to the repressor Sfl1. Rpb7 orthologs possess conserved domains with potential RNA binding ability (Orlicky et al., 1999) and ScRpb7 is known to play in mRNA stability (Lotan et al., 2007). The possibility of CaRpb7 specifically affecting the stability of FLO gene transcripts is being pursued.

published_or_final_version / Ecology and Biodiversity / Doctoral / Doctor of Philosophy

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica de homem e animais, causada pela implantação traumática do patógeno e que normalmente envolve a derme e o tecido subcutâneo. Desde 1898, quando o agente etiológico esporotricose foi descoberto por Schenck, esta doença tem sido atribuída a um único patógeno, Sporothrix schenckii Hektoen & Perkins, um fungo termodimórfico, que cresce como levedura a 37 º C e como micélio à temperatura ambiente. No entanto, os isolados identificados como S. schenckii demonstraram uma grande variabilidade genética, sugerindo que este táxon consiste em um complexo de espécies crípticas. Com base nesta informação o nosso grupo está interessado no estudo da taxonomia polifásica deste complexo de espécies e suas implicações sobre a eco-epidemiologia da doença no Brasil. Foram estudadas 161 cepas de Sporothrix spp. provenientes de amostras clínicas e ambientais de diversas regiões do Brasil e outros países. Os parâmetros fenotípicos analisados levaram em consideração o crescimento vegetativo em meio PDA sob diferentes temperaturas (30, 35, 37 e 40 º C), a coloração da colônia em meio CMA, o padrão de assimilação de fontes de carbono (glicose, ribitol, rafinose e sacarose) e as características micro morfológicas in vitro. Os dados fenotípicos foram confirmados por biologia molecular utilizando as informações de sequenciamento de DNA de um fragmento do lócus calmodulina. Nossos dados mostram que S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana e S. schenckii tem uma ampla distribuição geográfica no Brasil. Para o nosso conhecimento, esta é a primeira descrição na literatura da espécie S. mexicana fora do México, e provocando doença em hospedeiro humano. S. brasiliensis foi isolado com alta frequência de gatos nos estados do Rio Grande do Sul e Rio de Janeiro, sugerindo que este animal tem sido um importante vetor na epidemiologia desta espécie. Uma abordagem proteômica foi proposta neste trabalho para comparar o perfil protéico de isolados de Sporothrix spp. com o intuito de entendermos as diferenças em termos de expressão de proteína entre as espécies crípticas. Os perfis 2-D foram fortemente diferentes entre os isolados. Para elucidar o principal antígeno da esporotricose humana, o fungo foi cultivado em meio BHI caldo, 37 °C e as proteínas intracelulares foram fracionadas por eletroforese bidimensional. As proteínas foram transferidas para uma membrana e, em seguida, incubadas com soro de pacientes com as duas principais formas clínicas da doença (cutânea fixa e linfocutânea). Nossos resultados demonstram que anticorpos IgG presentes no soro de pacientes reagem com diferentes antígenos dos isolados do complexo Sporothrix schenckii. O imunoblot mostrou que existem imunoglobulinas que reagem com um antígeno de 70 kDa em três isolados (S. brasiliensis, S. globosa e S. schenckii). Diferenças no perfil de antigenicidade foram observadas entre S. mexicana e as demais espécies aqui avaliadas. / Sporotrichosis is a chronic mycotic infectious disease of man and animals caused by the traumatic implantation of a pathogenic fungus that typically involves the skin and subcutaneous tissue. Since 1898, when the sporotrichosis etiological agent was discovered by Schenck, this disease has been attributed to a single pathogen, Sporothrix schenckii Hektoen & Perkins, a thermo dimorphic fungus that grow as a yeast at 37 ºC and as a mycelium at room temperature. However, isolates identified as S. schenckii showed a great deal of genetic variability, suggesting that this taxon consist in a cryptic species complex. Based on this information our group is interested in the study of the polyphasic taxonomy of this species complex and its implication on its ecoepidemiology in Brazil. We studied 161 strains of Sporothrix spp. provided from environmental and clinical samples obtained from diverse regions of Brazil and other countries. The phenotypic parameters assayed include vegetative growth on PDA media at different temperatures (30, 35, 37 and 40 ºC), the colony colors on CMA media, the assimilation pattern of carbon sources (raffinose, ribitol and sucrose) and morphological microscopic features of in vitro cultivation. The phenotypic data were confirmed by molecular biology using the sequencing information of a fragment of calmodulin locus. Our data show that the S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana and S. schenckii have a widespread geographical distribution in Brazil. To our knowledgement this is the first description of the specie S. mexicana outside of Mexico and causing disease in human host. S. brasiliensis was isolated with high frequency from cats in Rio Grande do Sul and Rio de Janeiro states, suggesting that cats has been an important vector in epidemiology of this specie. A proteomic approach was proposed in this work to compare protein profile of Sporothrix spp. isolates and get a better understanding about the differences in terms of protein expression among the cryptic species. The 2-D profiles were strongly different among the isolates. To elucidate the major antigen of human sporotrichosis, the fungus was cultured in BHI broth, 37 °C, and intracellular proteins were resolved by 2-DE. Proteins were transferred to a nitrocellulose membrane and then incubated with serum from patients with the two major clinical form of disease (cutaneous fixed and linfocutaneous). Our results show that IgG present in serum from patients react with different antigens from Sporothrix schenckii complex. Immunoblotting showed that the sera of patients had antibodies reacting with a 70 kDa antigen in three isolates (S. brasiliensis, S. globosa and S. schenckii). Profile differences in antigenicity were observed between S. mexicana and the other species studied here. / FAPESP: 2008/55975-8 / TEDE

Investigações foram realizadas com fermentação submersa de Rhizopus arrhizus para produção de biomassa e dos co-polímeros quitina e quitosana, através do cultivo em meio sintético para Mucorales e milhocina, como substrato alternativo. Neste sentido, foram realizadas fermentações em frascos de Erlenmyers de 250 mL de capacidade, contendo 50 mL dos meios, foram inoculados em duplicatas com 1% de uma suspensão de 107/esporos por mL, incubados sob agitação orbital de 150rpm. A cada 24 h foram realizados conteúdo em biomassa, consumo de glicose, além da estimação e caracterização de quitina e quitosana e o pH foi monitorado no decorrer dos estudos (96h). Os dados obtidos foram validados utilizando uma análise por regressão não linear, visando explorar o potencial e versatilidade dos mucorales na produção dos co-polímeros. Os resultados obtidos com o meio sintético para Mucorales demonstraram um aumento máximo de biomassa com 72 h de cultivo submerso. A glicose foi totalmente consumida pelo metabolismo do fungo com 96h, com pH 3,2 e conseqüente estágio de declínio celular. A produção máxima de quitina e de quitosana por R. arrhizus foi de 73,5 mg e 158 mg, respectivamente, por grama de biomassa em 48 h de cultivo, com velocidade máxima de crescimento de Max 0,036(h-1)e tempo de geração de 4,6 h. Por outro lado, o cultivo submerso de R. arrhizus em milhocina, nas concentrações de 4,8 e 16%, como meio alternativo e de baixo custo, demonstrou crescimento máximo de 16,8 g/L, na concentração de 8% de milhocina, observando-se Max 0,064(h-1. Altos rendimentos de quitina (575mg/g de biomassa) e quitosana (416 mg/g de biomassa) foram obtidos com milhocina a 8%, com 72 h de cultivo, respectivamente, e pH variando de 6,5 para 8,2. Todos os copolímeros isolados foram caracterizados pelo índice de cristalinidade e espectro de absorção ao raio infravermelho, confirmando um alto grau de pureza quando comparados aos padrões de quitina e quitosana. Os dados obtidos experimentalmente de produção de quitina e quitosana foram validados pela estimativa de regressão não linear, demonstrando um bom ajuste das equações e reprodutibilidade. Os resultados com a fermentação submersa de R. arrhizus comparando milhocina a 8% com o meio sintético para Mucorales observou-se um aumento considerável de 782% e 263%, respectivamente, para a produção de quitina e quitosana. Assim, os resultados obtidos sugerem R. arrhizus como fonte de produção dos co-polímeros, como também a milhocina, considerando o potencial nutritivo e o baixo custo / Inquiries had been carried out with submerged fermentation of Rhizopus arrhizus for production of biomass and copolymers chitin and chitosan, using the culture in synthetic medium for Mucoralean and corn steep liquor, as alternative substratum. In this direction, fermentations in Erlenmyers flasks of 250mL had been carried out, contend 50 mL of the media had been inoculated in duplicates with 1% of a suspension of 107/spores/mL, incubated under orbital shaker of 150rpm. To each 24 h had been carried out the content in biomass, glucose consumption, production and characterization of chitin and chitosan, and pH was monitored in elapsing of the studies (96h). The dates had been validated using an analysis for not linear regression, aiming at to explore the potential and versatility of Mucoralean in the production of copolymers. The results obtained with the synthetic medium for Mucoralean had demonstrated a maximum increase of biomass at 72 h of submerged culture. The total of glucose total was consumed by the metabolism of fungus at 96h, with pH 3,2 and consequence period of behavior of cellular decline. The maximum production of chitin and chitosan was 73.5mg and 158 mg, respectively, for gram of biomass with 48 h of cultivation, and maximum speed of growth of Max 0.036 (h-1) and generation time of 4.6h. On the other hand, the submerged culture of R. arrhizus in corn steep liquor, concentrations of 4, 8 and 16%, as alternative medium and of low cost showed maximum growth of 16.8 g/L, in the concentration of 8% of corn steep liquor, observing a Max 0.064h-1. High yields of chitin (575 mg/g biomass) and chitosan (416mg/g biomass) could be achieved using the medium containing corn steep liquor at 8%, with 72 h of cultivation, respectively, and pH varying of 6.5 to 8.2. All the isolated copolym rs in both culture media were characterized by index of crystallinity and absorption to the infra-red ray peaks, and were confirmed using the chitin and chitosan standards. The experimental data obtained with chitin and chitosan were validated by the estimation of not linear regression, demonstrating to a good adjustment of the equations and reproducibility. The results with the submerged fermentation of R. arrhizus were compared corn steep liquor at 8% with synthetic medium for Mucoralean fungi, and was observed an increase of 782% and 263% respectively, for chitin and chitosan production. The results obtained suggest R. arrhizus as source of production of the copolymers and as well as the corn steep liquor, considering the nutritional potential and the low cost

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:37:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4648060 bytes, checksum: 02f10a0cc1d0bf768aa16e7168f46ef9 (MD5) Previous issue date: 2010-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Nowadays, Brazil is the largest producer of papaya and the third largest exporter of fruit in the world. Papaya can be affected by various diseases that prevent them from being marketed and, consequently, the exportation of the fruit. Among the fungal diseases, smallpox, or blight, caused by Asperisporium caricae, is one of the diseases that affect the orchards in all regions. This disease interferes directly in the profitability and viability of the production. Beyond its incidence on leaves, it can also cause lesions on the fruit surface, making them unsuitable for marketing. It s almost impossible to find publications related to the biology of the fungus and to the phylogenetic position of the species. A. caricae is considered by many authors as a biotrophic pathogen, based on the difficulty of cultivation and sporulation in vitro. Some aspects of the taxonomic genus Asperisporium are controversial, such as proving Mycosphaerella as a teleomorph organism, the phylogenetic relationships with other genera of the complex cercosporoidal and the separation of the genus Asperisporium from Passalora. Other authors relate M. caricae to the anamorph Phoma caricae-papaya (= Ascochyta caricapapaya), causal agent of stalk rot. However, through the manual identification the genera Phoma and Ascochyta are related to the teleomorph Didymella. The differences between the genders Didymella and Mycosphaerella is the presence of pseudo paraphyses in the last one. This feature is difficult to visualize in histological sections under a light microscope, thus being liable to misunderstand at the time of identification. The aims of the study were the isolation of A. caricae in pure culture, examining the growth and sporulation of the isolates in seven different media and make a morphological characterization of isolates. Beyond these, other aim was to verify the relationship between Asperisporium caricae and Mycosphaerella caricae by comparing nucleotides of three DNA regions (ITS rDNA, LSU and mtSSU) and the phylogenetic relationships with other genera of the complex cercosporoidal, by comparing the sequences obtained to sequences published in databases. It was possible to cultivate A. caricae in all tested media. The culture medium potato dextrose agar, supplemented or not with amino acids, were those who presented the best source to the fungus. Moreover, the species produced spores in vitro in all tested media, except in the medium consisting of papaya leaves. Through the molecular data and clusters obtained, it can be concluded that A. caricae belongs to the family Mycosphaerellaceae grouping it with species of true Passalora and Mycosphaerella. M. caricae was grouped with species of the genus Phoma, Ascochyta and Didymella, representatives of the order Pleosporales. Thus, it is possible that M. caricae is a species of Didymella and teleomorph of Phoma carica-papaya. / O Brasil é o maior produtor mundial de mamão e o terceiro maior exportador da fruta. O mamoeiro pode ser afetado por diversas doenças que inviabilizam a sua comercialização e, consequentemente, a exportações de frutos. Dentre as doenças fúngicas, a varíola, ou pinta preta, causada por Asperisporium caricae, é uma das doenças que afetam os pomares em todas as regiões produtoras. Interfere diretamente na rentabilidade e viabilidade da produção, pois, além de incidir em folhas, pode também causar lesões na superfície dos frutos, tornando-os inadequados para a comercialização. Trabalhos referentes à biologia do fungo são quase inexistentes, bem como sobre o posicionamento filogenético da espécie. A. caricae é considerado por muitos autores como biotrófico, baseado na dificuldade de cultivo e esporulação in vitro. Alguns aspectos taxonômicos do gênero Asperisporium são controversos, como a comprovação de Mycosphaerella como teleomorfo, o relacionamento filogenético com os demais gêneros do complexo cercosporóide e a separação de Asperisporium do gênero Passalora. Outros autores relacionam M. caricae ao anamorfo Phoma caricae-papaya (=Ascochyta caricae-papayae), agente etiológico da podridão peduncular. Contudo, por meio dos manuais de identificação os gêneros Phoma e Ascochyta estão relacionados ao teleomorfo Didymella. A distinção entre os gêneros Didymella e Mycosphaerella está na presença de pseudoparáfises neste último, sendo esta característica dificilmente visualizada em cortes histológicos em microscópio de luz, deste modo, sendo passível o equívoco no momento da identificação. Os objetivos do trabalho foram: realizar o isolamento de A. caricae em cultura pura, analisar o crescimento e a capacidade de esporulação dos isolados em sete diferentes meios de cultura e proceder a caracterização morfológica dos isolados; verificar a relação entre Asperisporium caricae e Mycosphaerella caricae por meio da comparação de nucleotídeos de três regiões do DNA (ITS do rDNA, LSU e mtSSU), assim como o relacionamento filogenético com os demais gêneros pertencentes ao complexo cercosporóide, por meio da comparação das sequências obtidas com as sequências publicadas em bancos de dados. Foi possível o cultivo de A. caricae em todos os meios de cultura testados, sendo que os meios de cultura batata-dextrose-ágar, suplementado ou não com aminoácidos, foram os que proporcionaram melhor desenvolvimento ao fungo. Além disso, a espécie produziu esporos in vitro em todos os meios de cultura testados, exceto no meio composto por folhas de mamão. Por meio dos dados moleculares e dos agrupamentos obtidos, pode-se concluir que A. caricae pertence à família Mycosphaerellaceae, agrupando com espécies de Passalora verdadeiras e de Mycosphaerella. M. caricae agrupou-se com espécies pertencentes ao gênero Phoma, Didymella e Ascochyta, representantes da ordem Pleosporales. Com isso, é possível que M. caricae seja uma espécie de Didymella, e teleomorfo de Phoma caricae-papayae.

Para investigar o papel dos linfócitos T no modelo de Paracoccidioidomicose pulmonar, depletamos in vivo os linfócitos TCD4+ e TCD8+ de camundongos resistentes (A/J) e susceptíveis (B10.A) infectados intratraquealmerite com um milhão de leveduras de isolado virulento do Paracoccidioides brasiliensis. Quando comparados ao grupo não depletado de linfócitos TCD4+, após 4 semanas de infecção, camundongos A/J apresentaram aumento da disseminação de leveduras ao fígado; na 8ª semana, contudo, houve redução na carga fúngica pulmonar destes animais. Ao contrário, a depleção de células TCD4+ não alterou a gravidade da doença de animais B10.A em ambos os períodos de infecção. O tratamento com o AcM anti-CD4, em ambos os tempos de infecção, diminuiu as reações de HTT dos animais A/J, mas não alterou a anergia cutânea dos camundongos B10.A. Em adição, ambas as linhagens depletadas tiveram a produção específica de anticorpos diminuída na 4ª e 8ª semanas. Quanto às citocinas pulmonares, após 4 semanas de infecção, os animais A/J depletados apresentaram redução nos níveis de IL-12 pulmonar e na 8ª semana da infecção, esta linhagem apresentou redução nos níveis de IL-10, IL-4, IL-5,IL-2 e GM-CSF pulmonar, e os animais B10.A mostraram aumento nos níveis de IL-12. Por outro lado, verificamos que ambas as linhagens depletadas com o AcM anti-CD8, apresentaram aumento da gravidade da doença após a semanas de infecção, pois camundongos A/J tratados apresentaram aumento da carga fúngica pulmonar, e animais B10.A apresentaram aumento do crescimento fúngico no pulmão e fígado. Animais B10.A depletados de células TCD8+ apresentaram ainda um incremento nas suas reações de HTT específicas. Esses dados sugerem que na linhagem susceptível há a presença de duas subpopulações celulares de TCD8+, uma subpopulação protetora que controla o crescimento fúngico e outra inibidora de reações de HTT. A depleção dos linfócitos TCD8+ não levou a grandes alterações na produção de anticorpos específicos em ambas as linhagens; no entanto, levou a alterações significativas nos níveis das citocinas pulmonares; os animais A/J apresentaram aumento de IL-4, IL-12, IL-3 e GM-CSF, e diminuição de IL-2. Por outro lado, os animais B10.A apresentaram aumento nos níveis de IL-10, IL-12, IL-3 e IFN-γ. Estes resultados demonstraram que nos animais B10.A as células TCD4+ têm pouca ou nenhuma participação no controle da infecção. No entanto, nos animais A/J há duas subpopulações, uma protetora (4ª semana) e outra exacerbadora (8ª semana) dependendo do estágio da doença. Contudo, em ambas as linhagens a subpopulação TCD8+ apresentou-se importante no controle da doença. Além disso, na PCM experimental, tanto as respostas de HTT como a produção de anticorpos específicos, são mecanismos que dependem de células TCD4+ e na linhagem B10.A há uma subpopulação TCD8+ que regula negativamente as reações de HTT. / To investigate the role of T lymphocytes in the pulmonary model of Paracoccidioidomycosis (PCM), resistant and susceptible mice were in vivo depleted of T CD4+ and T CD8+ cells by intraperitoneal injection of specific monoclonal (mAb) antibodies and infected intratracheally with one million yeast cells of a virulent isolate of Paracoccidioides brasiliensis. When compared with the non-depleted group, at week 4 after infection A/J mice presented increased dissemination of yeasts to liver; however, at week 8 A/J-depleted mice showed decreased fungal loads in the lungs. In contrast, depletion of TCD4+ cells of B10.A mice did not alter the severity of disease at any periods of infection assayed. Treatment with anti-CD4 mAb diminished the delayed-type hypersensitivity reactions (DTH) of resistant mice but the cutaneous anergy of B10.A mice was not modified. In addition, CD4-depleted A/Sn and B10.A mice presented decreased titers of P.brasiliensis specific antibodies at both the 4th and 8th week postinfection. Regarding pulmonary cytokines, at week 4 of infection A/J-depleted mice presented diminished levels of IL-12 but at week 8 IL-10, IL-4, IL-S, IL-2 and GM-CSF appeared in lower levels. Only IL-12 was detected in lower levels in the lungs of B10.A-depleted mice at week 8 after infection. Depletion of CD8+ cells led to a more severe disease in both mouse strains. A/J-treated mice presented increased fungal burdens in the lungs whereas in the B10.A strain increased number of yeast cells was detected in the lungs and liver. Importantly, neutralization of CD8+ cells reverted the DTH anergy of susceptible mice. These data suggest the existence of two T CD8+ subpopulations in B10.A mice, a protective that controls fungal growth and another one that suppresses DTH reactions. The production of P.brasiliensis specific antibodies by resistant and susceptible mice depleted of CD8+ T cells was similar to that of mice given control antibody. Neutralization of CD8+ cells, however, induced significant alterations in the concentrations of pulmonary cytokines. In A/J-treated mice, higher levels of IL-4, IL-12, IL-3 and GM-CSF were concomitant with reduced amounts of IL-2. B10.A mice depleted of CD8+ cells presented higher levels of pulmonary IL-10, IL-12, IL-3 and IFN-γ than their controls. As a whole, our results demonstrate that CD4+ T cells have no influence on the control of disease severity of B10.A mice. Depending on the period of the infection, A/J mice develop two subpopulations of CD4+ T cells: one protective subset which appeared early in the infection, followed by a subpopulation that lead to disease exacerbation. Moreover, in both mouse strains CD8+ T cells are protective and able to control fungal growth. It was also verified that DTH reactions and antibody production in murine PCM are CD4+ T cells mediated. Finally, only in B10.A mice a regulatory CD8+ T cell subpopulation was characterized by its ability to suppress DTH reactions