Orientador: : Leonardo Fernandes Fraceto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T08:25:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_AndersondoEspiritoSanto_M.pdf: 3153536 bytes, checksum: 2427b9dc08e349cd1eadf5c8a001ceb9 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A "Revolução Verde" ocorreu na década de 60 e previa o aumento da produção agrícola devido ao crescimento populacional, onde foi intensificado o estudo de novas tecnologias para o aumento da produção de alimentos e rentabilidade dos agricultores. Entre as várias tecnologias, destacou-se a utilização de defensivos agrícolas no controle, prevenção e na eliminação de doenças que interferem na produtividade agrícola. O uso de nanopartículas (NPs) para o carreamento de compostos bioativos para liberação sustentada aumenta o tempo de ação e estabilidade química do ativo no meio, bem como a disponibilidade para ação junto ao organismo alvo. Na agricultura, o uso de NPs visa reduzir a concentração efetiva do ativo a ser utilizado, reduzir de aplicações, reduzir a toxicidade, diminuir a periculosidade e os riscos de contaminação ambiental. O presente trabalho propôs o desenvolvimento de NPs poliméricas de poli-épsilon caprolactona (PCL) como sis-temas carreadores para o herbicida atrazina (ATZ) bem como a avaliação das características físico-químicas destes sistemas, a atividade herbicida e a genotoxicidade das formulações preparadas. As nanocápsulas (NCs/ATZ) e as nanoesferas (NEs/ATZ) contendo ATZ apresentaram diâmetro médio de 483,1 ± 10,4 nm e 408,5 ± 2,5 nm, respectivamente. A ATZ apresentou uma eficiência de encapsulação acima de 90% para as formulações de NE e NC e foram observadas alterações no perfil de liberação da ATZ em comparação com o herbicida ATZ. A estabilidade coloidal e físico-química das formulações foi mantida por um período de 90 dias. O uso de NPs aumentou a retenção da ATZ em ensaios com coluna de solo, sendo que a atividade herbicida se mostrou mais eficaz quando comparada ao ativo ATZ apenas e ao de uma formulação comercial (Gesaprin). A investigação da genotoxicidade das formulações, utilizando o ensaio de aberração cromossômica Allium cepa, mostrou que a encapsulação da ATZ reduziu os efeitos sobre o número de aberrações cromossômicas quando comparadas ao ativo ATZ e à formulação comercial. As formulações de NPs contendo ATZ preparadas neste trabalho apresentam grande potencial para aplicação na agricultura, uma vez que estas podem ter ação herbicida utilizando menor concentração de ativo, reduzem a mobilidade da ATZ no solo e diminuem os efeitos genotóxicos, tornando-se mais seguras ao meio ambiente e reduzindo os riscos de contaminação / Abstract: The "Green Revolution" occurred during the decade of 60 and it aimed towards the rapid increase on agriculture production due to population growth, when was intensified the research and development to increase agriculture production and profitability. Among several technologies, herbicides and pesticides have emerged to control, prevent and destroy diseases that interfere in the agricultural productivity. The use of nanoparticles (NPs), as drug delivery system loads to modified drug release profile, increase time of action and increased chemical stability is wells is increase in bioavailability. In agriculture the use of NPs can reduces the amount of chemical used and the number of applications with decrease in toxicity, minimizing the risks of an environmental contamination. This study aims to develop NPs pre-pared with poly-épsilon-caprolactone (PCL) as a carrier system for the herbicide atrazine (ATZ). The formulations were characterized and the herbicide activity and genotoxicity were investigated. The nanocapsules (NCs/ATZ) and nanospheres (NE/ATZ) containing ATZ showed a size average diameter of 483.1±10.4 nm and 408.5±2.5 nm respectively. The ATZ presented encapsulation efficiency over 90% on formulations of NC and NE. The release profiles of the ATZ encapsulated in NPs were changed in relation to the ATZ herbicide only. The colloidal stability over 90 days showed that the formulations were stable. The use of NPs increased the retention of ATZ on soil column and showing that the herbicide was more active when compared to ATZ or a commercial formulation (Gesaprin). The genotoxicity evaluation showed that the encapsulation of ATZ reduced the toxic effects on the number of chromosomal aberration when compared to active ATZ and commercial formulation. NPs formulation containing ATZ prepared in this study presented a great potential for application in agriculture, since these formulations have the same herbicide activity (using lower concentration of active compound), reduce the ATZ soil mobility and also decrease the genotoxicity effects of ATZ, and in this way, reducing the risks of environmental contamination / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

O desenvolvimento de nanosensores luminescentes, não tóxicos e biocompatíveis estão sendo utilizados para marcação e visualização de células em biologia celular e imunoensaios ultrassensíveis. Neste trabalho, marcadores biológicos à base de terras raras para a detecção do 17-β-estradiol (E2), em fluido biológico(plasma) foram estudados. Os complexos precursores à base de terras raras (Eu3+ e Tb3+) foram sintetizados e caracterizados. O complexo contendo tta- de Eu3+ e liganteauxiliar TOPO [Eu(tta)3(TOPO)2] registrou a maior eficiência de luminescência dentre todos os demais compostos estudados e foi escolhido como sonda luminescente para desenvolvimento das etapas seguintes deste trabalho. Este complexo foi incorporado às matrizes poliméricas, PMMA e PHB, em diferentes concentrações de dopagens pordois métodos distintos: nanoprecipitação crioscópica e pela técnica de emulsão-difusão. As nanopartículas poliméricas de PMMA demonstraram maior eficiêncialuminescente quando dopadas com concentração de 5% do complexo precursor [Eu(tta)3(TOPO)2]. Estas nanopartículas foram funcionalizadas com 1,6 hexodiamino eposteriormente foram ligadas a um dialdeído que servirá como ponte na reação comas entidades biológicas. No entanto, devido à transferência de energia do sistemaorgânico Ac-Ac/nanossensor, as nanopartículas poliméricas luminescentes de PHBdemonstraram maior intensidade de sinal para a detecção do 17-β-estradiol por espectrofluorimetria. Pode-se concluir que as nanopartículas produzidas e testadasneste trabalho são fortes candidatas para a detecção do 17-β-estradiol em plasma sanguíneo ou outras entidades biológicas, apresentando opções diagnósticas, conduta extremamente importante para direcionamento terapêutico. / The development of luminescent, non-toxic and biocompatible nanosensors are being used for marker and imaging of cells in cellular biology and ultrasensitive immunoassays. In this work, biological markers based on rare earths for detection of 17 β -estradiol (E2), in biological fluids (Plasmon), were studied. The precursor complexes based on rare earths ( Eu3+ and Tb3+) were synthesized and characterized. The complex containing tta Eu3+ and secondary ligand TOPO- [Eu(tta)3(TOPO)2] registered the highest luminescence efficiency among all other compounds studied and was chosen as luminescent probe for the following development stages of this work. This complex was doped into polymer matrices, PMMA and PHB, at different concentrations of doping by two different methods: cryoscopic nanoprecipitation and emulsion-diffusion technique. The PMMA polymer nanoparticles demonstrated higher luminescence efficiency when doped with 5% concentration of the precursor complex [Eu(tta)3(TOPO)2]. These nanoparticles were functionalized with 1,6 diaminohexane and later they were linked to a dialdehyde that will serve as a bridge in the reaction with the biological entities . These nanoparticles were functionalized with 1,6 diaminohexane and later they were linked to a dialdehyde that can serve as a bridge in the reaction with the biological entities. Due to the energy transfer Ac- Ac/nanosensor, the PHB polymeric nanoparticles showed higher luminescence intensity signal for the detection of 17- β -estradiol by spectrofluorimetry. It can be concluded that the nanoparticles produced and tested in this work are strong candidates for the detection of 17β- estradiol in the blood plasma or others biological entities, presenting diagnostic options, an extremely important conduct for therapeutic direction.

O paclitaxel (PCX) é o fármaco de primeira escolha para o tratamento do câncer de ovário. Contudo, a baixa solubilidade do PCX torna necessária a adição de adjuvantes tóxicos à formulação comercial (Taxol®). Assim, o desenvolvimento de sistemas de liberação nanoestruturados têm sido estudados para promover a redução dos efeitos tóxicos e aumentar a segurança e a eficiência terapêutica do PCX. Uma das estratégias utilizadas para aumentar a seletividade dos nanocarreadores às células tumorais é a funcionalização de suas superfícies com folato, devido a superexpressão dos receptores de folato nas células tumorais. O objetivo do presente trabalho foi desenvolver e caracterizar nanopartículas de PLGA funcionalizadas (NP-PCX-AF) e não funcionalizadas (NP-PCX) para a veiculação do PCX, bem como a avaliação in vitro da eficácia dos sistemas desenvolvidos em linhagens celulares de adenocarcinoma de ovário. Os nanocarreadores foram produzidos pela técnica de nanoprecipitação e avaliados por meio das análises físico-químicas de diâmetro médio de partícula, índice de polidispersão, potencial zeta, eficiência de encapsulação, estabilidade coloidal e espectro de infravermelho. Além disso, foi avaliada a eficácia antitumoral e o uptake dos sistemas desenvolvidos por meio dos ensaios de citotoxicidade celular por resazurina e internalização por microscopia confocal e citometria de fluxo. Os resultados obtidos mostraram que as formulações funcionalizadas e não funcionalizadas apresentaram reduzidos valores de diâmetros médios de partículas (menor que 150 nm) e índices de polidispersão reduzidos (menor que 0,2) com elevada eficiência de encapsulação do PCX, próximo a 100%, o que é adequado para a via de administração endovenosa e promoção do direcionamento ativo e passivo no ambiente tumoral. Os resultados de citotoxicidade celular in vitro em linhagens OVCAR-3 e SKOV-3 demostraram a elevada capacidade das formulações desenvolvidas em liberar o PCX em tempo hábil para ocasionar dano celular. Além disso, a formulação NPPCX- AF apresentou maior capacidade citotóxica que a formulação NP-PCX nas menores concentrações de PCX avaliadas, com redução máxima da viabilidade celular, aproximadamente 22 % para a linhagem celular SKOV-3 e 11% para OVCAR-3, utilizando a concentração de 1000 nM no tempo de 72 horas. Os ensaios de citometria de fluxo e de microscopia confocal mostraram a elevada capacidade de ambos os carreadores serem internalizados através do processo de endocitose, com valores de internalização celular superiores a 80% após 1 hora de tratamento. Estudos in vivo subsequentes serão necessários para confirmar o potencial da formulação NP-PCX-AF no tratamento do câncer de ovário / Paclitaxel (PCX) is a first-line medicinal treatment for ovarian cancer. However, the low PCX water solubility makes necessary the addition of toxic adjuvants to the commercial formulation (Taxol®). Thus, the development of nanostructured delivery systems has been studied to promote a reduction on side effects and an increase on safety and PCX therapeutic efficacy. One of strategies used to increase nanocarriers selectivity to tumor cells is the modification of their surfaces with folate due to folate receptor overexpression on tumor cells membrane. The aim of this work was the development and characterization of folate-modified PLGA nanoparticles (NP-PCXAF) and unmodified nanoparticles (NP-PCX) to PCX delivery, as well as the evaluation of in vitro efficacy of developed systems using human ovarian cancer cell lines. The nanocarriers were produced through nanoprecipitation technique and evaluated through physico-chemical parameters like particle size, polydispersity index, zeta potential, encapsulation efficiency, colloidal stability and infrared spectroscopy. Besides that, antitumoral efficacy and cellular uptake were evaluated using resazurin cytotoxicity assay, confocal microscopy and flow cytometry. The results obtained for folate-modified nanoparticles and unmodified nanoparticles showed low particle size distribution (less than 150 nm) and polydispersity index (less than 0.2) with high PCX encapsulation efficiency (about 100%) which is suitable for intravenous administration and for promoting active and passive targeting to tumor microenvironment. The in vitro cellular cytotoxicity assays of OVCAR-3 and SKOV-3 cell lines demonstrated the high ability of both formulations to release PCX and consequently to cause cellular damage. Furthermore, in lower concentrations NP-PCX-AF formulation showed higher cytotoxicity capacity than NP-PCX with higher cell viability reduction, about 22% for SKOV-3 cell line and 11% for OVCAR-3, using concentration of 1000 nM at 72 hours. Finally, flow cytometry and confocal microscopy assays indicated a high capacity of both nanocarriers to be internalized through endocytosis process. Therefore, subsequent in vivo studies are necessary to confirm the NP-PCX-AF potential for ovarian cancer treatment

Submitted by Fernanda Isadora Boni null (boni.fernanda@gmail.com) on 2017-12-10T12:41:17Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao FERNANDA_BONI_FINAL-Repositorio.pdf: 2349970 bytes, checksum: 94103feab0447379967a227a0fcd3977 (MD5) / Submitted by Fernanda Isadora Boni null (boni.fernanda@gmail.com) on 2017-12-11T18:47:10Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao FERNANDA_BONI_FINAL-Repositorio.pdf: 2349970 bytes, checksum: 94103feab0447379967a227a0fcd3977 (MD5) / Submitted by Fernanda Isadora Boni null (boni.fernanda@gmail.com) on 2017-12-14T11:25:03Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao FERNANDA_BONI_FINAL-Repositorio.pdf: 2349970 bytes, checksum: 94103feab0447379967a227a0fcd3977 (MD5) / Submitted by Fernanda Isadora Boni null (boni.fernanda@gmail.com) on 2017-12-14T13:50:32Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao FERNANDA_BONI_FINAL-Repositorio.pdf: 2349970 bytes, checksum: 94103feab0447379967a227a0fcd3977 (MD5) / Submitted by Fernanda Isadora Boni null (boni.fernanda@gmail.com) on 2017-12-21T12:31:27Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao FERNANDA_BONI_FINAL-Repositorio.pdf: 2349970 bytes, checksum: 94103feab0447379967a227a0fcd3977 (MD5) / Approved for entry into archive by Vivian Rosa Storti null (vstorti@reitoria.unesp.br) on 2018-01-05T13:00:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 boni_fi_me_arafcf.pdf: 2349970 bytes, checksum: 94103feab0447379967a227a0fcd3977 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-05T13:00:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 boni_fi_me_arafcf.pdf: 2349970 bytes, checksum: 94103feab0447379967a227a0fcd3977 (MD5) Previous issue date: 2017-09-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A nanotecnologia farmacêutica é uma relevante ferramenta tecnológica para o desenvolvimento de novos sistemas para a veiculação de fármacos, pois devido às suas dimensões reduzidas são capazes de circular por capilares que irrigam os tecidos, escapar da fagocitose por células do sistema imunológico e permear passivamente células e epitélios. Além disso, esses sistemas possibilitam a encapsulação de fármacos de baixa estabilidade, protegendo-os contra degradação prematura e/ou permitindo a modulação de suas propriedades físico-químicas, bem como a interação biológica na biointerface. O metotrexato (MTX) é um dos fármacos mais utilizados no tratamento de tumores sólidos e doenças inflamatórias intestinais, no entanto, por ser altamente citotóxico e não seletivo promove diversos efeitos colaterais. Sua eficácia terapêutica é comprometida devido à resistência adquirida pelas células tumorais e por sua baixa permeabilidade intestinal, principalmente por meio do mecanismo de efluxo da forma livre. Nesse trabalho, nanopartículas poliméricas (NPs) orais compostas por quitosana (QS), ácido hialurônico (AH) e ftalato de hidroxipropilmetilcelulose (HP), polímeros que possuem propriedades como solubilidade pH dependente, mucoadesividade e de funcionalização, foram desenvolvidas como plataforma tecnológica para a vetorização do MTX para o cólon, visando o tratamento local de patologias intestinais. As análises de peso molecular e coeficiente viral demostraram a adequação dos polímeros e solventes para a obtenção das nanoestruturas pelo método de complexação polieletrolítica. A avaliação da influência do pH no potencial zeta dos polímeros permitiu a seleção do valor ótimo (pH 5,5) para obtenção das nanoestruturas. O diâmetro médio das NPs sem fármaco, contendo ou não HP variou de 451,73-574,95 nm e a incorporação do MTX reduziu significativamente esses valores para a faixa de 216,83-345,03 nm (p<0,05). A adição do HP, bem como do MTX promoveu a redução do potencial zeta das NPs (p<0,05). O índice de polidispersão das NPs contendo ou não MTX variou de 0,21-0,39 a 0,26-0,33, respectivamente, indicando a homogeneidade de tamanho. A forma esférica das partículas foi também foi demonstrada. Os espectros de absorção na região IV indicaram a formação dos complexos polieletrolíticos e as análises de DRX a formação de estruturas cristalinas. A eficiência de incorporação do MTX variou de 20,06% a 36,18%, sendo as NHP0,5-1 e NHP0,2-5 as que apresentaram as maiores porcentagens (32,21% e 36,18%, respectivamente). Embora o MTX tenha promovido a redução dos valores de mucoadesão (p<0,05), a elevada mucoadesividade (71,22% a 91,53%) de todas as NPs foi evidenciada. De acordo com as isotermas de adsorção, os dados de interação com a mucina apresentaram correlação com o modelo de Freundlich, que indica a adsorção reversível em multicamadas. Em pH 6,8, a interação da mucina com as NPs promoveu a redução do potencial zeta, o que pode estar relacionado a maior capacidade de adsorção nesse valor de pH. A incorporação do MTX nas NPs permitiu a redução da liberação em meio ácido em até 40%, em relação ao fármaco livre, enquanto a adição de HP à matriz das NPs reduziu a liberação em até 10%, neste pH. O mecanismo de liberação do fármaco foi avaliado por diferentes modelos matemáticos. A viabilidade nas linhagens Caco-2 e HT29-MTX para os polímeros e NPs (0,01 - 1 μg.mL-1) foi demonstrada. Para as NPs contendo MTX, nas concentrações de 10 μg.mL-1 e 100 μg.mL- 1, a viabilidade na linhagem Caco-2 após 24 h de incubação foi de aproximadamente 50%. Nos estudos de permeabilidade in vitro, as NPs sem adição de HP permearam aproximadamente 3 vezes mais as monocamadas de Caco-2 e de co-cultura tripla de células, em comparação às amostras contendo HP e ao fármaco livre. A maior associação celular para o fármaco incorporado às NPs, em comparação ao MTX livre, demonstrou a capacidade do sistema em modular a interação biológica. / The pharmaceutical nanotechnology is a relevant technological tool for the development of new drug delivery systems, because of their small size they are able to circulate through capillaries that irrigate tissues, escape from phagocytosis by the immune system cells and passively permeate cells and epithelia. In addition, these systems enable the encapsulation of low stability drugs, protecting them against premature degradation and/or allowing the modulation of their physico-chemical properties, as well as the biological interaction in the biointerface. Methotrexate (MTX) is one of the most used drug in the treatment of solid tumors and inflammatory bowel diseases, however, because MTX highly cytotoxic and nonselectivity promotes several side effects. Its therapeutic efficacy is compromised due to the resistance acquired by tumor cells and it low intestinal permeability, mainly through the efflux mechanism of the free form. In this work, oral nanoparticles composed of chitosan (CS), hyaluronic acid (HA) and hydroxypropylmethylcellulose (HP) phthalate, polymers that have properties such as pH-dependent solubility, mucoadhesiveness and functionalization have been developed as a technological platform for the target of MTX to the colon, aiming the treatment of local pathologies. Molecular weight and second viral coefficient analyzes demonstrated the suitability of polymers and solvents to obtain nanostructures by the polyelectrolyte complexation method. The evaluation of the pH influence on the zeta potential of the polymers allowed to the selection of the optimum value (pH 5.5) to obtain the nanostructures. The mean diameter of the MTX free nanoparticles, containing or not HP ranged from 451.73-574.95 nm and the incorporation of MTX significantly reduced these values for the range of 216.83-345.03 nm (p <0.05). The addition of HP as well as MTX promoted reduction of zeta potential of nanoparticles (p <0.05). The polydispersity index of the nanoparticles containing or not MTX ranged from 0.21-0.39 to 0.26-0.33, respectively, indicating homogeneity of size. The spherical shape of the particles has been demonstrated. The absorption spectra in the IV region indicated the formation of the polyelectrolyte complexes and the DRX analyzes, the formation of crystalline structures. The efficiency of drug incorporation ranged from 20.06% to 36.18%, with the NHP0.5-1 and NHP0.2-5 samples having the highest percentages (32.21% and 36.18%, respectively). Although MTX promoted the reduction of mucoadhesion values (p<0.05), the high mucoadhesiveness (71.22% to 91.53%) of all nanoparticles was evidenced. According to the adsorption isotherms, the interaction data with the mucin presented a correlation with the Freundlich model, which indicates the reversible adsorption in multilayers. At pH 6.8, the interaction of mucin with the nanoparticles promoted the reduction of the zeta potential, which may be related to the higher adsorption capacity at this pH value. The incorporation of MTX in the nanoparticles allowed to the reduction of MTX release in acidic media by up to 40% in relation to the free drug and the addition of HP to the nanoparticle matrix reduced the release by up to 10% at pH 1.2. The mechanism of drug release was evaluated by different mathematical models. The viability of Caco-2 and HT29-MTX lines for polymers and NPs (0.01-1 μg.mL-1) was demonstrated. For nanoparticles containing MTX, at concentrations of 10 μg.mL-1 and 100 μg.mL-1 , the viability of Caco-2 after 24 h incubation was approximately 50%. In the in vitro permeability studies, samples without HP permeated approximately 3- fold more monolayers of Caco-2 and triple co-culture compared to samples containing HP and the free drug. The higher cellular association for the drug incorporated into the nanoparticles, compared to free MTX, demonstrated the ability of the system to modulate the biological interaction / FAPESP: 2015/21176-5 / FAPESP BEPE: 2016/20360-0

Sistemas nanocarreadores de moléculas orgânicas têm emergido como promissores sistemas para aplicação na terapêutica e/ou diagnóstico. No presente trabalho foram desenvolvidas nanocápsulas poliméricas contendo, em seus diferentes domínios, sondas fluorescentes capazes de fornecer imagem quando analisadas em microscópio de fluorescência confocal, mostrando as potencialidades do sistema como agente para imagem ótica. Uma importante característica de moléculas propostas como marcadores fluorescentes, é que não haja sobreposição dos espectros de absorção e emissão de fluorescência. Para tanto, foi utilizado um corante sintético do grupo dos benzoxazólicos (HBO-C8) para marcação do núcleo lipofílico, e os polímeros PCL e quitosana foram ligados covalentemente aos corantes rodamina B e alaranjado de acridina, respectivamente. As formulações desenvolvidas e caracterizadas com dois ou três marcadores apresentaram caráter nanotecnológico e as fotomicrografias de transmissão revelaram que as nanopartículas contendo HBO-C8 e PCL-Rho (sem quitosana), preservou a morfologia da nanopartícula. Adicionalmente, o HBO-C8 foi quantificado na formulação contendo HBO-C8 e PCL-Rho, onde verificou-se que 98% do corante está internalizado na nanopartícula, alcançando assim, o objetivo proposto de usá-lo como sonda para marcação do núcleo lipofílico. Por meio da microscopia de fluorescência confocal, foram obtidas imagens dos marcadores fluorescentes colocalizados, para as formulações contendo dois ou três domínios fluorescentes, demonstrando que essas nanocápsulas podem ser propostas como uma plataforma promissora para serem empregadas como sondas para imagem ótica. / Nanocarriers systems of organic molecules have emerged as promising systems for application in therapy and diagnosis. In the present study polymeric nanocapsules containing fluorescent probes in their different domains, capable of providing image when analyzed in confocal fluorescence microscope, showing the potential of the system as an agent for optical imaging. An important feature of proposed molecules as fluorescent probes, there is no overlap of the spectra of absorption and fluorescence emission. Thus, a group of synthetic dye benzoxazólicos (HBO-C8) to mark the lipophilic core, and PCL and chitosan polymers were covalently linked to dye rhodamine B and acridine orange , respectively. The formulations developed and characterized with two or three markers showed nanotechnological character and transmission photomicrographs showed that nanoparticles containing PCL-Rho and HBO-C8 (without chitosan) preserved morphology of the nanoparticle. Additionally, the HBO-C8 was was quantified on formulation contained HBO-C8 and PCL-Rho, where it was found that 98% of the dye is internalized in the nanoparticle thus reaching the purpose proposed to use as a probe for marking the lipophilic core . By images of confocal fluorescence microscopy were obtained the colocalized of fluorescent markers to formulations containing two or three fluorescent domains, demonstrating that these nanocapsules can be proposed as a promising platform to be used as probes for optical image.

Orientador: Prof. Dr. Fernando Carlos Giacomelli / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2015. / O presente estudo se insere na emergente area da nanomedicina, tendo como base a ciencia de coloides e interfaces, e teve como objetivo inicial a sintese de nanoparticulas polimericas usando diferentes copolimeros para se obter sistemas nanoestruturados com diferentes caracteristicas no que se refere a dimensao, carga superficial e estrutura interna. Os dados experimentais de espalhamento de luz e imagem mostraram que foi possivel obter sistemas polimericos nanoestruturados de diferentes tamanhos e carga superficial utilizando o protocolo de nanoprecipitacao. Haja vista a diferenca estrutural dos polimeros utilizados, as nanoparticulas produzidas sao estruturalmente diferentes do ponto de vista de tamanho de nucleo hidrofobico e coroa hidrofilica. Tambem foi possivel elucidar a influencia destes parametros estruturais na captura e internalizacao celular das entidades. Os resultados sugerem que a espessura da coroa hidrofilica de polioxietileno (PEO), que tem o papel fundamental de estabilizar as nanoestruturas produzidas, e decisiva no processo. Na medida em que foram utilizados copolimeros em bloco de longa cadeia hidrofilica, percebeu-se uma reducao semi-quantitativa e quantitativa na internalizacao celular das entidades. A carga superficial tambem possui importante papel no processo que, porem, e ofuscado pelo fator dimensao da coroa, onde para nanoparticulas de elevado potencial-¿ê (~ - 40 mV), que e o caso de NPs de PLGA, a internalizacao celular nao apresentou diferenca estatisticamente significativa em comparacao com outros sistemas. Por outro lado, NPs apresentando cadeias estabilizantes de PEO mais curtas (Mw ~ 2000 g.mol-1) foram mais eficientemente internalizadas, apesar de seu potencial-¿ê negativo (~ -20 mV). Para NPs com o mesmo tamanho de cadeia estabilizante de PEO, os dados experimentais sugerem que NPs formadas por um bloco hidrofobico de policaprolactona (PCL) sao internalizadas de maneira mais eficiente em comparacao com NPs formadas por um bloco hidrofobico de poli acido latico (PLA). Este ultimo efeito foi atribuido a maior hidrofobicidade do bloco de PCL, o que vai de encontro com o modelo teorico da molhabilidade, apesar dos resultados de SPR mostrar adsorcao a membrana mimetica somente das NPs a base de PLA. / Herein, the cellular uptake of naked PLGA and PLA- and PCL-based block copolymer nanoparticles (NPs) have been evaluated. The nanoparticles were produced containing the same amount of loaded fluorescent cumarina-6 (0.5 % wprobe/wpolymer) by using the so-called nanoprecipitation protocol. This procedure yielded nano-sized objects with distinct structural features dependent on the length of the hydrophobic and hydrophilic blocks and volume ratio. They were further detailed characterized by scattering techniques and atomic force microscopy. The cellular uptake of selected nanoparticles has been evaluated by laser confocal scanning microscopy and flow cytometry analysis. The cellular uptake events were examined in relation to size, surface charge, hydrophobic core nature and hydrophilic chain length of the produced NPs. The experimental results indicated that cellular uptake was considerably enhanced as the length of the hydrophilic PEO-stabilizing shell reduces. Additionally, it has been also evidenced that a high negative surface charge restricts cellular uptake and that, on the other hand, nanoparticles comprising a hydrophobic core of higher degree of hydrophobicity (PEO-b-PCL) are more efficiently internalized as compared to PEO-b-PLA NPs. In summary, there should be a compromise regarding protein fouling and cellular uptake as resistance to non-specific protein adsorption and enhanced cellular uptake are respectively directly and inversely related to the length of the PEO stabilizing shell.

Orientador: Prof. Dr. Tiago Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2017. / O melanoma e uma doenca causada pela proliferacao exacerbada dos melanocitos caracterizada por alta capacidade metastatica e alta mortalidade. Apesar de existirem drogas disponiveis para seu tratamento, existe uma busca por tratamentos alternativos, devido a toxicidade e resistencia tumoral. Com os avancos no campo da nanotecnologia, surgiram novas tecnicas e possibilidades para o desenvolvimento de drogas. O objetivo deste estudo foi avaliar a citotoxicidade de nanoparticulas de quitosana doadoras de oxido nitrico (¿PNO) em celulas de melanoma (B16-F10) e melanocitos (Melan-A), e investigar os mecanismos envolvidos neste processo. Os resultados obtidos mostram potentes efeitos citotoxicos das nanoparticulas de quitosana contendo S-nitroso-mercaptossuccinico (S-nitroso-MSA-CS) contra a linhagem tumoral B16-F10 em um modo concentracao dependente (EC50= 6,7 ¡Ó 0,7 £gg/mL), enquanto que as nanoparticulas de acido mercaptossuccinico (MSA-CS) apresentaram um EC50 seis vezes maior (> 40 £gg/mL). Em contraste, as nanoparticulas de S nitroso-MSA-CS nao foram significativamente citotoxicas nos melanocitos nao tumorais (Melan-A) com EC50 quatro vezes maior (32,0 ¡Ó 7,5 £gg/mL). De acordo com os resultados obtidos por citometria de fluxo (dupla marcacao com anexina V-FITC/PI e caspase-3 na forma ativa) pode-se associar a morte celular induzida pelas nanoparticulas de S-nitroso-MSA-CS a um perfil de apoptose tardia (com marcacao positiva para anexina V e PI), ativacao de caspase-3 sem liberacao de LDH. Observou-se tambem um aumento na producao de especies reativas de oxigenio e nitrogenio, aumento da geracao de superoxido mitocondrial e oxidacao de grupamentos tiolicos de proteinas celulares, o que mostra que o estresse oxidativo e um evento importante no processo de morte celular induzido pelas nanoparticulas de S-nitroso-MSA-CS nas celulas B16-F10. Alem disso, observou-se por imunofluorescencia indireta o aumento da nitracao dos residuos de tirosina e nitrosacao de cisteina das proteinas celulares. Nossos resultados apontam para o potencial uso destas nanoparticulas para a terapia antitumoral. / The cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp) is a legume of important economic and nutritional representativeness, especially in Brazil. Serine protease inhibitors, such as trypsin, have been described in many species, as well as in other plants. In this specie an inhibitor with activity on human neutrophil elastase (HNE) has not yet been identified. This protease is involved in many pathological processes, such as the onset and progression of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). We purified and characterized an inhibitor from the protein extract of Vigna unguiculata presenting activity towards HNE. Firstly, we performed the alkaline extraction procedure for proteins followed by three different chromatographic steps using Hitrap Q (ion exchange), Source15RPC (Reversed-Phase) and ACE18 (Reversed Phase) columns. These steps were followed by the inhibitory activity tests using fluorogenic substrates, MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-MCA (elastase) and Z-Phe-Arg-MCA (trypsin), and quantitation assays of protein concentration. To determinate the size of the molecule, we used MALDI-TOF mass spectrometry and SDS-PAGE. The molecular mass of the inhibitor was 10,99 kDa. The dissociation constant (Ki) toward HNE was 9 pM. HNE inhibitor showed no inhibitory activities toward trypsin and thrombin. However, the inhibitor presented activity toward subtilisin and chymotrypsin. These datas indicate that this molecule is a novel inhibitor to HNE and we named it Vigna unguiculata Elastase Inhibitor (VuEI).

Orientador: Prof. Dr. Wanius José Garcia da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2017. / A hidrolise enzimatica da celulose e realizada pela acao sinergica de pelo menos tres tipos de celulases distintas: endoglucanases, exoglucanases e B.glicosidases. As endoglucanases e celobiohidrolases sao frequentemente inibidas pelo aumento da concentracao de celobiose (dimero de glicose) no meio reacional. As ¿À-glicosidases sao enzimas que clivam celobiose em monomeros de glicose. Portanto, as B-glicosidases sao essenciais ao processo de hidrolise da celulose por impedirem o acumulo de celobiose e, assim, evitar a diminuicao da taxa de hidrolise. Processos de pre-tratamento da biomassa lignocelulosica sao empregados, antes da reacao de hidrolise enzimatica da celulose, a fim de retirar a fracao de lignina e aumentar a taxa de conversao da celulose em glicose. Porem, estes processos de pre-tratamento da biomassa lignocelulosica nao sao 100% eficientes na remocao da lignina. Estudos previos mostraram que a adicao de lignina a celulose pura pode causar a reducao da liberacao de acucar em valores superiores a 60%. Assim, neste estudo, nos caracterizamos a adsorcao nao produtiva da enzima ¿À-glicosidase da familia GH1 da bacteria Thermotoga petrophila (TpBGL1) em ligninas extraidas de diferentes biomassas (cana-de-acucar e eucalipto). Em pH 7 e 6, nossos resultados indicaram que a repulsao eletrostatica enfraquece a adsorcao nao produtiva de TpBGL1 em ligninas. Contudo, em pH 4 a atracao eletrostatica fortalece a adsorcao nao produtiva. Alem disso, o aumento da temperatura de 25 oC para 70 oC nao resultou em um aumento significativo da adsorcao de TpBGL1 em ligninas, provavelmente porque nao ocorre um aumento significativo de regioes hidrofobicas na estrutura da enzima expostas ao solvente. Todas as informacoes obtidas neste estudo poderao ser uteis para aplicacoes biotecnologicas no campo de conversao de polissacarideos estruturais em bioenergia. / The B-glucosidases are a group of important enzymes employed in a large number of industrial applications. In this study, we reported for the first time the photobiosynthesis of stable and functional silver nanoparticles (AgNPs) using two hyperthermostable bacterial â-glucosidases with industrial potential. The syntheses were simple and rapid processes carried out by mixing â-glucosidases and silver solution under irradiation with light (450-600 nm), therefore, compatible with the green chemistry methodology. The synthesized AgNPs were characterized using a series of physical techniques. Absorption spectroscopy showed a strong absorption band at 460 nm due to surface plasmon resonance of the AgNPs. X-ray diffraction analysis showed that the AgNPs were purely crystalline in nature. Electron microscopy showed AgNPs of variable diameter ranging from 20 to 100 nm. In addition, electron microscopy, zeta potential and Fourier transform infrared spectroscopy results confirmed the presence of â-glucosidases coating and stabilizing the AgNPs. The results also showed that the enzymatic activities were maintained in the â-glucosidases assisted AgNPs. The data described in this study should provide a useful basis for future studies of â-glucosidases assisted AgNPs, including biotechnological applications.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5344.pdf: 8625914 bytes, checksum: ca016750526887a0b244ab6c793fe7e5 (MD5) Previous issue date: 2013-03-26 / Universidade Federal de Sao Carlos / The term cancer refers to neoplasias that are characterized by uncontrolled growth of cells that have some kind of genetic mutation. Prostate cancer is the cancer with the highest incidence in men. In its initial phase, the prostate cancer is hormone dependent, so current therapy is based on blocking the biosynthesis of hormones, but after the initial treatment, neoplastic cells grow back inordinately becoming resistant to treatment. Although there are drugs in clinical trials, it´s still necessary the search for molecules that exhibit activity against prostate cancer cells. Natural products have a great importance in cancer treatment. Due to its past history of beneficial effects on human health and especially its cytotoxic activity on cancer cells, the plant Casearia sylvestris was studied. However, the insolubility and low bioavailability in aqueous media hamper the use of these compounds. In an attempt to reduce this limitation, nanostructured systems for drug delivery have been recognized as promising vehicles. Polymeric nanoparticles have been used to overcome problems of solubility, bioavailability and aiming the target cells (tumor). The purpose of this work was the preparation of formulations of polymeric nanoparticles containing plant extract of C. sylvestris and evaluation of cytotoxic activity in cell lines and healthy prostate carcinoma. Thus, 3 factorial 22 designs were developed, and parameters as solution stability, recovery and encapsulation efficiency were considered. The nanoparticles were prepared by the method of nanoprecipitation, and the stability, recovery and encapsulation efficiency were satisfactory. In biological tests, the nanoparticles formulations showed selectivity up to 23 % on healthy and neoplastic cells, decreasing the viability of prostate carcinoma cells by 45%. Therefore, plant extracts of C. sylvestris shown to be active in cancer cells, and polymeric nanoparticle delivery systems may be promising in the treatment of prostate carcinoma. / O termo câncer refere-se a neoplasias que são caracterizadas pelo crescimento desordenado de células que apresentam algum tipo de mutação genética. O câncer de próstata é a neoplasia com maior incidência em homens. Em sua fase inicial, a neoplasia de próstata é hormônio dependente, dessa forma a terapia atual é baseada no bloqueio da biossíntese de hormônios, porém após o período inicial do tratamento as células neoplásicas voltam a crescer desordenadamente se tornando resistente ao tratamento. Apesar de existirem fármacos em triagens clínicas, ainda se faz necessária a procura de moléculas que exibem atividade contra células neoplásicas prostáticas. Os produtos naturais possuem grande importância no tratamento do câncer. Devido ao seu antigo histórico de efeitos benéficos a saúde humana e principalmente a sua atividade citotóxica sobre células neoplásicas a planta estudada foi a Casearia sylvestris. Porém a insolubilidade e biodisponibilidade baixa em meios aquosos dificulta a utilização destes compostos. Na tentativa de diminuir essa limitação, sistemas nanoestruturados de liberação de fármacos têm sido reconhecidos como veículos promissores. As nanopartículas poliméricas têm sido utilizadas para superar problemas de solubilidade, biodisponibilidade e direcionamento para células alvo (tumor). O objetivo desse trabalho foi o preparo de formulações de nanopartículas poliméricas contendo extrato vegetal de C. sylvestris e avaliação da atividade citotóxica em linhagens de células sadias e carcinoma de próstata. Para isso, foram desenvolvidos 3 planejamentos fatoriais 22 , para análise dos parâmetros: estabilidade em solução, eficiência de encapsulameto e recuperação. As nanopartículas foram preparadas pelo método de nanoprecipitação, e a estabilidade a eficiência de recuperação e eficiência de encapsulamento foram satisfatórias. Nos ensaios biológicos em células, as formulações de nanopartículas apresentaram seletividade de até 23 % entre células sadias e neoplásicas, diminuindo a viabilidade de células de carcinoma de próstata em 45 %. Dessa forma, extratos vegetais de C. sylvestris mostraram ser ativos em células neoplásicas, e nanopartículas poliméricas podem ser sistemas de liberação promissores no tratamento de carcinoma de próstata.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-04-18T13:37:34Z No. of bitstreams: 1 2016_JanainaGomesPenteado.pdf: 1707561 bytes, checksum: 7d887c75501d8d6d5bb010f333c4e8e9 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-04-18T20:06:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_JanainaGomesPenteado.pdf: 1707561 bytes, checksum: 7d887c75501d8d6d5bb010f333c4e8e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-18T20:06:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_JanainaGomesPenteado.pdf: 1707561 bytes, checksum: 7d887c75501d8d6d5bb010f333c4e8e9 (MD5) / Entre os tipos de câncer de pele, o melanoma é responsável por 4% dos casos. É o mais agressivo, por possuir um alto potencial metastático. Como proposta para um tratamento mais efeciente e que cause menos danos estéticos, foi utilizada a Terapia Fotodinâmica (TFD) como um sistema que proporcionasse uma futura utilização por via tópica. No presente trabalho as micelas de Pluronic® F127 contendo 1, 5 e 10 μg/mL do fotossensibilizante alumínio-cloro-ftalocianina (NP F127/AlClPc), as micelas foram utilizadas para investigar os efeitos da TFD em células de melanoma murino. NP F127/AlClPc foram avaliadas quanto a sua estabilidade e caracterização fotofísica e fotoquímica O diâmetro hidrodinâmico (DH) médio de NP F127/AlClPc com 1 μg/mL de ALCLPc foi de 22 nm ; 42,03 nm para 5 μg/mL e 152,9 nm para 10 μg/mL a ~25 °C. O índice de polidispersão foi 0,43 para 1 μg/mL; 0,68 para 5 μg/mL; 0,37 para 10 μg/mL, e o potencial zeta (PZ) de -2,71mV para 1 μg/mL; -0,11mV para 5 μg/mL e -0,58 mV para 10 μg/mL, mostrando que as micelas são polidispersas. NP F127/AlClPc apresentou máxima absorbância a 670 nm e fluorescencia a 680 nm.Duas linhagens celulares foram utilizadas: B16F10 (melanoma murino) e B16F10FF (melanoma murino modificadas com FireFly Luciferase). Somente a irradiação com a luz LED ou a exposição das células a diferentes concentrações de NP F127/AlClPc não causaram toxicidade em ambas as linhagens celulares. Quando aplicada a TFD com fluência de 85,1 J/cm2. Os resultados de citotoxicidade da NP F127/AlClPc, com vários tempos de incubação, mostrou uma maior eficácia em células B16F10 do que em células B16F10FF. A concentração de 1 μg/mL; 5 μg/mL;10 μg/mL mostraram-se mais eficaz no tempo de incubação de 20 e 25 minutos para as células B16F10. Pelo mesmo tempo de exposição de 25 minutos, as células B16F10FF mostraram-se mais resistentes ao tratamento. A citotoxicidade sem irradiação e com irradiação do LED mostrou que as micelas não causaram toxicidade em ambas as linhagens celulares. As células expostas à NP F127/AlClPc nas concentração de 1 μg/mL; 5 μg/mL; 10 μg/mL por 15, 20 e 25 minutos e irradiadas com a fluência de 85,1 J/cm2, mostraram que células B16F10 tratadas com a NP F127/AlClPc 10 μg/mL apresentaram viabilidade de 25%, enquanto as células B16F10FF sob as mesmas condições apresentaram viabilidade de 64%. A citotoxicidade nas células B16F10FF foi de 7% para o tempo de incubação de 20 minutos e de 3 a 4% nos tempos de 15 e 25 minutos, quando estas células sofream duas incubações (24-48 horas) e duas aplicações de TFD (24-48 horas). Pode-se concluir então que, a NP F127/AlClPc apresentou características fotofísicas e fotoquímicas favoráveis para o seu uso da TFD. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Melanoma accounts for 4% of cases among skin cancer types. But it is the most aggressive with a high metastatic potential. Photodynamic therapy (PDT) was used as an alternative efficient and less damage inducing treatment in comparison to chemotherapy for topical application. In the present work Pluronic® F127 micelles containing 1, 5 and 10 μg /mL of the photosensitizer aluminum-chlorophthalotocyanine (F127/AlClPc). The micelles were used to investigate the effects of PDT on murine melanoma cells. Their stability, photophysical characteristics and photochemistry was evaluated. The hydrodynamic diameter for the micelles carrying 1μg/mL, 5μg/mL and 10μg/mL was 22nm, 42.04nm and 152.9nm respectively. The poly dispersity index for the micelles with 1mg/mL, 5mg/mL and 10mg/mL were 0.43, 0.68 and 0.37 respectively. The zeta potential for the micelles with 1μg/mL, 5μg/mL and 10μg/mL F127/AlClPc were -2.7mV,-0.11mV and -0.58mV. The micelles showed maximum absorbance at 670nm and fluorescence at 680nm. Two cell lines were evaluated B16F10 (murine melanoma) and B16F10FF (murine melanoma modified with firefly luciferase). The irradiation of LED with light or with different concentration of F127 / AlClPc did not cause toxicity to both cell lines when the PDT fluent was 85.1 J / cm2. The cytotoxity results of the micelles F127/AlClPc at various incubation times was more prominent with B16F10 than B16F10FF. The concentration of 1μg/mL, 5μg/mL and 10 μg/mL were more effective against B16F10 cells when incubated for 20 minutes and 25 minutes. However, for B16F10FF cells they were resistant to treatment after 25 minutes of incubation. The cytotoxicity with either irradiation or without showed that the micelles did not cause toxicity to both cells. Upon exposure to 1μg/mL, 5μg/mL and 10 μg/mL for 15, 20 and 25 minutes and irradiation of fluency 85.1 J / cm2 B16F10 presented a viability of 25% while B16F10FF had 64%. After incubation of 15, 20 and 25 minutes the cytotoxicity of B16F10FF cells was 3%, 7% and 4% respectively when the cells were incubated (24-48 hours) and PDT was applied twice (24-48 hours). It can be concluded that the micelles with F127 / AlClPc presented photophysical and photochemical characteristics favorable for use in photodynamic therapy.