La maladie de Paget est une ostéopathie caractérisée par une augmentation multifocale du remodelage osseux, qui débute par un front de résorption osseuse, suivi d'une formation osseuse excessive, avec un remodelage anarchique et intense. Les ostéoclastes "OCs" impliqués dans la phase initiale sont les cellules responsables dans l'initiation du processus pagétique. Les OCs pagétiques sont caractérisés par une résistance à l'apoptose, et des anomalies du processus de l'autophagie "en particulier défaut d'induction"; afin de voir si ces deux caractéristiques étaient liées, nous avons émis l'hypothèse d’un rôle des complexes Bcl2-Beclin1. Beclin-1 est une protéine inductrice de l'autophagie qui peut lier les protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2; Bcl-2 inhibe alors Beclin-1 "et donc l'induction de l'autophagie" en conservant ses fonctions anti-apoptotiques. Dans le but d'étudier l'impact de l'expression de Bcl2 sur l’autophagie dans les OCs humains, nous avons utilisé un modèle de différenciation in vitro à partir de monocytes dérivés de sang de cordon ombilical, cultivés en présence de RANKL et MCSF pendant 21 jours. Ces conditions permettent d'obtenir des cellules multinucléées au phénotype ostéoclastique. Pour augmenter l’expression de Bcl-2 dans les OCs et analyser son impact sur l’autophagie par interaction avec Beclin-1, les cultures ont été stimulées par TNFα ou RANKL dans le but d'induire une activation de NF-κB. L'expression de Beclin1 et Bcl2 a été confirmée par immunobuvardage dans les OCs. L’autophagie était induite dans les cultures réalisées en conditions stringentes "milieu pauvre en nutriments", sans variation de l'expression de Bcl2 ou Beclin 1 selon les conditions, et sans impact de TNFa ou RANKL. TNFa stimulait de manière significative l'activation de NF-kB dans les cellules HEK mais pas dans les OCs. Toutefois, et quelque soit les conditions, les immunoprécipitations ne permettaient pas de retrouver d'association entre Beclin1 et Bcl2. En revanche, le partenaire d'interaction classique de Beclin1, PI3K type III, était associé à Beclin1. En conclusion, notre travail n'a pas permis d'étudier la formation des complexes Beclin1/Bcl2 et les relations entre apoptose et autophagie, en partie du fait de la complexité du modèle "effets multiples de NF-kB et TNFa" ce qui n'exclut pas l'hypothèse initiale "à ré-évaluer par une méthodologie plus appropriée". En revanche les différentes techniques d'analyse sont maintenant au point pour la poursuite de l'étude. / Abstract : Paget's disease is an osteopathy characterized by a multifocal increase in bone remodeling, which begins with excessive bone resorption followed by increased bone formation. Osteoclasts "OCs" were incriminated in the initiation of the pagetic process. Pagetic OCs are characterized by a resistance to apoptosis, and abnormalities in the process of autophagy “in particular induction defect”. In order to define whether these two characteristics were linked, we hypothesized the role of Bcl2-Beclin1 complexes. Beclin-1 is an autophagy-inducing protein that can bind anti-apoptotic proteins of the Bcl-2 family; Bcl-2 then inhibits Beclin-1 "and thus the induction of autophagy" while retaining its anti-apoptotic functions. To study the impact of Bcl2 expression on autophagy in human OCs, we used an in vitro differentiation model that uses monocytes, which are derived from umbilical cord blood and grown in the presence of RANKL and MCSF for 21 days. These conditions make it possible to obtain multinucleated cells with an osteoclastic phenotype. To increase the expression of Bcl-2 in OCs and analyze its impact on autophagy due to its interaction with Beclin-1, cultures were stimulated with TNFα or RANKL in order to induce NF-κB activation. The expression of Beclin1 and Bcl2 was confirmed by immunoblotting of Ocs cell lysates. Autophagy was induced in cultures carried out under stringent conditions "nutriment-deprived mediun", but we did not observe any variation in the expression of Bcl2 or Beclin 1 according to the culture conditions or TNFα or RANKL stimulation. TNFα significantly stimulated the activation of NF-κB in HEK cells but not in OCs. However, whatever the conditions, results from immunoprecipitaion experiments did not reveal any association between Beclin1 and Bcl2. On the other hand, the classic interaction partner of Beclin1, PI3K type III, was associated with Beclin1. In conclusion, our work did not allow us to demonstrate the formation of Beclin1 / Bcl2 complexes and the relationship between apoptosis and autophagy, partly because of the complexity of the model "multiple effects of NF-κB and TNFα". Our initial hypothesis should thereby be re-evaluated using a more appropriate methodology. On the other hand, the different techniques are now ready for further study.

L'autotaxine (ATX) est une protéine sécrétée par différents tissus y compris le foie, le tissu adipeux et l'os. L'ATX possède une activité lysophopholipase D responsable du clivage de la lysophosphatidyl-choline (LPC) en acide lysophosphatidique (LPA), facteur de croissance affectant la prolifération cellulaire, la différenciation et la migration. Il a été démontré que les effets biologiques du LPA pourraient être la conséquence de la production locale d'ATX dans un tissu ou une cellule donnée. Nous avons récemment démontré que le LPA contrôle l'ostéoclastogenèse et l'activité de résorption ostéoclastique. De plus, nous avons démontré que l'expression de Enpp2 (gène de l'ATX) augmente au cours de l'ostéoclastogenèse. Le but de notre étude était d'évaluer l'implication de l'ATX produite par les ostéoclastes au cours de l'ostéoclastogenèse et dans le contrôle de la masse osseuse, en particulier en conditions inflammatoires.La production et le rôle de l'ATX au cours de l'ostéoclastogenèse ont été analysés sur les ostéoclastes murins et humains. De plus, l'ATX a été spécifiquement ciblée dans les ostéoclastes avec l'utilisation des souris Enpp2fl/fl Ctsk-Cre et par le traitement pharmacologique des souris par un anti-ATX. La perte osseuse en conditions inflammatoires a été évaluée dans le modèle d'inflammation induite par le lipopolysaccharide (LPS) et dans les modèles de souris arthritiques par transfert de sérum K/BxN et avec la lignée transgénique surexprimant le TNF humain hTNF. La production de l'ATX par les ostéoclastes est cruciale pour l'activité de résorption osseuse ostéoclastique in vitro. Les souris Enpp2fl/fl Ctsk-Cre ne présentent pas de phénotype osseux en conditions physiologiques mais sont protégées de la perte osseuse systémique et des érosions osseuses observées en conditions arthritiques. De plus, l'ihibition pharmacologique de l'ATX protège les souris de la perte osseuse systémique et des érosions focales observées dans le modèle hTNF+/- .L'inhibition pharmacologique et génétique de l'ATX améliore la perte osseuse locale et systémique inflammatoire en inhibant la résorption osseuse. L'ATX semble être une cible thérapeutique prometteuse dans la prévention de la perte osseuse associée à l'inflammation / Autotaxin (ATX) is a secreted protein produced by various tissues including the liver, adipose tissue and bone. ATX exhibits a lysophospholipase D activity responsible for cleavage of lysophosphatidyl-choline (LPC) in lysophosphatidic acid (LPA) that in turn acts as a growth factor, affecting cell proliferation, differentiation, and migration. It has been shown that biological effects of LPA could be the direct consequence of local production of ATX in a given tissue or cell type. We showed that LPA controls osteoclastogenesis and osteoclast bone resorption activity. In addition, we observed that Enpp2 (ATX gene) was upregulated during osteoclastogenesis. The aim of the study was to evaluate if ATX produced by osteoclasts could play a role in osteoclastogenesis and bone mass control, especially in inflammatory conditions.The role of ATX on osteoclastogenesis and osteoclast activity were analysed by murine and human assays. ATX was targeted by conditional inactivation of Ennp2 (ATX gene) in osteoclasts (Enpp2fl/fl Ctsk-Cre) and by treatment with anti-ATX. Arthritic and erosive diseases were studied in arthritis models using human tumor necrosis factor transgenic (hTNF+/-) mice and K/BxN serum-treated mice. Systemic bone loss was analysed in the Lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation model. Joint inflammation and osteoclasts were assessed by histology and bone mass and bone erosion by micro-CT.ATX production by osteoclasts was observed and was revealed as a crucial factor controlling osteoclast activity. Inhibition of ATX led to reduced bone resorption in vitro. Then, we generated Enpp2fl/fl Ctsk-Cre+/- mice allowing ATX depletion specifically in mature osteoclasts. These mice showed no specific bone phenotype under physiological conditions but displayed significant protection against systemic bone loss and almost an absence of bone erosion formation after challenge with LPS and K/BxN serum transfer. Pharmacological inhibition of ATX significantly mitigated focal and systemic TNF-induced bone loss. Pharmacological and genetic inactivation of ATX ameliorates systemic and focal inflammatory bone loss by inhibiting bone resorption. ATX emerges as a new promising therapeutic target for the prevention of inflammatory associated bone loss

L’ostéoporose touche principalement les femmes après la ménopause, c’est une maladie caractérisée par une détérioration de la minéralisation et de la micro-architecture de l’os. L’objectif du travail de thèse présenté ici est d’identifier une fraction protéique laitière ayant un effet stimulant sur la formation osseuse. Une telle fraction, ajoutée dans un produit ou un complément alimentaire, pourrait contribuer à réduire la perte osseuse. La première étape du projet consiste à produire les fractions laitières. Des protéines laitières (caséine ou protéines sériques) ont été digérées par des enzymes puis filtrées pour les fractionner selon leur poids moléculaire. Les fractions obtenues ont ensuite été testées sur des cultures primaires de cellules osseuses. Certaines fractions protéiques laitières ont augmenté la prolifération et la différenciation des ostéoblastes. Parmi ces fractions actives, la fraction correspondant au rétentat d’une filtration sur un filtre à 10kDa d’un hydrolysat de caséine par de la chymotrypsine a été sélectionnée pour être testée sur animaux. Cette fraction a été nommée fraction CR10. Pour étudier l’activité du CR10 in vivo sur le métabolisme osseux, un modèle de souris sous restriction protéique est mis au point. Nos études démontrent que, lorsque le régime est basé sur des protéines de soja, le passage d’un régime contenant 20% de protéines à un régime contenant 6% de protéines induit une réduction de la formation osseuse. Le traitement des souris sous restriction protéique avec du CR10 n’a eu aucun effet, ce qui signifie que le CR10 n’arrive pas à exercer son activité anabolique in vivo. En revanche, si de la caséine est donnée à la place du soja ou si de la PTH est injectée aux souris, la formation osseuse est augmentée. Ces résultats suggèrent que la fraction CR10 n’est pas un bon candidat comme fraction anabolique. En revanche, l’effet positif de la caséine par rapport au soja pourrait être exploité lors de futures études visant à mettre au point une fraction caséique ostéoanabolique. / Osteoporosis is a disease mainly affecting women after menopause, characterized by a reduced bone mineralization and a deterioration of bone micro-architecture. The aim of this thesis is to identify a milk protein fraction able to stimulate bone formation. When added to a food product, this fraction could reduce bone loss. The first task of this project was to produce the milk protein fractions. Milk proteins (casein or whey proteins) were digested by enzymes and fractionated by filtration according to their molecular weight. The fractions obtained were then tested on primary cultures of bone cells. Some of the milk protein fractions tested were able to increase proliferation and differentiation of osteoblasts. Among these active fractions, the one obtained by digestion of casein by chymotrypsin followed by filtration through a 10 kDa filter have been selected to be tested on animals. This fraction is named CR10. To study the activity of CR10 in vivo, a protein-restricted mouse model has been developed. Our studies showed that a reduction of protein in the diet from 20% to 6% impaired bone formation when the diet was based on soy protein. When these protein-restricted mice ingested the CR10 fraction, no improvement of the BMD was reported, which means that the CR10 cannot exert its anabolic activity in vivo. However, if casein is given instead of soy or if PTH is injected to the mice, bone formation is increased. These results suggest that the CR10 is not a good candidate as an anabolic fraction. However, the positive effect of casein compared to soy could be exploited in future studies aimed at finding an osteoanabolic casein fraction.

Les maladies inflammatoires chroniques sont associées à un maintien de la réponse immunitaire et notamment la présence de cellules T CD4+ mémoires. Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ont pour conséquence une perte osseuse due à une augmentation du nombre et de l'activité des ostéoclastes, les cellules responsables de la résorption osseuse. Les cellules CD4+ ont été décrites comme participant à la différenciation des ostéoclastes mais la nature exacte de ces cellules reste encore indéterminée. Des études in vivo et in vitro chez la souris et chez l’Homme nous ont permis de décrire une population inflammatoire Th17 TNFα CD4+ présente dans la moelle osseuse participant à la différenciation des ostéoclastes. Ces cellules Th17 participent au recrutement et à la différenciation des monocytes en ostéoclastes en agissant sur les cellules stromales mésenchymateuses. De plus, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin sont associées à une augmentation de la prolifération et de la différenciation des cellules souches hématopoïétiques en cellules myéloïdes. Suite à un stress chimique ou mécanique, les ostéoclastes participent à la mobilisation des cellules souches hématopoïétiques depuis la moelle osseuse. Nous avons montré qu’au cours des maladies inflammatoires de l’intestin, l’augmentation de l’activité des ostéoclastes participe à la prolifération et la différenciation des cellules souches en cellules myéloïdes. Ainsi, les ostéoclastes sont devenus une nouvelle cible thérapeutique intéressante dans la lutte des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin / Chronic inflammatory diseases are associated to maintain of memory response and the presence of memory CD4+ T cells. Inflammatory bowel diseases are associated with bone loss due to an increase of the number and activity of osteoclasts, the bone-resorbing cells. CD4+ T cells participated to osteoclasts differentiation, but their nature is still undetermined. In vivo and in vivo studies in mice and human allow us to describe an inflammatory Th17 TNFα CD4+ T cells in the bone marrow that participated to osteoclast differentiation and link inflammation and bone loss. Th17 T cells induce the recruitment and the differentiation of monocytes into osteoclasts acting on mesenchymal stromal cells. Moreover, inflammatory bowel diseases are associated in an increase of hematopoietic stem cell (HSC) mobilization. In stress condition, osteoclasts act on HSC niches and induce their mobilization. We have shown that in inflammatory bowel disease, increase osteoclast activity is involved in the proliferation and differentiation of stem cells into myeloid cells. These myeloid cells are responsible for the intestinal inflammation. Thus, osteoclasts have become an exciting new therapeutic target in the fight of inflammatory bowel diseases

L’exposition à l’uranium, qu’elle soit naturelle ou accidentelle, est un sujet de préoccupation de santé publique. Cet actinide est utilisé dans de nombreuses applications civiles ou de défenses. Il est également présent de façon naturelle dans l’eau de boisson et dans l’alimentation. Sa toxicité chimique cible en majorité le rein, organe de stockage à court terme, et les tissus squelettiques, où l’uranium est retenu pendant des années. L’uranium induisant une perte osseuse à long terme, il est susceptible d’affecter les cellules impliquées dans le processus de remodelage osseux : les ostéoclastes (OCs) qui résorbent la matrice osseuse, les ostéoblastes (OBs), qui la reconstitue via la minéralisation, et les ostéocytes (OSTs), les capteurs mécano-sensibles, orchestrant le cycle de remodelage. Par ailleurs, aucune thérapie de chélation (comme il en existe pour d’autres métaux lourds) n’est véritablement efficace pour diminuer l’exposition interne et éliminer cet actinide en cas de contamination à l’uranium. Dans l’optique de comprendre les mécanismes de toxicité mis en jeu sur les cellules osseuses, la première partie de cette thèse est ainsi consacrée à l’étude des effets moléculaires et fonctionnels d’une exposition aiguë et chronique à l’uranium sur une lignée ostéocytaire, les cellules MLO-A5. Nous avons d’abord montré que ces cellules présentent une IC50 plus élevée que les OCs et les OBs et qu'une exposition aiguë stimule le processus autophagique. Dans un second temps, nous avons analysé la réponse de ces cellules lors d’une exposition chronique à des concentrations sub-toxiques d’uranium, et observé une inhibition drastique de leur capacité de minéralisation, sans toutefois affecter leur viabilité.Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés aux effets d’un décorporant potentiel de l’uranium, le 3,4,3-LI(1,2-HOPO), sur les OBs et les OCs, dans le but de mettre au point une méthode de criblage de nouveaux décorporants. Les résultats ont montré que le 3,4,3-LI(1,2-HOPO) permet une restauration partielle des capacités de différenciation et de résorption des OCs exposés à l'uranium. Ces résultats permettront d’adapter cette méthode pour le criblage de futurs décorporants dans une démarche de valorisation. Ainsi, ces travaux ont permis d’accroître les connaissances de la toxicité chimique de l’uranium sur les cellules osseuses, et ont apporté de nouvelles données toxicologiques in vitro concernant les effets d’un agent décorporant, le 3,4,3-LI(1,2-HOPO), dans ces modèles cellulaires. / Natural or accidental uranium exposure is a health care concern. Uranium is a natural metal found in the environment and is both used for civil or military applications. It is also naturally present in food and water. It exhibits both a radiological and a chemical toxicity, the latter being considered largely predominant for natural uranium. Kidneys and bones are the main targeted organs of its toxicity. The skeleton is the storage organ of uranium and can be retained there for years, causing a long-term bone loss. Bone cells, osteoclasts cells in charge of bone resorption, osteoblasts involved in matrix production and mineralization, and osteocytes, considered the major orchestrators of bone remodeling, are therefore likely to exhibit impaired functions. Furthermore, current chelation therapy treatments failed to demonstrate a true decorporating efficiency after internal uranium contaminations.The first part of this study describes molecular and cellular effects of acute and chronic uranium exposure on a murine osteocytic cell line MLO-A5. Acute exposure enhanced their autophagic process and CI50 determination shows less toxicity on osteocytes than on osteoclasts and osteoblasts. Moreover, mineralization capacity of these cells was strongly inhibited after a chronic exposure without affecting cell viability. In a second part, we determined the in vitro effects of 3,4,3-LI(1,2-HOPO), a potential decorporating agent, on osteoclasts and osteoblasts with the intend to develop methods for decorporating agent screening. This molecule shows an ability to partly restore differentiation and resorption function of exposed osteoclasts to uranium. These results constitute a step forward in the development of screening methods to evaluate the potential of new decorporating agent.Taken together, these results enhanced our knowledge of uranium toxicity mechanisms on bone cells and brought new toxicological data regarding the use of 3,4,3-LI(1,2-HOPO) in our cellular models.

Le neutrophile, le leucocyte le plus abondant de circulation, est un acteur majeur dans la réaction inflammatoire. Bien qu'il soit indispensable pour la défense de l'hôte, le dérèglement de l'activité des neutrophiles a également le potentiel de causer des dommages tissulaires importants. Nous sommes partis de l'hypothèse que l'exposition à long terme à des médiateurs inflammatoires pourrait changer le profil fonctionnel du neutrophile. À cette fin, nous avons incubé des neutrophiles circulants humains avec des cytokines facilitant la survie et trouvé une sous-population de ces cellules pouvant persister pendant plus de 72 heures. Par rapport aux neutrophiles fraîchement isolés, ces neutrophiles de longue durée de vie avaient un phénotype très différent avec des caractéristiques de surface modifiée. Leurs fonctions effectrices notamment le chimiotactisme, la production de superoxyde et de leucotriènes, la dégranulation et la synthèse de cytokines, etc. ont été également modifiées. Comme les médiateurs dérivés de neutrophiles ont été impliqués dans la propagation de l'inflammation dans l'arthrite rhumatoïde, on a essayé ensuite de placer le neutrophile ± reprogrammé ¿ dans ce contexte spécifique. Nous avons trouvé que le liquide synovial et des neutrophiles stimulés par le lipopolysaccharide pouvaient augmenter l'expression de surface du receptor activator of NF-kappa B ligand (RANKL), une molécule essentielle pour l'activation de la résorption osseuse, par le neutrophile. En effet, nous avons montré que le RANKL du neutrophile interagit avec le RANK exprimé par les ostéoclastes, et induit la différenciation des ostéoclastes et la résorption osseuse. En outre, le RANKL associé à la membrane est actif au sein du neutrophile lui-même, induit une phosphorylation du Src homology 2 domain-containing tyrosine phosphatase -1 et inhibe les fonctions des neutrophiles. De plus, nous avons procédé à la co-incubation des neutrophiles avec des synoviocytes d'arthrite rhumatoïde (RA-FLS). Cette co-incubation induit l'expression de RANK dans les neutrophiles. L'activation du RANK par son ligand biologique favorise la survie des neutrophiles, la dégranulation et la synthèse de cytokines. En conclusion, nous présentons des preuves que le neutrophile inflammatoire acquiert de nouvelles fonctions au-delà de celles associées à sa contrepartie classique circulant. Par ailleurs, l'expression de molécules ostéotropiques de l'axe RANKL-RANK-OPG positionne le neutrophile comme un lien cellulaire entre le squelette et le système immunitaire.

Les eicosanoïdes sont des médiateurs importants qui encadrent et régulent les fonctions osseuses. Leur production est sous la tutelle des phospholipases A[indice inférieur 2] qui permettent la relâche d’acide arachidonique et de lysophospholipides puis de leur métabolisme subséquent des membranes cellulaires. Les PLA[indice inférieur 2] sécrétées ont également comme particularité de pouvoir exercer leurs effets directement via leurs récepteurs membranaires comme ligand. Malgré l’implication connue des prostaglandines sur les fonctions ostéoclastiques et dans plusieurs processus pathologiques résultants en érosion osseuse, les phospholipases A[indice inférieur 2] ostéoclastiques restent inconnues et leurs rôles, spéculatifs. Les études présentées démontrent la présence de la cPLA[indice inférieur 2]-α et de la sPLA[indice inférieur 2] IIA chez les ostéoclastes humains. Par contre, leur expression semble différer selon l’état de l’os. En effet, la cPLA[indice inférieur 2]-α semble exprimée ubiquitairement, mais la sPLA[indice inférieur 2] IIA n’est détectable que dans l’os fœtal ou atteint de la maladie de Paget et n’est pas exprimée dans l’os sain, ostéoporotique ou arthrosique. La sPLA[indice inférieur 2] IIA semble donc exprimée en condition de fort remodelage osseux. Dans notre modèle, la cPLA[indice inférieur 2]-α revêt un rôle anti-ostéoclastogénique. En effet, la cPLA[indice inférieur 2]- α produit des écosanoïdes qui inhibent l’ostéoclastogenèse. Ces derniers sensibilisent les ostéoclastes à l’apoptose. En revanche, un certain degré d’activation de la cPLA[indice inférieur 2]-α est requis pour la résorption osseuse, car son inhibition bloque la résorption osseuse en désorganisant les anneaux d’actine requis pour la résorption, et ce, de façon dépendante de la production d’acide arachidonique. En ce qui a trait à la sPLA[indice inférieur 2] IIA, elle stimule l’ostéoclastogenèse indépendamment de son activité catalytique, probablement via l’un de ses récepteurs membranaires. D’autre part, elle confère une résistance à l’apoptose autant chez les ostéoclastes matures que chez leurs précurseurs CD14+. Par contre, l’inhibition de la sPLA[indice inférieur 2] IIA bloque la résorption osseuse indépendamment du remodelage du cytosquelette d’actine, probablement via leur apoptose. Les résultats inclus dans cette thèse semblent donc démontrer la présence de deux PLA[indice inférieur 2]s chez les ostéoclastes humains ainsi que leur attribuer des rôles en physiologie et pathologie osseuse. Ces évidences pourraient faire des PLA[indice inférieur 2] de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de pathologies ostéo-articulaires, dont la maladie osseuse de Paget. // Abstract : Eicosanoïds are important mediators of bone biology. The first regulated enzymes in the biosynthetic pathway of eicosanoids are the PLA[subscript 2]s, which release arachidonic acid and lysophospholipids from membrane phospholipids. Further metabolism of arachidonic acid will lead, among other things, to the synthesis of prostaglandins, which deeply influence bone metabolism. Secreted PLA[subscript 2]s (sPL[subscript 2]) may also act independently of their catalytic activity, as a ligand to their membrane bound receptors. Even though PLA[subscript 2]s have been associated with joint and bone pathologies, their presence and functions were never investigated in osteoclasts (OCs), the principal cell responsible for bone destruction. Our study established the presence of cPLA[subscript 2] and sPLA[subscript 2] in human OCs, but demonstrated a contrast in their expression. cPLA[subscript 2] seems to be expressed ubiquitously, contrary to sPLA[subscript 2] whose expression is restricted to OCs from foetal bone and bone suffering from Paget disease. There is no trace of sPLA[subscript 2] in healthy bone or bone suffering from osteoarthrosis or osteoporosis, thus sPLA[subscript 2] seems tightly linked to high bone turnover. In our model, cPLA[subscript 2] exerted an anti-osteoclastogenic effect. Indeed, cPLA[subscript 2] produces eicosanoïds that inhibit osteoclastogenesis and sensitize OCs to apoptosis. Nevertheless, a minimum cPLA[subscript 2] activity is required since complete cPLA[subscript 2] inhibition blocks osteoclast mediated bone resorption. Its inhibition leads to disorganization of the OC cytoskeleton and inhibits the actin ring formation required for bone resorption in an arachidonic acid dependent fashion. On the other hand, sPLA[subscript 2] stimulates osteoclastogenesis independently of its catalytic activity; probably via interaction with one of its membrane bound receptors. sPLA[subscript 2] decreases OC and their CD14+ precursors’ sensibility to apoptosis. Moreover, sPLA[subscript 2] inhibition inhibits bone resorption independently of actin cytoskeleton remodeling, probably by inducing mature OC apoptosis. Together, these results demonstrate the presence of two PLA[subscript 2]s in human OCs and highlight their important roles in bone physiology and pathophysiology. Highlighting those functions could eventually lead to the elaboration of new strategies to control hyperosteoclastic states by targeting PL[subscript 2]s.

Cette thèse traite de la modélisation du remodelage osseux. Nous présentons tout d'abord un modèle général continu tenant compte de la réponse cellulaire à un stimulus mécanique. Ce modèle est appliqué à des géométries 2D et 3D macroscopiques afin de se rapprocher des problématiques réelles, ainsi que sur des géométries mésoscopiques d'os trabécullaires en 2D. Cependant la complexité du remodelage osseux ne permet pas d'avoir une approche unique de modélisation. Ainsi, dans un second temps, le cas particulier du remodelage osseux orthodontique est étudié. Un nouveau modèle spécifique est développé tenant compte de l'influence du ligament parodontal sur le remodelage osseux, et intégrant l'influence du taux d'oxygène qui contrôle les évolutions de densités cellulaires. Des données expérimentales in vitro sont extraites de la littérature et servent de données d'entrées du modèle développé afin d'obtenir l'évolution de la densité osseuse alentours d'une racine dentaire cylindrique en 3D. / This work deals with modelization of bane remodeling. We present first a madel thal accounts for the cellular res panse to a mechanical stimulus in a general case at a continuous scale. This madel is applied to 2D and 3D geometries at macroscopic scale to mimic real cases, as weil as 2D trabecular-type geometries at mesoscopic scale. However, the complexity of bane remodeling does not allow a unique approach. Th us, the thesis work is focused on the particular case of orthodontie bane re mode ling. A new specifie madel is developed accounting for the influence of the periodontal ligament on orthodontie bane remodeling by integrating the oxygen concentration effect controling the evolutions of cellular densities. The cellular experimental data in vitro are extracted from the literature, and serve as input data of the developed madel in arder to ablain the evolution of bane density around the root of a 3D cylindrical tooth.

Ce travail de thèse a eu comme objectif la mise en place et la validation d’une méthodologie expérimentale pour le suivi de l’évolution in-vitro de substituts osseux à base de phosphates de calcium. Du phosphate dicalcique dihydraté (DCPD, CaHPO4·2H2O) et du phosphate tricalcique bêta (β-TCP, β-Ca3(PO4)2) ont été choisis comme matériaux modèles de deux grandes classes de substituts osseux: les “biosolubles” (sujets à dissolution après implantation) et les “biorésorbables” (sujets à résorption cellulaire après implantation). Pour l’étude des phénomènes de dissolution et de reprécipitation observés lorsque les phosphates de calcium sont plongés en solution, ces matériaux ont été produits sous forme d’échantillons microporeux (60% de porosité pour le DCPD, 75% pour le β-TCP) et soumis à des tests de dissolution in-vitro en conditions statiques ou dynamiques (sans ou avec renouvellement du liquide) dans différentes solutions tamponnées à pH physiologique (TRIS et PBS) et pour des durées s’étalant entre 30 minutes et 2 mois. L’analyse des propriétés physico-chimiques, microstructurales et mécaniques des échantillons avant et après immersion a permis d’évaluer l’influence du type de milieu et des conditions de test choisies sur l’évolution des échantillons. Une attention particulière a été prêtée à la caractérisation mécanique: la technique de micro-indentation instrumentée sphérique a été préférée à autres essais plus conventionnels. Cette technique permet d’évaluer plusieurs paramètres tels que la dureté et le module de Young de façon quasi non-destructive et à une échelle locale. En conséquence, l’utilisation de la micro-indentation s’est avérée d’une grande aide pour le suivi des caractéristiques d’échantillons dégradés qui présentaient un gradient de propriétés entre la surface (où le processus de dégradation commence) et le cœur (sujet à des changements sur plus long terme). La dernière partie de cette étude a été dédiée à l’étude du deuxième phénomène qui entraine la résorption de substituts osseux in-vivo, à savoir la résorption cellulaire. Pour cela des essais cellulaires avec des cellules précurseurs d’ostéoclastes ont été réalisés sur des échantillons denses de β-TCP pur ou dopé avec 5% molaire de magnésium. L’addition de cet élément est censée modifier les propriétés du matériau (notamment sa solubilité) et, par conséquence, modifier le comportement cellulaire. Les résultats des tests ont confirmé la cytocompatibilité des deux types de β-TCP, mais ont également mis en avant une difficulté d’activation des ostéoclastes. Deux des causes possibles seraient liées à la topographie de surface des échantillons et au relargage des ions calcium suite à la dissolution du matériau. / The present Ph.D. thesis work was aimed to establish and assess an experimental methodology to monitor the in-vitro evolution of calcium phosphate (CaP) bone substitutes. Dicalcium phosphate dihydrate and beta-tricalcium phosphate were chosen as model of two main classes of bone substitutes: “biosoluble” ones (which undergo dissolution after implantation) and “bioresorbable” ones (which undergo cellular resorption after implantation). In order to study the dissolution and precipitation phenomena, which take place once CaPs are immersed in solution, these materials were produced in the form of micro-porous samples (60% of porosity for DCPD, 75% for β-TCP) and used for dissolution tests in-vitro in static and dynamic conditions (without or with liquid renewal) in different buffered solutions at physiologic pH (TRIS and PBS) and for periods of time ranging between 30 minutes and 2 months. The analysis of the physico-chemical, microstructural and mechanical properties of the samples before and after immersion allowed to evaluate the influence of the chosen medium and immersion conditions on the evolution of the specimens. Particular attention was paid to the mechanical characterisation: instrumented spherical micro-indentation was preferred to other more conventional tests. This technique enables the evaluation of several parameters such as the hardness and the Young’s modulus in a quasi-non-destructive way and on a local scale. As a consequence, the use of micro-indentation proved to be of great help for monitoring the characteristics of the degraded specimens, which presented a gradient of properties between the surface (where the degradation process starts) and the core (subject to changes on a longer period). The last part of this work was focused on the study of the second main phenomenon, which takes part in the in-vivo resorption of bone substitutes, that is to say the cellular resorption. For this purpose, cellular tests with osteoclast-precursor cells were carried out on dense samples made of pure and magnesium-doped β-TCP (5 mol.% of Mg). The addition of magnesium was aimed to modify the properties of the material and, as a consequence, the cellular behavior. The results confirmed the cytocompatibility of both types of β-TCP, but they also showed a difficult activation of osteoclasts. Two of the possible causes would be linked to the topography of the surface of the specimens and to the release of calcium ions due to the dissolution of the material.

L'interleukine-17A (IL-17A) et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) sont des cytokines pro-inflammatoires impliquées dans la pathogénèse de plusieurs maladies articulaires. Au cours de la polyarthrite rhumatoïde (PR), une augmentation de la destruction osseuse ainsi qu'un defaut de réparation sont responsables des dommages articulaires. Cependant au cours de la spondylarthrite ankylosante (AS), une importante ossification ectopique est observée, conduisant à la formation de syndesmophytes, associé à une perte de la masse osseuse systémique. Récemment, l'étude de ces cytokines a conduit à la publication de résultats contradictoires. Notre objectif a donc été d'étudier l'effet de ces deux cytokines sur la différenciation ostéogénique de cellules souches mésenchymateuses humaines isolées (hMSCs) et de fibroblastes de la membrane synoviale (FLS). Tous les modèles de cellules utilisés, ont démontré que l'IL-17A et le TNF-α augmentent de manière synergique l'ostéogénèse. Ceci semble se rapprocher du modèle de l'AS où une formation d'os ectopique est observée dans laquelle l'IL-17A et le TNF-α jouent un rôle majeur. En parallèle, ces deux cytokines stimulent localement les ostéoclastes, entraînant une perte de masse osseuse observée à la fois dans la PR et dans l'ostéoporose. Cibler simultanément l'IL-17A et le TNF-α pourrait conduire à une diminution de l'infiltration de cellules et de la destruction articulaire observée dans la PR et pourrait ainsi réduire les effets des FLS PR sur l'activation de l'ostéoclastogénèse / Interleukin-17A (IL-17A) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) are pro-inflammatory cytokines involved in the pathogenesis of several arthritic diseases. In rheumatoid arthritis (RA), joint damage is a result of an increase in bone destruction and a decrease in bone repair. In contrast, in ankylosing spondylitis (AS), a bone mass loss accompanied by a significant ectopic ossification is observed leading to the formation of syndesmophytes. Recent studies led to contradictory findings regarding the role of IL-17A and TNF-α in arthritic disease. Therefore, our objective was to study the effect of these two cytokines on the osteogenic differentiation of isolated human mesenchymal stem cells (hMSCs) and fibroblasts of the synovial membrane (FLS). In all the cell models used, we demonstrated that Il-17A and TNF α synergistically increase osteogenesis. This seems to approach the model of AS where ectopic bone formation is observed and in which IL-17A and TNF-α both are involved. These cytokines stimulate osteoclasts locally resulting in loss of bone mass observed in both RA and osteoporosis. Thus, targeting IL-17A and TNF-α could lead to a decrease in cell infiltration and joint destruction which is observed in RA and may reduce the effects of RA FLS on the activation of osteoclastogenesis