SOX9 est un facteur de transcription, appartenant à la famille des protéines à domaine HMG, et connu pour réguler la transcription grâce à la liaison de ce domaine à l'ADN. Au laboratoire, il a été montré que SOX9 possédait des propriétés anti-oncogéniques, cependant, de façon paradoxale, SOX9 est surexprimé dans les tumeurs colorectales. Nous avons mis en évidence l'existence d'un nouveau variant d'épissage de SOX9, MiniSOX9, qui possède un effet dominant négatif vis-à-vis de l'activité transcriptionnelle de SOX9. MiniSOX9 est fortement exprimé dans les tumeurs en comparaison avec le tissu sain adjacent à la tumeur. Nous avons émis l'hypothèse que MiniSOX9 pourrait donc avoir, dans les tumeurs, un effet antagoniste à SOX9 et s'opposer à ses propriétés anti-oncogéniques. Grâce à la mise en place de modèles cellulaires tumoraux de surexpression de SOX9 et MiniSOX9, inductibles à la doxycycline, nous avons mis en évidence que SOX9 réduit la prolifération, la migration et l'invasion cellulaire. De manière surprenante, MiniSOX9 ne possède aucun effet sur la prolifération cellulaire, suggérant que les effets de SOX9 pourraient être dus à son activité transcriptionnelle. En revanche, SOX9 ainsi que MiniSOX9 réduisent la capacité clonale des cellules et leur capacité à former des tumorosphères. Dans ce cas, il serait probable que SOX9 et MiniSOX9 modulent l'activité de protéines partenaires / SOX9 is an HMG transcription factor known to regulate transcription by binding of its HMG domain to DNA. We previously demonstrated that SOX9 has anti-oncogenic-properties but SOX9 is overexpressed in colon tumors when compared to adjacent healthy tissu. This overexpression appears paradoxical, unless its anti-oncogenic activity cannot be exert. In this study, we report the discovery of MiniSOX9, a new SOX9 splice variant, which is highly expressed in colon tumors. MiniSOX9 acts as a SOX9 dominant negative isoform. Our hypothesis was that MiniSOX9 antagonizes the SOX9 anti-oncogenic activity in tumors.Using tumors cells lines inducible for SOX9 and MiniSOX9 overexpression, we showed that SOX9 reduces cell proliferation, migration and invasion. Surprisingly, MiniSOX9 has no effect on cell proliferation, suggesting that SOX9 effects could be du to his transcriptionnal activity. However, SOX9 and MiniSOX9 decrease cell clonal ability and tumorosphere formation. In this case, it is likely that SOX9 and MiniSOX9 modulate the activity of proteins partners.

Depuis sa découverte en 1991, l’implication du récepteur CD95 dans l’induction de l’apoptose a été plus que largement décrite. Mais bien qu'ayant été identifié comme étant un récepteur de mort, CD95 est aussi capable d'induire un signal pro-oncogénique lorsqu'il est fixé au CD95L clivé. L’activation de cette voie de signalisation non-apoptotique par le s-CD95L contribue au processus inflammatoire dans le lupus et à la dissémination métastatique dans les cancers du sein triples négatifs. Cependant aucun traitement thérapeutique satisfaisant n’est à ce jour disponible. De par son implication dans des pathologies cancéreuses et inflammatoires, mieux comprendre les mécanismes à l’origine de la double signalisation de CD95 n’est plus un enjeu mais une nécessité. Afin de développer des molécules pour bloquer la signalisation non apoptotique de CD95, il est essentiel d’en identifier tous les protagonistes et de définir leur fonction biologique. C’est avec cet objectif que notre équipe a mené deux études protéomiques dont les résultats ont permis d’identifier eIF4A1 comme un nouveau partenaire direct de CD95. Nous montrons que eIF4A1 est indispensable à la mise en place de la signalisation pro-motile de CD95 dépendante de la voie PI3K. De plus eIF4A1 est recruté à la membrane ainsi que les autres protéines du complexe eIF4F. Nos données de séquençage ont montré que de par cette interaction, CD95 recrute à la membrane un ensemble d’ARNm impliqués dans la réponse immunitaire et l’adhésion cellulaire. En outre, une perte de CD95 dans certaines cellules cancéreuses conduit à la perte d’expression de ces ARNm. Ainsi CD95 pourrait protéger certains ARNm de la dégradation et favoriser la traduction des ARNm pro-inflammatoires de manière indépendante du ligand. Cibler spécifiquement cette interaction pourrait être une piste thérapeutique prometteuse dans la lutte contre les cancers du sein triples négatifs mais aussi contre le lupus. / Since its discovery in 1991, the involvement of the CD95 receptor in the induction of apoptosis has been more than widely described. But although identified as a death receptor, CD95 is also capable of inducing a pro-oncogenic signal when attached to the cleaved CD95L. Activation of this non-apoptotic signaling pathway by s-CD95L contributes to the inflammatory process in lupus and metastatic spread in triple negative breast cancers. However, no satisfactory therapeutic treatment is currently available. By its implication in cancerous and inflammatory pathologies, better understanding the mechanisms at the origin of the double signaling of CD95 is no longer an issue but a necessity. In order to develop molecules to block the non-apoptotic CD95 signaling, it is essential to identify all the protagonists and define their biological function. Our team conducted two proteomic studies, the results of which identified eIF4A1 as a new direct partner of CD95. We show that eIF4A1 is essential for the implementation of PI3K pathway-dependent CD95 signaling. In addition eIF4A1 is recruited to the membrane as well as the other eIF4F complex proteins. Our sequencing data showed that by this interaction, CD95 recruits a set of mRNAs involved in the immune response and cell adhesion. In addition, a loss of CD95 in some cancer cells leads to the loss of expression of these mRNAs. Thus CD95 could protect certain mRNA from degradation and promote the translation of pro-inflammatory mRNAs independently of the ligand. Specific targeting of this interaction could be a promising therapeutic avenue in the fight against triple negative breast cancers but also against lupus.

No description available.

La protéine cIAP1 (cellular Inhibitor of Apoptosis Protein-1) de la famille des IAP (Inhibitor of Apoptosis Protein) est un oncogène avec une activité E3 ubiquitine ligase. Au cours de la différenciation de nombreux modèles cellulaires (macrophages, cellules dendritiques, cellules épithéliales du colon, cellules souches hématopoïetiques, cardiomyocytes), cIAP1 sort du noyau pour se relocaliser dans le cytoplasme, cette relocalisation étant associée à un arrêt de prolifération. La plupart des fonctions connues de cIAP1 sont liées à sa localisation cytoplasmique où il est un régulateur important des voies de signalisation des récepteurs du TNF-a et de NF-?B. Cependant, cIAP1 est principalement exprimée dans le noyau de différents types cellulaires ce qui n’est pas en accord avec son rôle dans la signalisation cellulaire. Mon travail de thèse a permis d’identifier un rôle de cIAP1 dans la prolifération cellulaire. cIAP1 interagit avec le facteur de transcription E2F1 et favorise son recrutement sur les promoteurs des Cycline E et A impliquées dans les transitions G1/S et G2 du cycle cellulaire, ce qui augmente l’expression des transcrits et des protéines de ces deux cibles. Il semblerait que par cette activité, cIAP1 régule la prolifération des cellules et soit important dans l’équilibre entre la prolifération et la différenciation, deux mécanismes cellulaires étroitement liés. Dans un second travail, nous avons montré que cAIP1 est déterminant dans le remodelage du cytosquelette d’actine en réponse au TNF-a. Dans les fibroblastes, le TNF-a induit la formation de fines protrusions membranaires riches en actine appelées filipodes, cette formation étant régulée par cdc42. Mes travaux ont montrés que cIAP1, associé à son partenaire historique TRAF2, régule la formation de ces filipodes. Il est capable d’interagir directement avec la RhoGTPase Cdc42 et de contrôler son activation après un traitement par le TNF- a, mais aussi par l’EGF. De plus, cIAP1 régule également la transformation oncogénique par HRas en augmentant les propriétés invasives et migratoires des cellules. Ces nouvelles fonctions de cIAP1 pourraient contribuer à ses propriétés oncogéniques. / The inhibitor of apoptosis protein cIAP1 (cellular inhibitor of apoptosis protein-1) from the IAP family (Inhibitor of Apoptosis Protein) is an oncogene with an E3 ubiquitin ligase activity. cIAP1 is relocalized from the nucleus to the cytoplasm during the differentiation of many kind of cellular models (macrophages, dendritic cells, colon epithelial cells, hematopoietic stem cells, cardiomyocytes) and this relocalization is associated with a proliferation arrest. The well-known functions of cIAP1 are associated with its cytoplasmic localization, where it regulates the TNFa receptors and NF-?B signaling pathways. However, cIAP1 is mainly expressed in the nucleus on many cell types which is not in accordance with its cell signalling activity. My work identifies a function of cIAP1 in proliferation regulation. cIAP1 interacts with E2F1 transcription factor and favors its recruitment on Cyclins E and A promoters, both involved in G1/S and G2 phases of the cell cycle, which leads to high level of transcript and protein expression of these two targets. It seems that cIAP1 regulates the cellular proliferation and is important for the balance between proliferation and differentiation, two mechanisms tightly connected in cells. In a second work, we showed that cIAP1 is critical for actin cytoskeleton modification upon TNF-a treatment. In fibroblasts, TNF-a induce filipodia formation, a process regulated by cdc42. Our work showed that cIAP1, when associated with its partner TRAF2, interact and control cdc42 activation, a member of Rho GTPases protein family. We also observed that cIAP1 regulates HRas driven oncogenic transformation and increases the motility and invasiveness of the cells. These new functions of cIAP1 in the control of transcription factor and cell cytoskeleton could be important for its oncogenic properties.

Une dérégulation de la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK1/2 est observée dans plus de 30% des cancers et des mutations activatrices de RAS sont observées dans 30% à 50% des adénomes colorectaux. À la suite d’une analyse extensive de biopsies de tumeurs colorectales humaines par micromatrices tissulaires (TMA), nous avons observé que 44% des tissus cancéreux exprimaient MEK1/2 phosphorylés, contre 10% des tissus normaux. L'analyse des TMA a également révélé que 79% des tumeurs arboraient un marquage nucléaire de MEK1/2 phosphorylés, contre 4 % pour les tissus normaux. Bien que la voie MEK/ERK1/2 soit fréquemment activée dans les cancers, le rôle précis des isoformes de MEK1 et de MEK2 n'a jamais été clairement établie. De même, l'impact de cette localisation nucléaire aberrante de phospho-MEK1/2, dans l'initiation et la progression des cancers colorectaux, est inconnu. Lors d'un premier projet, nous avons démontré, que l’expression de MEK1 ou MEK2 activé est suffisante pour transformer in vitro des cellules intestinales épithéliales de rat (IEC-6). L'expression des mutants actifs de MEK1 ou MEK2 est suffisante pour induire une dérégulation de la prolifération cellulaire et engendrer la formation d'adénocarcinomes invasifs dans un modèle de greffe orthotopique du côlon chez la souris. Nous avons également démontré que l'inhibition de MEK2 par shRNA supprime complètement la prolifération des lignées humaines de cancer du côlon, alors que la suppression de MEK1 a peu d'effet sur la capacité de prolifération. Le deuxième projet, nous a permis d'observer que l'expression d'un mutant nucléaire de MEK1 dans les cellules IEC-6 transforme drastiquement les cellules. Une augmentation de prolifération, une résistance à l'anoikose, un dérèglement du cycle cellulaire, de l'instabilité chromosomique (CIN), de la tétra/aneuploïdie sont observés. La caractérisation des mécanismes responsables de cette localisation aberrante de MEK1/2 phosphorylés, a permis d'identifier la protéine Sef, un régulateur de la localisation cytoplasmique de MEK/ERK1/2. Nous avons démontré que l'expression d'une forme oncogénique de Ras (H-RasV12) inhibe l'expression de Sef, engendrant alors une accumulation nucléaire de MEK1/2 activés. Plus encore, la réexpression de Sef restaure la localisation cytoplasmique de MEK1/2 et renverse les propriétés tumorigéniques ainsi que l'aneuploïdie induite par Ras activé. Un troisième projet, visant la caractérisation des mécanismes associés à la CIN et à l'aneuploïde engendrés par l'activation aberrante de la voie de Ras-ERK1/2, a permis d'observer que l'hyperactivation de ERK1/2 induit des anomalies mitotiques menant à la binucléation. Une localisation erronée et une surexpression de la kinase Aurora A, de même que des protéines de passage du complexe chromosomique (CPC), Aurora B, Survivine et INCENP, sont observées. L'inhibition partielle de l'activation de ERK1/2 par de faible dose de PD184352, un inhibiteur de MEK1/2, est suffisante pour renverser la surexpression de ces régulateurs mitotiques, de même que corriger les anomalies de la mitose et réduire la tétra/aneuploïdie engendrée par Ras oncogénique. Ainsi, nous avons démontré, pour la première fois, que la voie des MAP kinases ERK1/2 est impliquée dans la CIN, la tétraploïdie et l'aneuploïdie. Nos résultats suggèrent que la perte de Sef est un événement oncogénique précoce, qui contribue à la localisation nucléaire aberrante de MEK1/2 qui est observée dans les tumeurs colorectales. Cette localisation anormale de MEK1/2 est associée à l'initiation de la transformation, la progression tumorale et la CIN, via l'activité soutenue de ERK1/2. Ces informations sont capitales et démontrent l’importance de la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK1/2 dans le processus de tumorigénèse colorectale. / The Ras-dependent Raf/MEK/ERK1/2 signaling pathway is frequently hyperactivated in human cancer as a result of receptor tyrosine kinase overexpression or gain-of-function mutations in RAS or RAF genes. More specificaly, activating mutation in RAS genes are found in ~ 30-50% of colorectal adenomas and phosphorylation of ERK1/2 is frequently observed in human colorectal cancer cells and tumor specimens. In a large TMA analysis, we found that MEK1/MEK2 are aberrantly activated in 44% of human colorectal cancers. In addition, our analysis revealed that 79% of colorectal cancers exhibit aberrant phospho-MEK1/2 staining in the nucleus, as compared to 4% of normal tissue. How dysregulation and mislocalization of MEK1/2 contribute to tumor initiation and progression is not well understood. In order to determine the exact contribution of MEK1 and MEK2 to the pathogenesis of colorectal cancer, wild type and constitutively active forms of MEK1 and MEK2 were ectopically expressed by retroviral gene transfer in the normal intestinal epithelial cell line IEC-6. We found that the expression of activated MEK1 or MEK2 is sufficient to morphologically transform intestinal epithelial cells, dysregulate cell proliferation and induce the formation of high-grade adenocarcinomas after orthotopic transplantation in mice. A large proportion of these intestinal tumors metastasize to the liver and lung. Importantly, we show that silencing of MEK2 expression completely suppresses the proliferation of human colon carcinoma cell lines, whereas inactivation of MEK1 has a much weaker effect. In a second project, we have investigated the impact of the nuclear mislocalization of phosphorylated MEK1/2 observed in colorectal tumors. We show that oncogenic activation of Ras is sufficient to induce the nuclear accumulation of phosphorylated MEK1/2 and ERK1/2 in intestinal epithelial cells. To evaluate the biological impact of the mislocalization of MEK1/2, we have forced the localization of MEK1 in the nucleus of epithelial cells. We found that sustained nuclear MEK1 signaling leads to hyperactivation of ERK1/2 and to enhanced cell proliferation. Nuclear localization of MEK1 also leads to tetraploidization, chromosomal instability (CIN) and tumorigenesis. Importantly, we show that oncogenic Ras downregulates the spatial regulator Sef, concomitant to nuclear accumulation of activated MEK1/2. Moreover, re-expression of Sef is sufficient to restore the normal localization of MEK1/2 and to revert the cell cycle defects and tumorigenesis induced by oncogenic Ras. Another project was initiated to characterize the tetraploidy and CIN observed upon hyperactivation of the Ras-ERK1/2 pathway. Aneuploidy and CIN are observed in the majority of colorectal cancers and are associated with a poorer prognosis. We show that hyperactivation of ERK1/2 by oncogenic Ras or sustained nuclear MEK-ERK1/2 signaling induces mitotic defects that lead to tetraploidy, aneuploidy and CIN. We also found that dysregulation of Ras-ERK1/2 signaling alters the expression and localization of Aurora A and the Chromosomal passenger complex proteins. In conclusion, we show for the first time that the MEK/ERK1/2 signaling pathway is implicated in aneuploidy and CIN. Our results suggest that sustained nuclear ERK1/2 signaling may contribute to the initiation and progression of colorectal cancer by rapidly inducing aneuploidy and CIN. We suggest that loss of Sef is an early oncogenic event that contributes to genetic instability and tumor progression by sustaining nuclear ERK1/2 signaling. These observations are significant and highlight the importance of the Ras-ERK1/2 signaling pathway in colorectal tumorigenesis.

No description available.

Une dérégulation de la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK1/2 est observée dans plus de 30% des cancers et des mutations activatrices de RAS sont observées dans 30% à 50% des adénomes colorectaux. À la suite d’une analyse extensive de biopsies de tumeurs colorectales humaines par micromatrices tissulaires (TMA), nous avons observé que 44% des tissus cancéreux exprimaient MEK1/2 phosphorylés, contre 10% des tissus normaux. L'analyse des TMA a également révélé que 79% des tumeurs arboraient un marquage nucléaire de MEK1/2 phosphorylés, contre 4 % pour les tissus normaux. Bien que la voie MEK/ERK1/2 soit fréquemment activée dans les cancers, le rôle précis des isoformes de MEK1 et de MEK2 n'a jamais été clairement établie. De même, l'impact de cette localisation nucléaire aberrante de phospho-MEK1/2, dans l'initiation et la progression des cancers colorectaux, est inconnu. Lors d'un premier projet, nous avons démontré, que l’expression de MEK1 ou MEK2 activé est suffisante pour transformer in vitro des cellules intestinales épithéliales de rat (IEC-6). L'expression des mutants actifs de MEK1 ou MEK2 est suffisante pour induire une dérégulation de la prolifération cellulaire et engendrer la formation d'adénocarcinomes invasifs dans un modèle de greffe orthotopique du côlon chez la souris. Nous avons également démontré que l'inhibition de MEK2 par shRNA supprime complètement la prolifération des lignées humaines de cancer du côlon, alors que la suppression de MEK1 a peu d'effet sur la capacité de prolifération. Le deuxième projet, nous a permis d'observer que l'expression d'un mutant nucléaire de MEK1 dans les cellules IEC-6 transforme drastiquement les cellules. Une augmentation de prolifération, une résistance à l'anoikose, un dérèglement du cycle cellulaire, de l'instabilité chromosomique (CIN), de la tétra/aneuploïdie sont observés. La caractérisation des mécanismes responsables de cette localisation aberrante de MEK1/2 phosphorylés, a permis d'identifier la protéine Sef, un régulateur de la localisation cytoplasmique de MEK/ERK1/2. Nous avons démontré que l'expression d'une forme oncogénique de Ras (H-RasV12) inhibe l'expression de Sef, engendrant alors une accumulation nucléaire de MEK1/2 activés. Plus encore, la réexpression de Sef restaure la localisation cytoplasmique de MEK1/2 et renverse les propriétés tumorigéniques ainsi que l'aneuploïdie induite par Ras activé. Un troisième projet, visant la caractérisation des mécanismes associés à la CIN et à l'aneuploïde engendrés par l'activation aberrante de la voie de Ras-ERK1/2, a permis d'observer que l'hyperactivation de ERK1/2 induit des anomalies mitotiques menant à la binucléation. Une localisation erronée et une surexpression de la kinase Aurora A, de même que des protéines de passage du complexe chromosomique (CPC), Aurora B, Survivine et INCENP, sont observées. L'inhibition partielle de l'activation de ERK1/2 par de faible dose de PD184352, un inhibiteur de MEK1/2, est suffisante pour renverser la surexpression de ces régulateurs mitotiques, de même que corriger les anomalies de la mitose et réduire la tétra/aneuploïdie engendrée par Ras oncogénique. Ainsi, nous avons démontré, pour la première fois, que la voie des MAP kinases ERK1/2 est impliquée dans la CIN, la tétraploïdie et l'aneuploïdie. Nos résultats suggèrent que la perte de Sef est un événement oncogénique précoce, qui contribue à la localisation nucléaire aberrante de MEK1/2 qui est observée dans les tumeurs colorectales. Cette localisation anormale de MEK1/2 est associée à l'initiation de la transformation, la progression tumorale et la CIN, via l'activité soutenue de ERK1/2. Ces informations sont capitales et démontrent l’importance de la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK1/2 dans le processus de tumorigénèse colorectale. / The Ras-dependent Raf/MEK/ERK1/2 signaling pathway is frequently hyperactivated in human cancer as a result of receptor tyrosine kinase overexpression or gain-of-function mutations in RAS or RAF genes. More specificaly, activating mutation in RAS genes are found in ~ 30-50% of colorectal adenomas and phosphorylation of ERK1/2 is frequently observed in human colorectal cancer cells and tumor specimens. In a large TMA analysis, we found that MEK1/MEK2 are aberrantly activated in 44% of human colorectal cancers. In addition, our analysis revealed that 79% of colorectal cancers exhibit aberrant phospho-MEK1/2 staining in the nucleus, as compared to 4% of normal tissue. How dysregulation and mislocalization of MEK1/2 contribute to tumor initiation and progression is not well understood. In order to determine the exact contribution of MEK1 and MEK2 to the pathogenesis of colorectal cancer, wild type and constitutively active forms of MEK1 and MEK2 were ectopically expressed by retroviral gene transfer in the normal intestinal epithelial cell line IEC-6. We found that the expression of activated MEK1 or MEK2 is sufficient to morphologically transform intestinal epithelial cells, dysregulate cell proliferation and induce the formation of high-grade adenocarcinomas after orthotopic transplantation in mice. A large proportion of these intestinal tumors metastasize to the liver and lung. Importantly, we show that silencing of MEK2 expression completely suppresses the proliferation of human colon carcinoma cell lines, whereas inactivation of MEK1 has a much weaker effect. In a second project, we have investigated the impact of the nuclear mislocalization of phosphorylated MEK1/2 observed in colorectal tumors. We show that oncogenic activation of Ras is sufficient to induce the nuclear accumulation of phosphorylated MEK1/2 and ERK1/2 in intestinal epithelial cells. To evaluate the biological impact of the mislocalization of MEK1/2, we have forced the localization of MEK1 in the nucleus of epithelial cells. We found that sustained nuclear MEK1 signaling leads to hyperactivation of ERK1/2 and to enhanced cell proliferation. Nuclear localization of MEK1 also leads to tetraploidization, chromosomal instability (CIN) and tumorigenesis. Importantly, we show that oncogenic Ras downregulates the spatial regulator Sef, concomitant to nuclear accumulation of activated MEK1/2. Moreover, re-expression of Sef is sufficient to restore the normal localization of MEK1/2 and to revert the cell cycle defects and tumorigenesis induced by oncogenic Ras. Another project was initiated to characterize the tetraploidy and CIN observed upon hyperactivation of the Ras-ERK1/2 pathway. Aneuploidy and CIN are observed in the majority of colorectal cancers and are associated with a poorer prognosis. We show that hyperactivation of ERK1/2 by oncogenic Ras or sustained nuclear MEK-ERK1/2 signaling induces mitotic defects that lead to tetraploidy, aneuploidy and CIN. We also found that dysregulation of Ras-ERK1/2 signaling alters the expression and localization of Aurora A and the Chromosomal passenger complex proteins. In conclusion, we show for the first time that the MEK/ERK1/2 signaling pathway is implicated in aneuploidy and CIN. Our results suggest that sustained nuclear ERK1/2 signaling may contribute to the initiation and progression of colorectal cancer by rapidly inducing aneuploidy and CIN. We suggest that loss of Sef is an early oncogenic event that contributes to genetic instability and tumor progression by sustaining nuclear ERK1/2 signaling. These observations are significant and highlight the importance of the Ras-ERK1/2 signaling pathway in colorectal tumorigenesis.