Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Evidências têm mostrado que as espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas pela NAD(P)H oxidase são importantes moduladores de diversas funções celulares como migração, crescimento, proliferação e sobrevivência. Estudos recentes demonstraram o envolvimento da atividade da NAD(P)H oxidase no crescimento e sobrevivência de células de melanoma. Neste trabalho, investigamos o efeito da inibição da NAD(P)H oxidase por difenileneiodônio (DPI) sobre o crescimento das células de melanoma humano MV3 e observamos que este composto reduziu o crescimento destas células em aproximadamente 50%. A inibição da NAD(P)H oxidase induziu mudanças no formato celular, com arredondamento, diminuição do espraiamento e descolamento celular. Esta redução foi acompanhada por um rearranjo do citoesqueleto de actina, diminuição da fosforilação no resíduo Tyr397 da quinase de adesão focal (FAK) e redução na associação de FAK com actina e com a tirosina quinase c-Src. Isto indica que a inibição da geração de ROS está modulando negativamente vias de sinalização ativadas por integrinas, o que freqüentemente conduz a um tipo particular de morte celular conhecida por anoikis. Comprovando a ocorrência deste fenômeno, observamos que a inibição da atividade da NAD(P)H oxidase aumentou a apoptose das células de melanoma e induziu a ativação da caspase-3. Nossos resultados mostram ainda que a inibição da viabilidade celular por DPI foi revertida com o pré-tratamento das células MV3 com um inibidor de tirosina fosfatases (ortovanadato de sódio). Em resumo, este estudo mostra que a geração de ROS por NAD(P)H oxidase está envolvida nos mecanismos de sobrevivência em células de melanoma, uma vez que afetam as vias de sinalização dependentes de FAK-Src, através da inibição da atividade de proteína tirosina fosfatases. / NAD(P)H oxidase-derived reactive oxygen species (ROS) have emerged as critical mediators of several cell functions as diverse as migration, growth, proliferation and survival. Recent evidence has show that NAD(P)H oxidase activity is essential to melanoma proliferation and survival. We reported that NAD(P)H oxidase inhibitor diphenyleneiodonium (DPI) inhibited melanoma growth. NAD(P)H oxidase inhibition induced changes in cell shape with cell spreading decrease, rounding up and detachment. These phenomena were accompanied by rearrangement of actin network and a decrease in both focal adhesion (FAK) phosphorylation in Tyr397 residue and in FAK association to actin and c-Src, indicating that inhibition of ROS generation would down- modulate integrin-mediated signaling, what often results in a particular type of apoptotic cell death, known as anoikis. We observed that NAD(P)H oxidase inhibitor induced apoptosis in melanoma cells with activation of caspase-3. We results show that the effects promoted by NAD(P)H oxidase inhibition on melanoma growth were completely abolished by the pre-treatment of MV3 cells with the protein tyrosine phosphatases inhibitor sodium orthovanadate. In conclusion, our results strongly suggest that ROS generated by NAD(P)H oxidase complex transmit cell survival signals in melanoma cells through the FAK-Src pathway, probably inhibiting protein tyrosine phosphatases.

Este trabalho consiste em estudar o comportamento eletroquímico de biomoléculas imobilizadas sobre o eletrodo de carbono vítreo, utilizando materiais biocompatíveis como meios imobilizadores para detecções em meios aquosos. Foram utilizados inicialmente compósitos de hidrogéis capazes de auxiliar a permanência da enzima sobre a superfície do eletrodo e beneficiar a transferência de carga entre a enzima e o eletrodo de trabalho. Para melhorar a resposta eletroquímica do biossensor, também foram estudados métodos que utilizam líquidos iônicos no processo de imobilização da enzima. Deste modo a eletroatividade da enzima foi inicialmente estudada por voltametria cíclica, a fim de evidenciar tal eletroatividade no meio totalmente iônico, como também avaliar o melhor método de imobilização, para futuras aplicações em detecções de analitos. Os líquidos iônicos utilizados são compostos por cátions alquil-imidazol com ânions de natureza orgânica ou inorgânica. Como se sabe os íons que compõem o líquido iônico podem distinguir sua funcionalidade, pois é o tamanho desses íons que influencia na maioria das suas propriedades físico-químicas, tais como hidrofobicidade e viscosidade. / The aim of this work is to study the electrochemical behavior of biomolecules immobilized on a glassy carbon electrode, using biocompatible materials as a way for immobilizing detection in aqueous media. Initially, hydrogels composite were used because they are able to assist the permanence of the enzyme on the electrode surface and they are benefit to the charge transfer between enzyme and electrode surface. To improve the electrochemical response of the biosensor, methods using ionic liquids in the process of immobilization of the enzyme were also studied. Thus the electroactivity of the enzyme was initially analyzed by cyclic voltammetry in order to show that the electroactivity remains in an entirely ionic media, as well as evaluating the best method of immobilization, for future applications in biosensors. The ionic liquids used are composed of imidazole-alkyl cations with anions of organic or inorganic nature. As it is well known, the ions in the ionic liquid can distinguish its functionality, due to the fact that it is the size of these ions that influences most on their physicochemical properties such as hydrophobicity and viscosity.

Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2017-02-22T20:14:46Z No. of bitstreams: 1 2016 - Diego Mattos Penedo.pdf: 4081734 bytes, checksum: 3e13fd4d6f8b8c4d8d31a05fefa2ba14 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-22T20:14:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016 - Diego Mattos Penedo.pdf: 4081734 bytes, checksum: 3e13fd4d6f8b8c4d8d31a05fefa2ba14 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / CAPES / Several studies have been conducted with capuchin monkeys (Sapajus and Cebus) in order to understand their evolutionary histories by South and Central America. Genetic analysis, in association with the coat coloration, assist in the identification of the relationships between species and show the diversity presented by both genera. In Brazil, Sapajus species are predominantly distributed, being S. nigritus endemic to the Atlantic Forest and characteristic of southeast. At Ilha da Marambaia, an important area with forest remaining in the state of Rio de Janeiro, there is a population of capuchin monkeys, but without previous study. The objective of this study was to characterize the population of capuchin monkeys at this region through phenotypic and genetic analyzes, including the coat coloration, the sequencing of the mitochondrial gene cytochrome oxidase II and the evaluation of karyotype with conventional staining and C-band. Interviews with residents and military personnel in the region, were also carried out, in order to identify the possible origin and isolation of the primates. Twelve specimens, eight males and four females, were analyzed. The coat features were consistent with that described for S. nigritus, with coloration varying from brown to blackish on the back, limbs, tail and top of the head, in addition to yellow chest and face with white or light yellow, contrasting. Tufts at the top of the head were seen in adults, being greater in females. The analysis of mitochondrial gene revealed closer proximity of this population with S. xanthosternos, which occurs at Bahia, and then with S. cay that occurs in parts of Brazil and Paraguay. The greatest divergence was in relation to the population of S. nigritus in Argentina. The karyotype was consistent with that described for Sapajus species, with 2n = 54 (XX or XY), although the morphology of the sex chromosome Y, submetacentric, was different from that commonly described in the literature (acrocentric). Presented intercalary C-band the chromosome pairs 4, 11, 12 and 17. The par 11 presented three polymorphisms, all interstitial to euchromatin and diversified from each other by deletion and inversion processes. The pattern of this pair is different from that described, as a small acrocentric, to S. nigritus in populations of Argentina, with banding similar to that considered specific for S. xanthosternos. According to the survey, the population of primates seems to be native of the island and is currently isolated. According to the genetic divergences found, the population of Ilha da Marambaia may have maintained ancestral characteristics. The C-band pattern of the pair 11 indicates that the polymorphism described for populations of Argentina does not correspond to the entire distribution of S. nigritus. These data may help to understand the diversity and evolution of Sapajus, since this would have radiated from southeastern Brazil. Further studies with populations from other regions of Rio de Janeiro are needed to verify the C-band pattern presented for the pair 11 as well as the genetic relationships demonstrated by the mitochondrial gene for the population of Ilha da Marambaia. / Diversos estudos v?m sendo realizados com macacos-prego e caiararas (Sapajus e Cebus) de modo a entender suas hist?rias evolutivas pelas Am?ricas do Sul e Central. An?lises gen?ticas, em associa??o ?s caracter?sticas de pelagem, auxiliam na identifica??o das rela??es entre as esp?cies e evidenciam a diversidade apresentada por ambos os g?neros. No Brasil, est?o distribu?das predominantemente as esp?cies de Sapajus, sendo S. nigritus end?mica de Mata Atl?ntica e caracter?stica do sudeste. Na Ilha da Marambaia, importante ?rea com remanescente florestal no estado do Rio de Janeiro, existe uma popula??o de macacos-prego, sem nenhum estudo anterior. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a popula??o de macacos-prego dessa regi?o atrav?s de an?lises fenot?picas e gen?ticas, incluindo o padr?o de pelagem, o sequenciamento do gene mitocondrial Citocromo Oxidase II e a avalia??o do cari?tipo com colora??o convencional e bandamento de heterocromatina constitutiva (banda C). Foram realizadas, tamb?m, entrevistas com moradores e militares da regi?o, de modo a identificar a poss?vel origem e isolamento dos primatas. Foram analisados doze esp?cimes, oito machos e quatro f?meas. As caracter?sticas de pelagem coincidiram, de modo geral, com descrito para S. nigritus, sendo observada colora??o variando de marrom a enegrecida no dorso, membros, cauda e topo da cabe?a, al?m de peito amarelo e face branca ou amarelo-clara, contrastante. Tufos de pelos no topo da cabe?a foram observados nos adultos, sendo maiores nas f?meas. A an?lise do gene mitocondrial revelou maior proximidade da popula??o da ilha com S. xanthosternos, que ocorre na Bahia, e em seguida com S. cay, que ocorre em parte do Brasil e no Paraguai. A maior diverg?ncia apresentada foi em rela??o a popula??es de S. nigritus da Argentina. A an?lise do cari?tipo revelou padr?o condizente com as esp?cies de Sapajus, com 2n = 54 (XX ou XY), embora a morfologia do cromossomo sexual Y, submetac?ntrica, fosse divergente do comumente descrito na literatura (acroc?ntrica). Apresentaram banda C intercalar os pares cromoss?micos 4, 11, 12 e 17. O par 11 mostrou-se com tr?s polimorfismos, todos intercalares e diversificados entre si por processos de dele??o e invers?o. O padr?o deste par foi divergente do descrito, como um pequeno acroc?ntrico, para S. nigritus em popula??es da Argentina, apresentando bandamento semelhante ao considerado espec?fico de S. xanthosternos. Segundo o levantamento realizado, a popula??o de primatas parece ser natural da ilha, estando provavelmente isolada. De acordo com as diverg?ncias gen?ticas encontradas, a popula??o da Ilha da Marambaia pode ter conservado caracter?sticas ancestrais. O padr?o de banda C do par 11 indica que o polimorfismo descrito para popula??es da Argentina pode n?o corresponder a toda a distribui??o de S. nigritus. Estes dados podem auxiliar no entendimento da diversidade e evolu??o das esp?cies de Sapajus, uma vez que este teria irradiado a partir do sudeste brasileiro. Novos estudos com popula??es de outras regi?es do Rio de Janeiro s?o necess?rios para se averiguar o padr?o de bandamento de heterocromatina apresentada para o par 11, bem como as rela??es gen?ticas demonstradas pelo sequenciamento do gene mitocondrial para a popula??o da Ilha da Marambaia.

As biocélulas a combustível enzimáticas (BFCs) são dispositivos eletroquímicos que convertem energia química em energia elétrica, utilizando enzimas como biocatalisadores. Quando miniaturizada, uma BFC pode ser implantada em animais vertebrados e invertebrados, vislumbrando-se sua utilização na produção de energia elétrica para alimentar microdispositivos biomédicos e microssensores em pequenos insetos. No entanto, ainda é um desafio obter BFCs implantáveis e miniaturizadas, com uma potência suficiente (dezenas de microwatts) para alimentar microcircuitos eletrônicos de maneira estável e em longo prazo. Diante do exposto, esta tese de doutorado apresenta um estudo das propriedades eletroquímicas de eletrodos enzimáticos, visando a aplicação em BFCs de glicose/O2 miniaturizadas e implantáveis. Para isso, utilizaram-se fibras flexíveis de carbono (FCFs) modificadas com as enzimas bilirrubina oxidase (BOx) no cátodo e glicose desidrogenase (GDh) NAD-dependente no ânodo, a fim de se obter a redução de O2 e a oxidação de glicose, respectivamente. Os resultados obtidos mostram que FCFs previamente submetidas a um tratamento químico de oxidação com permanganato de potássio e com posterior eletrodepolimerização do mediador vermelho neutro produzem bioânodos estáveis e robustos. Estes eletrodos, combinados com biocátodos compostos por FCFs na ausência de mediadores redox, foram utilizados em BFCs miniaturizadas, que foram implantadas em formigas da espécie Atta sexdens rubrupilosa. A potência máxima da BFC operando in vivo foi 13,5 ± 3,8 µW cm-2 em 190 ± 58,9 mV, com corrente máxima de 143 ± 40,2 µA cm-2 e a voltagem de circuito aberto de 260 ± 99,6 mV. Acredita-se que estes valores ainda possam ser otimizados e este trabalho contribui para mostrar que a flexibilidade das FFC, a presença de um mediador de elétrons polimérico no ânodo, o uso do tratamento químico de oxidação com permanganato de potássio das fibras e a miniaturização dos eletrodos são elementos importantes, e que podem ser considerados no desenvolvimento de biocélulas a combustível implantáveis. / Enzymatic biofuel cells (BFCs) are electrochemical devices that convert chemical energy into electrical energy using enzymes as biocatalysts. When miniaturized, BFCs can be implanted in vertebrate and invertebrate animals and, their use to produce electrical energy to feed biomedical microdevices and micro-sensors in small insects can be observed. However, it is still challenging to obtain implantable and miniaturized BFCs, with sufficient power (tens of microwatts) to power electronic microcircuits in a stable and long-term manner. In view of the above, this PhD thesis presents a study of the electrochemical properties of enzymatic electrodes, aiming to use them in miniaturized and implantable glucose/O2 BFCs. In order to obtain a reduction in O2 and oxidation of glucose, flexible carbon fibers (FCFs) modified with bilirubin oxidase (BOx) enzymes in the cathode and glucose dehydrogenase (GDh) at the anode, respectively, were used. The results show that FCFs previously submitted to a chemical treatment of oxidation with potassium permanganate and, subsequently, electropolymerization of the neutral red mediator produce stable and robust bioanodes. These electrodes, combined with biocathodes consisting of FCFs in the absence of redox mediators, were used in miniaturized BFCs, which were implanted in Atta sexdens rubrupilosa ant species. The BFC maximum power source, operating in vivo, was 13.5 ± 3.8 μW cm-2 at 190 ± 58.9 mV, with a maximum current of 143 ± 40.2 μA cm-2 and the open circuit voltage was 260 ± 99.6 mV. Although these values can be optimized, this research shows that the flexibility of the FCF, the presence of a polymer electron mediator on the anode, using the chemical treatment of oxidation with potassium permanganate of the fibers and electrode miniaturization are important elements, which can be considered in the development of implantable biofuels.

A análise da estruturação populacional de espécies codistribuídas permite a comparação de padrões de estruturação, fornecendo informações acerca dos fatores que influenciam a diferenciação em espécies pertencentes ao mesmo ecossistema. Este projeto teve como objetivo principal analisar a variabilidade intraespecífica em caranguejos habitantes de manguezais, codistribuídos ao longo do Oceano Atlântico Ocidental, por meio de ferramentas moleculares e morfológicas, visando testar a hipótese de elevada estruturação populacional em manguezais. Para este fim, cinco espécies foram utilizadas como modelo (Aratus pisonii, Goniopsis cruentata, Sesarma rectum, Uca thayeri e Ucides cordatus) e avaliadas por meio de marcadores mitocondriais COI e 16S e nuclear H3 e análises morfológicas comparativas e de morfometria. Os dados moleculares revelaram dois padrões, indicando elevada estruturação populacional para as espécies A. pisonii e U. thayeri e ausência de estruturação para G. cruentata, S. rectum e U. cordatus. Os dados morfológicos, no entanto, não acompanham esses padrões, já que não foram encontradas diferenças morfológicas ou morfométricas associadas aos grupos evidenciados pelas análises moleculares. A ausência de fluxo gênico entre regiões para algumas espécies deve-se, muito provavelmente, à existência de fatores que não se limitam ao isolamento por distância, mas também devido a diferenças na duração do estágio larval e a diferenças bruscas em alguns fatores abióticos, como a salinidade, por exemplo, que, associados às diferentes características do desenvolvimento larval de cada espécie, culminam na existência de estruturas populacionais diferentes. Além disso, os padrões de diferenciação genética observados concordam com os cenários biogeográficos propostos para o Atlântico Ocidental, no qual mudanças e flutuações geológicas, climáticas e oceanográficas, resultantes do fechamento do Istmo do Panamá e de ciclos glaciais na América do Norte, promoveram divergência genética. / The analysis of population structure of codistributed species allows the comparison of patterns of population structuring, providing information on the factors that influence the differentiation in species belonging to the same ecosystem. This project aimed to analyze the intraspecific variability of crabs inhabiting mangroves, codistributed along the western Atlantic Ocean, by means of molecular and morphological tools, in order to test the hypothesis of high populational structure in mangroves. The genetic variability of five species used as models (Aratus pisonii, Goniopsis cruentata, Sesarma rectum, Uca thayeri and Ucides cordatus) was assessed using the mitochondrial genes COI and 16S and the nuclear H3 and comparative morphological analysis and morphometry were performed. The molecular data revealed two patterns, indicating high population structure for the species A. pisonii and U. thayeri and absence of structure for G. cruentata, S. rectum and U. cordatus. The morphological data, however, do not follow these patterns, because there were no morphological or morphometric differences associated with the groups evidenced by the molecular analyzes. Possibly the absence of gene flow between regions for some species is due to factors not limited to isolation by distance, but also because of differences in the larval stage duration and in withstanding some abiotic factors, such as salinity. These factors associated with different characteristics of larval development can culminate in differences on population structure. In addition, the genetic differentiation patterns observed agree with biogeographical scenarios proposed for the western Atlantic, where geological, climate and oceanographic fluctuations, resulting from the Isthmus of Panama closure and cyclical glaciation in North America, promoted genetic divergence.

O Aspergillus fumigatus é um fungo filamentoso e saprofítico, encontrado em todas as regiões do mundo, desempenhando um importante papel na reciclagem de carbono e nitrogênio do solo. A principal forma de infecção ocorre através da inalação dos conídios com predominância de infecções no trato respiratório, principalmente em pacientes imunocomprometidos. A mitocôndria de A. fumigatus foi caracterizada em nosso laboratório, que revelou a presença de uma respiração resistente a cianeto mediada pela oxidase alternativa. A clonagem e sequenciamento deste gene foram realizadas através de screening de uma biblioteca de DNA genômico. O alinhamento das sequências genômica e de cDNA mostrou a presença de dois introns, que após splicing codifica uma proteína contendo 352 aminoácidos, possuindo uma massa molecular estimada de 40,84 kDa e um pI teórico de 9,51. Além disso, foram identificados domínios altamente conservados (LET, NERMHL, LEEA e RADEH) que interagem com átomos de ferro e estão contidos em -hélices propostas como responsáveis pela organização estrutural da enzima. A fim de caracterizar bioquimicamente esta proteína, a sequência de cDNA do gene foi clonada em plasmídeo pYES2 e expressa em S. cerevisiae INVSc1 como um modelo eucarioto. Após expressão, a proteína encontrou-se de forma ativa, conferindo à levedura uma respiração resistente a cianeto. Esta característica herdada provocou uma discreta diminuição na taxa de crescimento em meio não-fermentativo e uma capacidade de sobrevivência na presença de KCN. Acredita-se que a atividade das AOXs esteja diretamente relacionada com a presença de diferentes espécies reativas de oxigênio (ERO). Neste contexto, a avaliação do efeito de diferentes agentes pró-oxidantes provocou um aumento na atividade e na expressão da enzima. Paralelamente, a caracterização funcional do gene foi realizada através da técnica de interferência por RNA, utilizando o vetor de expressão pALB1. Em meio contendo maltose, as cepas pALB1/aoxAf apresentaram coloração branca devido ao silenciamento do gene alb1. Os níveis de mRNA do gene aoxAf foram determinados por Real time RT-PCR, mostrando o eficiente silenciamento do gene alvo com a construção utilizada. Devido à relação já descrita entre ERO e a atividade das AOXs, avaliou-se a produção de espécies reativas de oxigênio nas cepas silenciadas utilizando-se a sonda CM-H2DCFDA, observando maior produção na cepa pALB1/aoxAf. Além disso, a viabilidade destas cepas foi determinada por citometria de fluxo após a exposição com agentes pró-oxidantes, a qual indicou maior letalidade na cepa pALB1/aoxAf, quando comparada com CEA e pALB1. Da mesma forma, após a incubação dos conídios das cepas silenciadas com macrófagos de camundongos foi verificada uma maior atividade microbicida dos macrófagos na cepa duplamente silenciada pALB1/aoxAf, quando comparada com as outras cepas. Com estes resultados podemos concluir que a oxidase alternativa apresenta uma importante atividade antioxidante, além de contribuir nos mecanismos de defesa durante o processo de infecção de A. fumigatus. / The saprophytic species Aspergillus fumigatus is a deuteromycete fungus found worldwide, which has an essential role in recycling carbon and nitrogen. Following inhalation of conidia by the immunocompetent host, the innate cellular immune system is responsible for killing the conidia, exposing them to reactive oxygen. However, A. fumigatus is capable of surviving and replicating within the phagolysosomal compartment of immunocompromised macrophages. It was previously demonstrated that A. fumigatus mitochondria possess an alternative oxidase (aoxAf) wich is a cyanide-resistant protein. A partial genomic DNA library was screened to cloning an aoxAf gene. The alignment between the cDNA and genomic DNA sequences revealed the existence of two introns which after splicing encodes a 352 amino acid sequence with a calculated molecular mass of 40 kDa and a theoretical pI of 9.51. The deduced amino acid sequence revealed four regions completely conserved among the AOXs sequences (LET, NERMHL, LEEA and RADE-H), where six conserved amino acids residues are proposed to be a metal ligand site. To characterize the AOX protein, a cDNA of aoxAf gene was cloned into pYES2 plasmid and transformed in S. cerevisiae INVSc1. After the incubation of the cells in a nonfermentable medium in the presence of KCN, S. cerevisiae expressing AOX was able to grow, while it was lethal for the control yeast. These results suggest that the recombinant AOXAf is properly targeted to the S. cerevisiae mitochondria where it has functional activity. Studies with different species demonstrated that AOX is induced by a variety of treatments usually labeled as stresses. To verify the function of AOX in A. fumigatus under oxidative stress conditions, conidia were treated with different donors of ROS. These treatments caused an increase in aoxAf activity and transcription levels. To identify genetically attributes of virulence and oxidative defense in A. fumigatus, we construct a RNA interference plasmid. Two inverted repeated sequences of conserved region of an interest gene were amplified and cloned in pALB1 plasmid. In maltose medium pALB1 and pALB1/aoxAf transformants demonstrated white colonies, attributable to the reduction of alb1 gene expression. The aoxAf mRNA levels were analyzed by Real time RT-PCR, showing an efficient alternative oxidase gene silencing in pALB1 plasmid construction. It was previously demonstrated that ROS can stimulate the AOXs activity, so, we used the dye CM-H2DCFDA to measure ROS production in RNAi transformants, showing that the decrease in aoxAf gene expression caused an increase in ROS production. After incubation with ROS donors the viability of these strains was determined by flow cytometry analysis. The pALB1/aoxAf strain showed higher lethality, when compared with CEA and pALB1, suggesting the involvement of AOX in antioxidant defense in A. fumigatus. Besides, ROS produced by alveolar macrophages play an essential role in the killing of A. fumigatus conidia. In the same way, phagocytosis assay revealed that pALB1/aoxAf strain was more lethal than CEA and pALB1. With these results, we concluded that alternative oxidase is an efficient antioxidant system and might contribute with defense mechanism of A. fumigatus.

A doença de Parkinson (DP) é considerada a segunda doença neurodegenerativa mais comum em idosos e é caracterizada pela presença de disfunções motoras decorrentes da redução de neurônios dopaminérgicos na substância negra pars compacta (SNpc). Uma das principais neurotoxinas utilizadas para o estudo de DP em modelos animais é a 6-hidroxidopamina (6-OHDA), que possui como mecanismo de neurotoxicidade a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs). A liberação de EROs pela NADPH oxidase (Nox) e a ativação microglial constituem os eventos iniciais da neurodegeneração induzida pela 6-OHDA. A Nox2 está relacionada com a modulação dos fenótipos microgliais e encontra-se superativada na DP, levando a um desequilíbrio redox e a danos celulares. A microglia é o principal componente da defesa imune no sistema nervoso central (SNC) e é dependente do receptor fator 1 estimulador de colônias (CSF1R) para a sobrevivência. O inibidor de CSF1R é utilizado como método para depletar microglia em modelos de neurodegeneração e, consequentemente, compreender o impacto da sua eliminação no processo da doença. Baseado nisso, foram propostas duas abordagens para compreender o papel da microglia na progressão da DP induzida pela 6-OHDA, sendo que o primeiro investigou a modulação da ativação microglial pela Nox2 em camundongos nocautes para a subunidade gp91phox, enquanto que o segundo avaliou o impacto da depleção por meio do tratamento com 1200mg/Kg de PLX5622, um tipo de inibidor de CSF1R. Os animais naïves gp91phox-/- apresentaram aumento da proliferação de microglias e da expressão da enzima iNOS. Quando submetidos à 6-OHDA, os nocautes não apresentaram declínio motor em função do tempo avaliado pelo teste do cilindro, devido à maior sobrevivência de neurônios dopaminérgicos na SN em relação aos selvagens (WT). Um dos possíveis fatores relacionados à perda expressiva de neurônios nos WT foi a indução precoce da enzima iNOS, sugerindo que a ativação de Nox2 conjuntamente com iNOS na microglia aumenta os níveis de EROs tornando os neurônios mais susceptíveis à morte celular. Também foram observadas modulações temporais distintas entre os grupos com relação à expressão de CD86 e Arginase-1, além dos nocautes apresentarem baixos níveis de lesões oxidativas no DNA mitocondrial quando comparado com os WT. Assim, a ativação da Nox2 e da iNOS parecem atuar em sinergia no processo neurodegenerativo causado pela 6-OHDA. Por outro lado, os resultados com PLX5622 mostraram que a depleção microglial acelera o comprometimento da coordenação motora e da bradicinesia avaliado pelo teste do poste, bem como reduz o número de neurônios dopaminérgicos na SNpc. Além disso, a redução de células postivas para GFAP, do marcador CD68 e da regulação de genes ligados a microglia foram observados. O gene MeCP2, que está relacionado à via nigroestriatal e que consiste em um importante modulador da expressão de TH, está pouco expresso no grupo submetido à depleção microglial e a 6-OHDA. Esses achados sugerem que a deficiência na comunicação entre microglias e astrócitos, bem como a redução do nível de transcritos do gene MeCP2 causados pela depleção microglial, podem contribuir para a aceleração do processo neurodegenerativo causado pela 6-OHDA. / Parkinson\'s disease (PD) is considered the second most common neurodegenerative disease in elderly people and is characterized by the presence of motor impairment, which is a consequence of dopaminergic neuron loss in the substantia nigra pars compacta (SN). A major neurotoxin used for PD study in animal models is 6-hydroxydopamine (6-OHDA), which exerts neurotoxic effects through the production of reactive oxygen species (ROS). ROS release by the enzyme NADPH oxidase (Nox) and microglial activation are early events of neurodegeneration induced by 6-OHDA. Nox2 is related to modulation of microglia phenotypes and is overactivated in PD, which can lead to redox imbalance and cellular damage. Microglial cells are the main components of immune defense in the central nervous system and are dependent upon Colony-stimulating factor 1 receptor (CSF1R) for survival. The CSF1R inhibitor is used with a tool to deplete microglia in models of neurodegenerative diseases and, consequently, to understand the impact of its elimination in the disease process. Based on that, we proposed two approaches to evaluate the microglial role in the PD progression induced by 6-OHDA, in which the first one investigated the modulation of microglial activation by Nox2 in gp91phox knockout mice, whereas the second one evaluated the impact of microglial depletion through a treatment with 1200 mg/Kg of PLX5622, one type of CSF1R inhibitor. The gp91phox-/- naïve mice showed an increase of microglia proliferation and in the iNOS expression. When the knockout mice were submitted to 6-OHDA, they did not have motor impairments as a function of toxin exposure as evaluated by cylinder test. This result is due to the increase number of dopaminergic neurons survival in SNpc compared to wild type (WT). One of the possible factors involved in neurons death in WT was the early iNOS induction, which indicates that Nox2 and iNOS simultaneous activation in microglial cells enhance ROS levels, leading to neurons more vulnerable to cell death. Moreover, the expression of CD86 and Arginase-1 have differences in temporal modulation between both groups, as well as knockout mice showed lower levels of oxidative damage in mitochondrial DNA when compared with WT. Thus, the activation of Nox2 and iNOS could act sinergically in the neurodegenerative process caused by 6-OHDA.On the other hand, results with PLX5622 indicated that the microglial depletion aggravates the impairment of bradykinesia and motor coordination evaluated by pole test, as well as the reduction of tyrosine hydroxylase (TH) positive neurons in the SNpc. Moreover, the decrease of GFAP positive cells, of CD68 marker and regulation of genes linked to microglia were observed. The MeCP2 gene, related to the nigrostriatal pathway and an important modulator of TH expression, is down-regulated in the group with microglial elimination and submitted to 6-OHDA. These findings suggest that the deficiency of crosstalk between astrocytes and microglia, as well as the reduced MeCP2 transcript levels may contribute to the acceleration of neurodegenerative process initiated by 6-OHDA.

Modern biorefineries provide a framework for the sustainable conversion of biomass to biofuels and biochemicals. In light of the recalcitrance of lignin in woody feedstocks, the native shrub eastern leatherwood is proposed as a model hypolignified species. Xylem tissue of this low-lignin plant contained syringyl-rich lignin that was more easily hydrolysed and did not appear to be localised in the middle lamellae. Also, leatherwood cellulose was less crystalline and the xylan was highly acetylated. While viable low-lignin plants will enable the sustainable utilisation of woody feedstocks, high-value bioproducts are needed to economise future biorefineries. The carbohydrate oxidoreductases galactose oxidase and glucooligosaccharide oxidase were studied for use in the oxidation and derivatisation of plant-derived polysaccharides for the production of such high-value bioproducts. The carbohydrate-binding module of galactose oxidase was necessary for recombinant protein production. Also, a mutant library of glucooligosaccharide oxidase variants was produced to generate enzymes with novel activity.

Modern biorefineries provide a framework for the sustainable conversion of biomass to biofuels and biochemicals. In light of the recalcitrance of lignin in woody feedstocks, the native shrub eastern leatherwood is proposed as a model hypolignified species. Xylem tissue of this low-lignin plant contained syringyl-rich lignin that was more easily hydrolysed and did not appear to be localised in the middle lamellae. Also, leatherwood cellulose was less crystalline and the xylan was highly acetylated. While viable low-lignin plants will enable the sustainable utilisation of woody feedstocks, high-value bioproducts are needed to economise future biorefineries. The carbohydrate oxidoreductases galactose oxidase and glucooligosaccharide oxidase were studied for use in the oxidation and derivatisation of plant-derived polysaccharides for the production of such high-value bioproducts. The carbohydrate-binding module of galactose oxidase was necessary for recombinant protein production. Also, a mutant library of glucooligosaccharide oxidase variants was produced to generate enzymes with novel activity.

Thiophene ended poly(ethylene oxide) (ThPEO) and random copolymer (RPEO) of 3-methylthienyl methacrylate and p-vinylbenzyloxy poly (ethyleneoxide) units were synthesized chemically. Further graft copolymerization of RPEO and ThPEO with pyrrole (Py) and thiophene (Th) were achieved in H2O - sodium dodecylsulfate (SDS), H2O - p-toluenesulphonic acid (PTSA) and acetonitrile (AN) - tetrabutylammonium tetrafluoroborate (TBAFB) solvent electrolyte couples via constant potential electrolyses. Characterizations were performed by cyclic voltammetry (CV), nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), and fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). The morphologies of the films were examined by scanning electron microscopy (SEM). Conductivities of the samples were measured by using four-probe technique. Moreover, spectroelectrochemical and electrochromic properties of the copolymers obtained from thiophene were investigated by UV-Vis spectrometry and colorimetry. . Immobilizations of alcohol oxidase and polyphenol oxidase enzymes were performed in the matrices obtained via copolymerization of ThPEO and RPEO with pyrrole. Immobilization was carried out via entrapment of enzyme in matrices during the polymerization of pyrrole. Temperature optimization, operational stability and shelf-life of the enzyme electrodes were investigated. Maximum reaction rate (Vmax) and Michaelis-Menten constant (Km) were determined. It is known that wine includes phenolic groups that give astringency in high concentrations. Polyphenol oxidase (PPO) converts mono and diphenols to quinone. By analyzing the product, one can find out the amount of phenolic groups. By using the enzyme electrodes via immobilization of PPO, amount of phenolics in different wines were analyzed.