Orientador: Ana Maria Pires Soubhia / Resumo: Realizamos um estudo clínico, histopatológico e histoquímico utilizando a técnica de coloração pela prata, para evidenciação das regiões organizadoras de nucléolos (Agnor). Foram analisados 81 casos de biópsias incisionais de carcinoma espinocelular de boca de regiões diferentes, ou seja, lábio, língua, assoalho, palato e retromolar. Foram observados e analisados os dados com relação a sexo, cor, idade, grau de diferenciação, estadiamento e hábitos de fumar e beber. Esses dados analisados entre si revelaram que a maior incidência de carcinoma espinoceluar em nossos estudos foi de carcinoma de assoalho bucal em torno de 30% contrariando a literatura que se refere à língua como local de maior freqüência; os outros dados analisados foram todos concordantes com a literatura de vários autores. A análise quantitativa e morfométrica das Nors foram realizadas por um sistema computadorizado, Imagelab 2000 que analisa as imagens capturadas de um microscópio por uma câmera e transfere para o sistema computadorizado, onde são analisadas. Usando esse sistema analisamos lâminas coradas pela técnica Agnor para verificação do número de Nors, área das Nors, número de Núcleos e área dos Núcleos das células presentes em tecidos removidos por biópsia incisional de boca, em áreas diferentes. Pelos resultados obtidos na análise histoquímica podemos verificar que existe uma diferença significativa na proporção do número de Nors/Núcleo para as diferentes áreas analisadas, mas que são coerentes com a literatura em carcionoma bem diferenciado e moderadamente diferenciado. Notamos ainda diferenças significativas entre as áreas das Nors, área dos Núcleos e números dos Núcleos entre as regiões diferentes analisadas e não conclusiva, portanto necessitando de outros estudos com a técnica de Agnor para aprimoramento da mesma, elucidação de resultados e uso mais freqüente em laboratórios de Anatomia Patológica. / Abstract: We have carried out a clinical, histopathological and histochemical study using silver staining technique, to evidence the nucleolar organizing regions (Agnor). Eighty-one cases of incisional biopsies of oral squamous cell carcinoma from different regions of de mouth (lip, tongue, floor, palate and retromolar) have been observed and analyzed with regard to sex, race, age, degree of differentiation, staging and habit to smoke and to drink. The compared analyses of the data in our study indicated a greater incidence of oral floor cell carcinoma (about 30%) in disagreement with the current literature with mentions the tongue as the local of greater occurrence. The other analyzed data were all in agreement with the literature. The quantitative and morphometric analyses of the Nors have been carried out by a computerized system, Imagelab 2000 that analyzes the captured images of a microscope for a camera and transfers to the computerized system, where are analyzed. Using this system we have analyzed slides stained by the Agnor technique for verification of the number of Nors, area of the Nors, number of nuclei and area of the nuclei of the cells present in tissue removed by incisional biopsy of mouth in different areas. By the results gotten in the histochemical analysis we can verify that there is a significant difference in the ratio of the number of Nors/Nuclei for the different analyzed areas, but they are coherent with the literature for well differentiated and moderately differentiated carcinoma. We notice too significant differences between the areas of the Nors, area and de numbers of the nuclei among the different regions analyzed and not conclusive, therefore needing other studies with the Agnor technique for better interpretation of the results. / Doutor

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2016-03-01T16:46:11Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) PDF - Fernando Antônio Portela da Cunha Filho.pdf: 2695056 bytes, checksum: a131200985526e00580ae8e119325801 (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2016-04-12T17:26:00Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) PDF - Fernando Antônio Portela da Cunha Filho.pdf: 2695056 bytes, checksum: a131200985526e00580ae8e119325801 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-12T17:29:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) PDF - Fernando Antônio Portela da Cunha Filho.pdf: 2695056 bytes, checksum: a131200985526e00580ae8e119325801 (MD5) Previous issue date: 2015-07-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The squamous cell carcinoma (SCC) of lower lip is one of the most common malignancies of the head and neck region. Nevertheless, several aspects related to the progression of this lesion remain incompletely understood. Evidence shows that regulatory T cells (Tregs) play a major role in the suppression of the activity of various immune system cells, they may be involved in tumor progression and associated with the most aggressive biological behavior of various tumors. Despite these findings, there are few studies about the presence of these cell types in the SCC of lower lip. The objective of this study was to evaluate, through immunohistochemistry, the amount of Tregs cells (FoxP3+) in the microenvironment of SCCs of the lower lip and to relate this with clinicopathological parameters (tumor size / extent, regional nodal metastasis, distant metastasis, clinical stage and histopathological grade of malignancy). The sample consisted of 50 cases of SCC of the lower lip. Clinical data were obtained from medical records of patients and the histopathological grade of malignancy of the lesion was evaluated in the invasive front, according to the system proposed by Bryne et al. (1992). For the immunohistochemical study, lymphocytes exhibiting nuclear positivity for FoxP3 were counted in 10 microscopic fields at the tumor invasive front and the mean value was calculated for each case. Comparisons of the medians of Tregs cells according to clinicopathological parameters were performed using the nonparametric Mann-Whitney test. Possible associations between histopathological grade of malignancy and clinical parameters were analyzed by Fisher's exact test. The level of significance was set at 5% (p < 0.05). Most SCCs of the lower lip without regional nodal metastasis (n = 17; 81.0%) were classified as lowgrade malignancy (p < 0.001). In turn, the majority of patients in stages III and IV (n = 22; 84.6%) had high-grade tumors (p < 0.001). FoxP3+ lymphocytes were observed in all cases evaluated, with a tendency for higher amounts of these cell types, although not statistically significant, in lesions of small size, without regional nodal metastasis, and in early clinical stages (p > 0.05). Low-grade malignancy lesions revealed higher amount of FoxP3+ lymphocytes in comparison with high-grade tumors (p = 0.019), with medians of 16.00 and 6.60, respectively. Tumors with intense inflammatory infiltrate exhibited higher median of FoxP3+ lymphocytes (p = 0.035). Similarly, SCCs of the lower lip with well-delineated infiltrating borders or arranged in solid cords, bands and/ or strands showed greater median of FoxP3+ lymphocytes compared to tumors arranged in small groups (p = 0.003). No statistically significant differences were observed in the amount of FoxP3+ lymphocytes in relation to the degree of keratinization (p = 0.525) and the degree of nuclear pleomorphism (p = 0.343) in the lesions. The results of this study suggest the involvement of Treg cells in the modulation of immune and inflammatory responses in the microenvironment of SCCs of the lower lip. The role of these cells may be more important in the initial stages than in the advanced stages of lip carcinogenesis. / O carcinoma de células escamosas (CCE) de lábio inferior é uma das neoplasias malignas mais comuns da região de cabeça e pescoço. Apesar disso, vários aspectos relacionados à progressão dessa lesão permanecem incompletamente compreendidos. Evidências mostram que as células T regulatórias (Tregs), por desempenharem importante papel na supressão da atividade de diversas células do sistema imune, podem estar envolvidas na progressão tumoral e associadas ao comportamento biológico mais agressivo em várias neoplasias. A despeito desses achados, investigações a respeito da presença desses tipos celulares nos CCEs de lábio inferior são escassas. O objetivo deste estudo foi avaliar, por meio de imunoistoquímica, a quantidade de células Tregs (FoxP3+) no microambiente de CCEs de lábio inferior e relacioná-la com parâmetros clínico-patológicos (tamanho/ extensão do tumor, metástase em nodos regionais, metástase à distância, estádio clínico e grau histopatológico de malignidade). A amostra foi constituída por 50 casos de CCE de lábio inferior. Os dados clínicos foram obtidos a partir dos prontuários médicos dos pacientes e o grau histopatológico de malignidade da lesão foi avaliado no front de invasão tumoral, de acordo com o sistema proposto por Bryne et al. (1992). Para o estudo imunoistoquímico, foram quantificados, em 10 campos microscópicos ao longo do front de invasão tumoral, os linfócitos exibindo positividade nuclear para o FoxP3 e, em seguida, determinada a média de células Tregs para cada caso. As comparações das medianas das células Tregs em relação aos parâmetros clínico-patológicos foram realizadas por meio do teste não paramétrico de Mann-Whitney. Possíveis associações do grau histopatológico de malignidade das lesões com os parâmetros clínicos foram avaliadas por meio do teste exato de Fisher. O nível de significância foi estabelecido em 5% (p < 0,05). A maioria dos CCEs de lábio inferior sem metástase nodal regional (n = 17; 81,0%) foram classificados como de baixo grau de malignidade (p < 0,001). Por sua vez, a maioria dos pacientes nos estágios III e IV (n = 22; 84,6%) apresentaram tumores de alto grau de malignidade (p < 0,001). Foram observados linfócitos FoxP3+ em todos os casos avaliados, com uma tendência a uma maior quantidade destes tipos celulares, sem diferenças estatisticamente significativas, em lesões de menor tamanho, sem metástase nodal regional e em estádios clínicos iniciais (p > 0,05). Lesões de baixo grau de malignidade revelaram maior quantidade de linfócitos FoxP3+ em comparação com as de alto grau (p = 0,019), com medianas de 16,00 e 6,60, respectivamente. Tumores com intenso infiltrado inflamatório exibiram maior mediana de linfócitos FoxP3+ (p = 0,035). De forma similar, CCEs de lábio inferior com bordas infiltrativas bem delimitadas ou arranjados em cordões, bandas e/ ou trabéculas sólidas revelaram maior mediana de linfócitos FoxP3+ em comparação com tumores arranjados em pequenos grupos celulares (p = 0,003). Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas na quantidade de linfócitos FoxP3+ em relação ao grau de ceratinização (p = 0,525) e ao grau de pleomorfismo nuclear (p = 0,343) nas lesões. Os resultados do presente estudo sugerem a participação das células Tregs na modulação das respostas imunes e inflamatórias no microambiente dos CCEs de lábio inferior. O papel desempenhado por estas células pode ser mais importante em estágios iniciais do que em estágios avançados da carcinogênese labial.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:25:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 NADIA DO LAGO COSTA.pdf: 608666 bytes, checksum: 23e2ae20a38159f1979bd765af9f7bd5 (MD5) Previous issue date: 2012-08-21 / Tumor-Associated Macrophages (TAMs) can contribute with events involved in the progression and in the invasion of the tumor (angiogenesis, degradation of the extracellular matrix and local immunosuppression), or collaborate with an effective antitumor response and reduce the progression and metastasis. The purpose of these studies was to evaluate the macrophages (MA) presence in the microenvironment of oral cavity squamous cell carcinoma (OCSCC), and the relationship of these cells with clinicopathological factors. Additionally, we aimed also to characterize these cells through the expression of pro (IL-12/23 e INF-&#947;) and anti-inflammatory (IL-10 and TGF-&#946;) by macrophages and globally in selected samples. Besides that, considering these goals, the techniques of immunohistochemistry, flow cytometry and qRT-PCR were used. The results revealed, even with the flow cytometry technique, that a predominance of M2 phenotype macrophage in the tumor microenviromment of OCSCC, because the proportion of macrophages expressed both cytokines IL-10/TGF-&#946; (10.8%) was higher compared cytokines IL12/23/INF-&#947; (5.7%). Demonstrated although that a high proportion of MA (CD11b+CD11c-) present in OCSCC expressed cytokines IL-10, INF-&#947; and TGF-&#946; compared to the control group, however this difference was significant only for TGF-&#946; (Mann Whitney; P = 0,016). The evaluation of the expression of messenger RNA (mRNA) by qRT-PCR technique revealed a high overall expression of cytokines TGF-&#946;, IL-10 and IL-23 in OCSCC in metastatic when compared with control (P < 0,05 for all groups). The proportion of macrophages (CD68+), identified by immunohistochemistry technique, was significantly lower in the control group (normal oral mucosa) when compared to OCSCC groups with and without cervical lymph node metastasis (Mann Whitney; P = 0,00001 e P = 0,044, respectively). Additionally, the proportion of these cells was significantly higher in metastatic OCSCC when compared with non-metastatic (Mann Whitney; P = 0,038). Survival analysis showed that patients with a high proportion of CD68+ cells showed a trend toward shorter survival (44 months) than those with low proportion of these cells (93 months) (Kaplan-Meier; Log Rank, P = 0,08). In conclusion, the results suggest that there is a predominance of the M2 phenotype on the microenviromment of OCSCCC. Additionally, these cells may promote metastasis and reduce survival of patients affected by OCSCC, probably contributing to a local immunosuppression via TGF-&#946; production. / Os macrófagos associados ao tumor (MATs) podem contribuir com eventos envolvidos tanto na progressão e invasão tumoral (angiogênese, degradação da matriz extracelular e imunossupressão local), quanto para impedir ou reduzir a infiltração local e metástase através de eventos de combate ao tumor. O objetivo desse estudo foi avaliar os macrófagos (MA) presentes no microambiente do carcinoma espinocelular de cavidade oral (CECCO), bem como a relação dessas células com fatores de prognóstico clínicos e microscópicos. Além disso, objetivou-se caracterizar essas células através da expressão das citocinas pró (IL-12/23 e INF-&#947;) e anti-inflamatórias (IL-10 e TGF- &#946;) pelos macrófagos e na totalidade das amostras selecionadas. Considerando esses objetivos, as técnicas de imunoistoquímica, citometria de fluxo e PCR quantitativo (qRT-PCR) foram utilizadas. Os resultados revelaram, com a técnica da citometria de fluxo, que há, no microambiente do CECCO, um predomínio do macrófago fenótipo M2, pois a proporção dessas células que expressaram simultaneamente as citocinas IL-10/TGF-&#946; (10,8%) foi maior quando comparado as citocinas IL12/23/INF-&#947; (5,7%). Demonstrou-se, ainda, que uma alta proporção dos MA (CD11b+CD11c-) presentes no CECCO expressaram as citocinas IL-10, INF-&#947; e TGF-&#946; quando comparado ao grupo controle, no entanto esta diferença foi significativa apenas para o TGF-&#946; (Mann Whitney; P = 0,016). A avaliação da expressão do RNA mensageiro (mRNA) pela técnica do qRT-PCR revelou uma alta expressão total das citocinas TGF-&#946; , IL-10 e IL-23 no CECCO metastático quando comparado ao controle (P < 0,05 para todos os grupos). A proporção de macrófagos CD68+, identificados pela técnica da imunoistoquímica, foi significativamente menor no grupo controle (mucosa bucal saudável) quando comparado aos grupos de CECCO com e sem metástase em linfonodo cervical (Mann Whitney; P = 0,00001 e P = 0,044, respectivamente). Adicionalmente, a proporção dessas células foi significativamente maior no grupo de CECCO metastático quando comparado ao não metastático (Mann Whitney; P = 0,038). A análise da sobrevida demonstrou que os pacientes com uma alta proporção de macrófagos CD68+ apresentaram uma tendência ao menor tempo de sobrevida (44 meses) do que aqueles com baixa proporção dessas células (93 meses) (Kaplan-Meier; Log Rank, P = 0,08). Em conclusão, os resultados sugerem que há no microambiente do CECCO um predomínio do fenótipo M2. Adicionalmente, essas células podem favorecer a metástase e reduzir a sobrevida de pacientes acometidos pelo CECCO, provavelmente contribuindo com uma imunossupressão local via produção de TGF-&#946;.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-01-17T10:39:11Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Mariana Quirino Silveira Soares - 2013.pdf: 13435092 bytes, checksum: 9f0cdc0e0760b610575d58eeeda768a1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-01-17T10:39:45Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Mariana Quirino Silveira Soares - 2013.pdf: 13435092 bytes, checksum: 9f0cdc0e0760b610575d58eeeda768a1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-17T10:39:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Mariana Quirino Silveira Soares - 2013.pdf: 13435092 bytes, checksum: 9f0cdc0e0760b610575d58eeeda768a1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2013-08-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / E-cadherin (E-cad), β-catenin (β-cat), α2β1 and α3β1 integrins play important roles in cell adhesion, and alterations of their expression have been reported in several neoplasms. Nevertheless, their participation in oral squamous cell carcinoma (OSCC) progression and metastasis remains controversial. The aim of this study was to investigate the immunoexpression of E-cad, β-cat, α2β1 and α3β1 integrins in non-metastatic and metastatic OSCC and in metastatic cells of positive cervical lymph nodes. Molecules’ immunoexpression was evaluated in forty samples of OSCC in Lesion’s Center (LC), Invasive Tumor Front (ITF) and in Metastatic Lymph Node Cells (MLNC) and classified as low expression (<50%) or high expression (≥50% ). Low cytoplasmic membrane expression and high cytoplasmic expression of E-cadherin was observed in LC and in the ITF in non-metastatic and metastatic groups. In LC, the β-catenin presented significantly lower expression in cytoplasmic membrane in metastatic OSCC (p= 0.013) and in ITF low expression was noticed in both groups. Integrins presented highly granular cytoplasmic expression regardless of the presence of metastasis in LC or ITF. When molecules’ expression was compared in metastatic OSCC in LC, ITF and MCLN, E-cadherin and β-catenin presented a significant decrease of cytoplasmic membrane (p= 0.007 and p= 0.043, respectively) and cytoplasmic expression (p= 0.021 and p= 0.002, respectively). Integrins presented high cytoplasmic expression in LC, ITF and MCLN. In conclusion, abnormal expression of E-cad and β-cat with loss of membranous and high cytoplasmic expression added to high expressiveness of α2β1 and α3β1 integrins suggest that these molecules contribute to lymph node metastasis in OSCC. / A E-caderina (E-cad), β-catenina (β-cat), integrinas α2β1 e α3β1 desempenham papéis importantes na adesão celular e alterações de sua expressão têm sido relatadas em diversos tipos de neoplasias. No entanto, sua participação na progressão e metastase do carcinoma espinocelular oral (CEC) permanece controversa. O objetivo deste estudo foi investigar a imunoexpressão da E-cad, β-cat e integrinas α2β1 e α3β1 na CEC não-metastático e metastático e em células metastáticas de linfonodos cervicais positivos. A imunoexpressão das moléculas foi avaliada em quarenta amostras de CEC, no centro de Lesão (CL), fronte de invasão tumoral (FIT) e nas células neoplasicas de linfonodos metastáticos (CNLM) e as amostras foram classificadas como baixa expressão (<50%) ou alta expressão (≥ 50%). A baixa expressão em membrana citoplasmática de E-cad e elevada expressão citoplasmática foi observada no CL e no FIT nos grupos não metastático e metastático. No CL, a β-cat apresentou significativamente menor expressão em membrana citoplasmática no CEC metastático (p= 0,013) e no FIT foi observada baixa expressão nos grupos metastáticos e não metastáticos. As integrinas apresentaram alta expressão citoplasmática granular, independentemente da presença de metástases no CL e no FIT. Quando a expressão das moléculas foi comparada no CEC metastático no CL, FIT e nas CNLM, a E-cad e a β-cat apresentaram uma diminuição significativa de expressão em membrana celular (p= 0,007 e p= 0,043, respectivamente) e em citoplasma (p= 0,021 e p= 0,002, respectivamente). Integrinas apresentaram alta expressão citoplasmática no CL, FIT e CNLM. Em conclusão, a expressão anormal de E-cad e β-cat com perda de expressão em membrana citoplasmática e alta expressão em citoplasma somada à alta expressividade de integrinas α2β1 e α3β1 sugerem que essas moléculas contribuem para a metástase em linfonodal em CEC.

A radiação ultravioleta (UV) do sol é a principal responsável pelo desenvolvimento do câncer de pele não-melanoma. A radiação UV induz efeitos biológicos, que promovem a fotocarcinogênese, agindo diretamente sobre o DNA, provocando mutações. Porém, tudo indica que há um efeito indireto, que induz imunossupressão. O fenômeno fisiológico da imunotolerância, que é responsável pela prevenção de doenças autoimunes e pela modulação da resposta inflamatória, pode ser aproveitado por determinadas neoplasias para escaparem do controle imunológico e reforçado pela radiação UV. Os personagens principais da imunotolerância no ambiente tumoral são células dendríticas imaturas e linfócitos T reguladores (Treg), além de inúmeras citocinas imunossupressoras. Com o objetivo de avaliar a imunotolerância na fotocarcinogênese em lábio, foram analisadas, por meio da técnica de imuno-histoquímica, 75 amostras de material fixado e emblocado em parafina, sendo 44 casos de queilite actínica (QA) nos três graus de displasia epitelial (discreta, moderada e intensa), 18 casos de carcinoma epidermoide de lábio (CEL) e 12 espécimes representativos de lábio normal (LN). Tais amostras foram submetidas aos anticorpos anti-CD83, anti-DEC-205, anti-FOXP3, anti-CD1a e anti-CD207. Foi efetuada a contagem de células em 3 campos significativos, escolhidos aleatoriamente, e obtida a média de células contadas/campo. Assim, os resultados mostraram uma grande quantia de linfócitos Treg FOXP3+ tanto no CEL como na QA. Também houve uma expressão acentuada de DEC-205 nos casos estudados. Quanto à presença de células de Langerhans CD207+ e CD1a+, notou-se um acúmulo no epitélio das lesões de QA e nas ilhotas do CEL, além de algumas células estarem presentes no tecido conjuntivo. Já para o marcador CD83, a contagem de células positivas foi baixa em relação aos demais marcadores tanto no CEL como na QA. Portanto, sugere-se um microambiente imunotolerante tanto no início, quanto no estabelecimento do processo da fotocarcinogênese em lábio. / Ultraviolet radiation (UV) is the main cause of non-melanoma skin cancer and induces biological effects that promote photocarcinogenesis by causing mutations directly on DNA. However, there seems to be an indirect effect, which induces immunosuppession. The physiological phenomenon of immune tolerance, which is responsible for the prevention of autoimmune diseases and the modulation of inflammatory response, may be used by certain tumors to escape immune control. This phenomenon is enhanced by UV radiation. Immature dendritic cells, regulatory T cells (Treg), and also several immunosuppressive cytokines play a central role in immune tolerance associated to the tumor environment. In order to assess the immune tolerance in lip photocarcinogenesis, we analyzed 75 samples represented by 44 cases of actinic cheilitis (AC), 18 cases of lip squamous cell carcinoma (LSCC) and 12 specimens of normal lip. Sections were submitted by means of immunohistochemistry, to the antibodies against CD83, DEC-205, FOXP3, CD1a and CD207. Positive cells for each marker were counted in three high-power fields in each section and the results expressed by the mean number of cells per field. The results showed a large amount of Treg FOXP3+ in both AC and LSCC. There was also a strong staining for DEC-205 in the cases studied. There were an increased number of CD1a+/CD207+ Langerhans cells in the AC epithelium and LSCC islets, as well as a few cells in the connective tissue. For the marker CD83, the count of positive cells was low compared to other markers for both lesions. Therefore, we suggest an immune tolerant microenvironment both at the beginning, and in the establishment of the lip photocarcinogenesis process.

Estudos funcionais in vitro são essenciais para a compreensão do papel de miRNAs, pequenas moléculas de RNA que desempenham papel importante na regulação gênica, no câncer. Neste estudo analisamos a viabilidade de linhagens celulares derivadas de carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço (CECP), queratinócitos orais provenientes de culturas primárias e queratinócitos imortalizados, como modelos para estudos funcionais de miRNAs previamente identificados como desregulados nesse tipo de carcinoma: miRNA-1, miRNA-7, miRNA-10b e miRNA- 196a. Com este fim avaliamos inicialmente a expressão dos quatro miRNAs em todos os tipos celulares propostos através de reações em cadeia da polimerase em tempo real específicas. As linhagens celulares de carcinoma epidermoide de boca foram previamente caracterizadas quanto ao seu perfil de sequências de DNA do tipo STR (do inglês Short Tandem Repeats ou repetições curtas em sequência) com o objetivo de confirmar a identidade da linhagem. Foram realizados ensaios para a super-expressão e inibição da expressão destas quatro moléculas na linhagem SCC25 e em queratinócitos orais derivados de cultura primária e, uma vez constatado o sucesso da transfecção, avaliamos, para cada caso, a expressão de alvos (mRNAs) validados na literatura. O impacto destas intervenções em proliferação celular, um importante processo desregulado em câncer, também foi avaliado. Os resultados apontam diferenças significativas na expressão dos miRNAs entre linhagens celulares passíveis de serem utilizadas como modelos para estudos funcionais em carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço. Ressaltam-se diferenças entre linhagens de carcinoma de língua e de faringe, bem como diferenças expressivas entre a linhagem de queratinócitos orais imortalizados e queratinócitos orais normais provenientes de culturas primárias. Conclui-se que cada modelo celular possui características particulares que os tornam mais ou menos adequados para um determinado estudo. A inibição da expressão de genes alvo em função da super-expressão do miRNA regulador foi observada apenas em parte das situações avaliadas. Este resultado decorre do fato que um alvo é regulado por diferentes miRNAs, bem como por diversos outros fatores genéticos e/ou epigenéticos, que podem variar de acordo com modelo estudado. Este resultado ressalta o fato de que seleção cuidadosa das linhagens é fundamental para conclusões precisas em estudos funcionais. A super- expressão de miRNA-10b e miRNA-196a afetou significativamente a progressão do ciclo celular tanto em SCC25 quanto em queratinócitos orais em cultivo, sugerindo um possível papel em CECP relacionado ao controle da proliferação celular. / Functional in vitro studies are fundamental for the comprehension of the role of microRNAs, small noncoding RNA molecules that function as posttranscriptional regulators, in cancer. The aim of this study was to determine the applicability of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human oral keratinocytes as models for functional studies of microRNAs previously identified as deregulated in squamous cell carcinomas of the head and neck: miRNA-1, miRNA-7, miRNA-10b e miRNA-196a. The expression level of the four microRNAs was assessed in cell lines and in primary cultures of oral keratinocytes using specific real-time polymerase chain reactions. The identity of oral squamous cell carcinoma cell lines was confirmed by means of STR (Short Tandem Repeats) profiling. We performed gainof- function and loss-of-function experiments in a HNSCC cell line, SCC25, as well as in normal human keratocytes. After successful transfection, we evaluated the expression of selected target genes. Significant differences in microRNA gene expression were observed between squamous cell carcinoma cell lines, particularly between cells lines from distinct sub-sites, and between primary culture of human keratinocytes and the immortalized keratinocyte cell line. Thus, each cell model possesses a characteristic phenotype; while one may be useful for a particular study, it may be inappropriate for another. The down-regulation of selected target genes was not observed after the over-expression of all miRNAs studied, an expected result since gene targets might be regulated by more than one microRNA, as well as by genetic and epigenetic mechanisms which are not common among all cell types. There is, therefore, an imperative for cautious selection of suitable cell lines for functional studies in cancer. Finally, the over-expression of miR-10b and miR-196a clearly interfered with cell cycle progression, suggesting a possible role in cell proliferation control for these molecules in HNSCC.

Objetivo: Verificar a presença da expressão imunoistoquímica das Citoqueratinas (CKs) 7 e 8 nas células do Carcinoma epidermóide localizado em assoalho bucal (CEAB), estabelecendo a especulação de que essa neoplasia tem origem no epitélio de transição entre o ducto excretor da glândula salivar e a mucosa oral de superfície. Métodos: Noventa e dois casos de CEAB foram avaliados através da técnica imunoistoquímica da streptavidina/biotina, utilizando-se anticorpos monoclonais anti-CKs 7 e 8. Resultados: Setenta e oito casos (84,78%) mostraram positividade para as CKs estudadas. Quarenta e cinco casos (48,9%) mostraram positividade para CK7 e Sessenta seis casos (71,7%) para CK8. Conclusão: Houve uma intensa marcação celular das CKs estudadas. Os resultados encontrados indicam a participação do epitélio de transição entre os ductos excretores das glândulas salivares e a mucosa bucal de revestimento, na gênese dos carcinomas epidermóides nessa localização. Objetivo: Verificar a presença da expressão imunoistoquímica das Citoqueratinas (CKs) 7 e 8 nas células do Carcinoma epidermóide localizado em assoalho bucal (CEAB), estabelecendo a especulação de que essa neoplasia tem origem no epitélio de transição entre o ducto excretor da glândula salivar e a mucosa oral de superfície. Métodos: Noventa e dois casos de CEAB foram avaliados através da técnica imunoistoquímica da streptavidina/biotina, utilizando-se anticorpos monoclonais anti-CKs 7 e 8. Resultados: Setenta e oito casos (84,78%) mostraram positividade para as CKs estudadas. Quarenta e cinco casos (48,9%) mostraram positividade para CK7 e Sessenta seis casos (71,7%) para CK8. Conclusão: Houve uma intensa marcação celular das CKs estudadas. Os resultados encontrados indicam a participação do epitélio de transição entre os ductos excretores das glândulas salivares e a mucosa bucal de revestimento, na gênese dos carcinomas epidermóides nessa localização. / Objetive: The aim of this study is to verify the presence of Citokeratin7 (CK7) and Citokeratin 8 (CK8) positive cells of OSCC of the floor of the mouth establishing a speculation if this neoplasia has origin in excretory salivary duct epithelia transition to floor of the mouth mucosa. Methods: Ninety two cases of OSCC of the floor of the mouth were evaluated by straptavidin/biotin complex immunohistochemical technique and anti-CK7 and anti-CK8 monoclonal antibodies were used. Results: Seventy eight cases (84,78%) showed positive for one of the CKs; Forty five cases (48,9%) showed positive for CK7 and Sixty six cases (71,7%) showed positive for CK8. Conclusions: There is a high and significantly incidence of the immunoexpression of this citokeratins. These results suggest that the excretory salivary duct epithelia transition to floor of the mouth mucosa participates on the genesis of the OSCC in this location.

A leucoplasia é a mais comum das lesões potencialmente malignas (LPM) da mucosa bucal acometendo cerca de 2% da população. A via PI3K- AKT-mTOR, tem papel importante na carcinogênese em diversos tumores, incluindo o câncer de cabeça e pescoço e estudos têm apontado os inibidores do mTOR como promissores agentes de avaliação terapêutica. Desta forma, no presente estudo avaliamos a expressão imuno-histoquímica de lesões bucais diagnosticadas clinicamente como leucoplasias, comparando-as com carcinomas espinocelulares (CEC), hiperqueratoses irritativas (HI) e mucosa normal (MN). Foram avaliados 186 casos, divididos em 5 grupos tais como displasia epitelial de alto risco (DAR), displasia epitelial de baixo risco (DBR), CEC, HI e MN. Os casos foram retirados do arquivo do Serviço de Patologia Cirúrgica da Disciplina de Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo. As informações clínicas, relativas ao sexo e idade dos pacientes e localização das lesões foram compiladas. Todas as lesões selecionadas foram observadas ao HE por dois patologistas, ao microscópio de luz para confirmação dos diagnósticos. As proteínas pesquisadas incluiram: pAKT, pmTOR, pS6, e p4EBP1. A marcação dos diversos anticorpos foi quantificada com o auxílio da aquisição de imagens realizada com o uso de um fotomicroscópio. Na imagem capturada (aumento de 400x), foi observada a presença ou ausência de células marcadas, bem como, numa segunda análise, a quantidade percentual das mesmas. Na primeira análise, o padrão de marcação foi classificado em positivo e negativo e, na segunda, foi classificado em graus de 0 a 3. As variáveis do estudo foram avaliadas pelos testes Qui-quadrado e o teste F, ANOVA e posteriormente foi realizada uma regressão logística univariada. Entre todos os casos de mucosa oral normal, foi encontrada positividade somente para o anticorpo pS6, em 50%dos casos; nas HI houve marcações positivas para a pS6 (em 54,8% dos casos) e p4EBP1 (em 22,6% dos casos). Nas DBR foi observada a imunorreatividade aos anticorpos pS6 (em 67,4% dos casos), pAKT(em 56,2% dos casos), p4EBP1(em 41,7%dos casos) e pmTOR (em 29,2% dos casos), já nas DAR houve positividade para a pS6 (em 74% dos casos), pAKT (em 68% dos casos), p4EBP1 (em 44% dos casos) e pmTOR (em 28% dos casos). Os CECs expressaram pAKT ( em 83,3% dos casos), pS6 (em 77,4% dos casos), p4EBP1(em 50% dos casos) e pmTOR (em 50%dos casos). Quando se considerou o resultado da marcação positiva ou negativa, houve diferença estatisticamente significante, ente os grupos, em relação ao número de casos que expressaram as proteínas pAKT, pmTOR e p4EBP1, sendo que o grupo dos CECS foi o que apresentou maior frequência de imunorreatividade para todos os anticorpos estudados. Comparando-se apenas as lesões de CEC e DEO, observou-se que mais casos de CEC foram positivos para pAKT e pmTOR e não observou-se diferença na expressão do p4EBP1. Logo, podemos concluir que todas as proteínas estudadas, exceto a pS6, representam bons biomarcadores no que se concerne à diferenciação entre MN, HI, DEO e CEC. Entretanto somente as proteínas pAKT e pmTOR podem ser relacionadas à carcinogênese oral . / Leukoplakia is the most common potentially malignant lesion (PML) of the oral cavity affecting approximately 2% of the population. PI3K-AKT-mTOR pathway plays an important role in carcinogenesis in many tumors, including head and neck cancer, and several studies have showed mTOR inhibitors as promising therapeutic agents. In this study we evaluated the immunohistochemical expression of oral lesions diagnosed clinically as leukoplakia and squamous cell carcinoma (SCC), comparing them to normal mucosa (NM) and frictional hyperkeratosis (FR). We evaluated 186 cases, divided into 5 groups including high risk dysplasia (HRD), low risk dysplasia (LRD), SCC, NM and FR. The cases were obtained from the archives of the Oral Pathology Laboratory of the School of Dentistry of the University of São Paulo. Clinical information regarding sex, age of the patient and location of the lesions were compiled. The slides (HE staining) were observed by two pathologists and all cases were re-evaluated under light microscope. The proteins investigated were: pAKT, pmTOR, PS6, and p4EBP1. The staining pattern of the antibodies was quantified by acquiring images using a photomicroscope. In the captured image (400x magnification), the total of counted labeled cells, were divided by the total number of cells present in the field captured. The staining pattern was classified into positive and negative and also divided into degrees starting from 0 to 3. The study variables were evaluated by chi-square test, ANOVA F and univariate logistic regression analysis. Among all the cases of MN, positivity was found only for pS6 (50% of cases); in FH cases immunoreactivity was observed in pS6 (54.8% of cases) and 4EBP1 (22.6% of cases). In LRD immunoreactivity was observed in pS6 (67.4% of cases), pAKT (56.2% of cases), p4EBP1 (41.7% of cases) and pmTOR (29.2% of cases), while for HRD cases positivity was found for pS6 (74% of cases), pAKT (68% of cases), p4EBP1 (44% of cases) and pmTOR (28% of cases). In SCCs cases positivity was found for pAKT (83.3% of cases), PS6 (77.4% of cases), p4EBP1 (50% of cases) and pmTOR (50% of cases). Statistically significant differences were observed in all positive study groups for the proteins pAKT, pmTOR and p4EBP. After the evaluation of SCC and the oral dysplasia groups, there were statistically significant differences for the study groups that showed imunorretivity for the proteins pAKT and pmTOR. Therefore, we conclude that all the proteins of the study are good biomarkers to differentiate normal tissue from OD and SCC, but only pAKT and pmTOR proteins could be related to carcinogenesis.

O carcinoma epidermoide bucal (CEB) é uma malignidade epitelial que causa grande mortalidade. As metalotioneínas (MTs) são proteínas envolvidas na homeostasia de metais e eventos oxidativos. Estudos de expressão proteica a apontaram como marcadora de prognóstico e comportamento metastático para o CEB. A análise da expressão gênica das mesmas tem auxiliado no entendimento deste papel para outros tumores, mas ainda não foi estudada no CEB. O objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil de expressão gênica das MTs no CEB e em fragmentos de mucosa oral (MOC), além de sua relação com dados clínicopatológicos, comportamento metastático e prognóstico. Para tal, foram utilizadas amostras armazenadas a -80º C no Banco Nacional de Tumores do Instituto Nacional de Câncer, constando de 35 casos de CEB de língua e/ou assoalho bucal e 35 MOC. Todos os fragmentos foram submetidos ao qRT-PCR com uso de TaqMan® para os genes: MT1A, MT1B, MT1E, MT1F, MT1G, MT1H, MT1X, MT2A, MT3 e MT4. A expressão dos genes MT1B e MT1H foi raramente detectada. Houve queda significativa de expressão dos genes MT1A, MT1X, MT3 e MT4 e aumento significativo de expressão de MT1F no CEB com relação à MOC. Casos de baixa expressão de MT1G tiveram pior prognóstico. A alta expressão de MT1X indicou casos não metastáticos e a alta expressão de MT3 indicou casos metastáticos. Em suma, foi demonstrado pela primeira vez o perfil gênico das MTs no CEB, indicando que a mesma pode fornecer informações sobre o prognóstico e comportamento metastático do CEB. / The oral squamous cell carcinoma (OSCC) is a malignancy that causes high mortality. Metallothioneins (MTs) are proteins involved in metal homeostasis and antioxidant events. Studies regarding its protein expression indicated its potential as marker of prognosis and metastatic behavior, also for OSCC. The analysis of its specific gene expression can clarify its importance in these aspects and no study has been done for OSCC. The aim of this work was to evaluate the profile of gene expression of MTs in OSCC and samples of non-neoplastic oral mucosa (OM), evaluating its relationship with clinic-pathologic characteristic, metastatic behavior and prognosis for OSCC. For this, tissue samples archived at -80º C at the National Bank of Tumors of the Brazilian National Institute of Cancer were collected, in a total of 35 cases of OSCC and 35 fragments of OM. All tissues were submitted to qRTPCR with TaqMan® for the genes: MT1A, MT1B, MT1E, MT1F, MT1G, MT1H, MT1X, MT2A, MT3 e MT4, besides the constitutive gene GAPDH. Expressions of MT1B and MT1H were rarely detected. There was significant loss of expression for MT1A, MT1X, MT3 and MT4 and gain of expression for MT1F comparing OSCC with OM. Cases with down-regulation of MT1G had the worst prognosis. Up-regulation of MT1X indicated non-metastatic cases whereas up-regulation of MT3 indicated metastatic ones. In conclusion, this study shows for the first time the profile of gene expression of MTs on OSCC indicating distinctive patterns of regulation for each, and giving associations with prognosis and metastatic behavior of cases.

A queilite actínica é uma lesão causada pela exposição excessiva aos raios ultra-violeta (UV). Atingindo mais homens a partir da 5º década de vida e de pele clara, possuindo grande potencial de malignização, quando originará o carcinoma epidermóide de lábio, a malignidade mais comum em boca. Seu diagnóstico na maioria das vezes é tardio e quando isto ocorre sua taxa de sobrevida é de apenas 5 anos. O processo de progressão da carcinogênese está relacionado com a quebra no balanço entre os processos de proliferação/diferenciação celular e apoptose. A survivina é uma proteína com importantes funções na inibição da apoptose e progressão da mitose. Sua expressão desregulada, presente na maioria dos cânceres humanos, está relacionada a um prognóstico pobre e uma diminuição na sobrevida dos pacientes. Acredita-se que ela participe de eventos chaves na carcinogênese. Pode ser gene alvo da b-catenina, uma proteína de adesão com funções de transcrição relacionada com a via Wnt. A b-catenina presente nas junções aderentes da membrana celular junto com a caderina- E, quando livre no citoplasma é translocada para o núcleo onde faz a transcrição de gens reguladores do ciclo celular. O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão imunoistoquímica da survivina e b-catenina nas lesões de queilite actínica e carcinoma epidermóide de lábio, e relacionar a expressão das duas proteínas e a participação na carcinogênese dessa lesão. Além disso, as lesões de queilite actínica foram classificadas quanto às alterações morfológicas por duas classificações: a proposta pela OMS, 2005 e por um sistema binário de graduação proposto por Kujan et al. em 2006. Foram realizadas reações de imunoistoquímica para verificação da expressão das duas proteínas. Os resultados mostraram, para b-catenina, expressão de membrana em todos os casos e marcação citoplasmática em 85% os casos de queilite actínica e marcação nuclear em 22%. A survivina foi positiva em 42% dos casos de queilite, com padrão de marcação irregular. Os carcinomas epidermóides foram positivos em 83% dos casos para b-catenina e nenhum deles teve marcação nuclear, e foram 100% positivos para survivina. Os resultados mostram alterações nas lesões de displasia, evidenciando o potencial maligno. Mais estudos são necessários para relacionar a expressão das duas proteínas e para esclarecer o papel da survivina na carcinogênese das lesões de lábio. / The actinic cheilitis is caused by excessive exposure to ultra violet (UV) radiation, most common in men after the 5º decade and fair skin, it has a great potencial of malignization, when it will become the squamous cell carcinoma of the lip, the malignancy most frequent in the mouth. The diagnosis is late in most cases which leads to a decrease of the survival to only 5 years. The progression of carcinogenesis is related to the balance between cell proliferation/ differenciation and apoptosis. Survivin is a protein with important functions on the inhibition of apoptosis and progression of mitosis. It?s desregulated expression, present in most human cancers, is related to a poor prognosis and a decrease of overall survival. Many authors believe that it participates and is key event on early carcinogenesis. Survivin might be a target gene of b-catenin, that is a adhesion protein with transcription functions related with the Wnt pathway. b-catenin is present in the adherens junctions of the cellular membrane in complex with the E-cadherin, and when free on the cytoplasm, it?s translocated to the nucleus, where it?s responsible for the transcription of cell-cycle regulators genes. The aim of the study was to evaluate the immunohystochemical expression of survivin and b-catenin in actinic cheilitis and squamous cell carcinoma lesions, and correlate the expression of the two proteins and the participation on the carcinogenesis of this lesion. Besides, the actinic cheilitis samples were classified as the epithelial changes by two methods: one proposed by the World Health Organization (WHO), in 2005 and the other, a binary system of graduation proposed by Kujan et al. in 2006. The results showed, for the b-catenin, membrane expression in all cases, and cytoplasmatic staining in 85% of the actinic cheilitis lesions, and 22% of nuclear staining. Survivin was positive in 42% of the actinic cheilitis, with an irregular pattern of staining. The squamous cell carcinomas were positives in 83% for b-catenin and none of them had nuclear staining, and were a 100% positive for survivin. The results showed alterations on the dysplasic lesions, proving their malignant potencial. More studies are needed to correlated the expression of the two proteins and to elucidate the role of survivin in the carcinogenesis of lip lesions.