INTRODUÇÃO: A maioria dos pacientes com CECP é diagnosticada em estágios avançados da doença, apresentando taxas de sobrevida insatisfatórias. Em carcinomas localmente avançados e irressecáveis, o tratamento padrão na rotina do ICESP é a QRT a base de cisplatina. Entretanto, cerca de dois terços desses pacientes apresentam recidiva local, à distância ou óbito em cinco anos. Entender os mecanismos de resistência a QRT e descobrir marcadores que possam indicar resposta ao tratamento continuam sendo um desafio. Os microRNAs possuem papel chave nos mecanismos de resistência a QRT, sendo possível quantificá-los em saliva. Neste estudo avaliamos a expressão de microRNAs na saliva de pacientes com CEC de cavidade oral e orofaringe e se esses microRNAs estão contidos dentro de microvesículas. MÉTODOS: Por meio de revisão da literatura e análises in sílico, selecionamos 8 microRNAs para serem avaliados: miR-15a-5p, 21-5p, 23a-3p, 125b-5p, 142-3p, 200b-3p, 296-5p e 503-5p. A expressão dos microRNAs foi determinada por PCR quantitativo na saliva livre de células de 70 pacientes portadores de CEC de cavidade oral e orofaringe localmente avançado e irressecável, em diferentes estágios da progressão da doença: antes de iniciar tratamento (G1), com falha do tratamento (G2) e livre da doença há 2 anos (G3) e em 28 voluntários sadios (G0). Microvesículas foram isolados por ultracentrifugação ou exoQuick, analisados por Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET), Nanosight e para determinação da expressão do miR-21-5p. RESULTADOS: Os miRs-296-5p e 503-5p foram indetectáveis na maioria das amostras testadas. Quando comparamos os grupos em diferentes situações clínicas, encontramos diferença significativa na expressão do miR-21-5p (p=0.005), miR-23a-3p (p=0,026), miR-125-5p (p=0,013), miR-142-3p (p=0,033) e miR-200b-3p (p=0,031). Observou-se aumento na expressão dos miRs 21-5p (p=0,001), 23a-3p (p=0,004), 125b-5p (p=0,026) e 142-3p (p=0,005) na saliva dos pacientes em G1 em relação ao voluntários sadios (G0). O grupo G3 também apresentou maior expressão do mir-21-5p (p=0,018), 125b-5p (p=0,002) e 200b-3p (p=0,014) comparado ao G0, assim como o grupo G2 teve maior expressão do mir-15a-5p (p=0,023) e 23a-3p (p=0,017) comparado ao grupo G0. O grupo G2 apresentou menor expressão do miR-200b-3p (p= 0,019) e maior expressão do miR-15a-5p (p=0,057) em relação ao grupo G3. Além disso, os pacientes tabagistas e/ou etilistas apresentaram maior expressão relativa do miR-21-5p (p=0,001 e p=0,046, respectivamente) e os etilistas também tiveram maior expressão do miR-200b-3p (p=0,013). Com relação à resposta inicial do paciente ao tratamento avaliada pelo médico bem como, com a resposta a longo prazo (recidiva, status global e prognóstico), a expressão dos miR-15a-5p, miR-125b-5p, miR-23a-3p e miR-142-3p apresentaram associação com sobrevida livre de progressão e sobrevida global, porém não atingiram significância estatística. Microvesículas foram detectadas na saliva tanto na MET como na contagem no nanosight. A expressão do miR-21-5p foi predominantemente detectada dentro de microveículas em relação ao sobrenadante livre de vesículas. CONCLUSÕES: Alguns dos microRNAs analisados foram diferencialmente expressos entre os diferentes grupos estudados, a expressão do miR-21 foi associada ao tabagismo e etilismo e a do miR-200b com etilismo e a expressão de alguns microRNAs podem estar associadas à resposta ao tratamento e ao prognóstico dos pacientes / BACKGROUND: Most patients with HNSCC are diagnosed in advanced stages of the disease, with unsatisfactory survival rates. In locally advanced and unresectable carcinoma, the standard treatment in ICESP is cisplatin based QRT. However, about two-thirds of these patients have local recurrence, distance or death within five years. Understanding the QRT resistance mechanisms and discovery of markers that may indicate benefit of treatment is a great challenge. MicroRNAs have key role in the mechanisms of QRT resistance and are detectable in saliva. In the present study we analyzed the expression of microRNAs in the saliva from oral cavity/oropharynx squamous cell carcinoma (OSCC) patients and whether these microRNAs are contained within exosomes. METHODS: Through a review of studies in the literature and by in silico analysis, we choose 8 microRNAs to be evaluated: miR-15a-5p, 21-5p, 23a-3p, 125b-5p, 142-3p, 200b-3p, 296-5p and 503-5p. The expression of microRNAs was determined by quantitative PCR in the cell-free saliva from 70 locally advanced and unresectable OSCC patients at different stages of disease progression: treatment naive (G1), after treatment failure (G2) and disease free for at least 2 years (G3) and 28 healthy volunteers (G0). Exosomes were isolated by ultracentrifugation or exoQuick, analyzed by transmission electron microscopy (MET), Nanosight quantification and by determination of the miR-21-5p expression. RESULTS: The miRs-296-5p and 503-5p were undetectable in almost all saliva samples. Significant differences was observed in the expression of miR-21-5p (p=0.005), miR-23a-3p (p=0.026), miR-125-5p (p=0.013) miR-142-3p (p=0.033) and miR-200b-3p (p=0.031) among the groups analyzed. The expression of miRs 21-5p (p=0.001), 23a-3p (p=0.004), 125b-5p (p=0.026) and 142-3p (p=0.005) were high in saliva of G1 patients as compared to heath volunteers (G0). The G3 group also showed higher expression of mir-21-5p (p=0.018), 125b-5p (p=0.002) and 200b-3p (p=0.014) and G2 presented higher expression of miR-15a-5p (p=0.023) and 23a-3p (p=0.017) as both compared to the G0. The group G2 presented lower expression of the miR-200b-3p (p=0.019) and higher expression of the miR-15a-5p (p=0.057) as compared to the G3 group. In addition, saliva from the smokers and/or drinkers patients showed high relative expression of the miR-21-5p (p=0.001 e p=0.046; respectively) compared to former drinker/smokers and drinkers also showed high expression of the miR-200b-3p (p=0.013). In relation to the initial response to treatment assessed by the physician, as well the long-term response (relapse, global status and prognosis), the expression of the miR-15a-5p, miR-125b-5p, miR-23a-3p e miR-142-3p showed association with progression-free survival and overall survival, however did not reach statistical significance. Microvesicles were detected in saliva by both MET as the count in nanosight. The expression of the miR-21-5p was predominantly detected in microvesicles in relation to the supernatant. CONCLUSIONS: Some of the microRNAs analyzed were differentially expressed between the different groups, the expression of the miR-21 was associated with smoking and drinking habits and of the miR-200b with drinking habits and the expression of some microRNAs may be associated with the treatment response and prognosis of the patients

A radiação ultravioleta (UV) do sol é a principal responsável pelo desenvolvimento do câncer de pele não-melanoma. A radiação UV induz efeitos biológicos, que promovem a fotocarcinogênese, agindo diretamente sobre o DNA, provocando mutações. Porém, tudo indica que há um efeito indireto, que induz imunossupressão. O fenômeno fisiológico da imunotolerância, que é responsável pela prevenção de doenças autoimunes e pela modulação da resposta inflamatória, pode ser aproveitado por determinadas neoplasias para escaparem do controle imunológico e reforçado pela radiação UV. Os personagens principais da imunotolerância no ambiente tumoral são células dendríticas imaturas e linfócitos T reguladores (Treg), além de inúmeras citocinas imunossupressoras. Com o objetivo de avaliar a imunotolerância na fotocarcinogênese em lábio, foram analisadas, por meio da técnica de imuno-histoquímica, 75 amostras de material fixado e emblocado em parafina, sendo 44 casos de queilite actínica (QA) nos três graus de displasia epitelial (discreta, moderada e intensa), 18 casos de carcinoma epidermoide de lábio (CEL) e 12 espécimes representativos de lábio normal (LN). Tais amostras foram submetidas aos anticorpos anti-CD83, anti-DEC-205, anti-FOXP3, anti-CD1a e anti-CD207. Foi efetuada a contagem de células em 3 campos significativos, escolhidos aleatoriamente, e obtida a média de células contadas/campo. Assim, os resultados mostraram uma grande quantia de linfócitos Treg FOXP3+ tanto no CEL como na QA. Também houve uma expressão acentuada de DEC-205 nos casos estudados. Quanto à presença de células de Langerhans CD207+ e CD1a+, notou-se um acúmulo no epitélio das lesões de QA e nas ilhotas do CEL, além de algumas células estarem presentes no tecido conjuntivo. Já para o marcador CD83, a contagem de células positivas foi baixa em relação aos demais marcadores tanto no CEL como na QA. Portanto, sugere-se um microambiente imunotolerante tanto no início, quanto no estabelecimento do processo da fotocarcinogênese em lábio. / Ultraviolet radiation (UV) is the main cause of non-melanoma skin cancer and induces biological effects that promote photocarcinogenesis by causing mutations directly on DNA. However, there seems to be an indirect effect, which induces immunosuppession. The physiological phenomenon of immune tolerance, which is responsible for the prevention of autoimmune diseases and the modulation of inflammatory response, may be used by certain tumors to escape immune control. This phenomenon is enhanced by UV radiation. Immature dendritic cells, regulatory T cells (Treg), and also several immunosuppressive cytokines play a central role in immune tolerance associated to the tumor environment. In order to assess the immune tolerance in lip photocarcinogenesis, we analyzed 75 samples represented by 44 cases of actinic cheilitis (AC), 18 cases of lip squamous cell carcinoma (LSCC) and 12 specimens of normal lip. Sections were submitted by means of immunohistochemistry, to the antibodies against CD83, DEC-205, FOXP3, CD1a and CD207. Positive cells for each marker were counted in three high-power fields in each section and the results expressed by the mean number of cells per field. The results showed a large amount of Treg FOXP3+ in both AC and LSCC. There was also a strong staining for DEC-205 in the cases studied. There were an increased number of CD1a+/CD207+ Langerhans cells in the AC epithelium and LSCC islets, as well as a few cells in the connective tissue. For the marker CD83, the count of positive cells was low compared to other markers for both lesions. Therefore, we suggest an immune tolerant microenvironment both at the beginning, and in the establishment of the lip photocarcinogenesis process.

A leucoplasia é a mais comum das lesões potencialmente malignas (LPM) da mucosa bucal acometendo cerca de 2% da população. A via PI3K- AKT-mTOR, tem papel importante na carcinogênese em diversos tumores, incluindo o câncer de cabeça e pescoço e estudos têm apontado os inibidores do mTOR como promissores agentes de avaliação terapêutica. Desta forma, no presente estudo avaliamos a expressão imuno-histoquímica de lesões bucais diagnosticadas clinicamente como leucoplasias, comparando-as com carcinomas espinocelulares (CEC), hiperqueratoses irritativas (HI) e mucosa normal (MN). Foram avaliados 186 casos, divididos em 5 grupos tais como displasia epitelial de alto risco (DAR), displasia epitelial de baixo risco (DBR), CEC, HI e MN. Os casos foram retirados do arquivo do Serviço de Patologia Cirúrgica da Disciplina de Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo. As informações clínicas, relativas ao sexo e idade dos pacientes e localização das lesões foram compiladas. Todas as lesões selecionadas foram observadas ao HE por dois patologistas, ao microscópio de luz para confirmação dos diagnósticos. As proteínas pesquisadas incluiram: pAKT, pmTOR, pS6, e p4EBP1. A marcação dos diversos anticorpos foi quantificada com o auxílio da aquisição de imagens realizada com o uso de um fotomicroscópio. Na imagem capturada (aumento de 400x), foi observada a presença ou ausência de células marcadas, bem como, numa segunda análise, a quantidade percentual das mesmas. Na primeira análise, o padrão de marcação foi classificado em positivo e negativo e, na segunda, foi classificado em graus de 0 a 3. As variáveis do estudo foram avaliadas pelos testes Qui-quadrado e o teste F, ANOVA e posteriormente foi realizada uma regressão logística univariada. Entre todos os casos de mucosa oral normal, foi encontrada positividade somente para o anticorpo pS6, em 50%dos casos; nas HI houve marcações positivas para a pS6 (em 54,8% dos casos) e p4EBP1 (em 22,6% dos casos). Nas DBR foi observada a imunorreatividade aos anticorpos pS6 (em 67,4% dos casos), pAKT(em 56,2% dos casos), p4EBP1(em 41,7%dos casos) e pmTOR (em 29,2% dos casos), já nas DAR houve positividade para a pS6 (em 74% dos casos), pAKT (em 68% dos casos), p4EBP1 (em 44% dos casos) e pmTOR (em 28% dos casos). Os CECs expressaram pAKT ( em 83,3% dos casos), pS6 (em 77,4% dos casos), p4EBP1(em 50% dos casos) e pmTOR (em 50%dos casos). Quando se considerou o resultado da marcação positiva ou negativa, houve diferença estatisticamente significante, ente os grupos, em relação ao número de casos que expressaram as proteínas pAKT, pmTOR e p4EBP1, sendo que o grupo dos CECS foi o que apresentou maior frequência de imunorreatividade para todos os anticorpos estudados. Comparando-se apenas as lesões de CEC e DEO, observou-se que mais casos de CEC foram positivos para pAKT e pmTOR e não observou-se diferença na expressão do p4EBP1. Logo, podemos concluir que todas as proteínas estudadas, exceto a pS6, representam bons biomarcadores no que se concerne à diferenciação entre MN, HI, DEO e CEC. Entretanto somente as proteínas pAKT e pmTOR podem ser relacionadas à carcinogênese oral . / Leukoplakia is the most common potentially malignant lesion (PML) of the oral cavity affecting approximately 2% of the population. PI3K-AKT-mTOR pathway plays an important role in carcinogenesis in many tumors, including head and neck cancer, and several studies have showed mTOR inhibitors as promising therapeutic agents. In this study we evaluated the immunohistochemical expression of oral lesions diagnosed clinically as leukoplakia and squamous cell carcinoma (SCC), comparing them to normal mucosa (NM) and frictional hyperkeratosis (FR). We evaluated 186 cases, divided into 5 groups including high risk dysplasia (HRD), low risk dysplasia (LRD), SCC, NM and FR. The cases were obtained from the archives of the Oral Pathology Laboratory of the School of Dentistry of the University of São Paulo. Clinical information regarding sex, age of the patient and location of the lesions were compiled. The slides (HE staining) were observed by two pathologists and all cases were re-evaluated under light microscope. The proteins investigated were: pAKT, pmTOR, PS6, and p4EBP1. The staining pattern of the antibodies was quantified by acquiring images using a photomicroscope. In the captured image (400x magnification), the total of counted labeled cells, were divided by the total number of cells present in the field captured. The staining pattern was classified into positive and negative and also divided into degrees starting from 0 to 3. The study variables were evaluated by chi-square test, ANOVA F and univariate logistic regression analysis. Among all the cases of MN, positivity was found only for pS6 (50% of cases); in FH cases immunoreactivity was observed in pS6 (54.8% of cases) and 4EBP1 (22.6% of cases). In LRD immunoreactivity was observed in pS6 (67.4% of cases), pAKT (56.2% of cases), p4EBP1 (41.7% of cases) and pmTOR (29.2% of cases), while for HRD cases positivity was found for pS6 (74% of cases), pAKT (68% of cases), p4EBP1 (44% of cases) and pmTOR (28% of cases). In SCCs cases positivity was found for pAKT (83.3% of cases), PS6 (77.4% of cases), p4EBP1 (50% of cases) and pmTOR (50% of cases). Statistically significant differences were observed in all positive study groups for the proteins pAKT, pmTOR and p4EBP. After the evaluation of SCC and the oral dysplasia groups, there were statistically significant differences for the study groups that showed imunorretivity for the proteins pAKT and pmTOR. Therefore, we conclude that all the proteins of the study are good biomarkers to differentiate normal tissue from OD and SCC, but only pAKT and pmTOR proteins could be related to carcinogenesis.

Objetivos: O objetivo deste estudo foi o de identificar compostos seletivamente tóxicos ao carcinoma espinocelular de boca in vitro por meio do reposicionamento de fármacos. Material e Métodos: Por meio de um escaneamento baseado na viabilidade celular de 1.280 fármacos, nós selecionamos três princípios ativos (luteolin, metixene hydrochloride e nitazoxanide) letais às células de câncer de boca SCC-25 e pouco tóxicos às células de queratinócitos cutâneos imortalizados HaCaT. Os fármacos candidatos foram investigados quanto à sua dose- e tempo-resposta bem como comparados e combinados à agentes quimioterápicos padrão por meio do ensaio por colorimetria com brometo de tiazolil azul de tetrazolio (MTT). O impacto dos fármacos na motilidade do SCC-25 e do HaCaT foi verificado pelo ensaio de migração celular e seus mecanismos de ação também foram explorados por meio da verificação dos níveis das proteínas fosforiladas pelo western blotting. Todos os experimentos foram realizados em triplicata e, pelo menos, três vezes independentes. O teste t de student foi utilizado para confrontar as variáveis e nível de significância de 5% foi estabelecido para todos os testes. Resultados: O flavonoide natural luteolin exerceu citotoxicidade potente contra as células de câncer de boca in vitro, apresentando baixa toxicidade ao HaCaT e alta eficiência quando comparado a quimioterápicos como a cisplatina e o AG1478. Do ponto de vista molecular, a luteolin ativou a via de sinalização do dano do DNA e, combinada com um inibidor do Chk, apresentou efeitos potencializados. Além disso, nós demonstramos que a nitazoxanide e o metixene hydrochloride são capazes de destruir células SCC-25 porém não as HaCaT de maneira proporcional à dose e ao tempo de tratamento. As combinações entre os três fármacos hit e com a cisplatina ou o AG1478 potencializaram seus efeitos contra as células malignas. Conclusões: O presente estudo traz a luteolin, o metixene hydrochloride e a nitazoxanide como fortes candidatos a agentes terapêuticos contra o câncer de boca uma vez que estes compostos apresentam maior eficácia contra células de câncer de boca e menor toxicidade contra células não tumorais in vitro do que agentes quimioterápicos convencionais. / Objectives: Here we aimed at identifying and reposition approved drugs that could be selectively toxic towards oral squamous cell carcinoma cells. Materials and Methods: Through a cell-based drug screening of 1,280 chemical molecules, we selected 3 compounds (luteolin, metixene hydrochloride, and nitazoxanide) lethal to oral cancer SCC-25 cells, while sparing immortalized keratinocyte HaCaT cells. The drugs were then further challenged for their time- and dose-responses, as well as their comparison and combination to standard chemotherapeutic agents by colorimetric assay 1-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenylformazan, Thiazolyl blue formazan (MTT). The impact on SCC-25 and HaCaT motility as well as the mode of action of the drugs was then further explored by scratching assay and western blotting, respectively. All the experiments were performed in triplicated and, at least, three independent times. Students t test was performed to verify the differences among the variables and the level of significance was set at 5%. Results: The natural flavonoid luteolin was a potent cytotoxic agent against oral cancer cells in vitro, presenting low toxicity against HaCaT cells and high efficiency as compared to standard-of-care, such as cisplatin and AG1478. From a molecular standpoint, luteolin coopted the DNA-damage pathway and could be efficiently combined with Chk pharmacological inhibitor. Moreover, we demonstrated that nitazoxanide and metixene hydrochloride kill the SCC-25 but not the HaCaT cells in a dose- and time-dependent. The combinations among the three drugs hit and with cisplatin and AG1478 improved their effect against the malignant cells. Conclusions: Luteolin, metixene hydrochloride, and nitazoxanide emerge as strong cytotoxic and/or adjuvant therapy in oral cancer, as these compounds present higher efficiency and lower toxicity against oral cancer cells in vitro than conventional chemotherapeutic agents.

O carcinoma de células escamosas (SCC) é um tumor maligno de origem epitelial no qual o receptor de fator de crescimento epidermal (EGFR) está superexpresso e associado a malignização. O cetuximabe é um anticorpo monoclonal, capaz de se ligar seletivamente ao EGFR. A combinação de cetuximabe com o quimioterápico hidrofílico 5-fluorouracil (5-FU) é utilizada na clínica pela via intravenosa e é associada a efeitos colaterais. A administração tópica de 5-FU também é realizada a partir de cremes convencionais, porém sua eficácia é limitada a doenças pré-cancerosas e o carcinoma basocelular. Estima-se que a conjugação do cetuximabe à superfície de lipossomas, os quais podem ser administrados na pele em associação a um método físico, como a iontoforese, seja capaz de direcionar a liberação do 5-FU para as camadas da pele onde os tumores estão presentes, além de aumentar o uptake celular em linhagem EGFR positiva, viabilizando o tratamento tópico de SCC. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência do cetuximabe conjugado a um lipossoma (imunolipossoma) na penetração cutânea passiva e iontoforética do 5-FU e na regressão do SCC. Para tanto, um método analítico e um método bioanalítico foram desenvolvidos e validados para quantificação de 5-FU. Lipossomas convencionais foram preparados a partir de diferentes composições lipídicas, métodos de preparo e razão fármaco/lipídeo para selecionar aqueles que encapsulassem maior porcentagem de 5-FU. Lipossomas compostos por 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina e colesterol (DSPC:Chol, 55:45), preparados por hidratação do filme lipídico, na razão fármaco/ lipídeo 0,1, de aproximadamente 140 nm, foram escolhidos por encapsularem cerca de 50% de 5-FU. Para obtenção dos imunolipossomas, o cetuximabe foi primeiramente conjugado ao lipídeo DSPE acoplado ao ligante maleimida(polietilenoglicol)-2000 (DSPE-PEG-Mal), resultando em 94% de eficiência de conjugação. Os imunolipossomas foram então obtidos da mesma forma que os lipossomas e apresentaram tamanho e porcentagem de encapsulação do 5-FU semelhante a apresentada pelos lipossomas. Estudo in vitro em linhagem EGFR positiva (A431) mostrou sinergismo entre 5-FU e imunolipossoma, resultando em valores de IC50 cerca de 3 vezes menores do que o apresentado pelo 5-FU em solução. O uptake celular do imunolipossoma foi 3,5 vezes maior do que o do lipossoma. Nos estudos de penetração cutânea in vitro observou-se que, em relação a uma solução de 5-FU, lipossomas e imunolipossomas diminuíram a quantidade de 5- FU que atravessou a pele. A iontoforese aumentou a penetração do 5-FU a partir de todas as formulações. Neste caso, o acúmulo de 5-FU na epiderme viável, onde os tumores estão presentes, foi duas vezes maior quando este estava encapsulado no imunolipossoma em relação ao lipossoma. In vivo, as formulações foram administradas por via subcutânea ou tópica usando iontoforese em modelo xenográfico de SCC. O tratamento com os imunolipossomas diminuiu o crescimento tumoral em mais de 60% em relação ao controle e em torno de 50% em relação aos tratamentos com solução e lipossoma de 5-FU. A administração tópica por iontoforese apresentou maior redução tumoral do que a subcutânea quando os tumores foram tratados com solução de 5-FU e lipossomas, mas foi igualmente eficaz para os imunolipossomas. Análise imunohistológica revelou que o potencial de proliferação celular foi reduzido para os grupos tratados. Desta forma, a administração por iontoforese de imunolipossomas contendo 5-FU é uma estratégia promissora para o tratamento tópico de SCC / Squamous cell carcinoma (SCC) is a malignant tumor of epithelial origin in which the epidermal growth factor receptor (EGFR) is overexpressed and associated with malignization. Cetuximab is a monoclonal antibody, able to selectively bind EGFR. The combination of the chemotherapy with the hydrophilic drug 5-fluorouracil (5- FU) and cetuximab is applied in the clinic by intravenous injection and is associated with side effects. Cetuximab conjugation onto liposomal surface, which can be administered topically onto the skin using physical methods, such as iontophoresis, is able to direct 5-FU release to the skin layers where tumors are localized and to increase cellular uptake in EGFR positive cells, making possible the topical treatment of SCC. Thus, the objective of this work was to investigate the influence of cetuximab conjugation to liposomes (immunoliposomes) in the passive and iontophoresis skin penetration of 5-FU and SCC regression. For this purpose, an analytical and a bioanalytical method were developed and validated for 5-FU quantification. Then, conventional liposomes were prepared using different lipid compositions, preparation methods and drug to lipid ratios in order to select those able to load higher percentages of 5-FU. Liposomes composed by 1,2-Distearoylsn- glycero-3-phosphocholine and cholesterol (DSPC:Chol, 55:45) prepared by the thin lipid film hydration with drug/lipid ratio 0.1 with approximately 140 nm, were chosen because they encapsulated about 50% of 5-FU. For the obtainment of immunoliposomes, cetuximab was first coupled to the lipid DSPE linked to maleimide (polyethylene glycol)-2000 (DSPE-PEG-Mal) as an anchor for the antibody conjugation, resulting in 94% coupling efficiency. The immunoliposomes were obtained similarly to liposomes, with similar particle size and loading efficiency of 5-FU. In vitro studies using EGFR positive cells (A431) showed synergism for 5-FU and cetuximab, resulting in IC50 values about 3 times lower than 5-FU solution. Cellular uptake of immunoliposomes increased 3.5-fold compared to the liposomes. In vitro skin penetration studies revealed that, compared to the 5-FU solution, liposomes and immunoliposomes reduced the amount of 5-FU that passed through the skin. Iontophoresis increased the amount of 5-FU retained in viable epidermis for all formulations. In this case, the amount of 5-FU in viable epidermis, where tumors are localized, was 2 times higher when it was encapsulated in immunoliposomes compared to liposomes. In vivo, the formulations were administered subcutaneously or topically with iontophoresis in xenograft animal model of SCC. Treatment with immunoliposomes reduced tumor growth more than 60% compared to the negative control and about 50% compared to the treatments with 5-FU solution and liposomes. The topical administration using iontophoresis resulted in improved tumor reduction compared to the subcutaneous administration when tumors were treated with 5-FU solution and liposomes, but was equally effective for the immunoliposomes. The histological analysis showed the reduction of cellular proliferation for the treated groups. In conclusion, the administration of immunoliposomes containing 5-FU using iontophoresis is a promising strategy for the topical treatment of SCC

Estudos funcionais in vitro são essenciais para a compreensão do papel de miRNAs, pequenas moléculas de RNA que desempenham papel importante na regulação gênica, no câncer. Neste estudo analisamos a viabilidade de linhagens celulares derivadas de carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço (CECP), queratinócitos orais provenientes de culturas primárias e queratinócitos imortalizados, como modelos para estudos funcionais de miRNAs previamente identificados como desregulados nesse tipo de carcinoma: miRNA-1, miRNA-7, miRNA-10b e miRNA- 196a. Com este fim avaliamos inicialmente a expressão dos quatro miRNAs em todos os tipos celulares propostos através de reações em cadeia da polimerase em tempo real específicas. As linhagens celulares de carcinoma epidermoide de boca foram previamente caracterizadas quanto ao seu perfil de sequências de DNA do tipo STR (do inglês Short Tandem Repeats ou repetições curtas em sequência) com o objetivo de confirmar a identidade da linhagem. Foram realizados ensaios para a super-expressão e inibição da expressão destas quatro moléculas na linhagem SCC25 e em queratinócitos orais derivados de cultura primária e, uma vez constatado o sucesso da transfecção, avaliamos, para cada caso, a expressão de alvos (mRNAs) validados na literatura. O impacto destas intervenções em proliferação celular, um importante processo desregulado em câncer, também foi avaliado. Os resultados apontam diferenças significativas na expressão dos miRNAs entre linhagens celulares passíveis de serem utilizadas como modelos para estudos funcionais em carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço. Ressaltam-se diferenças entre linhagens de carcinoma de língua e de faringe, bem como diferenças expressivas entre a linhagem de queratinócitos orais imortalizados e queratinócitos orais normais provenientes de culturas primárias. Conclui-se que cada modelo celular possui características particulares que os tornam mais ou menos adequados para um determinado estudo. A inibição da expressão de genes alvo em função da super-expressão do miRNA regulador foi observada apenas em parte das situações avaliadas. Este resultado decorre do fato que um alvo é regulado por diferentes miRNAs, bem como por diversos outros fatores genéticos e/ou epigenéticos, que podem variar de acordo com modelo estudado. Este resultado ressalta o fato de que seleção cuidadosa das linhagens é fundamental para conclusões precisas em estudos funcionais. A super- expressão de miRNA-10b e miRNA-196a afetou significativamente a progressão do ciclo celular tanto em SCC25 quanto em queratinócitos orais em cultivo, sugerindo um possível papel em CECP relacionado ao controle da proliferação celular. / Functional in vitro studies are fundamental for the comprehension of the role of microRNAs, small noncoding RNA molecules that function as posttranscriptional regulators, in cancer. The aim of this study was to determine the applicability of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human oral keratinocytes as models for functional studies of microRNAs previously identified as deregulated in squamous cell carcinomas of the head and neck: miRNA-1, miRNA-7, miRNA-10b e miRNA-196a. The expression level of the four microRNAs was assessed in cell lines and in primary cultures of oral keratinocytes using specific real-time polymerase chain reactions. The identity of oral squamous cell carcinoma cell lines was confirmed by means of STR (Short Tandem Repeats) profiling. We performed gainof- function and loss-of-function experiments in a HNSCC cell line, SCC25, as well as in normal human keratocytes. After successful transfection, we evaluated the expression of selected target genes. Significant differences in microRNA gene expression were observed between squamous cell carcinoma cell lines, particularly between cells lines from distinct sub-sites, and between primary culture of human keratinocytes and the immortalized keratinocyte cell line. Thus, each cell model possesses a characteristic phenotype; while one may be useful for a particular study, it may be inappropriate for another. The down-regulation of selected target genes was not observed after the over-expression of all miRNAs studied, an expected result since gene targets might be regulated by more than one microRNA, as well as by genetic and epigenetic mechanisms which are not common among all cell types. There is, therefore, an imperative for cautious selection of suitable cell lines for functional studies in cancer. Finally, the over-expression of miR-10b and miR-196a clearly interfered with cell cycle progression, suggesting a possible role in cell proliferation control for these molecules in HNSCC.

Objetivo: Verificar a presença da expressão imunoistoquímica das Citoqueratinas (CKs) 7 e 8 nas células do Carcinoma epidermóide localizado em assoalho bucal (CEAB), estabelecendo a especulação de que essa neoplasia tem origem no epitélio de transição entre o ducto excretor da glândula salivar e a mucosa oral de superfície. Métodos: Noventa e dois casos de CEAB foram avaliados através da técnica imunoistoquímica da streptavidina/biotina, utilizando-se anticorpos monoclonais anti-CKs 7 e 8. Resultados: Setenta e oito casos (84,78%) mostraram positividade para as CKs estudadas. Quarenta e cinco casos (48,9%) mostraram positividade para CK7 e Sessenta seis casos (71,7%) para CK8. Conclusão: Houve uma intensa marcação celular das CKs estudadas. Os resultados encontrados indicam a participação do epitélio de transição entre os ductos excretores das glândulas salivares e a mucosa bucal de revestimento, na gênese dos carcinomas epidermóides nessa localização. Objetivo: Verificar a presença da expressão imunoistoquímica das Citoqueratinas (CKs) 7 e 8 nas células do Carcinoma epidermóide localizado em assoalho bucal (CEAB), estabelecendo a especulação de que essa neoplasia tem origem no epitélio de transição entre o ducto excretor da glândula salivar e a mucosa oral de superfície. Métodos: Noventa e dois casos de CEAB foram avaliados através da técnica imunoistoquímica da streptavidina/biotina, utilizando-se anticorpos monoclonais anti-CKs 7 e 8. Resultados: Setenta e oito casos (84,78%) mostraram positividade para as CKs estudadas. Quarenta e cinco casos (48,9%) mostraram positividade para CK7 e Sessenta seis casos (71,7%) para CK8. Conclusão: Houve uma intensa marcação celular das CKs estudadas. Os resultados encontrados indicam a participação do epitélio de transição entre os ductos excretores das glândulas salivares e a mucosa bucal de revestimento, na gênese dos carcinomas epidermóides nessa localização. / Objetive: The aim of this study is to verify the presence of Citokeratin7 (CK7) and Citokeratin 8 (CK8) positive cells of OSCC of the floor of the mouth establishing a speculation if this neoplasia has origin in excretory salivary duct epithelia transition to floor of the mouth mucosa. Methods: Ninety two cases of OSCC of the floor of the mouth were evaluated by straptavidin/biotin complex immunohistochemical technique and anti-CK7 and anti-CK8 monoclonal antibodies were used. Results: Seventy eight cases (84,78%) showed positive for one of the CKs; Forty five cases (48,9%) showed positive for CK7 and Sixty six cases (71,7%) showed positive for CK8. Conclusions: There is a high and significantly incidence of the immunoexpression of this citokeratins. These results suggest that the excretory salivary duct epithelia transition to floor of the mouth mucosa participates on the genesis of the OSCC in this location.

O objetivo desta pesquisa foi estabelecer uma metodologia para avaliar carcinomas espinocelulares (CEC) de cabeça e pescoço, identificando e distinguindo áreas de maior atividade metabólica dentro da neoplasia, associando dados simultaneamente adquiridos, obtidos por diferentes modalidades de aquisição de imagens, combinando informações metabólicas e anatômicas num único exame. A população estudada consistiu de 17 pacientes com carcinoma espinocelular (CEC) de cabeça e pescoço pertencentes aos arquivos do Departamento de Imagem do Hospital do Câncer, São Paulo. As imagens de TC (tomografia computadorizada) e do 18 F-FDG-PET (tomografia por emissão de pósitrons) foram simultaneamente adquiridas utilizando um aparelho não dedicado. Os dados originais foram transferidos para uma estação de trabalho independente com programa de computação gráfica para o processamento dos grupos individuais e fusão em um único grupo, contendo os dados fisiológicos e metabólicos. Os achados foram definidos como positivos na presença de focos com aumento da concentração do radiofármaco em áreas não relacionadas à distribuição normal do mesmo. Em 77% dos casos (n=13), a hipercaptação foi detectada ao centro da lesão e em 23% (n=4) dos casos houve comportamento diferente, com hipercaptação excêntrica. A fusão de imagens simultaneamente adquiridas num único exame ( 18 F- FDG PET e TC) possibilitou o mapeamento topográfico metabólico das lesões estudadas e foi possível localizar áreas de maior atividade metabólica dentro do próprio 13 tumor, verificando recidivas ou metástases, possibilitando aumentar as opções quanto ao planejamento radioterápico ou cirúrgico a serem seguidos. / The aim of this study is to propose a methodological approach to evaluate head and neck squamous cell carcinoma (SCCA) in order to identify and to distinguish areas of higher metabolic activity inside the lesion combining the functional metabolic and morphological data simultaneously acquired in a non dedicated PET-CT device. The study population consisted of 17 patients, with SCCA of the head and neck carcinoma. These patients were submitted to a non-dedicated 18 F- FDG- PET imaging using a system with low dose CT and Positron emission coincidence acquisition capabilities. The image acquisition was then transferred to an ENTEGRA 2 NT workstation to generate groups of individual images (metabolic and anatomical data) and image fusion (CT + PET). In those patients with anomalous concentrations of 18 F-FDG, the lesion was depicted on three planes (axial, coronal and sagittal) in CT, PET, and the image fusion at the computer screen. The findings were defined as positive in the presence of well-defined focal area of increased uptake in regions unrelated to the normal biodistribution of the tracer on visual inspection. Two examiners interpreted the images in different sessions, in order to get an agreement. Subsequently, the sites of higher metabolic activity inside the tumor were identified and classified in centric or eccentric, according to their relative location. Observing the images, we found 77.00% of the patients with the site of higher activity at the center of lesion. In 23.00% of the patients a different 15 behavior, with the tracer increased eccentrically to the lesion. This technique gave a realistic view of the functional metabolism, locating the anatomical tumor area and helping in future treatment planning.

INTRODUÇÃO: Osteopontina (OPN) é uma glicoproteína presente em tecidos e fluidos orgânicos e envolvida em vários processos patológicos que incluem inflamação, proliferação celular, invasão da matriz extracelular, progressão tumoral e metástase. Em pacientes (pts) portadores de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECCP), OPN tem sido associada a uma maior agressividade tumoral e empregada como marcador prognóstico. Nós investigamos o valor prognóstico e preditivo da OPN sérica em pacientes portadores de CECCP tratados de forma uniforme. MÉTODOS: Estudo longitudinal prospectivo de 47 pts portadores de CECCP localmente avançado e irressecável submetidos à quimioterapia e radioterapia. OPN sérica foi determinada pelo método ELISA (kit 1 com17 pts e kit 2 com 30 pts) com coleta realizada antes e após o término do tratamento e estudada a relação entre OPN, categorizada como alta ou baixa em relação ao valor mediano, e as características clínico-patológicas, resposta ao tratamento, sobrevida global (SG) e sobrevida livre de progressão (SLP). RESULTADOS: A OPN sérica mediana dos pacientes determinada pelo kit 1 (em ng/ml) foi de 2,1 e 1,9 pré e pós-tratamento, respectivamente; no kit 2 (em ng/ml) foi de 69,5 e 87,9 pré e pós-tratamento, respectivamente. Pacientes portadores de tumores de orofaringe foram mais freqüentemente associados a baixos níveis séricos de OPN pós-tratamento, em comparação com outros sub-sítios (p=0,03). Observada tendência à associação entre os valores séricos baixos de osteopontina pós-tratamento e a resposta tratamento (p=0,06). Houve associação entre os valores elevados da osteopontina pós-tratamento e menor SLP (p=0,09, log rank), com medianas de 11,9 meses e 14,5 meses, conforme valores séricos de OPN pós-tratamento altos e baixos, respectivamente. Não houve associação dos valores séricos de OPN pré e pós-tratamento e a SG (p=0,19 e p= 0,10, respectivamente). CONCLUSÃO: Neste grupo de pacientes portadores de CECCP, sugere-se que OPN sérica baixa após a quimioradioterapia associa-se à resposta ao tratamento e melhor SLP. / INTRODUCTION: Osteopontin (OPN) is a glycoprotein present in tissues and body fluids involved in several pathological processes that include inflammation, cell proliferation, invasion of the extracellular matrix, tumor progression and metastasis. In head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) patients, OPN has been associated with greater tumor aggressiveness and used as a prognostic marker. We investigated the prognostic and predictive value of plasma OPN in homogeneously treated (HNSCC) patients. METHODS: Longitudinal prospective study of 47 patients with locally advanced and inoperable HNSCC treated with exclusive platin based concomitant chemoradiotherapy. Plasma OPN was determined by ELISA (n=14 kit I, n=32 kit II) pre and postreatment and correlated with tumor response, overall survival (OS) and progression-free survival (PFS). RESULTS: Median OPN levels in ng/ml were 2,1 and 1,9 pre and postreatment, respectively, by kit I and 69,5 and 87,9 by kit II. Patients were categorized as OPN low or high, using the median as a cut-off point. Patients with oropharynx tumors, as compared to other subsites, were more frequently categorized as low OPN (p = 0,03). A low postreatment OPN level was associated with tumor response (p = 0,06) and a high postreatment OPN level was associated with poor PFS, 11.9 vs. 14.5 months (p=0.09, log rank). Mean OS was 16.2 and 13.7 months in low and high postreatment OPN pts, respectively (p=0.10, log rank). CONCLUSIONS: In this group of HNSCC patients, it is suggested that a low plasma OPN after chemoradiotherapy is associated with a lower response rate and a worse PFS.

Yu, Le. / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2009. / Includes bibliographical references (leaves 171-198). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstracts in English and Chinese.