Chez les plantes supérieures, les membranes thylacoïdiennes des chloroplastes contiennent des protéines de type respiratoire, un complexe NADH déshydrogénase (Ndh) homologue au complexe I bactérien et une oxydase (PTOX) homologue à l'oxydase alternative des mitochondries. Dans le but d'élucider la fonction du complexe Ndh, le gène chloroplastique ndhB a été inactivé par transformation chloroplastique du tabac. Chez les plantes transplastomiques obtenues, des mesures de fluorescence de la chlorophylle ont permis de démontrer que ce complexe est impliqué dans la réduction non photochimique du pool de plastoquinones (PQ). Chez les mutants dépourvus de complexe Ndh, un retard de croissance ainsi qu'une altération des capacités photosynthétiques ont été observés dans des conditions où la photorespiration est stimulée par une limitation de la disponibilité en CO2 (par exemple un déficit hydrique modéré). En étudiant les effets de l'antimycine A, un inhibiteur du transfert cyclique des électrons autour du PS I, sur l'activité photosynthétique de ces plantes, nous avons conclu que le complexe Ndh est impliqué dans une voie de transfert cyclique et participe à la fourniture en ATP nécessaire à la fixation de CO2 quand la demande est forte. <br />Afin de déterminer le rôle de PTOX, nous avons généré des plantes de tabac surexprimant cette protéine. Des mesures de fluorescence de la chlorophylle nous ont permis de démontrer l'implication de PTOX dans l'oxydation non photochimique du pool de PQ. Nous avons conclu que le complexe Ndh et PTOX, tous deux localisés dans les thylacoïdes lamellaires, constituent avec le pool de plastoquinones les éléments d'une chaîne de transfert d'électrons de type chlororespiratoire. Nous avons proposé un mécanisme par lequel l'activité du transfert cyclique des électrons autour du PS I serait régulée par l'activité de la chlororespiration, à travers un contrôle fin du niveau rédox de certains transporteurs de la chaîne de transfert d'électrons.

Les cytochromes c oxydases (CcO), situées dans les chaînes respiratoires eucaryotes et des bactéries aérobiques, catalysent la réduction de l'oxygène en eau, une réaction qui utilise quatre électrons et quatre protons. Ces complexes protéiques membranaires participent également à la formation de la force protonmotrice nécessaire à la synthèse d'ATP, en pompant quatre protons supplémentaires par molécule de dioxygène réduit. Le site actif des CcO aa3 contient un hème de type a de haut spin, l'hème a3, et un atome de cuivre, le CuB. Ces deux cofacteurs peuvent fixer, outre l'O2, d'autres ligands diatomiques impliqués dans la signalisation telle que le monoxyde d'azote (NO) et le monoxyde de carbone (CO). Les travaux présentés dans ce manuscrit, effectué sur l'oxydase mitochondriale et sur des oxydases bactériennes, aa3 et ba3, concernent à la fois l'interaction de ligands avec la CcO et le transfert interne d'électrons. Les oxydases étudiées possèdent quatre centres redox, l'hème a3 et le CuB ainsi que l'hème a (resp. b pour ba3) et le centre CuA, impliqués dans le transfert d'électron (ET) du donneur, le cytochrome c, à l'accepteur, l'oxygène fixé au site actif. L'inhibition réversible de la CcO par le NO est un processus de régulation de la respiration. En étudiant l'influence de la concentration de NO sur la dynamique du NO au sein des oxydases aa3 de P. denitrificans et ba3 de T. thermophilus nous avons mis en évidence une interaction entre plusieurs ligands dans le site actif. Pour l'oxydase aa3, la recombinaison géminée du NO, après sa photodissociation de l'hème a3, a lieu selon deux phases de 200 ps et 20 ns, dont l'intensité augmente pour les concentrations de NO superstoechiométriques. A l'inverse, aucun effet de la concentration n'est observé pour l'oxydase ba3 où l'activité NO réductase de cette CcO exclut la présence stable de deux molécules de NO dans le site actif. L'ensemble de ces résultats converge vers la présence d'une seconde molécule de NO dans ou à proximité du site actif dans l'oxydase aa3, créant un encombrement favorisant une recombinaison géminée plutôt qu'un cheminement vers l'extérieur de la protéine. Des expériences de spectroscopie RPE ont été effectuées afin de déterminer la nature du second site de fixation du NO. La modification du signal avec la concentration de NO est observée uniquement pour l'oxydase aa3. Si le spectre à basses concentrations (NO: CcO<1:1), très similaire à celui obtenu avec l'oxydase ba3, est caractéristique de la liaison du NO sur un hème ayant pour 5ème ligand une histidine, le spectre enregistré à hautes concentrations est similaire à celui mesuré lorsque NO est lié à un hème sans autre ligand en trans. Comme le spectre visible de l'oxydase n'indique pas une rupture de la liaison Fe-NεHis, nous proposons que la 2nd molécule de NO induise une rotation du NO lié à l'hème depuis une position parallèle au plan de l'histidine à une position perpendiculaire à ce plan, rompant ainsi les interactions paramagnétiques entre l'histidine et le NO. Cette interprétation est renforcée par des modélisations de la structure de l'oxydase aa3 avec un et deux molécules de NO dans le site actif. Elles montrent qu'en effet la présence d'un second NO, lié au CuB dans le site actif, induit une rotation du NO lié à l'hème de ~70°. Par ailleurs, à hautes concentrations de NO, il y a apparition d'un signal caractéristique d'une interaction métal de transition-NO, qui peut être attribué, par élimination, à la liaison CuB-NO. L'établissement de la présence simultanée de deux molécules de NO dans le site actif de la CcO aa3 de P. denitrificans dès les faibles concentrations de NO, ouvrent de nouvelles voies dans la compréhension des mécanismes d'inhibition de l'oxydase par le NO. Afin d'étudier plus en détail l'influence de l'environnement du site actif sur la dynamique du NO dans le site actif, le résidu V279 à été substitué par mutagenèse dirigée. Les premiers résultats sur des souches exprimant les oxydases mutées indiquent des modifications de leur activité O2 réductase. Par ailleurs, nous nous sommes intéressé à la vitesse de réduction du site actif par l'hème a. Cette réaction étant trop rapide pour être visualisée par injection d'électrons, nous avons étudié le flux des électrons en sens inverse. Ces expériences ont été effectuées sur l'oxydase mitochondriale dont l'hème a était oxydé et l'hème a3 réduit et lié une molécule de CO. Après photodissociation du CO de l'hème a3, les électrons se répartissent entre les deux hèmes de potentiel redox proche. Par spectroscopie, nous avons ainsi mesuré que 13 ±3 % de ce transfert s'effectue en 1,2 ns; ce temps correspond au transfert intrinsèque. Des études précédentes avaient montré une phase de 3 µs, considérée jusqu'ici comme la phase la plus rapide du ET entre les hèmes. Au regard de nos résultats, cette phase de ET peut être expliquée par le départ du CO du CuB, ce qui modifierait le potentiel redox de l'hème a3. Le transfert intrinsèque des électrons en 1,2 ns, permettrait à l'oxydase, dans des conditions physiologiques ([O2] faibles et e-peu disponibles) de capturer et de réduire l'oxygène en diminuant la durées des périodes où le site actif n'est pas réduit.

Lors de la phagocytose d'un micro-organisme, le complexe de la NADPH Oxydase des neutrophiles est activé. Il permet alors la production d'espèces réactives de l'oxygène qui contribuent à la destruction du pathogène. Ce complexe est constitué de facteurs cytosoliques (p67phox, p40phox, p47phox), d'une petite protéine G Rac et du flavocytochrome b558 membranaire, lui-même composé de p22phox et gp91phox. Des mutations dans les gènes codant pour certaines de ces protéines conduisent à une maladie génétique rare mais grave!: la granulomatose septique chronique (CGD). Au sein du complexe ternaire formé par les facteurs cytosoliques, il existe des interactions de type domaine SH3/motif polyproline et une interaction entre domaines PB1. Par Résonance Magnétique Nucléaire, nous avons caractérisé d'un point de vue structural l'interaction entre les domaines PB1 de p67phox et p40phox. Nous avons également étudié les conséquences de l'activation sur les interactions entre le motif polyproline C-terminal de p47phox et ses domaines SH3 partenaires. Ainsi, nous avons combiné l'analyse des structures des domaines SH3 de p40phox et SH3 C-terminal de p67phox, en complexe avec le polyproline C-terminal de p47phox, avec nos mesures d'affinité entre ces partenaires à différents stades de l'activation. Ces données ont été obtenues par fluorescence intrinsèque du tryptophane présent au sein des domaines SH3.

L'Astyanax mexicanus est un poisson téléostéen utilisé dans les études de microévolution. Au sein de la même espèce, il existe plusieurs populations. Des poissons de surface (SF), vivant en banc dans les rivières d'Amérique Centrale et plusieurs populations cavernicoles (CF), vivant dans l'obscurité des grottes mexicaines. La majorité des populations cavernicoles sont indépendantes et ont dérivé des populations de surface depuis environ un million d'années. Les CF sont aveugles et dépigmentés. D'un point de vue comportemental, les CF ont, entre autres, perdu l'agressivité qui est un caractère important des SF. Ce travail caractérise finement les différences comportementales entre poissons de surface et cavernicoles, et analyse les modifications des circuits neuronaux qui sont à l'origine de la perte du comportement agressif chez les poissons cavernicoles. Les tests d'agressivité montrent que deux SF s'attaquent dix fois plus que deux CF. La distribution temporelle des attaques diffère également entre les populations. En effet, la majorité des attaques entre CF ont lieu lors des premières minutes du test, alors que chez les SF la fréquence des attaques augmente au cours du temps. L'étude de l'agressivité de SF rendu aveugle ou dans le noir montre que la perte d'agressivité chez les CF n'est pas due au phénotype aveugle. De plus, l'agressivité des poissons hybrides suggère que le comportement agressif des SF est génétiquement codé. Après des expériences pharmacologiques utilisant des composés interférant avec le système sérotoninergique ou soumettant les SF et les CF à différents régimes alimentaires, nous faisons l'hypothèse selon laquelle la perte d'agressivité des CF est une adaptation à la vie cavernicole, ceux-ci recherchant en permanence de la nourriture. En revanche, l'agressivité des SF est étroitement reliée à la hiérarchie existant au sein du banc, la dominance étant elle-même liée en partie à la concentration de la sérotonine présente au niveau du raphé. La concentration de sérotonine est inversement corrélée à l'agressivité. D'un point de vue neuroanatomique, l'organisation du système sérotoninergique est similaire entre les populations. Cependant, l'un des noyaux hypothalamiques est plus large chez les CF et contient plus de neurones. Par ailleurs, l'agressivité et le taux de sérotonine sont connus pour être inversement corrélés chez les vertébrés. De fait, des traitements pharmacologiques augmentant le taux de sérotonine diminuent l'agressivité des SF et modifient leur profil d'agressivité, mimant celui des CF. Cependant, le système sérotoninergique n'est pas le seul à être modifié dans le système nerveux des CF. En réalité, les dosages HPLC montrent que l'ensemble des systèmes aminergiques est amplifié chez les CF, conduisant à l'apparition d'un phénotype " hyper-aminergique ". Les études neuro-anatomiques et enzymologiques des systèmes sérotoninergiques et catécholaminergiques montrent que des variations du nombre de neurones et de l'activité des enzymes de dégradation des neurotransmetteurs aminergiques convergent vers cette amplification et sont à l'origine de ce phénotype. Par ailleurs, et en parallèle, les méthodes de transgénèses stables ont été testées chez l'Astyanax. Cette étude montre que l'utilisation des méganucléases et des transposons sont utilisables chez notre poisson modèle et permettent l'établissement de lignées transgéniques. Cet outil permettra de tester à l'avenir l'importance et la fonction des gènes d'intérêt lors du développement du système nerveux, ainsi que lors de la mise en place des comportements.

La NADPH oxydase (NOX) est un complexe multienzymatique responsable de la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) que l'on retrouve dans un grand nombre de types cellulaires. La NOX des neutrophiles est composée de deux protéines transmembranaires (gp91phox et p22phox), qui constituent le site catalytique, et de trois facteurs cytosoliques (p47phox, p67phox et p40phox). Lors de son activation, p47phox subit des changements conformationnels que nous tâchons de définir, afin de mieux comprendre la régulation de ce complexe impliqué dans un grand nombre de pathologies. Dans les neutrophiles, les ROS sont responsables de la destruction de pathogènes phagocytés. Il paraît donc primordial de bien comprendre les bases moléculaires du mécanisme d'activation de la NOX pour envisager sa régulation future. Au cours de ce travail, des changements conformationnels ont été identifiés sur p47phox par protéolyse ménagée et échange H/D couplés à la spectrométrie de masse (DXMS). Le relargage de l'AIR, entraînant une meilleure accessibilité du site d'interaction avec p22phox, a été confirmé et caractérisé d'un point de vue structural et fonctionnel sur protéine entière. De plus, une surface inédite contrôlant l'état autoinhibé a été mise en évidence. La mutagénèse dirigée au sein de cette surface a permis de confirmer cette hypothèse en identifiant deux résidus clés (R162 et D166) responsables de cette autoinhibition et donc susceptibles d'être de futurs candidats de cibles thérapeutiques. Les propriétés d'interactions relatives des divers mutants avec GST-p22phoxCter et des liposomes ont été testées par BiacoreTM et cosédimentation, respectivement. L'identification de ces résidus a permis de mieux comprendre le mécanisme d'activation de p47phox, et notamment comment le démasquage de l'AIR phosphorylée entraîne celui du domaine PX. Enfin, une étude méthodologique a montré que la plasmepsine 2 de P. falciparum était un nouvel outil susceptible d'améliorer la résolution du DXMS.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Deux biocapteurs, respectivement fondés sur des cellules de micro-algues et sur la polyphénol oxydase (PPO), sont décrits dans cette étude.<br />Le principe du biocapteur algal repose sur le suivi de l'activité photosynthétique des micro-algues par la mesure de la fluorescence chlorophyllienne. Le mode de culture en continu a été choisi afin d'obtenir des suspensions algales dont l'état physiologique des cellules est stable au cours du temps. Les cellules algales sont immobilisées sur- une membrane en fibre de quartz. Le biocapteur comporte cinq membranes algales. L'utilisation simultanée de cinq souches algales différentes permet d'augmenter la représentativité du signal mesuré d'un point de vue statistique ou écotoxicologique. Chlorella vulgaris a été utilisée lors des étapes d'optimisation et de validation du biocapteur. Le comportement de cinq souches algales a été étudié simultanément en l'absence et en la présence de polluants. <br />Le biocapteur enzymatique est fondé sur l'immobilisation de la polyphénol oxydase dans un film électrogénéré de polymère : le poly(3,4-éthylènedioxythiophène) (PEDT). Il permet la détection directe de composés phénoliques et la détection indirecte d'inhibiteurs de cette enzyme. Les conditions d'élaboration et d'utilisation des bioélectrodes ont été optimisées.<br />Par leur spectre de détection et leur sensibilité, ces deux biocapteurs sont des outils complémentaires. Le biocapteur algal est capable de détecter des concentrations en herbicides anti-PSII inférieures au µg.l-1, tandis que la bioélectrode à PPO détecte les composés phénoliques à des concentrations de l'ordre du µg.l-1.

Ce travail montre qu'une protéine non encore décrite dans les phagocytes, la PAT1 " Protein interacting with APP Tail 1 ", interagit avec la partie cytosolique de la p22phox (composant du cytochrome b558 membranaire de la NADPH oxydase). Nous avons utilisé différentes approches pour montrer cette interaction : le système double hybride, la technique de GST-pull down, la microscopie confocale et la technique de co-immunoprécipitation. De plus, nous avons montré que la PAT1a recombinante augmente l'activité de la NADPH oxydase, in vitro dans un système acellulaire reconstitué, et dans les cellules intactes (monocytes et cellules COS-phox). Cette nouvelle interaction régule donc l'activation de la NADPH oxydase et la production des FRO. Par ailleurs, la liaison de PAT1 aux microtubules pourrait favoriser l'assemblage du complexe NADPH oxydase pendant son activation. Ceci pourrait conduire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques qui préviennent la survenue des lésions tissulaires dans les maladies inflammatoires.

La cytochrome c oxydase (CcO) est un complexe protéique commun à tous les organismes aérobies. Elle catalyse la réduction de l'oxygène en eau au niveau d'un site catalytique qui contient un atome de fer hémique et un atome de cuivre (CuB). La famille de ces oxydases est ainsi appelée super famille des oxydases à "hème-cuivre". Malgré le grand nombre d'études réalisées au sujet de l'activité catalytique des CcO, le déroulement exact des étapes de leur mécanisme reste encore mal connu. Afin de mieux cerner le problème de la relation structure-activité de cette hémoprotéine, deux approches distinctes et complémentaires ont été abordées : l'étude du système naturel et l'approche biomimétique. Les propriétés électroniques et vibrationnelles de certains intermédiaires du cycle catalytique de la cytochrome c oxydase ont été caractérisées par spectroscopies UV-Visible, de fluorescence résolue en temps et infrarouge. L'analyse du site actif de la CcO par des substitutions isotopiques du CuB, ainsi que l'influence du pH sur la structure de cet enzyme sont discutées. La deuxième partie de ce travail concerne l'étude du rôle de l'environnement proche de l'hème sur la réactivité des complexes FeII-CO et FeII-O2 grâce à une série de modèles superstructurés du centre binucléaire Fe/Cu de la CcO. Ces analogues synthétiques conservent l'hème, la ligation fer-histidine du site proximal et le ligand complexant le cuivre du site distal de la CcO, mais se différencient notamment par leur environnement autour de l'atome de cuivre et par leur rigidité. Deux techniques ont été utilisées: la spectroscopie ATR-IRTF et la photochimie dans le cas d'espèces carbonylées.

La Polyarthrite Rhumatoïde, caractérisée par une synovite à l'origine de lésions progressives ostéo-articulaires, est le plus fréquent des rhumatismes inflammatoires. Les formes réactives de l'oxygène (ROS) produites par la NADPH oxydase des polynucléaires neutrophiles (PMN) infiltrant le pannus rhumatoïde, sont responsables de lésions tissulaires. La NADPH oxydase des phagocytes, est formée d'un centre catalytique membranaire, le cytochrome b558, sur lequel vient s'associer des protéines cytosoliques régulatrices (p67phox, p47phox, p40phox et Rac1/2). L'étude du complexe NADPH oxydase isolé et constitutivement actif, à partir de PMN activés, a révélé la présence de deux enzymes impliquées dans la régulation du métabolisme du glucose. Il s'agit de la PFK2 (6-phosphofructokinase 2) et de la 6PGDH (6-phosphogluconate déshydrogénase) [Paclet et al. 2007]. De plus, l'étude des protéines cytosoliques retenues sur une matrice d'affinité ciblant p47phox, a établi que les protéines S100A8 et S100A9, constituant 40% des protéines cytosoliques du PMN, participent à l'activation de l'oxydase [Berthier et al. 2003]. L'hétérocomplexe S100A8/A9, augmente l'activité de la NADPH oxydase phagocytaire et induit un changement conformationnel du cytochrome b558. Au regard de l'importance de la stimulation du PMN dans la physiopathologie de la PR, notre objectif, à terme, est d'analyser les mécanismes de l'activation de la NADPH oxydase dans cette pathologie. D'une part, nous avons étudié la spécificité de l'interaction entre la 6PGDH ou la PFK2 et la NADPH oxydase des PMN. D'autre part, nous avons caractérisé les domaines de l'hétérocomplexe S100A8/A9 impliqués dans l'activation de la NADPH oxydase phagocytaire. Par ailleurs, une étude de la signature protéique dans le liquide synovial a été menée afin de rechercher l'empreinte de l'activation du PMN dans la PR et de caractériser des biomarqueurs spécifiques de cette pathologie. Après stimulation par le PMA, la 6PGDH et la PFK2 co-imunoprécipitent avec les facteurs cytosoliques p67phox, p47phox and p40phox. Les expériences de microscopie confocale suggèrent une co-localisation de ces deux enzymes du métabolisme du glucose avec la NADPH oxydase, dans des micro-domaines membranaires : les radeaux lipidiques. La 6PGDH est impliquée dans l'activation de la NADPH oxydase phagocytaire en élevant la concentration du NADPH cytosolique mais également en augmentant l'affinité de cette enzyme pour son substrat, le NADPH. PFK2 est l'enzyme majeure de la régulation de la glycolyse. Dans les neutrophiles, cette voie est essentielle pour la production d'ATP disponible, d'une part, pour la phosphorylation des facteurs cytosoliques de la NADPH oxydase et d'autre part, pour la NDP Kinase. Cette dernière enzyme pourrait, secondairement, activer Rac en formant du GTP à partir d'ATP. Les protéines S100A8/A9 sont directement impliquées dans les mécanismes de régulation de la NADPH oxydase. L'utilisation du complexe S100A8/A9 et de protéines chimères de fusion nous a permis de révéler que la partie C-terminale de S100A8 est impliquée dans la liaison avec le cytochrome b558 et l'activation de la NADPH oxydase phagocytaire. In vivo, le profil protéique du liquide articulaire de PR a mis en évidence l'empreinte de l'activation du PMN dans cette pathologie. Les protéines S100A8, S100A9 permettraient de différencier le liquide synovial rhumatoïde de celui de patients arthrosiques ou souffrant d'arthrites non rhumatoïdes. De manière intéressante, une production ectopique de S100A8/A9 par les synoviocytes de type fibroblastique a été mise en évidence, suggérant une implication potentielle de ces protéines dans la physiopathologie de la PR. En conclusion, la 6PGDH, la PFK2 et l'hétérodimère S100A8/A9 sont de nouveaux partenaires d'activation de la NADPH oxydase des phagocytes. Dans la Polyathrite Rhumatoïde, l'activation des PMNs conduit à la sécrétion de S100A8/A9 qui semblent constituer à la fois des biomarqueurs pertinents, mais également des cibles thérapeutiques potentielles.