A manipulação no período neonatal tem sido utilizada há algumas décadas como modelo experimental para analisar os mecanismos pelos quais variações precoces no ambiente do animal afetam o desenvolvimento de sistemas neurais, dando origem a alterações comportamentais e neuroendócrinas estáveis na vida adulta. Em ratos, a manipulação neonatal consiste do manuseio suave dos filhotes por alguns minutos, em geral durante as duas primeiras semanas de vida. Trabalhos prévios demonstram que a manipulação neonatal altera o eixo hipotálamo-hipófise-gônada, reduzindo a capacidade reprodutiva de fêmeas através da diminuição do comportamento sexual, do bloqueio da ovulação e promove um atraso na instalação da puberdade. Com isso, o objetivo desse trabalho foi estudar os efeitos da manipulação neonatal sobre a função ovariana de ratas. Animais foram submetidos à manipulação neonatal durante 1 minuto, nos dez primeiros dias de vida pós-natal, e após três ciclos estrais regulares os ovários foram retirados, na fase do proestro, para análise histológica dos mesmos. A análise estrutural dos ovários das ratas manipuladas mostrou que não houve diferença estatisticamente significativa no peso ovariano, no número total de folículos antrais por ovário e nos diferentes diâmetros da espessura da camada das células da teca de folículos antrais normais e atrésicos. A manipulação neonatal induziu aumento do número de folículos antrais normais por ovário, redução no número de folículos antrais atrésicos por ovário, aumento do númerode folículos antrais normais com diâmetros inferiores a 300 mm e uma diminuição do número de folículos antrais atrésicos com diâmetros entre 401-500 mm. Em conjunto, nossos resultados demonstraram que a manipulação neonatal não induz alterações no desenvolvimento morfológico folicular e que, os mecanismos que levam a redução da capacidade reprodutiva de fêmeas provocada pela manipulação neonatal, como o bloqueio da ovulação, já visto em trabalhos do nosso laboratório, não estão associados a alterações de estrutura ovariana.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2016-09-19T16:54:13Z No. of bitstreams: 1 2016_JanicedeMirandaVasconcelosVilela.pdf: 3616352 bytes, checksum: 9412786c69d298726d117345dce621af (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-12-02T14:03:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_JanicedeMirandaVasconcelosVilela.pdf: 3616352 bytes, checksum: 9412786c69d298726d117345dce621af (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-02T14:03:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_JanicedeMirandaVasconcelosVilela.pdf: 3616352 bytes, checksum: 9412786c69d298726d117345dce621af (MD5) / O objetivo deste trabalho foi testar a viabilidade de utilização das técnicas de cultivo in vitro, cultivo em membrana corioalantoica de embriões de galinha (CAM) e autotransplante heterotópico para avaliação da do tecido ovariano de gatas. Na primeira etapa, foi comparado o cultivo de tecido ovariano fresco de gatas in vitro e em CAM para determinar se estes métodos seriam adequados para avaliar a eficácia da criopreservação de tecido ovariano. Para isso, ovários de 8 gatas foram cortados em cubos de 3 mm3, cultivados in vitro e em CAM por até 5 dias. A porcentagem de folículos primordiais na população de folículos morfologicamente normais (FMN) foi sempre maior que 80%, com exceção do dia 3 de cultivo em CAM. Não foi observado proliferação celular ao longo do cultivo. Adicionalmente, ambos os métodos mostraram um aumento do tecido conjuntivo a cada dia que o tecido permaneceu em cultivo. Foi observado vascularização durante o cultivo em CAM, porém sem associação com a viabilidade folicular. Nenhum dos sistemas foi capaz de promover crescimento e/ou desenvolvimento folicular. O autotransplante heterotópico já se mostrou eficiente em tecido ovariano fresco de gatas, por isso, na segunda etapa do experimento, este método foi utilizado para avaliar o protocolo de criopreservação de tecido ovariano felino. Quatro gatas foram submetidas a ovariohisterectomia e os ovários foram cortados e criopreservados. Após uma semana, foram autotransplantados para o tecido subcutâneo da região dorsal do pescoço e retirados após 7, 14, 28, 49 e 63 dias. A porcentagem de folículos morfologicamente normais primordiais e em crescimento nas amostras de tecido fresco (Grupo Controle) foram de 87,8% e 96,7%, respectivamente, e imediatamente após o descongelamento (Controle Crio) de 73,7% e 100%, respectivamente, e não foram significativamente diferentes entre si. Folículos em crescimento quase não foram vistos após o transplante. Nenhum FMN foi encontrado a partir de 49 dias de transplante. Nos fragmentos de Controle e Controle Crio, a maioria dos folículos (primordiais e em crescimento) apresentavam proliferação das células da granulosa. Dois folículos antrais foram encontrados aos 28 dias em uma das gatas e se mostraram vivos e proliferativos. Houve um aumento das fibras colágenas a partir dos 7 dias de transplante. A vascularização do tecido foi observada após 7 dias de transplante, e vasos sanguíneos calibrosos foram facilmente observados nos dias 49 e 63 após transplante. Houve uma grande perda folicular após o transplante de tecido ovariano de gatas previamente criopreservado. Em conclusão, o cultivo em CAM não parece promissor para tecido ovariano de felinos, mas o cultivo in vitro pode ser otimizado para melhor desenvolvimento dos folículos ovarianos de gatas e para avaliação do tecido após criopreservação. Os transplantes permanecem como a alternativa mais viável para avaliar a criopreservação. No entanto, o presente estudo mostrou que a sobrevivência folicular após criopreservação e transplante foi muito baixa, provavelmente devido à junção das injúrias causadas pela criopreservação com os danos provocados pelo período de isquemia-reperfusão do tecido nos primeiros dias de transplante. Desta forma, as técnicas de transplante e de criopreservação também devem ser otimizadas. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The aim of this study was to test the viability of in vitro culture (IVC), culture in the chorioallantoic membrane of chick embryos (CAM) and heterotopic autotransplantation techniques for evaluation of cat ovarian tissue. In the first stage, we compared the culture of fresh cat ovarian tissue in vitro and in CAM to determine if those methods would be suitable to evaluate the efficacy of cryopreservation of ovarian tissue. For this, ovaries from 8 queens were cut in 3 mm³ cubes, and cultured in vitro and in CAM for up to 5 days. The percentage of primordial follicles in the population of morphologically normal follicles (MNF) was always higher than 80%, with the exception of day 3 in the CAM. Cellular proliferation was not observed in culture. Additionally, both methods showed an increase in connective tissue during culture. Vascularization was observed during culture in CAM, however, there was no association with follicular viability. None of the systems were capable of promoting follicular growth and/or development. Heterotopic autotransplantation has already been demonstrated to be effective for fresh cat ovarian tissue, thus, in the second stage of this study, this method was used to evaluate ovarian tissue cryopreservation. Four queens were subjected to ovariohysterectomy and the ovaries were cut and cryopreserved. After one week, they were thawed and autografted to the subcutaneous tissue of the dorsal neck region and removed after 7, 14, 28, 49 and 63 days. The percentage of primordial and growing MNF in fresh tissue samples (Control) were 87.8% and 96.7%, respectively, and immediately after thawing (Cryo Control) were 73.7% and 96.7%, respectively, and they were not significantly different. Growing follicles were hardly seen after grafting. No MNF were found after 49 days of transplantation. In Control and Cryo Control fragments, most of the follicles (primordial and growing) presented granulosa cell proliferation. Two antral follicles were found on day 28 post-transplantation in one of the queens and they were alive and proliferative. There was an increase in connective fibers from day 7 of transplantation on. Vascularization of the tissue was observed after 7 days of grafting and calibrous blood vessels were easily observed in days 49 and 63 post-grafting. There was a great follicular loss after cryopreserved ovarian tissue transplantation. In conclusion, culture in CAM does not seem promising for cat ovarian tissue, but IVC may be optimized for better cat follicle development and evaluation of the tissue after cryopreservation. Transplantation remains the most viable alternative to evaluate cryopreservation. However, this study showed that follicular survival after cryopreservation and grafting was low, probably due to the combination of injuries caused by cryopreservation with the damages caused by ischemia-reperfusion period in the early days of the tissue transplant. Thus, the techniques of cryopreservation and transplantation must also be optimized.

A manipulação no período neonatal tem sido utilizada há algumas décadas como modelo experimental para analisar os mecanismos pelos quais variações precoces no ambiente do animal afetam o desenvolvimento de sistemas neurais, dando origem a alterações comportamentais e neuroendócrinas estáveis na vida adulta. Em ratos, a manipulação neonatal consiste do manuseio suave dos filhotes por alguns minutos, em geral durante as duas primeiras semanas de vida. Trabalhos prévios demonstram que a manipulação neonatal altera o eixo hipotálamo-hipófise-gônada, reduzindo a capacidade reprodutiva de fêmeas através da diminuição do comportamento sexual, do bloqueio da ovulação e promove um atraso na instalação da puberdade. Com isso, o objetivo desse trabalho foi estudar os efeitos da manipulação neonatal sobre a função ovariana de ratas. Animais foram submetidos à manipulação neonatal durante 1 minuto, nos dez primeiros dias de vida pós-natal, e após três ciclos estrais regulares os ovários foram retirados, na fase do proestro, para análise histológica dos mesmos. A análise estrutural dos ovários das ratas manipuladas mostrou que não houve diferença estatisticamente significativa no peso ovariano, no número total de folículos antrais por ovário e nos diferentes diâmetros da espessura da camada das células da teca de folículos antrais normais e atrésicos. A manipulação neonatal induziu aumento do número de folículos antrais normais por ovário, redução no número de folículos antrais atrésicos por ovário, aumento do númerode folículos antrais normais com diâmetros inferiores a 300 mm e uma diminuição do número de folículos antrais atrésicos com diâmetros entre 401-500 mm. Em conjunto, nossos resultados demonstraram que a manipulação neonatal não induz alterações no desenvolvimento morfológico folicular e que, os mecanismos que levam a redução da capacidade reprodutiva de fêmeas provocada pela manipulação neonatal, como o bloqueio da ovulação, já visto em trabalhos do nosso laboratório, não estão associados a alterações de estrutura ovariana.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Diogo Trindade Fóis (diogo_fois@hotmail.com) on 2009-10-13T15:56:58Z No. of bitstreams: 1 2008_RosangelaBatistaVasconcelos.pdf: 3213459 bytes, checksum: b9cfce3ea8f8eb38c4fed7e8a078f0a6 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2009-10-15T15:10:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_RosangelaBatistaVasconcelos.pdf: 3213459 bytes, checksum: b9cfce3ea8f8eb38c4fed7e8a078f0a6 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-10-15T15:10:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_RosangelaBatistaVasconcelos.pdf: 3213459 bytes, checksum: b9cfce3ea8f8eb38c4fed7e8a078f0a6 (MD5) Previous issue date: 2008-06 / Os efeitos dos hormônios gonadotrópicos sobre o desenvolvimento folicular já são bem caracterizados, no entanto, interações entre gonadotrofinas, esteróides e fatores de crescimento sobre os mecanismos intraovarianos envolvidos na regulação da foliculogênese e steroidogenesis ainda são pouco compreendidos. Neste sentido, o presente trabalho padroniza sistemas de cultivo com as células somáticas da parede do folículo, representado pela hemissecção da parede folicular, utilizando dois meios distintos: Um meio definido, aqui denominado ?-MEM e um meio indefinido, aqui denominado TCM. Os sistemas de cultura foram avaliados com relação à manutenção da atividade esteroidogênica, por dosagem dos hormônios estradiol e progesterona, expressão do RNAm da proteína StAR, enzimas da steroidogenesis, e receptor de FSH, aspectos morfológicos e imunomarcação para Cx43 nas hemissecções antes e após cultivo por 24 e 48 horas. Foram utilizados ovários de vacas abatidas em frigoríficos e transportados até o laboratório em solução salina à 37 ºC, dos quais foram dissecados folículos aparentemente saudáveis com 4 e 5 mm diâmetro. Os folículos foram seccionados ao meio para obter as hemissecções da parede do folículo, ou em três para obtenção das partes utilizadas na análise de RT-PCR. As secções do folículo foram cultivadas em meio 100ul do meio e incubadas em estufa a 37,5°C com 5% CO2 e 95% umidade por 24 ou 48 horas. Os Resultados mostram que os meios possuem capacidades de regulação distintas sobre a steroidogenesis folicular, características morfológicas e imunomarcação para Cx43. Os Sistemas de cultura com meio TCM apresentaram elevada concentração de P4 com 24 horas, e aumento progressivo da secreção deste hormônio no cultivo com 48 horas, redução da luminosidade das bandas das enzimas da steroidogenesis ( P450scc, arom, 17bHSD, 3bHSD) e do receptor do FSH após cultivo de 48 horas, além de alteração da morfologia celular a qual adquire forma semelhante a fibroblastos e perda da comunicação célula-célula evidenciada pela ausência da imunomarcação para Cx43 nas células foliculares; resultados que indicam luteinização celular, que podem ser decorrentes do uso do soro fetal bovino e elevadas concentração de FSH utilizado neste meio. Já os resultados obtidos para os sistemas de cultura que utilizaram o meio definido a-MEM puro ou acrescido de FSH em concentração fisiológica, mostra habilidade deste meio em manter atividade esteroidogênica ao longo do tempo de cultura, com menor secreção de P4 do que a obtida no meio indefinido, que não se altera ao longo da cultura, manutenção da expressão das enzimas da steroidogenesis após 48 horas de cultivo, além de conservar a característica morfológica das células semelhantes às obtidas in vivo e elevada expressão da proteína Cx43, resultados semelhantes àqueles obtidos com outros sistemas de cultivo livre de soro, e deixa evidente a capacidade do meio em manter as células foliculares in vitro com comportamento semelhante àquele de células de folículos saudáveis e em desenvolvimento. No meio a-MEM acrescido com FSH foi evidente o efeito estimulante sobre atividade esteroidogênica das células somáticas quando utilizado em dose fisiológica, por estimular a P450 aromatase e prevenir morte celular.

A manipulação no período neonatal tem sido utilizada há algumas décadas como modelo experimental para analisar os mecanismos pelos quais variações precoces no ambiente do animal afetam o desenvolvimento de sistemas neurais, dando origem a alterações comportamentais e neuroendócrinas estáveis na vida adulta. Em ratos, a manipulação neonatal consiste do manuseio suave dos filhotes por alguns minutos, em geral durante as duas primeiras semanas de vida. Trabalhos prévios demonstram que a manipulação neonatal altera o eixo hipotálamo-hipófise-gônada, reduzindo a capacidade reprodutiva de fêmeas através da diminuição do comportamento sexual, do bloqueio da ovulação e promove um atraso na instalação da puberdade. Com isso, o objetivo desse trabalho foi estudar os efeitos da manipulação neonatal sobre a função ovariana de ratas. Animais foram submetidos à manipulação neonatal durante 1 minuto, nos dez primeiros dias de vida pós-natal, e após três ciclos estrais regulares os ovários foram retirados, na fase do proestro, para análise histológica dos mesmos. A análise estrutural dos ovários das ratas manipuladas mostrou que não houve diferença estatisticamente significativa no peso ovariano, no número total de folículos antrais por ovário e nos diferentes diâmetros da espessura da camada das células da teca de folículos antrais normais e atrésicos. A manipulação neonatal induziu aumento do número de folículos antrais normais por ovário, redução no número de folículos antrais atrésicos por ovário, aumento do númerode folículos antrais normais com diâmetros inferiores a 300 mm e uma diminuição do número de folículos antrais atrésicos com diâmetros entre 401-500 mm. Em conjunto, nossos resultados demonstraram que a manipulação neonatal não induz alterações no desenvolvimento morfológico folicular e que, os mecanismos que levam a redução da capacidade reprodutiva de fêmeas provocada pela manipulação neonatal, como o bloqueio da ovulação, já visto em trabalhos do nosso laboratório, não estão associados a alterações de estrutura ovariana.

Introdução: A criopreservação de fragmentos de tecido ovariano previamente ao início da terapia oncológica e posterior reimplante do tecido ovariano tem sido sugerido como promissora alternativa para preservação de fertilidade. Neste sentido, um novo sistema de vitrificação denominado Ovarian Tissue Cryosystem (OTC), vem sendo desenvolvido visando aperfeiçoar a conservação do tecido congelado. Objetivo: Avaliar o impacto da criopreservação sobre a viabilidade do tecido ovariano murino vitrificado por três diferentes protocolos, dentre eles o sistema OTC. E avaliar o impacto do reimplante heterotópico do tecido ovariano murino fresco e descongelado pelos mesmos protocolos, sobre a sua viabilidade. Metodologia: Este é um estudo experimental onde foram utilizados tecido ovariano de camundongos C57BL/6. Três protocolos de vitrificação foram testados simultaneamente: protocolo murino (PrM); protocolo humano (PrH); protocolo OTC (PrOTC) em comparação ao grupo frescos (GF). As amostras foram analisadas imediatamente após o descongelamento (Etapa 1) ou após 15 ou 30 dias de reimplante retroauricular (Etapa 2). Para análise da viabilidade utilizou-se imunohistoquímica para proliferação celular (Ki-67), dano celular (NF-kB) e dano oxidativo (4-HNE e Nitrotirosina). Os resultados foram obtidos utilizando-se o teste Q-quadrado para verificar a distribuição entre os grupos e a imunomarcação (% de folículos marcados), sendo que o nível de significância adotado foi p<0,05. Resultados: Etapa 1: Os grupos PrOTC e PrM apresentaram melhor desempenho em relação à proliferação celular. Entretanto, estes mesmos protocolos apresentaram graus variados de dano oxidativo quando analisados pela imunomarcação de nitrotirosina, aonde o PrOTC teve maior marcação do que o GF, portanto maior dano, e o PrM teve maior marcação em relação ao HNE em comparação com os demais protocolos. Não houve nenhuma diferença na marcação do NF-kB entre os grupos descongelados. Etapa 2: O reimplante em si não pareceu comprometer significativamente o tecido, uma vez que as amostras GF e GF reimplantado com 15 e 30 dias tiveram desempenho semelhante em relação à todos os marcadores, com exceção do GF 30 dias que mostrou algum grau de dano oxidativo pela nitrotirosina (p<0,05). E ao se avaliar a somatória de efeitos entre congelamento e reimplante entre os diferentes protocolos apenas o PrH evidenciou dano tecidual imediatamente após o descongelamento e dano progressivo após o reimplante. Conclusão: Os PrM e PrOTC foram semelhantes ao GF na conservação da amostra durante o processo de criopreservação, sendo que o PrOTC causou algum grau de dano oxidativo. O reimplante retroauricular do tecido não impactou sobre a sua viabilidade do mesmo nem no GF e nem nos PrM e PrOTC. O PrH mostrou-se inadequado para a conservação de tecido ovariano murino. / Introduction: The Cryopreservation of fragments of ovarian tissue prior to initiation of oncotherapy and subsequent reimplantation of ovarian tissue has been suggested as promising alternative for fertility preservation. In this sense, a new system of vitrification called Ovarian Tissue Cryosystem (OTC), has been developed in order to improve the frozen ovarian tissue conservation. Objective: To compare the viability of murine ovarian tissue vitrified by three different vitrification protocols and to verify the efficiency of the Ovarian Tissue Cryosystem (OTC). Methods: This is an experimental study using ovarian tissue of C57BL/6 mice. Three vitrification protocols were tested simultaneously: Murine protocol (PrM); Human Protocol (PrH) and Protocol OTC (PrOTC); in comparison to Fresh Tissue (GF). Samples were analyzed immediately after thawing (Step 1) or after 15 or 30 days of retroauricular reimplantation (Step 2). For viability analysis immunohistochemistry for cell proliferation (Ki-67), cell damage (NF-kB) and oxidative damage (4-HNE and Nitrotyrosine) was used. The results were obtained using the Q-square test to analyze immunostaining counted as % of labeled follicles and the level of significance was set at p <0.05. Results: Step 1: The PrOTC and PrM presented the best performance in relation to cell proliferation. However, these same protocols presented varying degrees of oxidative damage when analyzed by the nitrotyrosine immunolabeling, where PrOTC had higher marking than GF, thus greater damage, and PrM had a greater marking in relation to HNE compared to the other protocols. There was no difference in the labeling of NF-kB between the thawed groups. Step 2: The reimplantation procedure did not appear to significantly impair the ovarian tissue quality once day 15 and 30 after fresh tissue engrafment of was similar for all markers except for nitrotyrosine after 30 days (p<0,05). And when assessing the sum of effects of freezing and reimplantation among the 3 different protocols only PrH showed tissue damage immediately after thawing and progressive damage after reimplantation. Conclusion: The PrM and PrOTC were similar to the GF in the preservation of the sample during the cryopreservation process, and PrOTC caused some degree of oxidative damage. Retroauricular reimplantation of the tissue did not impact on its viability in either the GF or PrM and PrOTC. PrH was found to be unsuitable for the cryopreservation of murine ovarian tissue.

Resumo não disponível.

O objetivo deste trabalho foi determinar o protocolo mais eficiente de criopreservação de tecido ovariano utilizando o sistema automático de congelação, que requer rampas de resfriamento gradativo, modelo Freeze Control®, para comparar a integridade do tecido ovariano congelado através de duas diferentes curvas de congelação combinadas com dois diferentes crioprotetores: dimetilsulfóxido (DMSO) e etileno glicol (EG). Para a realização do trabalho foram utilizadas 20 ratas Wistar que foram submetidas à oofarectomia bilateral. Os ovários foram divididos em duas partes, uma parte foi criopreservada em DMSO 1,5M e a outra em EG 1,5M. Ainda, foram analisadas duas curvas de congelamento (curva lenta com duração de 1h e 50min, e uma curva rápida com duração de 35 min). As amostras de tecido, após congelação, foram descongeladas, fixadas e processadas para a coloração com hematoxilina e eosina para a análise da integridade dos oócitos. Finalmente fez-se a análise e quantificação dos folículos íntegros versus os não íntegros, como também o dano tecidual. Para a análise folicular foi utilizado o microscópio óptico em aumento de 400x e realizou-se a classificação dos folículos pré-antrais de acordo com o estágio de desenvolvimento em primordiais e primários. Os resultados foram submetidos à ANOVA e as comparações entre as médias feitas pelo teste de Tukey com (P<0,05). Nos resultados foi observado que no tecido criopreservado os folículos que persistiram íntegros em cada ovário foram os primordiais em 79% e primários em 29%. Já no tecido não congelado (controle) foram encontrados todos os tipos foliculares, primordiais, primários, secundários, pré-antrais e antrais. Entre as alterações reversíveis identificaram-se vacuolizacão citoplasmática e contorno irregular. Quanto às alterações irreversíveis foi encontrado picnose. Concluindo, no tecido ovariano criopreservado, foram encontrados apenas folículos primordiais e primários apresentando alterações histológicas reversíveis e irreversíveis. Além disso, o crioprotetor EG promoveu uma melhor preservação destes folículos, comparado com o DMSO. Não foi encontrada diferença estatisticamente significativa, na preservação dos folículos, quando se comparou as duas curvas de congelação. / The aim of this study was to determine the most efficient protocol of cryopreservation of ovarian tissue using authomatic freezing system. This system requires Freeze Control® ramps of gradative cooling to compare the integrity of frozen ovarian tissue through two different freezing curves together with two different cryoprotectants: dimethilsulphoxide (DMSO) and ethylene glycol (EG). In this work 20 Wistar female rats were submitted to bilateral oophorectomy. The ovaries were divided in two parts, one part was cryopreserved in DMSO 1,5M and the other in EG 1,5M. Two frozen curves (a slow curve lasting 1h and 50min and a rapid curve lasting 35min) were analyzed. The tissue samples were frozen and after defrosted, fixed, and processed to hematoxylin and eosin staining to analyse oocyte. The analysis and quantification of integrated follicles, non-integrated, and tissue damage was performed. In the follicular analysis it was used 400x optical microscope and performed the classification of pre-antral follicles in primordial and primary according to their stage of development. The results were submitted to ANOVA and the comparasions between the averages were done using the Tukey test (P<0,05). It was observed that in the cryopreserved tissue the follicles remaining integrated in each ovary were 79% primordial and 29% primary. In the non-frozen tissue (control) were found all kinds follicular primordial, primary, secondary, preantral and antral follicles. Cytoplasmic vacuolization and irregular cell outline were identified among reversible alterations. Picnosis was found as an irreversible alteration. To conclude only primordial and primary follicles were enconutered in the ovarian tissue cryopreserved and there are revisable and irreversible histological alterations. Furthermore, the crioprotectant EG was more efficient then DMSO in other to preserve a higher number of primordial and primary viable folicules. No statistical significant difference was detected when we compare the two curves of cryopreservation system.

FROTA, I. M. A. Estabilidade de genes de referência e influência das BMPs-6 e 7 sobre o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos. 2010. 114 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará. 2010. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-04-04T14:52:49Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_imafrota.pdf: 1470611 bytes, checksum: afb3ce2b8c7bbc8dbd88c66e1c9331c5 (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa(djeannecosta@gmail.com) on 2016-04-04T14:53:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_imafrota.pdf: 1470611 bytes, checksum: afb3ce2b8c7bbc8dbd88c66e1c9331c5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-04T14:53:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_imafrota.pdf: 1470611 bytes, checksum: afb3ce2b8c7bbc8dbd88c66e1c9331c5 (MD5) Previous issue date: 2010 / This study aims to evaluate the stability of reference genes and the expression of growth factors and hormone receptors in goat secondary follicles. It also seeks to quantify the expression of messenger RNA for BMP-6 and BMP-7 in goat preantral follicles and to evaluate the effects of FSH, BMP-6 and BMP-7 on growth and gene expression in secondary follicles goats after 6 days of culture. To evaluate the stability of reference genes, secondary follicles (150-200 μm) were mechanically isolated from goat ovaries. After extraction of total RNA and synthesis of complementary DNA, the quantification of mRNA was carried out by real-time PCR using specific primers for genes of reference (GAPDH, β-tubulin, β-actin, PGK, UBQ, RPL - 19, rRNA18S), growth factors (GDF-9, BMP-15, BMP-6, FGF-2, VEGF, KL and IGF-1) and hormone receptor (FSH-R, LH-R and GH-R). To evaluate expression of BMP-6 and BMP-7, primordial follicles, primary and secondary as well as small and large antral follicles were obtained and the mRNA levels of BMP-6 and 7 were measured. For in vitro studies, the effects of BMP-6 (50 ng / mL) and BMP-7 (50 ng / mL) in the presence or absence of FSH (50 ng / mL) on the development of secondary follicles and on the expression of mRNA for BMP-6 and 7 and FSH-R was evaluated after 6 days of culture. Results showed that mRNA for growth factors (EGF, GDF-9, BMP-15, VEGF, FGF-2, BMP-6, IGF-1 and KL) and the receptors for FSH, LH and GH are expressed in at different levels in preantral follicles of goats. Moreover, among the growth factors studied, IGF-1 and EGF had higher and lower levels or RNA, respectively. UBQ and β-actin genes were the mostr stable reference in fresh and cultured preantral follicles. The level of mRNA for BMP-6 in primary and secondary follicles was significantly higher than those in primordial follicles, while the levels of mRNA for BMP-7 was higher in granulosa cells / theca in large antral follicles than in small antral follicles. After culture of secondary follicles for 6 days, FSH increased follicular diameter and FSH and BMP-7 significantly increased the levels of mRNA for BMP- 7 and FSH-R. In addition, BMP-6 in the presence or absence of FSH increased the diameter of secondary follicles after 6 days of culture. Real-time PCR shoed that FSH increased the levels of mRNA for BMP-6, while both BMP-6 and FSH and increased levels of mRNA for FSH-R, after a period of 6 days of culture. In conclusion, UBQ and β-actin are the two most stable genes for secondary follicles goats and FSH and BMPs of types 6 and 7 stimulate the growth of preantral follicles after 6 days of in vitro culture. / Este trabalho tem como objetivo avaliar a estabilidade de genes de referência e a expressão de fatores de crescimento e de receptores de hormônios em folículos secundários de caprinos. Além disso, visa quantificar a expressão dos RNA mensageiros para BMP-6 e BMP-7 em folículos pré-antrais e antrais caprinos e avaliar os efeitos de FSH, BMP-6 e BMP-7 sobre o crescimento e expressão gênica em folículos secundários caprinos durante 6 dias de cultivo. Para avaliar a estabilidade dos genes de referência, folículos secundários (150-200 µm) foram isolados mecanicamente de ovários caprinos. Após a extração do RNA total e síntese de DNA complementar, realizou a quantificação dos mRNA, por PCR em tempo real, utilizando-se primers específicos para genes de referência (GAPDH, β-tubulina, β-actina, PGK, UBQ, RPL-19, rRNA18S), fatores de crescimento (GDF-9, BMP-15, BMP-6, FGF-2, VEGF, KL e IGF-1) e receptores de hormônio (FSH-R, LH-R e GH-R). Para avaliar a expressão de BMP-6 e BMP-7, folículos primordiais, primários e secundários, bem como pequenos e grandes folículos antrais foram obtidos e os níveis de mRNA de BMP-6 e 7 foram quantificados. Nos estudos in vitro, os efeitos da BMP-6 (50 ng/mL) e BMP-7 (50 ng/mL) na presença ou ausência de FSH (50 ng/mL) sobre o desenvolvimento in vitro de folículos secundários e sobre a expressão de mRNA para BMP-6 e 7 e FSH-R foi avaliada após 6 dias de cultivo. Os resultados mostraram que UBQ e β-actina são os genes de referência mais estáveis em folículos pré-antrais caprinos fresco cultivados por 12 dias. Os RNAs mensageiros para os fatores de crescimento (EGF, GDF-9, BMP-15, VEGF, FGF-2, BMP-6, IGF-1 e KL) e os receptores de FSH, LH e GH são expressos em diferentes níveis em folículos pré-antrais de caprinos, sendo que o IGF-1 e o EGF apresentaram, respectivamente, o maior e o menor nível de mRNA. O nível de mRNA para BMP-6 em folículos primários e secundários foi significativamente maior do que aqueles em primordial, enquanto que os níveis de mRNA para BMP-7 foi maior nas células da granulosa/teca de grandes do que nos pequenos folículos antrais. Após o cultivo de folículos secundários durante 6 dias, FSH aumentou o diâmetro folicular e FSH e BMP-7 aumentou significativamente os níveis de mRNA para BMP-7 e FSH-R. Já a BMP-6 na presença ou ausência de FSH aumentou o diâmetro dos folículos secundários. Além disso, FSH aumentou os níveis de mRNA para BMP-6, enquanto ambos BMP-6 e FSH e aumentaram os níveis de mRNA para FSH-R, após o período de cultivo. Em conclusão, UBQ e β-actina são os dois genes mais estáveis para folículos secundários caprinos e o FSH e as BMPs dos tipos 6 e 7 estimulam o crescimento de folículos pré-antrais in vitro durante 6 dias de cultivo.

Resumo não disponível.