En pathologie tumorale, l’étude du micro-environnement tumoral doit prendre en compte différents modes de communication cellulaire : contacts directs entre membranes plasmiques, émission et réception de cytokines et enfin émission et internalisation d’objets biologiques plus complexes comme les microvésicules et les exosomes qui peuvent être assimilés à de véritables organites extra-cellulaires. Le virus d’Epstein-Barr (EBV) participe à l’oncogenèse de plusieurs affections malignes humaines d’origine épithéliale (carcinomes nasopharyngés ou NPC) ou lymphocytaire (lymphomes post-transplantation). Dans ces tumeurs, les cellules malignes qui sont infectées de façon latente par EBV libèrent des exosomes et des microvésicules qui contiennent des protéines et des acides nucléiques d’origine virale. L’étude de ces éléments doit permettre de mieux comprendre les interactions hôte-tumeur et de mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs utiles pour le diagnostic précoce et la surveillance de la maladie sous traitement. Le premier objectif de ma thèse consistait à étudier la sécrétion par les cellules malignes d’une famille de microARN viraux appelés miR-BART et leur diffusion dans le sang périphérique chez les sujets porteurs de tumeurs associées à EBV. Pour la première fois j’ai mis en évidence une sécrétion d’exosomes porteurs de miR-BART par les cellules de NPC en culture in vitro. J’ai également montré que les miR-BART, particulièrement miR-BART7, sont détectables dans le plasma de sujets porteurs de NPC. Contrairement à ce qui se passe in vitro les miR-BART plasmatiques ne sont pas transportés par des exosomes. Des données obtenues chez la souris montrent qu’ils peuvent être transportés par des complexes extra-cellulaires que l’on peut précipiter au moyen d’anticorps anti-ago2. Nous cherchons à confirmer ces données sur des échantillons de plasma provenant de patients porteurs de NPC. Ces données pourront guider à l’avenir l’utilisation des miR-BART circulants comme source de biomarqueurs.Le deuxième volet de ma thèse avait pour but d’étudier les modifications du protéome des exosomes induites par une oncoprotéine du virus d’Epstein-Barr appelée LMP1 (latent membrane protein 1). J’ai montré que la LMP1, lorsqu’elle est exprimée dans les cellules lymphocytaires ou épithéliales, infectées ou non par EBV, induit la libération de la protéine PARP1 dans le milieu extra-cellulaire. Cette PARP1 extra-cellulaire n’est pas associée aux exosomes ni aux microvésicules mais à des nano-objets non-vésiculaires contenant notamment des histones et de l’ADN. Nous avons désignés ces objets sous le terme de complexes ADN-protéines extra-cellulaires. Nous ne savons presque rien de la biogenèse de ces complexes ; nous pensons qu’ils ne proviennent pas uniquement de cellules en apoptose. En revanche, des expériences préliminaires suggèrent que la présence de PARP1 dans ces complexes coïncide avec une activation permanente de la PARP1 induite dans les cellules productrices par l’expression de l’oncoprotéine LMP1. Cette hypothèse est en cours de vérification grâce à des expériences menées sur des lignées cellulaires exprimant différentes formes sauvages ou mutées de la LMP1. Ces données sur l’activation de la PARP1 et sur sa sécrétion induite par la LMP1 auront des retombées intéressantes pour notre compréhension des mécanismes d’oncogenèse et d’auto-immunité liés à l’infection par le virus d’Epstein-Barr. / The study of tumoral microenvironment should take into account different modes of intercellular communications: direct contacts between extracellular membranes, secretion and uptake of cytokines and finally emission and uptake of complex biological objects like exosomes and microvesicles.Epstein-Barr virus (EBV) is associated with several human malignancies of epithelial origin (Nasopharyngeal carcinoma or NPC) or of lymphoïd origin (post-transplant lymphoproliferative disorder or PTLD). In these tumors, malignant cells are latently infected by EBV and release exosomes and microvesicles containing viral nucleic acids and proteins. Studying them will enable a better understanding of tumor-host interactions and the discovery of new markers which could be useful for early diagnostic and the follow-up of the disease under treatment.The first aim of this thesis was to study the release by malignant cells of EBV microRNAs belonging to the BART family and their blood diffusion in patients bearing NPC tumors. For the first time, I’ve shown that exosomes released by NPC cells in vitro contain EBV miR-BART microRNAs. Moreover, ebv-miR-BART7 can be detected in the plasma of NPC patients. Unlike what is observed in vitro, circulating BART microRNAs are not carried by exosomes. Recent data from studies in xenografted mice show that they are carried by extra-cellular complexes which can be immunoprecipitated by anti-Ago2 antibodies. We are currently trying to confirm these data in plasma from NPC patients. This work will ease the use of miR-BARTs as potential biomarkers.The second aim was to study the proteome modifications induced by the EBV Latent Membrane Protein 1 protein (LMP1). I’ve shown that LMP1 expression in lymphoid or epithelial cells infected or not by EBV induces the release of PARP1 in the extra-cellular space. This extra-cellular PARP1 is not carried by exosomes or microvesicles but is embedded in non-vesicular nano-objects containing histones and DNA. We have called these objects “DNA-proteins complexes”. We don’t know how they are produced and released by cells. We think that they are not only secreted by apoptotic cells. Recent data show that this release of extra-cellular PARP1 is associated with PARP1 activation by LMP1 oncoprotein expression. We are trying to prove this hypothesis using cell lines expressing wild type or mutated LMP1. The release and the activation of PARP1 induced by LMP1 expression will help to understand the mechanisms of EBV-associated oncogenesis and auto-immunity.

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Environ 40 pour cent du protéome humain est composé d'importantes régions dépliées. Ces protéines intrinsèquement désordonnées (PID) n'adoptent pas de structures secondaires et tertiaires stables mais échantillonnent un vaste paysage conformationnel. Malgré cela, elles sont aujourd'hui connues pour intervenir dans de nombreux processus biologiques ou pathologiques. À l'instar des eucaryotes, les virus -- surtout les virus à ARN -- ont eux aussi recours aux propriétés particulières des PID pour effectuer les interactions nécessaires à leur réplication. Les paramyxovirus, comme le virus de la rougeole, sont des virus à ARN simple brin de polarité négative et environ 10 pour cent de leur génome de 15 à 18 kilobases code pour des régions dépliées. Cette thèse détaille l'étude de deux protéines virales directement impliquées dans la réplication, la nucléoprotéine et la phosphoprotéine. Elles interagissent l'une avec l'autre et sont composées à la fois de régions dépliées et repliées. Des données à résolution atomique ont été obtenues en spectroscopie par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) en ce qui concerne les parties désordonnées, et en cristallographie pour ce qui est des parties repliées. Les résultats apportent un nouvel aperçu du rôle du désordre conformationnel dans la transcription et la réplication des paramyxovirus. / About 40 percent of the human proteome contains large disordered regions. These intrinsically disordered proteins (IDPs) do not adopt stable secondary and tertiary structures, but sample a large conformational space. In spite of that, they are now known to be involved in many physiological as well as pathological processes. Following the example of eukaryotes, viruses -- especially RNA viruses -- benefit from the particular features of IDPs in their replication machinery. Paramyxoviruses, that includes Measles virus, are single stranded, negative sense RNA viruses and about 10 percent of their 15 to 18 kilobase RNA genome is known to encode for disordered regions. This thesis focuses on the study of two different proteins of paramyxoviruses, namely the nucleoprotein and the phosphoprotein that are directly involved in the replication of the viral genome. They interact with each other and are composed of folded and disordered domains. Atomic resolution information is obtained about the structure and dynamics of these proteins using a combination of Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy measurements for the disordered parts and X-ray crystallography for the folded domains. The results provide novel insight into the role of conformational disorder in transcription and replication of paramyxoviruses.

Le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) et le virus Nipah (NiV) appartiennent respectivement aux familles des Rhabdoviridae et des Paramyxoviridae. VSV est un modèle du virus de la rage tandis que NiV est un virus émergeant, appartenant à la sous-famille des Paramyxovirinae, pour lequel les données moléculaires et structurales sont limitées. Ces sont des virus enveloppés dont le génome code pour cinq à neuf protéines. Le complexe de réplication de ces virus est constitué de trois protéines : la phosphoprotéine (P), la nucléoprotéine (N) et la polymérase virale (L). La N encapside le génome viral et l'ensemble N-ARN sert de matrice pour la transcription et la réplication. La P joue deux rôles : elle sert de cofacteur pour la polymérase et forme le complexe N0-P qui maintient la N sous une forme soluble, compétente pour l'encapsidation des génomes néo-synthétisés. Un premier objectif de mon travail de thèse consistait à étudier la structure et la dynamique des protéines P de VSV et de NiV. Ce sont des protéines modulaires qui contiennent des domaines structurés, séparés par des régions flexibles. A mon arrivée au laboratoire un travail important avait été déjà réalisé sur la P de VSV et j'ai participé à l'achèvement de cette étude. Je me suis ensuite intéressé à la protéine P de NiV. J'ai cristallisé et résolu par diffraction des rayons X les structures du domaine C-terminal et du domaine central (codes PDB : 4F9X et 4GJW). La combinaison de ces modèles cristallographiques avec des données de SAXS sur la P entière et des données de résonance magnétique nucléaire (RMN, collaboration IBS) va permettre d'obtenir un modèle atomique de la P entière sous la forme d'un ensemble de conformères. Un deuxième objectif était d'étudier les complexes N0-P. J'ai activement participé au développement de la méthode de reconstitution et à la caractérisation structurale du complexe N0-P de VSV, entre un mutant de la N (NΔ21) et un peptide N-terminal de la P (code PDB : 3PMK). J'ai ensuite reconstitué, cristallisé et résolu la structure de complexe N0-P de NiV entre la N (tronquée de son domaine C-terminal) et la partie N-terminale de la P. Ces structures montrent par quel mécanismes moléculaires la P maintien la N sous forme monomérique, en empêchant sa polymérisation et son interaction avec l'ARN. Les résultats présentés ici ont permis de générer de nouvelles hypothèses pour expliquer les mécanismes d'encapsidation et d'initiation de la synthèse d'ARN chez ces virus. Le complexe N0-P étant essentiel pour la réplication du virus, l'information structurale obtenue au cours de ce travail devrait permettre d'envisager l'utilisation de ce complexe comme cible pour le développement de composés antiviraux. / Abstract Vesicular stomatitis virus (VSV) and Nipah virus (NiV) belong to the Rhabdoviridae and Paramyxoviridae families, respectively. VSV serves as model system for rabies virus while NiV is an emerging pathogen of the Paramyxovirinae subfamily, for which molecular and structural data are scarce. Both viruses are enveloped and their genomes encode five to nine proteins. Three proteins form their replication complex: the phosphoprotein (P), the nucleoprotein (N) and the viral polymerase (L). N encapsidates the viral genome and this N-RNA complex serves as template for transcription and replication. P has two functions: it serves as a polymerase cofactor and forms an N0-P complex, which keeps the N protein in a soluble and monomeric state, competent for the encapsidation of the newly synthesized genomes. The first goal during the PhD work was to study the structure and dynamics of the VSV and NiV P proteins. These proteins are modular, containing structured domains separated by flexible regions. Before my arrival, a large amount of work was already done on the VSV P protein in the lab and I was involved in the final stages of this work. Then this I studied the NiV P protein, crystallizing and solving the structures of its Central and C-terminal domains by X-ray crystallography (PDB codes: 4F9X and 4GJW). Combining these structures with small angle X-ray scattering (SAXS) and nuclear magnetic resonance (NMR, collaboration with IBS group) data obtained for the entire protein will allow the construction of an atomic model of the phosphoprotein in the form of a conformational ensemble. The second goal was to study the N0-P complex. I actively participated in the development of the method which permitted the reconstruction of the VSV N0-P complex, using a truncation mutant of the N protein (NΔ21) and an N-terminal peptide from P, and to its structural determination (PDB code: 3PMK). Then I reconstructed, crystallized and solved the structure of the NiV N0-P complex using a C-terminally truncated N protein and the N-terminal region of the P protein. Both structures yielded insights into the molecular mechanisms used by the phosphoproteins in order to maintain the corresponding nucleoproteins in their monomeric state, thus inhibiting their polymerization and interaction with RNA. The results presented here also offered new hypothesis about mechanisms of encapsidation and of RNA synthesis initiation. Given that the N0-P complex is an essential component of the replication complex, the structural information gained from this work allow us to consider this complex as a potential antiviral target.

Le virus respiratoire syncytial humain (hRSV) est le principal agent pathogène responsable des bronchiolites. Le complexe ARN polymérase (RdRp), du hRSV, nécessaire à la réplication de son génome, est composé a minima de la sous-unité catalytique (L), de son principal cofacteur qu’est la phosphoprotéine (P) et de la nucléoprotéine (N) qui assure l’encapsidation du génome viral. Le cœur de mon projet doctoral a été l’étude dynamique et structurale de domaines des protéines N et P du hRSV ainsi que leurs interactions avec certaines protéines cellulaires principalement par résonance magnétique nucléaire.Dans un premier temps j’ai étudié une potentielle interaction entre 2 domaines appartenant à la protéine N et à la protéine cellulaire Tax1BP1 impliquée notamment dans la régulation de l’autophagie. Ensuite, j’ai entrepris une étude structurale et dynamique de hRSV-P isolée notamment dans le but de déterminer des contacts transitoires au sein de la protéine et d’obtenir la structure tridimensionnelle du domaine d’oligomérisation de P. Enfin, j'ai participé à la caractérisation de l’interaction entre la protéine hRSV-P et le cofacteur de transcription du hRSV hRSV-M2-1, puis entre hRSV P et la phosphatase cellulaire PP1α, afin d’en cartographier les régions de contacts. / Human respiratory syncytial virus (hRSV) is the main pathogen responsible for bronchiolitis. The RNA polymerase complex (RdRp) of hRSV, necessary for the replication of its genome, is composed at least of the catalytic subunit (L), its main cofactor phosphoprotein (P) and nucleoprotein (N), which encapsidates the viral genome. At the heart of my doctoral project was the dynamic and structural study of domains of the proteins N and P of the hRSV as well as of their interactions with several cellular proteins, mainly by nuclear magnetic resonance.Firstly, I studied a potential interaction between 2 domains belonging to the N protein and to the Tax1BP1 cellular protein involved notably in regulation of autophagy. Secondly, I undertook a structural and dynamic study of isolated hRSV-P in order to determine transient contacts within the protein and to obtain the three-dimensional structure of the P oligomerization domain. Last, I participated in the characterization of the interaction between the hRSV-P protein and the hRSV transcription cofactor hRSV-M2-1, and between hRSV P and the cellular phosphatase PP1α to map the contact regions.

Les virus Nipah (NiV) et Hendra (HeV) sont des paramyxovirus zoonotiques appartenant au genre Henipavirus. Les paramyxovirus possèdent un génome ARN simple brin de polarité négative encapsidé par la nucléoprotéine (N) au sein d’une nucléocapside hélicoïdale. Cette dernière sert de substrat pour la transcription et la réplication, réalisées par la polymérase virale qui consiste en un complexe entre la protéine L et la phosphoprotéine (P). A l’aide d’approches biophysiques, j’ai établit une cartographie de l’interaction entre la région C-terminale désordonnée de N (NTAIL) et la région C-terminale de P (PXD) chez NiV, HeV et MeV. L’observation à l’échelle atomique par RMN a confirmé l’intervention d’un élément de reconnaissance moléculaire (MoRE) qui subit un repliement α-hélical au contact de PXD. J’ai également montré la capacité des domaines NTAIL et PXD des henipavirus à former des complexes hétérologues soulignant leur proximité structurale. L’interaction NTAIL-PXD, cruciale pour le recrutement de la polymérase virale constitue une cible idéale pour des approches antivirales. Ainsi, un test de criblage à haut débit par HTRF a été mis en place dans le but d’identifier des inhibiteurs. Enfin, une approche structurale a révélé une organisation trimérique de la protéine P de NiV et HeV en solution. La résolution de la structure cristalline de la région de tétramérisation de P du virus de la rougeole montre la présence d’une région désordonnée à proximité du site putatif de recrutement de L. Collectivement, ces résultats représentent une étape clé vers l’élucidation du l’impact fonctionnel de l’oligomérisation de la protéine P sur le cycle réplicatif des paramyxovirus. / Nipah (NiV) and Hendra (HeV) viruses are zoonotic paramyxoviruses that belong to the Henipavirus genus. Paramyxoviruses possess a single-stranded negative-sense RNA genome that is encapsidated by the nucleoprotein (N) into a helical nucleocapsid. This latter is the substrate for both transcription and replication that are carried out by the polymerase, consisting of a complex between the large protein (L) and the phosphoprotein (P). Using various biophysical approaches, I was able to map the interaction between the C-terminal disordered region of N (NTAIL) and the C-terminal region of P (PXD) in NiV, HeV and MeV. Atomic resolution description of the HeV NTAIL-PXD interaction by NMR confirms the involvement of a molecular recognition element (MoRE) of α−helical nature in binding to PXD. I also showed that Henipavirus NTAIL-PXD form heterologous complexes, involving a structural similarity. As this interaction is crucial for the recruitment of the viral polymerase, it is a promising target for antiviral approaches. This prompted me to set up a protein-protein interaction (PPI) assay based on the HTRF technology to identify inhibitors. Finally, I provided the first experimental evidence of a trimeric organization of P proteins in NiV and HeV. We also solved the crystal structure of two different forms of MeV P tetramerization domain who unveiled the presence of a disordered region located near the putative L-binding site and reveal significant structural variations in coiled-coils organization. Collectively, these results represent a key step towards the elucidation of the functional impact of P protein oligomerization on the replicative cycle of paramyxoviruses.

Influenza A Viren besitzen ein segmentiertes, einzelsträngiges RNA-Genom, welches in Form viraler Ribonukleoprotein (vRNP)-Komplexe verpackt ist. Während das virale Genom im Zellkern repliziert wird, finden Assemblierung und Knospung reifer Viruspartikel an der apikalen Plasmamembran statt. Für die Virusbildung müssen die einzelnen viralen Komponenten hierher gebracht werden. Während intrinsische apikale Signale der viralen Transmembranproteine bekannt sind, sind der zielgerichtete Transport und der Einbau des viralen Genoms in neuentstehende Virionen noch wenig verstanden. In dieser Arbeit wurden potentielle Mechanismen des vRNP-Transportes untersucht, wie die Fähigkeit der vRNPs mit Lipidmembranen zu assoziieren und die intrinsische subzellulären Lokalisation des viralen Nukleoproteins (NP), eines Hauptbestandteils der vRNPs. Es konnte gezeigt werden, dass vRNPs nicht mit Lipidmembranen assoziieren, was mittels Flotation aufgereinigter vRNPs mit Liposomen unterschiedlicher Zusammensetzung untersucht wurde. Die Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass das virale M1 in der Lage ist, Bindung von vRNPs an negativ-geladene Lipidmembranen zu vermitteln. Subzelluläre Lokalisation von NP wurde des Weiteren durch Expression fluoreszierender NP-Fusionsproteine und Fluoreszenzphotoaktivierung untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass NP allein nicht mit zytoplasmatischen Strukturen assoziiert, stattdessen aber umfangreiche Interaktionen im Zellkern eingeht und mit hoher Affinität mit bestimmten Kerndomänen assoziiert, und zwar den Nukleoli sowie kleinen Kerndomänen, welche häufig in der Nähe von Cajal-Körperchen und PML-Körperchen zu finden waren. Schließlich wurde ein experimenteller Ansatz etabliert, welcher erlaubt, den Transport vRNP-ähnlicher Komplexe mittels Fluoreszenzdetektion aufzuzeichnen und Einzelpartikelverfolgungsanalysen durchzuführen. Unterschiedliche Phasen des vRNP-Transportes konnten beobachtet werden und ein 3-Phasen-Transportmodell wird skizziert. / Influenza A viruses have a segmented single-stranded RNA genome, which is packed in form of viral ribonucleoprotein (vRNP) complexes. While the viral genome is replicated and transcribed in the host cell nucleus, assembly and budding of mature virus particles take place at the apical plasma membrane. Efficient virus formation requires delivery of all viral components to this site. While intrinsic apical targeting signals of the viral transmembrane proteins have been identified, it still remains poorly understood how the viral genome is transported and targeted into progeny virus particles. In this study, potential targeting mechanisms were investigated like the ability of vRNPs to associate with lipid membranes and the intrinsic ability of the viral nucleoprotein (NP) – which is the major protein component of vRNPs – for subcellular targeting. It could be shown that vRNPs are not able to associate with model membranes in vitro, which was demonstrated by flotation of purified vRNPs with liposomes of different lipid compositions. Results indicated, however, that the matrix protein M1 can mediate binding of vRNPs to negatively charged lipid bilayers. Intrinsic subcellular targeting of NP was further investigated by expression of fluorescent NP fusion protein and fluorescence photoactivation, revealing that NP by itself does not target cytoplasmic structures. It was found to interact extensively with the nuclear compartment instead and to target specific nuclear domains with high affinity, in particular nucleoli and small interchromatin domains that frequently localized in close proximity to Cajal bodies and PML bodies. An experimental approach was finally established that allowed monitoring the transport of vRNP-like complexes in living infected cells by fluorescence detection. It was possible to perform single particle tracking and to describe different stages of vRNP transport between the nucleus and the plasma membrane. A model of three-stage transport is suggested.

Made available in DSpace on 2017-07-21T19:25:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Wellington Claiton Leite.pdf: 3789073 bytes, checksum: f4c16b4260fbd54f4eada652038ae5bc (MD5) Previous issue date: 2016-09-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The bacterial RecA protein plays a role in the complex system of DNA damage repair. In the presence of ATP, RecA proteins polymerize onto single-strand DNA (ssDNA) as righthanded helical nucleoprotein laments, and catalyze strand exchange reaction between the ssDNA and homologous double-strand DNA (dsDNA) molecules. These activities are supported or stimulated by accessory proteins, as the single-stranded binding protein (SSB).Here, we report a functional and structural characterization of the Herbaspirillum seropedicae RecA protein (HsRecA).We report the crystal structure of HsRecA-ADP/ATP complex to 1.7 Å of atomic resolution. HsRecA protein contains a small N-terminal domain, a central core ATPase domain and a large C-terminal domain, similarly to homologous RecA proteins. Comparative structural analysis showed that the N-terminal polymerization motif of archaeal and eukaryotic RecA family proteins are also present in bacterial RecAs. The bacterial polymerization motif contains the sequence SV/IMR/KLG which interacts with the core ATPase domain residues DNLLLV/CS. In the inactive RecA, it is a loop - strand interaction, respectively, while in the active RecA it becomes a dyad strand. In both RecA forms, the polymerization motif seems to stabilize the subunitsubunit interface by hydrophobic interactions. The methionine of this motif may play an important role in the stability and formation of a right-handed helical nucleoprotein lament. The ATPase activity and the structure of the nucleoprotein lament of HsRecA and Escherichia coli RecA (EcRecA) were analyzed in the presence and absence of SSB. When SSB was added after RecA+ssDNA, HsRecA and EcRecA showed similar ATPase activity and nucleolament structure. However, when SSB was either not included or it was added before RecA+ssDNA, the HsRecA showed higher ATPase activity and formed longer nucleoprotein laments than EcRecA. Thus, HsRecA protein is more ecient at displacing SSB from ssDNA than EcRecA protein. HsRecA promoted DNA exchange more eficiently: a greater yield of nicked circular products were obtained in a shorter time. Reconstruction of electrostatic potential from the hexameric structure of HsRecAADP/ ATP revealed a high positive charge along the inner side, which is consistent with the fact that ssDNA binds inside the filament. It may explain the enhance capacity of HsRecA protein to bind ssDNA, forming a contiguous nucleoprotein filament, displace SSB and promote eficiently the DNA strand exchange reaction. Keywords: RecA, Crystallography, RecA nucleoprotein filament, ATPase activity, DNA strand exchange, crystal structure, structural analysis. / A proteína RecA bacteriana desempenha um importante papel no complexo sistema de reparo de danos ao DNA. Na presença de ATP, a proteína RecA se auto-polimeriza sobre o DNA simples ta (ssDNA) (do inglês single-strand DNA (ssDNA)) como um lamento de nucleoproteína helicoidal, cataliza a reação de troca de fitas entre as moléculas ssDNA e a ta de DNA dupla fita homóloga (dsDNA) (do inglês double-strand DNA (dsDNA)). Estas atividades são suportadas ou estimuladas por proteínas acessórias, como a proteína ligadora de ssDNA SSB (do inglês single-stranded binding protein (SSB)). Neste trabalho é apresentado a caracterização estrutural e funcional da proteína RecA da bactéria Herbaspirillum seropedicae. A estrutura tridimensional do complexo HsRecA-ADP/ATP foi resolvida numa resolução 1,7 Å. A estrutura monomérica da proteína HsRecA consiste em um pequeno domínio N-terminal, um domínio central contendo um sitío ATPásico e e um grande domínio C-terminal, similar com proteínas RecAs homólogas. Análises estruturais comparativas mostraram que o motivo de polimerização da região N-terminal de proteí- nas da familia RecA que incluem archaea e eucariotos, também está presente na proteína RecA bacteriana. O motivo de polimerização da região N-terminal de bactérias contêm a sequência de resíduos (Serina, Valina ou Isoleucina, Metionina, Arginina ou Lisina, Leucina, Glicina) que interage com a sequência de resíduos do core ATPásico (Aspartato, Asparagina, Leucina, Leucina, Leucina, Valina, Cisteína, Serina). Na proteína RecA inativa esta interação é do tipo loop - strand, respectivamente, enquanto na proteína RecA ativa essa interação se torna uma dupla -strand. Em ambas formas da RecA, o motivo de polimerização parece estabilizar a interface subunidade-subunidade por interações hidrofóbicas. No motivo N-terminal a presença de uma Metionina altamente conservada talvez desempenha um importante papel na estabilidade e formação do lamento de nucleoproteína. A atividade ATPásica e a estrutura do lamento de nucleoproteína da proteína HsRecA e da Escherichia coli RecA (EcRecA) foram analisadas na presença e ausência da proteína SSB. Quando a SSB foi adicionada após RecA+ssDNA, as proteínas HsRecA e EcRecA mostraram similar atividade ATPásica e estrutura de nucleo lamento. Entretanto, quando a SSB não estava incluída ou quando adicionada anteriormente a adição RecA+ssDNA, a proteína HsRecA mostrou maior atividade ATPásica e formou maiores lamentos de nucleoproteína que a proteína EcRecA. Ainda, a proteína HsRecA é mais eficiente em deslocar a SSB do ssDNA que a proteína EcRecA. A proteína HsRecA também promove a reação de troca de fitas mais eficientemente: uma maior quantidade de produtos duplex substrato convertido em duplex circular foram obtidos em um curto intervalo de tempo. A reconstrução do potencial eletrostático da estrutura hexamérica da proteína HsRecA revelou uma maior densidade de cargas positivas no seu interior, que é consistente com o fato que o ssDNA ligar-se internamente ao filamento hexamérico. Isto talvez possa explicar capacidade melhorada da proteína HsRecA ligar-se ao ssDNA, formando um continuo filamento de nucleoproteína, deslocando a SSB e ainda promovendo de forma eficiente a reação de trocas de fitas.

Les méthodes de vaccination actuelles contre l’influenza, axées sur la réponse à anticorps dirigée contre des antigènes hautement variables, nécessitent la production d’un vaccin pour chaque nouvelle souche. Le défi est maintenant de stimuler simultanément une réponse cellulaire pan-spécifique ciblant des antigènes conservés du virus, tel que la protéine de la matrice (M1) ou la nucléoprotéine (NP). Or, la présentation antigénique de ces protéines est peu définie chez l’humain. Nous avons analysé la présentation endogène par les complexes majeurs d’histocompatibilité de classes (CMH)-I et -II de M1 et de NP. Ainsi, les protéines M1 et NP ont été exprimées dans des cellules présentatrices d’antigènes (CPAs). Notamment, des épitopes de M1 et de NP endogènes peuvent être présentées par CMH-I et -II, ce qui résulte en une activation respectivement de lymphocytes T CD8+ et CD4+ précédemment isolés. Étant donné l’importance des lymphocytes T CD4+ dans la réponse cellulaire, nous avons cloné M1 ou NP en fusion avec des séquences de la protéine gp100 permettant la mobilisation vers les compartiments du CMH-II sans affecter la présentation par CMH-I. Des CPAs exprimant de façon endogène ces constructions modifiées ou sauvages ont ensuite été utilisées pour stimuler in vitro des lymphocytes T humains dont la qualité a été évaluée selon la production de cytokines et la présence de molécules de surface (ELISA ou marquage de cytokines intracellulaire). Nous avons observé une expansion de lymphocytes T CD8+ et CD4+ effecteurs spécifiques sécrétant diverses cytokines pro-inflammatoires (IFN-γ, TNF, MIP-1β) dans des proportions comparables avec une présentation par CMH-II basale ou améliorée. Cette qualité indépendante du niveau de présentation endogène par CMH-II de M1 et de NP des lymphocytes T CD4+ et CD8+ suggère que cette présentation est suffisante à court terme. En outre, la présentation endogène de M1 et NP a permis de stimuler des lymphocytes T spécifiques à des épitopes conservés du virus, tel qu’identifié à l’aide une méthode d’identification originale basée sur des segments d’ARNm, « mRNA PCR-based epitope chase (mPEC) ». Ensemble, ces nouvelles connaissances sur la présentation antigénique de M1 et de NP pourraient servir à établir de nouvelles stratégies vaccinales pan-spécifiques contre l’influenza. / New vaccines targeting hyper-variable influenza determinants must be prepared against every new strain. The challenge is now to develop influenza vaccines also eliciting a strong and sustained cytotoxic response against highly-conserved determinants such as the matrix (M1) and nuclear (NP) proteins. However, their antigenic presentation properties in humans are less defined. We, therefore, analyzed major histocompatibility complex class (MHC)-I and -II presentation of endogenously processed M1 and NP in human antigen presenting cells (APCs). To do so, we used APCs endogenously-expressing the M1 and NP proteins. M1 and NP epitopes can be presented by MHC-I and -II, which results in the activation of previously-isolated antigen-specific CD8+ and CD4+ T lymphocytes. Considering the importance of CD4+ T lymphocytes in the cellular immune response, we cloned M1 and NP proteins in fusion with gp100 MHC-II enhancing sequences, which do not disrupt MHC-I presentation. APCs expressing MHC-II-enhanced or wild type constructs were used to stimulate human T lymphocytes in vitro and quality of antigen presentation was evaluated on the basis of cytokine production and cell surface molecule expression (ELISA or intracellular cytokine staining). We expanded antigen-specific effector CD8+ and CD4+ T lymphocytes which secreted pro-inflammatory cytokines (IFN-γ, TNF and MIP-1β) to similar extents both with and without MHC-II enhancement. The quality of CD4+ and CD8+ T lymphocytes generated independent of the level of M1 and NP endogenous MHCII presentation suggests that this presentation is sufficient for short-term T lymphocyte stimulation. Thus, endogenous expression of M1 and NP have stimulated T lymphocytes specific to conserved influenza epitopes, as determined by an original identification technique based on mRNA segments called mRNA PCR-based epitope chase (mPEC). Overall, these new insights about T lymphocytes expanded following MHC-I and -II presentation of endogenous M1 and NP could prove useful for new complementary heterosubtypic vaccination strategies.

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