INTRODUÇÃO: O carcinoma espinocelular de origem bucal (CEC) apresenta uma alta taxa de mortalidade devido à invasividade das células tumorais. A migração celular, principal evento da invasão e metástase, pode ser regulada tanto por fatores intrínsecos, como adesão e contratilidade celular, quanto extrínsecos, como composição, densidade e remodelagem da matriz extracelular (MEC). OBJETIVO: Avaliar o papel de elementos intrínsecos e extrínsecos sobre o processo invasivo do carcinoma espinocelular de origem bucal. MÉTODOS: Foi realizada imuno-histoquímica para as proteínas: Miosina II (isoformas A, B e C), metaloproteinases de matriz (1, 2, 9 e 14); imunofluorescência as proteínas: e-caderina, n-caderina, FAK, paxilina, vinculina e fibronectina em amostras de CEC oral. Foi realizado ensaio de migração nas seguintes condições: 1 – matriz 2D com o substrato de fibronectina, ou laminina ou matrigel; 2 – matriz 3D com colágeno na presença ou não de fibronectina ou laminina; 3 – matriz 3D com diferentes concentrações de colágeno (0,6; 1,2 e 1,8 mg/ml) + fibronectina na presença ou não de um inibidor de MMP. Foi realizado análise de adesão celular utilizando-se o microscópio TIRF e o microscópio confocal, tanto em matrizes 2D quanto 3D. Foram realizados esferoides celulares para avaliar a contratilidade celular, através do plaqueamento das células em gel de agarose e a utilização de drogas que inibem ou que induzem a contratilidade, bem como a partir de células transfectadas com versões fosfomiméticas para a cadeia leve de miosina. Foi realizado ainda western blotting para proteínas: e-caderina, FAK, vinculina, paxilina, N-caderina, integrinas e as isoformas de miosina II, bem como foi avaliado os níveis de ativação das proteínas da família RhoGTPase, as quais estão envolvidas no controle da migração celular. RESULTADOS: A expressão das MMPs analisadas e das isoformas de miosinas foi maior nas zonas de invasão tumoral, sendo que o CEC oral também apresenta uma maior expressão de proteínas associadas à adesão com a MEC. A migração celular foi afetada pela densidade e a composição da MEC, bem como pela atividade das MMPs. Adicionalmente, a modulação das proteínas de adesão célula-matriz altera a velocidade de migração, a direcionalidade dessa migração e também a forma de migração, mudando de uma migração coletiva para uma migração individual. O aumento na contratilidade células resulta numa dispersão celular enquanto que a diminuição da contratilidade resulta numa melhor adesão célula – célula. CONCLUSÕES: O comportamento das células tumorais pode ser modulado através de fatores extrínsecos como, por exemplo, a alteração no microambiente tumoral, seja ela por mudança no substrato ou na densidade da matriz, e também dos fatores intrínsecos como a alteração nos níveis de miosina. / INTRODUCTION: Oral squamous cell carcinoma (OSCC) presents high mortality index due to the invasive phenotype of tumor cells. Cell migration is the main event in cell invasion and metastasis and it can be regulated by intrinsic factor, such as adhesion and cell contractility, and extrinsic factors, such as density and extracellular matrix (EMC) remodeling. OBJECTIVE: Analyze the role of intrinsic and extrinsic factor during the invasive process of oral squamous cell carcinoma. METHODS: We performed immunostaining in OSCC samples for the following proteins: myosin II (isoforms A, B and C), matrix metalloproteinase (1, 2, 9 and 14) e-cadherin, n-cadherin, FAK, paxillin, vinculin and fibronectin. We also performed migration assays with OSCC cell line in the following conditions 1 – 2D matrix with fibronectin or laminin or matrigel; 2 – 3D matrix with collagen in the presence or not of fibronectin or laminin; 3 – 3D matrix with different collagen concentration (0,6; 1,2 e 1,8 mg/ml) with fibronectin in the presence or not of the MMP inhibitor. In order to analyze cell adhesion, it was performed Total Internal Reflectance Fluorescence and Confocal microscopy, in 2D and 3D matrix. To analyze cell contractility, cells were plated in agarose gel in order to produce spheroids, which were treated with drugs that inhibit or induce cell contractility or cells were previously transfected with Myosin Light Chain phosphomimetics mutants. It was also performed western blotting to: e-cadherin, n-cadherin, FAK, paxillin, vinculin and myosin II isoforms, as well as it was analyze the levels in RhoGTPase family, which are involved in cell migration control. RESULTS: The expression to MMPs and myosin II isoforms were higher at invasion zone of the tumor, and the OSCC presented higher expression of proteins associated to adhesion to ECM. Cell migration was affected by the EMC composition and density and by MMP activity. Also, the modulation of cell-matrix adhesion proteins altered migration speed, cell directionality as well as influenced the switch between collective and single cell migration. The increase in cell contractility resulted in cell dispersion while the decrease in cell contractility resulted in a better cell-cell adhesion. CONCLUSIONS: The behavior of cell tumor can be modulate by extrinsic factors, for example, the change in tumor microenvironment, by the change in the EMC substrate or density and by intrinsic factors such as the alteration in myosin levels.

O corpo de evidências científicas a respeito da inter-relação entre câncer oral e doenças periodontais vem aumentando consideravelmente. Entretanto, estudos avaliando os mecanismos biológicos que permeiam esta associação ainda são escassos. O objetivo do estudo foi avaliar o efeito da exposição ao carcinógeno 4-nitroquinolina 1-óxido (4NQO), sobre a perda óssea alveolar induzida por ligadura e espontânea em ratos Wistar. Foram utilizados 84 ratos Wistar machos, divididos em quatro grupos experimentais: Grupo 1 (Controle total); Grupo 2 (Exposição ao 4NQO); Grupo 3 (Perda óssea alveolar); Grupo 4 (Exposição ao 4NQO e perda óssea alveolar). Os grupos 2 e 4 foram expostos ao carcinógeno, diluído em água (50ppm), por vinte semanas. A perda óssea alveolar foi induzida, por meio de ligadura com fio de seda no segundo molar da hemiarcada direita dos animais, nos grupos 3 e 4, sendo no grupo 4, após a exposição ao 4NQO. O peso corporal dos animais foi monitorado ao longo do estudo. Após decorridas vinte semanas do período experimental, os animais foram mortos e as peças maxilares e línguas foram analisadas em relação à perda óssea alveolar e lesões macroscópicas linguais. 71 animais completaram o estudo. Todos os animais expostos ao 4NQO apresentaram lesões macroscópicas na língua, demonstrando que o modelo experimental de exposição ao carcinógeno foi efetivo. A análise da perda óssea alveolar demonstrou diferenças significativas entre grupos expostos em relação a não expostos ao 4NQO na ocorrência de perda óssea alveolar espontânea. Essas diferenças não foram observadas nos lados com ligadura. Pode-se concluir que a exposição ao carcinógeno 4NQO potencialmente influencia a perda óssea alveolar espontânea em ratos. / Scientific evidence about the inter-relationship between periodontal disease and oral cancer has increased considerably. However, studies evaluating the biological mechanisms related to this association are still scarce. The aim of this study was to evaluate the effect of exposure to 4-nitroquinoline 1-oxide (4NQO) on spontaneous and ligature-induced alveolar bone loss. For this, 84 male Wistar rats were divided into four groups: Group 1 (Full Control), Group 2 (4NQO exposure), Group 3 (Alveolar bone loss), Group 4 (4NQO exposure and alveolar bone loss). Groups 2 and 4 were exposed to the carcinogen, diluted in water (50ppm) for twenty weeks. Alveolar bone loss was induced by silk ligatures at the upper right maxillae, around the second molar, for animals in groups 3 and 4; in group 4, ligatures were placed after exposure to 4NQO. Body weight of the animals was monitored throughout the study. After twenty weeks of the experimental period, the animals were killed and the maxillae and tongues were analyzed. Morphometric analysis of alveolar bone loss and macroscopic lesions in tongue were analyzed in 71 animals which completed the study. All animals exposed to 4NQO presented macroscopic lesions in dorsal part of tongue, demonstrating that the experimental model of carcinogen exposure was effective. The analysis of alveolar bone loss, was performed by medians and interquartile ranges and showed significant differences between animals exposed or not to 4NQO in terms of spontaneous alveolar bone loss. This was not observed in sites with ligatures. It can be concluded that exposure to carcinogenic 4NQO potentially influences spontaneous alveolar bone loss in rats.

Ampliar nosso conhecimento sobre a biologia do carcinoma espinocelular bucal é fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e para melhorar a sobrevida dos pacientes acometidos por essa patologia. Para tanto, compreender as contribuições do microambiente tumoral à carcinogênese é muito importante. Um característica importante a ser avaliada do microambiente tumoral é a acidificação do meio extracelular. Considerando que o pH ácido tumoral está relacionado à maior agressividade da lesão, o objetivo deste projeto é estudar os efeitos de um microambiente ácido na biologia de células de carcinoma espinocelular bucal. Para tanto, foram realizadas duas revisões da literatura, nas quais foram avaliados os seguintes temas: influência da acidez extracelular na invasão e migração; e os mecanismos moleculares envolvidos na resistência ao tratamento quimioterápico, induzida pela acidez do microambiente tumoral. Tais revisões embasaram a construção do terceiro artigo desta tese, o qual se propôs a comparar o comportamento de células linhagens de carcinoma espinocelular bucal (SCC-4 e SCC-9) e queratinócitos (HaCat) cultivadas em meio de cultura de pH 6.8 com células mantidas em meio neutro pH 7.4. As células foram expostas de forma contínua ou intermitente ao pH 6.8 e a adaptação das células foi avaliada pelo ensaio clonogênico. Além disso, as células foram avaliadas quanto à sua capacidade migratória pelo ensaio de cicatrização de feridas e de time lapse. A expressão gênica relacionada à indiferenciação e pluripotência foi investigada por PCR em tempo real com os marcadores Bmi-1 e CD44, assim como pelo ensaio de orosferas. A resistência desses grupos de células ao tratamento anti-câncer foi avaliada pelo ensaio de viabilidade celular da sulforodamina B após o tratamento com Cisplatina. Para a análise estatística, inicialmente foi realizada a distribuição dos dados, seguido da comparação estatística dos grupos utilizando, para distribuição normal, os testes ANOVA e ANOVA de duas vias. Toda a análise foi realizada no programa GraphPad Prism 5.0 e o nível de significância considerado foi de p< 0.05.Observamos que ambas as linhagens mudaram sua morfologia para um aspecto mesenquimal. Ao avaliar o perfil migratório observou-se que as células SCC-9 apresentaram maior capacidade de migração após a exposição ao pH6.8. O aumento da migração celular pode ser causado pela indução da transição epitélio-mesênquima, visto que observamos o aumento da expressão de N-caderina (SCC-4:p<0.05) concomitante à diminuição de E-caderina (SCC-4: p<0.05). A exposição à acidez também provocou, em ambas as linhagens, aumento da capacidade de formar orosferas em placa de baixa aderência, denotando um fenótipo pluripotente (SCC-4: p=0.007/ SCC-9: p= 0.1202). Tal resultado foi reforçado com aumento da expressão gênica do marcador de célula-tronco tumoral CD44 (p= 0.0325). na linhagem SCC-4. No entanto, observamos diminuição da expressão de Bmi-1(p=0.0572) em relação ao controle. A resistência à Cisplatina aumentou nos casos de exposição contínua à acidez (SCC-4: p<0,05). O recondicionamento em meio neutro reverteu a sensibilidade celular (SCC-4: p>0,05). Concluímos que a acidez extracelular no carcinoma espinocelular bucal aumenta a capacidade de migração, induz o fenótipo de células tronco-tumorais e aumenta a resistência a quimioterápicos. / To expand our knowledge about the biology of oral squamous cell carcinoma is crucial for the development of new therapeutic strategies and to improve the survival of the patients affected by this pathology. Therefore, understanding the contributions of the tumor microenvironment to carcinogenesis is very important. An important feature to be evaluated of the tumor microenvironment is the acidification of the extracellular medium. Considering that acidic pH is related to the greater aggressiveness of the tumor, the aim of this study is to analyze the effects of an acidic microenvironment on the biology of oral squamous cell carcinoma cells. We realized two reviews of the literature, in which the following themes were evaluated: the influence of extracellular acidity on the invasion and migration; and the molecular mechanisms involved in the resistance to chemotherapeutic treatment, induced by the acidity of the tumor microenvironment. These revisions helped to construct the third article of this thesis, which proposed to compare the behavior of squamous cell carcinoma lines (SCC-4 and SCC-9) and keratinocytes (HaCat), cultured under pH 6.8 was compared to cells maintained at pH 7.4. For the statistical analysis, the data distribution was initially performed, followed by the statistical comparison of the groups using, for normal distribution, ANOVA and ANOVA two-way tests. All analysis was performed in the GraphPad Prism 5.0 program and the level of significance considered was p <0.05.After continuous or intermittent exposure to pH 6.8, cell adaptation was assessed by the clonogenic assay. In addition, the migratory capacity of the cells was evaluated by the wound healing and time-lapse assays. The gene expression related to undifferentiation and pluripotency was assessed by real-time PCR analysis of the Bmi-1 and CD44 markers, as well as by the orosphere assay. The resistance of these cell groups to anti-cancer treatment was assessed by the sulforhodamine B cell viability assay after treatment with Cisplatin. We observed that both cell lines changed their morphology to a mesenchymal aspect. When assessed the migratory profile, it was observed that SCC-9 cells showed higher migration capacity after exposure to pH6.8. Increased cell migration may be caused by the induction of the epithelial-mesenchymal transition, as we observed increased N-cadherin (SCC-4:p<0.05) expression concomitant with decreased E-cadherin (SCC-4: p<0.05). Exposure to acidity also led to increased ability to form orospheres on low-attachment dishes, denoting a pluripotent phenotype in both strains (SCC-4: p=0.007/ SCC-9: p= 0.1202). This result was reinforced by increased expression of the CD44 (p= 0.0325) tumor cell marker in the SCC- 4 cells. However, we observed a decrease in the expression of Bmi-1(p=0.0572) in relation to the control. Resistance to Cisplatin increased when cells were continuously exposed to acidity(SCC-4: p<0,05). Neutral reconditioning reversed cell sensitivity (SCC-4: p>0,05). We conclude that extracellular acidity in oral squamous cell carcinoma increases the migration capacity, induces the cancer stem cell phenotype and increases resistance to chemotherapy.

Autofagia é o processo catabólico que ocorre nos lisossomos, e tem por finalidade degradar os componentes celulares e proteínas que já não são mais funcionantes e, assim manter seu equilíbrio homeostático para sobreviverem adequadamente em condições estressantes. Diante das funções biológicas da autofagia identificadas até hoje, a relação entre autofagia celular e neoplasias está provavelmente entre as mais estudadas, devido ao papel duplo que a autofagia exerce sobre o desenvolvimento do câncer, podendo atuar como um mecanismo supressor de tumor ou, podendo ser um mecanismo fundamental para a sobrevivência de células neoplásicas. No entanto, em lesões potencialmente malignas não se sabe sobre o comportamento do processo autofágico. Dessa forma, nosso estudo se propôs a estudar o comportamento da autofagia em neoplasias e em lesões potencialmente malignas bucais e correlacionar com os parâmetros clínicos e a evolução dessas lesões. Para tal finalidade foi utilizado a técnica de imunoistoquímica para avaliar em amostras de mucosa normal, leucoplasias e carcinomas espinocelulares bucais, o percentual de células positivas para o marcador LC3-II. Foram avaliadas 7 amostras de mucosa bucal normal, 51 leucoplasias e 120 carcinomas espinocelulares. Para a análise de carcinomas espinocelulares foi construído um microarranjo tecidual com 2 cilindros de cada paciente. Observamos o aumento dos níveis de autofagia no carcinoma espinocelular bucal (p<0,001) em relação aos outro grupos, porém sem associação com a evolução e sobrevida desses pacientes. Entre as leucoplasias, observamos maior percentual de células positivas na camada intermediária de leucoplasias 12 displásicas (p=0,0319) e na camada basal de lesões com pior evoluação (p=0,0133). Concluimos que os níveis de autofagia aumentam durante o processo de carcinogênese bucal e estão correlacionados com o pior comportamento das leucoplasias. / Autophagy is a catabolic process to digest the cell components and proteins that are no functional anymore. Autophagy maintains the homeostasis in order to cells survive in stressful conditions. In view of the biological functions of autophagy identified to date, the relationship between cellular autophagy and neoplasia is probably among the most studied, due to the dual role that autophagy exerts on the development of cancer. Cell autophagy can act as a tumor suppressor mechanism, or as a key mechanism for the survival of neoplastic cells. However, it is not known in potentially malignant lesions how the autophagic process is controlled. Therefore, the purpose of this study is to assess the autophagic process in oral cancer and potentially malignant oral lesions and to correlate with clinical parameters and the evolution of these lesions. For this purpose, the immunohistochemical technique was used to evaluate the percentage of cells positive for the LC3-II marker in the normal mucosa, leukoplakia and oral squamous cell carcinoma samples. Seven samples of normal buccal mucosa, 51 leukoplakia and 120 squamous cell carcinomas were evaluated. For the squamous cell carcinomas analysis, a tissue microarray with 2 cylinders of each patient was constructed. We observed increased levels of autophagy in oral squamous cell carcinoma (p <0.001) in relation to the other groups, however no association with the prognosis and survival of these patients was detected. Among the leukoplakias, we observed a higher percentage of positive cells in the intermediate layer of dysplastic leukoplakias (p = 0.0319) and in the basal layer of lesions with worse prognosis (p = 0.0133). We conclude that autophagy levels increase during the process of oral carcinogenesis and are correlated with the worse behavior of leukoplakia

Autofagia é o processo catabólico que ocorre nos lisossomos, e tem por finalidade degradar os componentes celulares e proteínas que já não são mais funcionantes e, assim manter seu equilíbrio homeostático para sobreviverem adequadamente em condições estressantes. Diante das funções biológicas da autofagia identificadas até hoje, a relação entre autofagia celular e neoplasias está provavelmente entre as mais estudadas, devido ao papel duplo que a autofagia exerce sobre o desenvolvimento do câncer, podendo atuar como um mecanismo supressor de tumor ou, podendo ser um mecanismo fundamental para a sobrevivência de células neoplásicas. No entanto, em lesões potencialmente malignas não se sabe sobre o comportamento do processo autofágico. Dessa forma, nosso estudo se propôs a estudar o comportamento da autofagia em neoplasias e em lesões potencialmente malignas bucais e correlacionar com os parâmetros clínicos e a evolução dessas lesões. Para tal finalidade foi utilizado a técnica de imunoistoquímica para avaliar em amostras de mucosa normal, leucoplasias e carcinomas espinocelulares bucais, o percentual de células positivas para o marcador LC3-II. Foram avaliadas 7 amostras de mucosa bucal normal, 51 leucoplasias e 120 carcinomas espinocelulares. Para a análise de carcinomas espinocelulares foi construído um microarranjo tecidual com 2 cilindros de cada paciente. Observamos o aumento dos níveis de autofagia no carcinoma espinocelular bucal (p<0,001) em relação aos outro grupos, porém sem associação com a evolução e sobrevida desses pacientes. Entre as leucoplasias, observamos maior percentual de células positivas na camada intermediária de leucoplasias 12 displásicas (p=0,0319) e na camada basal de lesões com pior evoluação (p=0,0133). Concluimos que os níveis de autofagia aumentam durante o processo de carcinogênese bucal e estão correlacionados com o pior comportamento das leucoplasias. / Autophagy is a catabolic process to digest the cell components and proteins that are no functional anymore. Autophagy maintains the homeostasis in order to cells survive in stressful conditions. In view of the biological functions of autophagy identified to date, the relationship between cellular autophagy and neoplasia is probably among the most studied, due to the dual role that autophagy exerts on the development of cancer. Cell autophagy can act as a tumor suppressor mechanism, or as a key mechanism for the survival of neoplastic cells. However, it is not known in potentially malignant lesions how the autophagic process is controlled. Therefore, the purpose of this study is to assess the autophagic process in oral cancer and potentially malignant oral lesions and to correlate with clinical parameters and the evolution of these lesions. For this purpose, the immunohistochemical technique was used to evaluate the percentage of cells positive for the LC3-II marker in the normal mucosa, leukoplakia and oral squamous cell carcinoma samples. Seven samples of normal buccal mucosa, 51 leukoplakia and 120 squamous cell carcinomas were evaluated. For the squamous cell carcinomas analysis, a tissue microarray with 2 cylinders of each patient was constructed. We observed increased levels of autophagy in oral squamous cell carcinoma (p <0.001) in relation to the other groups, however no association with the prognosis and survival of these patients was detected. Among the leukoplakias, we observed a higher percentage of positive cells in the intermediate layer of dysplastic leukoplakias (p = 0.0319) and in the basal layer of lesions with worse prognosis (p = 0.0133). We conclude that autophagy levels increase during the process of oral carcinogenesis and are correlated with the worse behavior of leukoplakia

O câncer bucal representa um problema de saúde pública mundial classificado como o sexto tipo de câncer mais comum. Apresenta índices de mortalidade em cinco anos preocupantes nas últimas décadas. Estima-se que aproximadamente 15% dos canceres bucais tenham causa desconhecida. Estudos publicados recentemente têm sugerido que a doença periodontal pode representar um risco aumentado para o desenvolvimento de câncer bucal. Entretanto, o impacto da doença periodontal sobre a patogênese do câncer bucal in vivo é quase inexistente na literatura. Esta tese avaliou, através de dois artigos, a relação entre a doença periodontal e o câncer bucal. O primeiro artigo da presente tese trata de uma revisão de estudos epidemiológicos sobre a associação da doença periodontal e câncer bucal, assim como estudos atuais a respeito de mecanismos biológicos. Os estudos epidemiológicos na sua maioria apontam a periodontite como um fator de risco independente para o câncer bucal após ajustes estatísticos para diferentes fatores confudindores, como o fumo. Os estudos biológicos tem na sua grande maioria a Porphyromonas gingivalis como agente etiológico para a doença periodontal e estaria envolvida em várias etapas de carcinogênese bucal como a proliferação, migração e invasão celular, assim como a metástase e resistência a agente quimioterapêuticos em estudos in vitro e in vivo a periodontite. O segundo artigo da presente tese teve como objetivo avaliar o efeito da periodontite induzida por meio de ligadura sobre a carcinogênese bucal através da exposição ao carcinógeno 4-Nitroquinolina 1-Óxido (4NQO) em ratos Wistar. Os resultados mostram o aumento da incidência de carcinoma espinocelular na língua de ratos quando na presença de periodontite previa. Além disso, houve um maior tamanho tumoral e uma menor diferenciação celular através da expressão de citoqueratina 10 nas línguas dos animais. Os resultados desta tese vêm ao encontro do que se encontra na literatura reforçando que a presença da doença periodontal é um importante modificador no desenvolvimento de câncer bucal. / Oral cancer is a worldwide public health problem rated as the sixth most common cancer. Its survival rates have remained worrisome in the last decades. It is estimated that approximately 15% of oral cancer have an unknown etiology. Recently published studies have suggested that periodontal disease may represent an increased risk for oral cancer development. However, the impact of periodontal disease on oral carcinogenesis in vivo is almost non-existent. The current thesis evaluated, through two articles, the relationship between periodontal disease and oral cancer. The first article was a review of epidemiological studies about the association of periodontal disease and oral cancer, as well as current studies about biologic mechanisms. Periodontal disease and oral cancer share many common established risk factors, but after adjusting for different confounding factors, periodontal disease seems to be an independent risk for oral cancer in most of epidemiologies studies. Studies focusing in biological mechanisms of the relationship between both diseases mainly focus in P.gingivalis. P. gingivalis seems to be involved with various steps of oral carcinogenesis as proliferation, migration invasion, aggressiveness and also metastasis and resistance to anti-cancer agents in vitro and in vivo studies. The second article of the current thesis aimed to evaluate the effect of induced-periodontitis by ligature on the experimental oral carcinogenesis induced by the chemical 4- nitroquinoline 1-oxide (4NQO) in Wistar rats. The results showed an increased incidence of squamous cell carcinoma in the rats’ tongues when in presence of previous periodontitis. The results of this thesis corroborate what we may find in the literature, reinforcing that the presence of periodontal disease act as an important modifier to oral cancer.

A descondensação da cromatina exerce um papel central nas diversas etapas do processo de carcinogênese abrindo o genoma para a ação de fatores de transcrição, exercendo papel na progressão e resistência tumoral. Bromodomínios e proteínas com terminal extra, como o BRD4, são leitores epigenéticos que regulam a expressão gênica e, portanto, também estão envolvidos na patogênese do câncer. O objetivo do presente estudo foi estudar o efeito da inibição do BRD4 no carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (CECP). Para esse propósito, foi utilizado JQ1, inibidor de BRD4, em concentração de 1uM, nas linhagens de carcinoma de cabeça e pescoço HN6, HN12 e HN13. Foi analisado os níveis de BRD4, H4 acetilada e SIRT1 fosforilado através de reações de imunofluorecência e p16ink4 por imunohistoquímica. Foi realizado western blot para checar os níveis de p53 e p53 acetilado. Ensaio de formação de colônias e câmera de invasão foram realizados para testar o efeito do inibidor na proliferação e invasão celular. Através da citometria de fluxo foi analisado o efeito da apoptose com a marcação de caspase-3 clivada, do ciclo celular através da reação por iodeto de propídio e ainda da população de células tronco tumorais pela análise de ALDH e CD44. Por fim, foi realizado modelo xenográfico subcutâneo para analisar o efeito do JQ1. Os resultados mostraram diminuição significativa da expressão de BRD4 e H4ac após tratamento com JQ1. As linhagens celulares mostraram redução na capacidade de invasão e de formação de colônias quando submetidas ao JQ1. Não foram encontradas diferenças em relação ao número de células caspase-3 clivada positivas. Por outro lado, foi encontrado um maior número de células na fase G1 do ciclo celular após o uso do inibidor estudado. As células tratadas com JQ1 mostraram menor expressão de p-SIRT1 o que levou a uma diminuição da acetilação do p53 e um aumento na expressão de p16ink4. Paralelamente, foi encontrado uma diminuição na população de células positivas para ALDH e CD44. Houve diminuição do crescimento do tumor no modelo xenográfico tratado com JQ1 quando comparado ao veículo. Nos tecidos derivados do ensaio in vivo, houve uma diminuição nos marcadores p16ink4, pSIRT1 além de acúmulo de H2AX. Conclui-se que o uso de JQ1 resulta na disrupção do crescimento do CECP associado a ativação de senescência, indução de dano de DNA além de reduzir a população de células tronco tumorais. Esses novos achados indicam que o BRD4 é um importante modificador epigenético nos CECP sendo um viável alvo terapêutico. / Chromatin descondensation plays a central step in the various stages of the carcinogenesis process opening the genome for transcription factors playing a role in tumor progress and resistance. Bromodomains and extra terminal family, as BRD4, are epigenetics readers that regulate gene expression thus they are also involved in cancer pathogenesis. The objective of this project was studied the effect of BRD4 in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). For this purpose, JQ1, a BRD4 inhibitor, was used in 1uM concentration, in HN6, HN12 and HN13 head and neck carcinoma cell lines. The levels of BRD4, acetylates h4 and phosphorylated SIRT1 were analyzed by immunofluorescence and p16ink4 labeling by immunohistochemistry. Western blot was performed to check the levels of p53 and acetylated p53. Colony assay and invasion chamber were performed to test the inhibitory effect on cell proliferation and invasion. The effect of apoptosis with the cleaved caspase-3 labeling, the cell cycle by propidium iodide and of the population of tumor stem cells by the analysis of ALDH and CD44 was analyzed through flow cytometry. Finally, a subcutaneous xerographic model was performed to analyze the effect of JQ1. A significant decrease in the expression of BRD4 and H4ac was found after application of JQ1. The cell lines results showed a reduction in the capacity of invasion and also formation of colonies when submitted to JQ1. No differences were found in relation to the number of cells caspase-3 cleaved positives. On the other hand, a large number of cells were found in G1 arrest of cell cycle after use of the BRD4 inhibitor studied. Cells treated with JQ1 showed lower expression of p-SIRT1 which led to a decrease in p53 acetylation and an increase in p16ink4 expression. In parallel, a decrease of ALDH and CD44 positive cells population was found. A decrease in tumor growth was discovered when treated by JQ1 if compared to the vehicle. In tissues samples derived from the in vivo assay, there was a decrease in p16ink4, pSIRT1 markers in addition to -H2Ax accumulation. In conclusion JQ1 causes HNSSC tumor growth disruption associated a senescence activation, DNA damage and a reduce number of cancer stem cells. These new findings indicate that BRD4 is an important genetic modifier in HNSSC and is a viable therapeutic target.

O câncer representa um importante problema de saúde pública no mundo, devido ao aumento da sua prevalência, além do grande impacto individual, institucional e social. Assim, merece uma abordagem ampliada, integral e interdisciplinar, a fim de minimizar as seqüelas decorrentes da doença ou do seu tratamento, visando à cura com manutenção da qualidade de vida (QV). Dessa forma, este trabalho teve como objetivos descrever o perfil sócio-demográfico e de saúde bucal de pacientes com câncer de cabeça e pescoço assistidos no HNSC, Porto Alegre – RS e, verificar o impacto na QV destes de um protocolo de cuidados odontológicos sistemático, antes, durante e depois da terapia oncológica. O estudo, delineado como um Ensaio Clínico Randomizado, teve a participação de 46 sujeitos com diagnóstico de neoplasia primária de cabeça e pescoço, captados por conveniência, consecutivamente e distribuídos aleatoriamente em dois grupos. No grupo controle, os pacientes foram examinados e orientados sobre os possíveis efeitos do tratamento oncológico e encaminhados aos serviços de atenção básica de referência para atendimento odontológico. No grupo intervenção, os pacientes foram examinados e orientados, sobre os possíveis efeitos do tratamento oncológico. Os sujeitos incluídos neste grupo receberam um protocolo de cuidados odontológicos na instituição, com acompanhamento profissional sistemático antes, durante e depois da terapia oncológica. Também foram fornecidas, aos cuidadores e pacientes, em ambos os grupos, orientações sobre os possíveis efeitos secundários da terapia oncológica e de ações para minimizar estes problemas. Os dados coletados referem-se a condições sócio-demográficas e de saúde bucal e também de avaliação da QV através de dois questionários - EORTC (específico para pacientes com câncer de cabeça e pescoço) e WHOQOL (avaliação geral da QV), aplicados em dois momentos distintos: antes e quinze dias depois da terapia oncológica concluída. Os resultados mostraram uma maior prevalência do câncer de cabeça e pescoço em homens, de baixo nível educacional e sócio-econômico, com pobre condição oral e média de idade de 54,2 anos. O diagnóstico histopatológico mais freqüente foi o carcinoma epidermóide, sendo as localizações preferenciais a língua e orofaringe. Mais de 60% dos diagnósticos foram realizados nas fases avançadas (III e IV – TMN) e os principais tratamentos realizados a cirurgia e a radioterapia. Apesar das características basais serem desfavoráveis, o grupo intervenção apresentou melhora na avaliação geral de QV e manutenção da específica após o tratamento oncológico, enquanto que o grupo controle mostrou piora em ambos, porém não houve diferença significativa entre os grupos. Entretanto, a variação das medidas (delta) no grupo intervenção, quando comparadas as características basais e finais, mostra uma projeção que tendencia uma melhoria significativa ao longo do tempo. Verifica-se também uma redução de candidíase (p<0,05) e mucosite no grupo intervenção. Conclui-se que os pacientes assistidos no Serviço de Oncologia do HNSC apresentaram o perfil típico dos tumores de localização de cabeça e pescoço no país, com maior prevalência de homens, tabagistas, de baixo nível sócio-econômico e educacional e pobre saúde oral. O protocolo de cuidados odontológicos desenvolvido foi capaz de reduzir danos decorrentes da terapia oncológica, além de poder contribuir para uma melhoria da QV ao longo do tempo aos pacientes com câncer de cabeça e pescoço. / Cancer represents a major public health problem all over the world due to the increase in its prevalence, besides its great individual institutional, and social impact. Thus, it deserves a wide, integral, and interdisciplinary approach in order to minimize the sequelae resulting from the disease or its treatment, and aiming to the healing with maintenance of the quality of life (QoL). This way, this study aimed to describe the social-demographic and oral health profile of head and neck cancer patients treated in Hospital Nossa Senhora da Conceição (HNSC), Porto Alegre, Brazil, and to check the impact of a systematic dental care guideline on the QoL before, during, and after the oncological therapy. The study, designed as a Randomized Clinical Trial, had the participation of 46 subjects with diagnosis of head and neck primary neoplasy, captured by convenience, consecutively, and randomly distributed in two groups. In the control group, patients were examined and advised about the possible effects of the oncological treatment and referred to the basic health care services for dental care. In the test group, patients were examined and advised about the possible effects of oncological treatment. The subjects included in this group received a dental care guideline in the institution, with a systematic professional follow-up before, during, and after the oncological therapy. Also, both caretakers and patients from each group received guidance about the possible secondary effects of the oncological therapy and the actions to minimize these problems. Collected data refer to the social-demographic and oral health status, as well as the evaluation of QoL by means of two questionnaires - EORTC (specific for head and neck cancer patients), and WHOQOL (general evaluation of QoL). These were administered in two distinct moments: before the onset and fifteen days after the conclusion of the oncological therapy. Results showed a higher prevalence of head and neck cancer in men, with low educational and social-economic level, with a poor oral condition, and an average age of 54.2 years. The most frequent histopathological diagnosis was epidermoidis carcinoma, being the preferential sites the tongue and the oropharynx. More than 60% of the diagnosis was done in the advanced phases (III e IV – TMN), and the main treatments performed were surgery and radiotherapy. In spite of the unfavorable baseline characteristics, the test group showed an improvement in the general evaluation of QoL, and maintenance of the specific QoL after the oncological treatment. The control group showed a worsening in both of them, although there was no significant difference between the groups. However, the range of the measures (delta) in the test group, when compared to the baseline and final characteristics, shows a projection tending to a significant improvement along time. A decrease in candidiasis (p<0,05) and muccositis was also shown in the test group. It is concluded that the patients treated in the Oncology Service of HNSC have shown a profile that is typical of the head and neck tumors in the country, with higher prevalence in men, smokers, low social-economic and educational level, and poor oral health. The dental care guideline that was developed was able to decrease harm resulting from the oncological therapy, as well as to contribute for an improvement of QoL along the time for the patients with head and neck cancer.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-06-01Bitstream added on 2014-06-13T19:30:16Z : No. of bitstreams: 1 mazon_rc_me_arafcf.pdf: 520188 bytes, checksum: 4af452f70d4ec4f1806399a4a3c1661c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O mdm2 parece controlar o tráfego da proteína p53 do núcleo-citoplasma enquanto a proteína p27 é um inibidor de CDK que controla a fase G1 para S do ciclo celular. Em contraste, a catepsina B parece induzir um sinal de apoptose independente de caspase na presença do HPV. Entretanto, a influência da infecção pelo HPV na carcinogênese oral e o envolvimento na desregulação das proteínas do ciclo celular não são claras. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a associação entre a expressão de proteínas do ciclo celular, p27, mdm2 e catepsina B e câncer oral na presença do HPV. Cinqüenta e cinco biópsias orais representando lesões benignas (LB), lesões potencialmente malignas (LPM) e lesões malignas (LM). A detecção e tipagem do HPV (6/11,16,18, 31 e 33) foi realizada pela reação da polimerase em cadeia (PCR). A expressão quantitativa de p27, mdm2 e catepsina B foi analisada pela reação imunohistoquímica. Vinte e uma (38%) de 55 lesões orais foram positivas para HPV. O DNA do HPV 6/11 foi encontrado em 6 (33%), HPV 16 em 1(5%) e o HPV 18 em 14 (72%). Não foi encontrado HPV 31 e 33. De 55 biópsias, foi encontrada alta expressão de todas as proteínas: o p27 foi encontrado em 37 (67,2%) lesões, mdm2 em 17 (30,9%) e a catepsina B em 37 (67,2%). Entre lesões orais de HPV positivo, uma superexpressão de p27, mdm2 e catepsina B foi encontrada, respectivamente, em 6 (33%) de 18 lesões benignas, 4 (22%) de 18 lesões potencialmente malignas e 11 (57,9%) de 19 lesões malignas. Adicionalmente, o HPV16/18 (11/58%) foi detectado em lesões malignas com alta expressão de todas as proteínas. Nós concluímos que os tipos de HPVs de alto risco devem estar associados com carcinoma oral, bem como, com a superexpressão de p27, mdm2 e catepsina B. Estes resultados sugerem que os tipos de HPVs de alto risco podem desregular o controle do ciclo celular, contribuindo para a carcinogênese oral. / Mdm2 seems to control p53 nucleus-cytoplasm traffic while p27 is a CDK inhibitor which control G1 to S phase of the cell-cycle. In contrast, cathepsin B is reported in HPVinduced apoptotic signalling caspase-independent. However, the influence of HPV infection in oral carcinogenesis and its involvement to this cell-cycle proteins dysfunction remain still unclear. The purpose of this study was to clarify the association between the expression of cell-cycle proteins, p27, mdm2 and cathepsin B and oral cancer HPV-related. Fifty-five oral biopsies presenting benign oral lesions (BL), potentially malignant lesions (PML) and malignant oral lesions (ML). HPV detection and typing (6/11, 16, 18, 31 and 33) was performed using polymerase chain reaction. p27, mdm2 and cathepsin B quantitative expression were performed by immunohistochemistry. Twenty one (38%) of the 55 oral lesions were positive for HPV, of which HPV6/11 DNA was found in 6 (33%), HPV 16 in 1(5%) e o HPV 18 in 14 (72%). No HPV positivity was found to HPV31 and 33. Of the 55 biopsies, a high expression of all proteins was found: to p27 in 37 (67,2%), mdm2 was observed in 17 (30,9%) slides, and cathepsin B in 37 (67,2%). Among HPV-positive oral lesions, an overexpression for mdm2, p27 and cathepsin B was found, respectively, in 6 (33%) out of 18 BL, 4 (22%) out of 18 PML and 11 (57,9%) out of 19 ML. In addition, HPV16/18 (11/58%) was detected in OSSC with high expression of all proteins. We conclude that high-risk HPV types might be associated with oral carcinoma, as well as, with the overexpression of mdm2, p27 and cathepsin B. These results suggest that high-risk HPV types might deregulate cell-cycle control, contribuiting to oral carcinogenesis.

O carcinoma espinocelular de boca (CEB) é a neoplasia maligna mais comum da cavidade oral, correspondendo à aproximadamente 94% dos casos dessa região. Apesar dos diversos estudos moleculares e celulares do CEB, a taxa de sobrevida dos pacientes é de aproximadamente 50%, devido principalmente ao tamanho do tumor, metástase em linfonodos regionais, grau de diferenciação das células e sítio anatômico. O microambiente tumoral do CEB, é extremamente complexo e diversificado, tendo como característica principal um estado inflamatório crônico imunossupressivo. Este microambiente é sustentado pela liberação de diferentes citocinas inflamatórias, como IL-6, TNF- - atividades exercidas tanto pelas células tumorais quanto pelas estromais. Dentre essas atividades, tem sido relatado na literatura que as citocinas inflamatórias são capazes de aumentar a migração e a capacidade de invasão das células tumorais. Entre as células estromais, os macrófagos são as mais abundantes e participam da manutenção do microambiente tumoral. De acordo com o estímulo, podem ser polarizados M1, com papel pró-inflamatório e antitumoral, e M2, com papel anti-inflamatório e pró-tumoral. O objetivo desta tese foi compreender o papel dos macrófagos no prognóstico de CEB e das citocinas inflamatórias IL-6, TNF- - linhagens celulares de CEB. Para verificar o papel dos macrófagos no prognóstico, foi realizada uma revisão sistemática na qual foram incluídos apenas os estudos que utilizavam amostra de pacientes com CEB e avaliavam o prognóstico com marcadores para macrófagos. Foi observado que maiores concentrações de macrófagos CD68+ e CD163+ estavam relacionados com pior prognóstico de pacientes com CEB, embora não tenha sido possível concluir qual região tumoral a presença destas células seja mais importante 7 para o desfecho. Para analisar o papel das citocinas inflamatórias IL-6, TNFILensaios in vitro utilizando duas linhagens celulares, SCC25 e Cal27, em condições promotoras de migração sob a influência dessas citocinas. Foi observado que a citocina IL-6 foi capaz de aumentar a velocidade de migração e a direcionalidade tanto da SCC25 quanto da Cal 27 e que esta melhora na capacidade migratória ocorreu através de um crosstalk entre a via de sinalização relacionada a IL6 (STAT3) e a via reguladora de migração celular, Rho GTPase Rac1. Estes dados reforçam o papel do microambiente tumoral no processo de progressão tumoral e sugerem potenciais alvos terapêuticos como a modulação do perfil da população de macrófagos e o papel de interleucinas no controle de invasão tecidual e metástase. / Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most common malignant neoplasm of the oral cavity, corresponding to approximately 94% of the cases in this region. Despite the diverse molecular and cellular studies of OSCC, the patient survival rate is approximately 50%, mainly due to tumor size, regional lymph node metastasis, cell differentiation and anatomic site. The OSCC tumor microenvironment is extremely complex and diverse, with the main characteristic being an immunosuppressive chronic inflammatory state. This microenvironment is supported by the release of different inflammatory cytokines, such as IL-6, TNF- - and enhance the activities of both tumor and stromal cells. Among these activities, it has been reported in the literature that inflammatory cytokines are capable of increasing migration and invasiveness of tumor cells. Among stromal cells, macrophages are the most abundant and participate in the maintenance of the tumor microenvironment. According to the stimulus, macrophages can be polarized in M1, with pro-inflammatory and anti-tumoral role, and M2, with antiinflammatory and pro-tumoral role. Thus, the aim of this thesis was to evaluate the role of macrophages in the prognosis of OSCC and the influence of inflammatory cytokines IL-6, TNF- - OSCC cell lines. To assess the role of macrophages in the prognosis, a systematic review was conducted in which only studies using a sample of OSCC patients were evaluated and the prognosis was evaluated with macrophage markers. It was observed that higher concentrations of CD68 + and CD163 + macrophages were related to worse prognosis in patients with OSCC, although it was not possible to conclude which tumor region the presence of these cells is more important for the outcome. In order to analyze the role of the inflammatory cytokines IL-6, TNF- - atory 9 behavior of OSCC cells, in vitro assays using two cell lines, SCC25 and Cal27, were performed in migration-promoting conditions under the influence of these cytokines. It was observed that IL-6 was able to increase the speed migration and directionality of both SCC25 and Cal 27 and that this improvement in migratory capacity occurred through a crosstalk between the IL6-related signaling pathway (STAT3) and cell migration-related pathway, RhoGTPase Rac1. These data reinforce the role of the tumor microenvironment in the tumor progression process and suggest potential therapeutic targets such as the modulation of the profile of the macrophages population and the role of interleukins in the control of tissue invasion and metastasis.