La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative fatale caractérisée par une perte progressive et sélective des neurones moteurs. La SLA est incurable et il n’existe aucun traitement efficace pour les personnes atteintes de cette maladie. Environ 90% des cas sont sporadiques tandis que 10% sont familiaux, et les patients décèdent généralement deux à cinq ans après l'apparition des premiers symptômes. De nombreuses anomalies génétiques sont associées à la SLA, incluant des mutations dans les protéines FUS, C9orf72, SOD-1 et TDP-43. Le laboratoire a développé un modèle transgénique de Caenorhabditis elegans surexprimant la protéine humaine mutante TDP-43(Q331K) dans les neurones moteurs GABAergiques. Nous avons également obtenu par mutagénèse et CRISPR-Cas9 des modèles physiologiquement représentatifs du nématode basés sur des mutations dans tdp-1, l'orthologue de TARDBP chez le C. elegans. L'objectif est de caractériser ces modèles et de déterminer s'ils peuvent récapituler certains aspects phénotypiques clés de la SLA, tels que des déficits moteurs et une neurodégénérescence dépendante de l'âge générant une paralysie. L’hypothèse est que le modèle TDP-1 pourra refléter plus précisément l’expression physiologique du gène dans la maladie humaine grâce à la mutation dans un gène endogène, l’absence de surexpression et l’expression ubiquitaire de la protéine TDP-1. Les résultats montrent que les modèles TDP-43/TDP-1 ont des déficits moteurs, une transmission synaptique altérée et une neurodégénérescence liée à l’âge. Cependant, seule la mutation dans TDP-43 semble avoir un effet sur la durée de vie. Ces modèles procurent différentes expressions physiologiques des protéines mutantes et donc, des phénotypes de niveaux d'intensité variables. Ils constitueront des outils utiles pour élucider de nouveaux mécanismes pathogéniques de la SLA ainsi que de bons candidats pour le criblage de médicaments et le développement de stratégies thérapeutiques. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease characterized by a progressive and selective loss of motor neurons. ALS is incurable and there are no effective treatments available for people living with the disease. About 90% of the cases are sporadic whereas 10% are familial, and patients usually die two to five years after symptom onset. Many gene defects are associated with ALS, including mutations in genes encoding FUS, C9orf72, SOD-1 and TDP-43 proteins. We have developed a transgenic Caenorhabditis elegans model expressing human mutant TDP-43(Q331K) in GABAergic motor neurons. We have also obtained by mutagenesis and CRISPR-Cas9 physiologically accurate models based on mutations in tdp-1, the C. elegans ortholog of TARDBP. Our objective is to characterize these models and determine if they can recapitulate key aspects of the disease such as motor deficits and age-dependent neurodegeneration causing paralysis. We believe that the TDP-1 model will reflect more precisely the physiological expression of the gene in the human disease because of its mutation in an endogenous gene, the absence of overexpression and ubiquitous protein expression. Our results show that both TDP-43 and TDP-1 models have motor deficits, synaptic transmission impairments and age-dependent neurodegeneration. However, only the TDP-43 mutation seems to have an effect on lifespan. These models provide different physiological expression of mutant proteins and thus phenotypes of varying intensity levels. They will be useful tools to elucidate new pathogenic mechanisms of ALS as well as being good candidates for drug screening and developing therapeutic strategies.

Le génie tissulaire permet de reconstruire des tissus hautement physiologiques qui constituent des modèles tridimensionnels utiles à de nombreuses applications, notamment pour étudier des interactions cellules-cellules ou cellules-matrice. Notre objectif était de modéliser par génie tissulaire le système nerveux périphérique (SNP) sensoriel et moteur, afin de permettre l'étude in vivo et in vitro de la régénération nerveuse et des différents facteurs qui la favorisent, aussi bien que l'étude de la myélinisation et des diverses maladies du SNP, dans le but d'approfondir les connaissances sur ces phénomènes. Nous voulions aussi développer des méthodes permettant d'obtenir des cellules de la moelle épinière murine ainsi que des neurones humains pouvant éventuellement être utilisés dans la reconstruction tissulaire et pour l'étude du SNP. En se basant sur l'expertise déjà acquise au laboratoire, nous avons fabriqué une peau humaine reconstruite en prenant comme base une éponge de collagène et avons étudié son innervation dans un contexte in vivo chez la souris. Nos résultats ont révélé que cette peau pouvait être innervée en 2 à 4 mois par des axones en régénération et que l'invasion de cellules de Schwann précédait cette innervation. Cette peau reconstruite a été par la suite utilisée et adaptée pour développer un modèle unique de régénération nerveuse périphérique sensorielle in vitro. Des neurones sensoriels murins ont été ensemencés sur des éponges de collagène colonisées par des cellules endothéliales et/ou des fibroblastes et, dans certains cas, des kératinocytes. Une forte croissance des prolongements nerveux a été observée et l'addition de cellules endothéliales a provoqué l'association des prolongements nerveux avec les pseudocapillaires reconstruits dans le modèle. Ce modèle constitue un outil puissant pour étudier l'effet de diverses cellules et/ou molécules sur la croissance des prolongements nerveux sensoriels in vitro. Dans le but d'adapter ce modèle à l'étude des neurones moteurs, nous avons d'abord optimisé différentes techniques afin d'obtenir des neurones moteurs de la moelle épinière embryonnaire de souris. Notre méthode a permis l'obtention de populations de neurones moteurs pures à 97%. Par la suite, ces neurones ont été ensemencés sur des éponges de collagène colonisées par des cellules de Schwann et/ou des fibroblastes. Notre modèle a permis la survie, l'élongation et la maturation des prolongements des neurones moteurs. Lorsque des cellules de Schwann étaient présentes, la formation de gaines de myéline autour des prolongements nerveux a été détectée. En plus de son utilité pour des études fondamentales sur la myélinisation et la régénération nerveuse motrice, ce modèle peut être complété par l'addition d'astrocytes, de microglies et de cellules musculaires afin de mieux comprendre les maladies des neurones moteurs. Finalement, nous avons cultivé des précurseurs provenant de la peau humaine adulte et les avons différenciés en neurones matures. Les cellules en différenciation exprimaient de façon séquentielle différents marqueurs du développement normal des neurones pour finalement révéler des marqueurs neuronaux tardifs. Ceci ouvre la voie à de nombreuses applications thérapeutiques potentielles et procure de nouvelles possibilités d'études sur des neurones d'origine humaine. En conclusion, le génie tissulaire nous a permis d'effectuer des études uniques sur le comportement en coculture tridimensionnelle de plusieurs types cellulaires avec des neurones du SNP par l'utilisation des nouveaux modèles que nous avons développés. Ces derniers sont hautement flexibles et s'avéreront très utiles pour plusieurs études fondamentales en neuroscience et pour l'acquisition de nouvelles connaissances sur les diverses maladies du SNP. / Tissue engineering allows the in vitro reconstruction of highly physiological tissues which constitute three-dimensional models useful for numerous applications, particularly to study cell-cell or cell-matrix interactions. Our objective was to modelize the sensory and motor peripheral nervous System (PNS) by tissue engineering, allowing the in vivo and in vitro study of nerve regeneration and the various factors that influence it, as well as myelination and PNS diseases in the aim of looking further into our knowledge on these phenomena. Since the reconstruction of tissues begins with cell isolation, we wanted also to develop methods allowing us to obtain spinal cord cells, including motor neurons, and human neurons to eventually use them in our models. Based on the expertise acquired by our laboratory, we reconstructed a human skin using a collagen sponge and studied its in vivo innervation after graft on mice. Our results revealed that this skin can be innervated in 2 to 4 months by regenerating axons and that this innervation was preceded by Schwann cell invasion. This permissive reconstructed skin was then adapted for the development of a unique in vitro model of sensory nerve regeneration. Murine sensory neurons were seeded onto collagen sponges populated by endothelial cells and/or fibroblasts and, in certain cases, keratinocytes. A robust neurite outgrowth was observed and the addition of endothelial cells allowed the association of neurite with capillary-like tubes formed in the model. This model constitutes a powerful tool for the in vitro study of various cells and/or molecules on sensory neurite outgrowth. In the aim of adapting this system to the study of motor neurons, we optimized different techniques to obtain motor neurons from mouse embryonic spinal cord. Our method allowed the harvesting of a population of 97% pure motor neurons. Afterward, these motor neurons were seeded onto collagen sponges populated with Schwann cells and/or fibroblasts. Our model allowed the survival, neurite outgrowth and maturation of motor neurons. When Schwann cells were added, myelin formation and axon ensheathment was observed. In addition to its utility for fundamental studies on myelination and motor nerve regeneration, this model may be completed by the coculture of astrocytes, microglia and muscle cells to better understand motor neuron diseases. Finally, we cultured precursor cells from adult human skin and differentiated them into mature neurons. Differentiating cells sequentially expressed markers of normal neural development to finally reveal markers of terminally differentiated neurons. This opens the way for numerous potential therapeutic applications and provides new possibilities for the study of human neurons. In conclusion, the tissue-engineered models we developed allowed us to perform unique studies on the three-dimensional coculture comportment of many cells types with PNS neurons with the use of new models that we have developed. Those models are highly flexible and will be very useful for many fundamental neuroscience studies and for acquiring new knowledge on various PNS diseases.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est la maladie des neurones moteurs la plus fréquente, affectant 4-6 individus par 100,000 habitants à l’échelle mondiale. La maladie se caractérise par une faiblesse et une atrophie musculaire suite à la dégénérescence des neurones du cortex moteur, tronc cérébral et moelle épinière. Les personnes atteintes développent les premiers symptômes à l’âge adulte et la maladie progresse sur une période de trois à cinq ans. Il a été répertorié qu’environ 10% des patients ont une histoire familiale de SLA; 90% des gens affectés le sont donc de façon sporadique. La découverte il y a 19 ans de mutations dans le gène zinc/copper superoxide dismutase (SOD1), présentes dans 15-20% des cas familiaux de SLA et environ 2% du total des individus affectés, a été l’événement déclencheur pour la découverte de variations génétiques responsables de la maladie. La recherche sur la génétique de la SLA a connu une progression rapide ces quatre dernières années avec l’identification de mutations dans de nouveaux gènes. Toutefois, même si certains de ces gènes ont été démontrés comme réellement liés à la maladie, la contribution d’autres gènes demeure incertaine puisque les résultats publiés de ceux-ci n’ont pas, à ce jour, été répliqués. Une portion substantielle de cas reste cependant à être génétiquement expliquée, et aucun traitement à ce jour n’a été démontré comme étant efficace pour remédier, atténuer ou prévenir la maladie. Le but du projet de recherche de doctorat était d’identifier de nouveaux gènes mutés dans la SLA, tout en évaluant la contribution de gènes nouvellement identifiés chez une importante cohorte multiethnique de cas familiaux et sporadiques. Les résultats présentés sont organisés en trois sections différentes. Dans un premier temps, la contribution de mutations présentes dans le gène FUS est évaluée chez les patients familiaux, sporadiques et juvéniles de SLA. Précisément, de nouvelles mutations sont rapportées et la proportion de mutations retrouvées chez les cas familiaux et sporadiques de SLA est évaluée. De plus, une nouvelle mutation est rapportée dans un cas juvénile de SLA; cette étude de cas est discutée. Dans un deuxième temps, de nouvelles avenues génétiques sont explorées concernant le gène SOD1. En effet, une nouvelle mutation complexe est rapportée chez une famille française de SLA. De plus, la possibilité qu’une mutation présente dans un autre gène impliqué dans la SLA ait un impact sur l’épissage du gène SOD1 est évaluée. Finalement, la dernière section explique la contribution de nouveaux gènes candidats chez les patients atteints de SLA. Spécifiquement, le rôle des gènes OPTN, SIGMAR1 et SORT1 dans le phénotype de SLA est évalué. Il est souhaité que nos résultats combinés avec les récents développements en génétique et biologie moléculaire permettent une meilleure compréhension du mécanisme pathologique responsable de cette terrible maladie tout en guidant le déploiement de thérapies suite à l’identification des cibles appropriées. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is the most common of motor neuron diseases, affecting 4-6 individuals per 100,000 individuals worldwide. ALS is characterized by muscle weakness and atrophy caused by the degeneration of neurons located in the motor cortex, brain stem and spinal cord. This fatal disease generally has an adult onset and progresses over a three to five year period. While 10% of patients affected have a family history of the disease, 90% of cases do not and are considered sporadic. The finding of mutations in the zinc/copper superoxide dismutase gene (SOD1) gene 19 years ago in about 15-20% of familial ALS (FALS) patients and approximately 2% of overall cases developed the interest of identifying rare genetics variants causing the disease. The ALS research field experienced a rapid progression during the last four years as mutations in new genes have been identified. While mutations in some of those new genes have been clearly linked to ALS, the role of others is still questionable and so far has not been positively replicated in other populations. Importantly, a significant portion of cases still need to be genetically explained and, unfortunately, there is still no effective treatment to cure, attenuate or prevent the disease. The aim of this Ph.D research project was to identify new ALS mutated genes while analysing the causative role of other newly identified genes in a large familial and sporadic ALS cohort of different origins. The results presented here are categorized into three different sections. First, the contribution of FUS mutations to familial, sporadic and juvenile ALS is analysed. Specifically, new FUS mutations are reported in ALS cases and the proportions of variants present in the tested familial and sporadic ALS cohorts are assessed. In addition, a new mutation is reported in a juvenile ALS patient, and this interesting case is discussed. Second, new genetic avenues are explored for the SOD1 gene. Precisely, a new and complex SOD1 mutation is reported in a French ALS family. Moreover, the possibility that other ALS mutated genes influence SOD1 splicing events is evaluated. Third, the contribution of new candidate genes is evaluated. Precisely, the contribution of OPTN, SIGMAR1 and SORT1 genes to the ALS phenotype is assessed. Hopefully, our different findings combined with recent developments in genetics and molecular biology will permit a better understanding of the pathological mechanisms involved in the disease and will lead to the identification of the right targets in order to develop appropriate therapeutics for ALS patients.

No description available.

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La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est la maladie des neurones moteurs la plus fréquente, affectant 4-6 individus par 100,000 habitants à l’échelle mondiale. La maladie se caractérise par une faiblesse et une atrophie musculaire suite à la dégénérescence des neurones du cortex moteur, tronc cérébral et moelle épinière. Les personnes atteintes développent les premiers symptômes à l’âge adulte et la maladie progresse sur une période de trois à cinq ans. Il a été répertorié qu’environ 10% des patients ont une histoire familiale de SLA; 90% des gens affectés le sont donc de façon sporadique. La découverte il y a 19 ans de mutations dans le gène zinc/copper superoxide dismutase (SOD1), présentes dans 15-20% des cas familiaux de SLA et environ 2% du total des individus affectés, a été l’événement déclencheur pour la découverte de variations génétiques responsables de la maladie. La recherche sur la génétique de la SLA a connu une progression rapide ces quatre dernières années avec l’identification de mutations dans de nouveaux gènes. Toutefois, même si certains de ces gènes ont été démontrés comme réellement liés à la maladie, la contribution d’autres gènes demeure incertaine puisque les résultats publiés de ceux-ci n’ont pas, à ce jour, été répliqués. Une portion substantielle de cas reste cependant à être génétiquement expliquée, et aucun traitement à ce jour n’a été démontré comme étant efficace pour remédier, atténuer ou prévenir la maladie. Le but du projet de recherche de doctorat était d’identifier de nouveaux gènes mutés dans la SLA, tout en évaluant la contribution de gènes nouvellement identifiés chez une importante cohorte multiethnique de cas familiaux et sporadiques. Les résultats présentés sont organisés en trois sections différentes. Dans un premier temps, la contribution de mutations présentes dans le gène FUS est évaluée chez les patients familiaux, sporadiques et juvéniles de SLA. Précisément, de nouvelles mutations sont rapportées et la proportion de mutations retrouvées chez les cas familiaux et sporadiques de SLA est évaluée. De plus, une nouvelle mutation est rapportée dans un cas juvénile de SLA; cette étude de cas est discutée. Dans un deuxième temps, de nouvelles avenues génétiques sont explorées concernant le gène SOD1. En effet, une nouvelle mutation complexe est rapportée chez une famille française de SLA. De plus, la possibilité qu’une mutation présente dans un autre gène impliqué dans la SLA ait un impact sur l’épissage du gène SOD1 est évaluée. Finalement, la dernière section explique la contribution de nouveaux gènes candidats chez les patients atteints de SLA. Spécifiquement, le rôle des gènes OPTN, SIGMAR1 et SORT1 dans le phénotype de SLA est évalué. Il est souhaité que nos résultats combinés avec les récents développements en génétique et biologie moléculaire permettent une meilleure compréhension du mécanisme pathologique responsable de cette terrible maladie tout en guidant le déploiement de thérapies suite à l’identification des cibles appropriées. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is the most common of motor neuron diseases, affecting 4-6 individuals per 100,000 individuals worldwide. ALS is characterized by muscle weakness and atrophy caused by the degeneration of neurons located in the motor cortex, brain stem and spinal cord. This fatal disease generally has an adult onset and progresses over a three to five year period. While 10% of patients affected have a family history of the disease, 90% of cases do not and are considered sporadic. The finding of mutations in the zinc/copper superoxide dismutase gene (SOD1) gene 19 years ago in about 15-20% of familial ALS (FALS) patients and approximately 2% of overall cases developed the interest of identifying rare genetics variants causing the disease. The ALS research field experienced a rapid progression during the last four years as mutations in new genes have been identified. While mutations in some of those new genes have been clearly linked to ALS, the role of others is still questionable and so far has not been positively replicated in other populations. Importantly, a significant portion of cases still need to be genetically explained and, unfortunately, there is still no effective treatment to cure, attenuate or prevent the disease. The aim of this Ph.D research project was to identify new ALS mutated genes while analysing the causative role of other newly identified genes in a large familial and sporadic ALS cohort of different origins. The results presented here are categorized into three different sections. First, the contribution of FUS mutations to familial, sporadic and juvenile ALS is analysed. Specifically, new FUS mutations are reported in ALS cases and the proportions of variants present in the tested familial and sporadic ALS cohorts are assessed. In addition, a new mutation is reported in a juvenile ALS patient, and this interesting case is discussed. Second, new genetic avenues are explored for the SOD1 gene. Precisely, a new and complex SOD1 mutation is reported in a French ALS family. Moreover, the possibility that other ALS mutated genes influence SOD1 splicing events is evaluated. Third, the contribution of new candidate genes is evaluated. Precisely, the contribution of OPTN, SIGMAR1 and SORT1 genes to the ALS phenotype is assessed. Hopefully, our different findings combined with recent developments in genetics and molecular biology will permit a better understanding of the pathological mechanisms involved in the disease and will lead to the identification of the right targets in order to develop appropriate therapeutics for ALS patients.