Les voies respiratoires sont exposées à une panoplie de pathogènes. Lors d’une infection virale respiratoire les cellules qui recouvrent ces voies participent activement à la défense immunitaire contre ces derniers en limitant la propagation du virus et en engendrant une réponse proinflammatoire. Un évènement clef dans ces processus est l’activation des facteurs de transcription, notamment le « Nuclear Factor » (NF)-κB et l’« Interferon Regulatory Factor -3 » (IRF-3), qui régulent l’expression des cytokines antivirales et proinflammatoires. Des données récentes démontrent que les dérivés actifs de l’oxygène (ROS), produits suite à une infection virale, ont la capacité de réguler les voies de signalisation enclenchées par NF-κB et IRF-3. Une source importante de ROS est la famille de NADPH oxydases (NOX), qui contient les membres NOX1-5 et DUOX1 et 2. L’objectif de notre étude était d’identifier la NOX qui régule les mécanismes antiviraux et proinflammatoires suite à l’infection avec le virus respiratoire syncytial (RSV), qui cause des complications respiratoires majeures, et le virus Sendai (SeV), un modèle viral non-pathogène. Nos travaux ont permis d’identifier que NOX2 est une molécule clef dans la réponse proinflammatoire suite à l’infection virale. Plus spécifiquement, NOX2 est important pour l’activation de NF-κB et la sécrétion des cytokines régulées par ce dernier. De plus, nous avons observé une forte augmentation de la présence de DUOX2 dans les cellules de voies respiratoires humaines infectées par SeV. Une étude plus approfondie nous a permis de caractériser qu’une synergie entre deux cytokines secrétées lors de l’infection, soit l’interféron (IFN)β et le TNFα est responsable de l’induction de DUOX2. Nous avons aussi découvert que DUOX2 confère une activité antivirale et est nécessaire pour maintenir les taux des cytokines antivirales tardives IFNβ et IFNλ. Lors d’une infection avec RSV, l’induction de DUOX2 n’est pas détectable. Nous avons mis en évidence que RSV interfère avec l’expression de DUOX2 ce qui pourrait suggérer sa pathogénicité. En conclusion, nos travaux démontrent pour la première fois une implication spécifique des NADPH oxydase NOX2 et DUOX suite aux infections virales respiratoires. / The mucosal linings of the airways are constantly exposed to an array of microbial pathogens. During the course of respiratory viral infection, Airway epithelial cells (AEC) actively participate in the innate antiviral immune response by limiting the spread of respiratory viruses and by fostering a proinflammatory environment that attracts and activates players of the immune system. A key step in the establishment of the antiviral and proinflammatory state is the activation of Transcription Factors (TFs), such as Nuclear Factor (NF)-κB and Interferon Regulatory Factor 3 (IRF-3), which regulate the expression of antiviral and proinflammatory cytokines. For the efficient functioning of these events, the signaling pathways involved underlie strict regulatory mechanisms. Recent data suggest that Reactive Oxygen Species (ROS), which are produced upon viral infection, are able to regulate these intracellular signaling pathways. One important source of ROS is the NADPH oxidase (NOX) family of enzymes, which is composed of NOX1-5 and Dual Oxidase (DUOX) 1 and DUOX2. The aim of our study was to identify the NADPH oxidase(s) that regulate(s) antiviral and proinflammatory mechanisms following infection of AEC with Respiratory syncytial virus (RSV), which causes major human lower respiratory tract complications, and Sendai virus (SeV), a non pathogenic virus. During the course of our studies we identified that NOX2 is a key molecule in the early proinflammatory response to RSV and SeV infection. We demonstrate that NOX2 is necessary for the activation of NF-κB. Consequently, NOX2 impacts on the proinflammatory cytokine secretion upon AEC infection. Further, we observed that expression of the ROS-generating NADPH oxidase DUOX2 is strongly increased following infection of AEC with SeV. We identified that DUOX2 induction requires the synergistic stimulation by IFNβ and TNFα. Importantly, DUOX2 exhibited ROS-dependent antiviral action. We identified that DUOX2 was necessary for sustaining the levels of late antiviral cytokines IFNβ and IFNλ. When AEC were infected with RSV, DUOX2 expression was barely detectable. Our data reveal that RSV has developed an evasion mechanism to counteract DUOX2 induction likely contributing to RSV pathogenicity. In conclusion, our work demonstrates for the first time the specific implication of NOX2 and DUOX2 in the antiviral and proinflammatory response to respiratory virus infection.

La cellule ß pancréatique sécrète l’insuline, la seule hormone capable de diminuer la concentration en glucose plasmatique. L'insuline est sécrétée de manière régulée sous l’influence de divers stimuli dont avant tout l’élévation de la glycémie, celle-ci augmentant lors de chaque repas. Elle est donc essentielle à la préservation de l'homéostasie du glucose. Son importance est attestée par le développement du diabète sucré et de ses complications sévères et parfois mortelles lorsque sa sécrétion est supprimée ou insuffisante et/ou lorsqu'il existe un défaut de son action.La cellule ß est une cellule excitable, c'est à dire capable de moduler son potentiel membranaire très rapidement en variant certaines conductances ioniques (Dean & Matthews 1968; 1970a; 1970b). En réponse à une élévation du glucose extracellulaire, la cellule ß se dépolarise et génère des potentiels d’action qui aboutissent à une augmentation du calcium cytoplasmique induisant la libération d’insuline par exocytose. La succession des différentes étapes menant à cette sécrétion régulée d'insuline est complexe, souvent désignée sous le vocable de couplage stimulus-sécrétion. Elle commence par une augmentation de l’entrée du glucose et de son métabolisme dans la cellule ß. L’augmentation de la concentration en ATP (ou du rapport de concentrations ATP/ADP) qui en résulte, entraîne la fermeture des canaux potassiques ATP-sensibles (KATP) avec une dépolarisation partielle de la membrane. Toutefois la fermeture de ces canaux ne semble pas suffisante pour expliquer la dépolarisation membranaire observée sous l’effet du glucose et une dépolarisation supplémentaire est nécessaire pour arriver au seuil d’activation des canaux calciques voltage-dépendants ou Cav (Gilon & Rorsman, 2009). Un efflux de Cl- de la cellule ß est déclenché lors d’une stimulation au glucose (Sehlin 1978; Sehlin 1987), proportionnellement à la concentration de glucose entre 5 et 20 mM (Malaisse et coll. 2004). Une diminution de la concentration en Cl- du milieu extracellulaire (à 10 mM ou moins) réduit fortement la sécrétion d’insuline (de 70 % ou plus avec 10 et 20 mM de glucose) et affecte l'activité électrique, inhibant voire abolissant les salves de potentiel d'action d'îlots de souris (Sehlin 1978; Sehlin & Meissner, 1988). L’ion chlorure joue donc un rôle essentiel dans l'activité électrique et la sécrétion d’insuline des cellules ß sous l'effet du glucose. Les travaux qui constituent l'objet de cette thèse sont consacrés à caractériser le transport membranaire des ions Cl- dans les cellules ß ainsi que sa régulation et particulièrement le rôle d’un canal Cl- récemment identifié et cloné: l’anoctamine1 (Ano1 ou TMEM16A).Au chapitre 3, nous démontrons l’expression de transcrits d’Ano1 par transcription inverse et amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR) chez l'homme et le rat ainsi que l’expression de la protéine par western blot et immunohistochimie chez le rat. Sur coupe de pancréas, un marquage pour Ano1 est observé dans les îlots et dans les cellules acinaires du pancréas exocrine. La spécificité du marquage est attestée par sa disparition lors de l'addition d’un peptide compétiteur (Ano1 exogène). Nous avons démontré en patch-clamp la présence d’Ano1 actif dans la membrane des cellules ß: i) Nous avons observé des courants typiques d'Ano1 dans des patchs de cellules ß de rat entières et excisés inside-out en présence de Ca2+ intracellulaire: à 1 µM, le courant Cl- est rectifiant sortant et à 2 µM il devient presque linéaire. ii) La relation amplitude unitaire-voltage des courants Cl- unitaires activés par le Ca2+ est linéaire et montre une conductance de 8,37 pS, correspondant exactement à la conductance décrite pour Ano1. iii) Les perméabilités relatives des anions monovalents sont NO3- (1.83 ± 0.10) > Br- (1.42 ± 0.07) > Cl- (1.0), compatibles avec celles d'Ano1. iv) Ces courants sont quasi abolis par des anticorps Ano1-bloquants ou par deux inhibiteurs d’Ano1, 2-(5-éthyl-4-hydroxy-6-méthylpyrimidine-2-ylthio)-N-(4-(4-méthoxyphényl)thiazol-2-yl)acétamide (T-AO1) et acide tannique (TA). Ayant démontré la présence d'Ano1 fonctionnels au niveau de la membrane des cellules ß, nous avons investigué l'implication d'Ano1 dans la dépolarisation membranaire induite par le glucose. Cette étude a été réalisée en patch-clamp perforé sur des cellules ß d'îlots entiers de souris et des cellules ß dispersées de rat et de souris stimulées par le glucose. Les inhibiteurs d'Ano1 (T-AO1 et TA) induisent une forte diminution de la fréquence des potentiels d'action lors d'une stimulation par 16.7 mM de glucose (au moins 87 % sur cellules dispersées) et une repolarisation partielle du potentiel membranaire avec le T-AO1. Ces inhibiteurs abolissent ou inhibent fortement l'augmentation de sécrétion d'insuline d'îlots de rat induite par 8.3 mM et 16.7 mM de glucose. Des anticorps Ano1-bloquants abolissent également l'incrément de sécrétion d'insuline provoqué par 16.7 mM de glucose. Un traitement combiné avec du bumétanide (inhibant l'entrée de Cl- dans la cellule par NKCC1/2) et de l'acétazolamide (inhibant l'anhydrase carbonique V mitochondriale produisant du HCO3- intracellulaire durant le métabolisme du glucose) dans un milieu contenant 20 mM de Cl- et sans HCO3- provoque une réduction de 65 % de l'amplitude des potentiels d'action (AP) avec une repolarisation de 15 mV de leur pic sur des cellules ß dispersées de rat, confirmant l'importance de ces anions dans la régulation des oscillations du potentiel membranaire sous l'effet du glucose. Cette étude démontre que l'ouverture d'Ano1 est nécessaire pour permettre les oscillations du potentiel membranaire stimulées sous l'effet du glucose et la sécrétion d'insuline.Au chapitre 4, nous avons étudié les effets de l'H2O2 sur le canal anionique sensible au gonflement cellulaire (appelé VRAC pour volume-regulated anion channel) dans les cellules ß de rat et de la lignée de rat BRIN-BD11. L'H2O2 produit par une ou plusieurs NAD(P)H oxidase(s) (NOX) a récemment été proposé d'agir, dans plusieurs types cellulaires, comme le signal médiateur de l'activation de ces canaux activés lors du gonflement cellulaire. L'H2O2 exogène (100 à 200 µM) à une concentration de glucose basale (1,1 à 2,8 mM) stimule la sécrétion d'insuline. L'inhibiteur de VRAC, 5-nitro-2-(3-phénylpropylamino)-benzoate (NPPB), également inhibiteur d'Ano1, inhibe la réponse sécrétoire à l'H2O2 exogène. Dans des expériences de patch-clamp, nous montrons que l'H2O2 exogène stimule l’ouverture de VRAC, induisant une dépolarisation du potentiel membranaire et un courant anionique, abolis par le NPPB. L'exposition des cellules BRIN-BD11 à un milieu hypotonique (200 mosmol/l) provoquait un gonflement cellulaire suivi d’un retour vers le volume initial (en 10-15 min) suite à l’activation du canal VRAC, et une augmentation détectable du niveau intracellulaire de dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) mise en évidence par l'oxydation du colorant fluorescent 5-(et-6)-chlorométhyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescéine (CM-H2DCF). Cette production de ROS est abolie par le chlorure de diphénylèneiodonium (DPI), un inhibiteur de flavoprotéines dont les NOX et certaines protéines de la chaîne respiratoire mitochondriale. Les inhibiteurs de NOX tels le DPI et la plumbagine inhibaient presque totalement l’incrément de sécrétion d'insuline provoqué par l'exposition des cellules BRIN-BD11 au milieu hypotonique. Une préincubation avec les deux drogues suivantes abolit quasiment la sécrétion d'insuline tant induite par l'hypotonicité que basale: i) N-acétyl-L-cystéine (NAC), un précurseur du glutathion qui sert d'antioxydant général et ii) l'acide bétulinique, un composé qui abolit presque totalement l'expression NOX4. Comme le NPPB, chacun de ces inhibiteurs (DPI, plumbagine, préincubation avec NAC ou de l'acide bétulinique) réduit fortement ou abolit la régulation du volume cellulaire observée suite à un choc hypotonique, fournissant une preuve indépendante que l'activation de VRAC est médiée par l'H2O2. L'ensemble de ces données suggère que l'H2O2 produit par une ou plusieurs NOX joue un rôle critique dans la réponse insulino-sécrétoire des cellules ß de la lignée de rat BRIN-BD11 et des cellules ß de rat à l'hypotonicité extracellulaire, via une dépolarisation produite par l'activation de VRAC et une sortie d'anions. L'inhibition de cette dépolarisation produite sous l’effet de l'H2O2 et de l’hypotonicité, ainsi que de la régulation du volume cellulaire observée suite à un choc hypotonique par les inhibiteurs d'Ano1 T-AO1 et TA (100 µM) suggèrent qu'Ano1 est associé à ce canal VRAC ou le constitue ou tout au moins en constitue une sous-unité. Le mécanisme exact entraînant l’ouverture d’Ano1 sous l’effet du glucose n’est pas élucidé. Toutefois à la suite des travaux de Llanos (Llanos et coll. 2015), nous suggérons la séquence d'événements suivante: outre la fermeture des canaux KATP, le métabolisme du glucose produit des ROS qui oxydent et ouvrent RyR2, libérant du Ca2+ des stocks intracellulaires à des endroits localisés près de la membrane cellulaire et d’Ano1 qui est ainsi activé. En conclusion, nos études démontrent que i) l'efflux de Cl- (dépolarisant) de cellules ß murines sous l'effet du glucose dépend de l’ouverture du canal Cl- activé par le calcium intracellulaire (CaCC) Ano1. Le canal Ano1 est activé sous l’effet du glucose et son activation est requise pour induire les potentiels d’action et l'entrée de Ca2+ dans la cellule ß, nécessaires à la libération d’insuline. L'ouverture d'Ano1 semble donc responsable des oscillations du potentiel membranaire en phase active avec potentiels d'action et sa fermeture pourrait participer à la repolarisation des phases silencieuses. ii) l'H2O2 produit par une ou plusieurs NAD(P)H oxydase(s) sous l’effet du gonflement cellulaire, ou du glucose (Pi et coll. 2007, Leloup et coll. 2009), ou encore ajouté de manière exogène est nécessaire à l’activation du canal anionique sensible au gonflement cellulaire VRAC. L'ouverture de VRAC s'accompagne d'une sortie d'anions, dépolarise les cellules ß de la lignée de rat BRIN-BD11 et de rat et provoque une stimulation de la sécrétion d’insuline. Ano1 pourrait être associé à VRAC, le constituer ou en constituer une sous-unité. Le mécanisme déclenchant l'ouverture d'Ano1 reste à élucider. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

De nombreuses réactions enzymatiques sont à l’origine de processus physiologiques au sein des organismes vivants. Ces réactions sont basées sur des transferts de protons et d’électrons et con-duisent souvent à la production d’espèces secondaires. Parmi elles, les espèces réactives de l’oxygène et de l’azote (ROS, RNS) présentent un intérêt particulier puisqu’elles jouent un double rôle : d’une part en permettant à l’organisme de réagir à un stress par l’activation de voie de signalisation redox, et d’autre part ces ROS et RNS peuvent causer des dommages tissulaires et être à l’origine de dys-fonctionnement (stress oxydant) au sein de l’organisme. La haute réactivité de ces espèces induit leurs faibles durées de vie (ns-min) et rend l’étude de certaines réactions enzymatiques difficiles en solu-tion. Ce projet de thèse a pour objectif de développer un microréacteur biomimétique pour l’étude d’activités enzymatiques produisant des ROS/RNS. En effet, en confinant une réaction au sein d’un compartiment de taille équivalente à celle d’une cellule (20-100 μm de diamètre), les espèces générées (H2O2, NO•, NO2-) doivent pouvoir être sondées in situ avec une résolution cinétique et quantitative. Des vésicules unilamellaires géantes sont formées en conditions physiologiques et servent de micro-réacteurs pour l’analyse des activités enzymatiques de la glucose oxydase et des NO-synthases. La microscopie de fluorescence permet l’observation des vésicules et le suivi du déclenchement de la réaction assuré par microinjection. Les espèces produites sont ensuite détectées en temps réel par électrochimie afin de déchiffrer à terme les différentes voies enzymatiques des NO-Synthases. / Enzymatic reactions are involved in many physiological phenomena in living organisms. These reactions are based on protons and electrons transfers and can lead to the production of by-products. Among them, reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS) are of great interest as they play a double role: on the one hand by allowing the organism to react to a stress by the activation of signaling redox pathways, and on the other hand, ROS and RNS can cause oxidative damages to tissues ensuing dysfunctions in the organism. The high reactivity of such species induce their short lifetimes (ns-min) and leads to uncertainties when it comes to the study of some enzymatic reactions in bulk. This PhD project aims to develop a biomimetic microreactor for the study of enzymatic ac-tivities producing ROS/RNS. Indeed, by confining a reaction within a cell-sized compartment (20-100 μm diameter), the generated species (H2O2, NO•, NO2-) could be analyzed in situ with a quantita-tive and kinetic resolution. Giant unilamellar vesicles are formed in physiological conditions and are used as microreactors for the monitoring of enzymatic activities of glucose oxidase and NO-synthases. Fluorescence microscopy allows individual vesicle observation and the monitoring of reactions trig-gered by microinjection. Then, released species are detected in real-time by electrochemistry in order to decipher the diverse enzymatic pathways of NO-Synthases.

La cytochrome c oxydase (CcO) est un complexe protéique commun à tous les organismes aérobies. Elle catalyse la réduction de l’oxygène en eau au niveau d’un site catalytique qui contient un atome de fer hémique et un atome de cuivre (CuB). La famille de ces oxydases est ainsi appelée super famille des oxydases à "hème-cuivre". Malgré le grand nombre d’études réalisées au sujet de l’activité catalytique des CcO, le déroulement exact des étapes de leur mécanisme reste encore mal connu. Afin de mieux cerner le problème de la relation structure-activité de cette hémoprotéine, deux approches distinctes et complémentaires ont été abordées : l’étude du système naturel et l’approche biomimétique. Les propriétés électroniques et vibrationnelles de certains intermédiaires du cycle catalytique de la cytochrome c oxydase ont été caractérisées par spectroscopies UV-Visible, de fluorescence résolue en temps et infrarouge. L’analyse du site actif de la CcO par des substitutions isotopiques du CuB, ainsi que l’influence du pH sur la structure de cet enzyme sont discutées. La deuxième partie de ce travail concerne l’étude du rôle de l’environnement proche de l’hème sur la réactivité des complexes FeII-CO et FeII-O2 grâce à une série de modèles superstructurés du centre binucléaire Fe/Cu de la CcO. Ces analogues synthétiques conservent l’hème, la ligation fer-histidine du site proximal et le ligand complexant le cuivre du site distal de la CcO, mais se différencient notamment par leur environnement autour de l’atome de cuivre et par leur rigidité. Deux techniques ont été utilisées: la spectroscopie ATR-IRTF et la photochimie dans le cas d’espèces carbonylées. / Cytochrome c Oxidase (CcO), a member of the heme-copper oxidase superfamily, is a membrane protein in many aerobic organisms, that catalyses the reduction of dioxygen to water. Dioxygen binding and reduction occurs at a heterobinuclear site that is comprised of a heme a3, and a copper atom (CuB) in close proximity. Despite, the CcO has been the subject of numerous biophysical and spectroscopic investigations, the detailed molecular mechanism of CcO remains still elusive. In order to better define the structure-function relationship for this hemoprotein, two distinct and complementary approaches have been employed: the study of the natural system and the biomimetic approach.Structural changes accompanying the change in the redox state of some CcO intermediates have been characterised by UV-Visible, ATR-FTIR and time-resolved fluorescence spectroscopies. The study of the cytochrome c oxydase active site modified with isotopic substitutions of CuB, and the effect of pH on the structure are discussed. The second part of this work is related to study the role of environment on the reactivity of FeII-CO et FeII-O2 complexes by exploiting a series of superstructured models of the binuclear Fe/Cu active site of CcO. Based upon a porphyrin core, all these models have the iron-histidine ligation of the proximal site and the copper ligand of the distal site of CcO but they differ strongly by the environment around the copper and their rigidity.

La présente étude évalue la capacité de EPA:DHA 6:1, une formulation d’omega-3 capable d’induire la formation continue de monoxyde d’azote par la NO synthase endothéliale, à prévenir l’hypertension et la dysfonction endothéliale induites par l’angiotensine II (Ang II) chez le rat. L’hypertension induite par l’Ang II est associée à une dysfonction endothéliale caractérisée par une altération des composantes de la relaxation et une augmentation des réponses contractiles dépendantes de l’endothélium. L’Ang II augmente le stress oxydant vasculaire et l’expression de NADPH oxydase, COXs, eNOS, et AT1R, alors que SKCa et connexin 37 sont sous-exprimés. EPA:DHA 6:1 prévient l’hypertension, la dysfonction endothéliale et la surexpression des protéines cibles. En conclusion, la consommation chronique de EPA:DHA 6:1 prévient l’hypertension et la dysfonction endothéliale induites par l’Ang II chez le rat, probablement en prévenant le stress oxydant dû à la NADPH oxydase et aux cyclooxygénases. / EPA:DHA 6:1 has been shown to be a superior omega-3 formulation inducing a sustained endothelial NO synthase-derived formation of nitric oxide. This study examined whether chronic intake of EPA:DHA 6:1 prevents hypertension and endothelial dysfunction induced by angiotensin II (Ang II) in rats. Ang II-induced hypertension was associated with endothelial dysfunction characterized by blunted components of relaxation and increased endothelium-dependent contractile responses. Ang II increased the vascular oxidative stress, and the expression of NADPH oxidase subunits, COXs, eNOS, and AT1R whereas SKCa and connexin 37 were down-regulated. Intake of EPA:DHA 6:1 prevented the Ang II-induced hypertension and endothelial dysfunction, and improved expression of target proteins. In conclusion, chronic intake of EPA:DHA 6:1 prevented the Ang II induced hypertension and endothelial dysfunction in rats, most likely by preventing NADPH oxidase and cyclooxygenase-derived oxidative stress.

La première partie du travail présenté ici se concentre sur l’optimisation d’une cathode à oxygène. Tout d’abord, l’utilisation d’une nouvelle enzyme (la BOD de Magnaporthe oryzae) permet de multiplier le courant de réduction de l’oxygène en eau jusqu’à neuf fois. Ensuite la synthèse d’un polymère rédox adapté a permis d’améliorer le coefficient de diffusion des électrons dans l’hydrogel résultant en l’augmentation de la densité de courant générée. Enfin nous sommes passés d’uneélectrode de carbone en 2 dimensions à une fibre d’or poreuse tridimensionnelle. Après modification de cette fibre avec l’hydrogel rédox à base de BOD de M. oryzaenous avons évalué sa biocompatibilité : in vitro les tests ont montré l’absence totale de cytotoxicité et seule une très faible réponse inflammatoire ; in vivo aucune infection ne s’est déclarée pendant les 8 semaines d’implantation dans les souris etla formation d’une capsule fibrotique autour de l’électrode traduit sa bonne intégration dans les tissus de l’animal. La seconde partie concerne la biopile dans son intégralité, construite à partir de la cathode optimisée et d’une anode adaptée à base de GDH. Elle permet de générer jusqu’à 240 μW.cm-2 dans du tampon Pipes/CaCl2 à 5mM de glucose. La biopile a ensuite été testée dans du sang humain total. Un maximum de 129 μW.cm-2 a été obtenu dans un échantillon avec une glycémie de 8,2 mM sous air. De plus nous avons constaté que la densité de puissance délivrée augmente proportionnellement avec la glycémie des différents échantillons de sang testés, faisant de la biopile à la fois une source d’électricité et un biocapteur à glucose ce qui n’avait jamais été démontré auparavant. / The first part of the work presented here focuses on the optimization of an oxygen cathode. First, the use of a new enzyme (BOD from Magnaporthe oryzae) permit to increase the current of reduction of oxygen into water by a factor nine. Then the synthesis of a suitable redox polymer greatly improved the diffusion coefficient of electrons in the hydrogel, resulting in an increase of the current density. Finally we switched from a two-dimensional carbon electrode to a three-dimensional porous gold fiber. After modification of the fiber with the redox hydrogel based on BOD from M. oryzae, we assessed its biocompatibility: in vitro the tests showed the total absence of cytotoxicity and only a very low inflammatory response; in vivo noinfection appeared during the 8 weeks of implantation in mice and the formation of afibrotic capsule around the device reflects its successful integration into the animal tissues.The second part concerns the full biofuel cell, elaborated from the optimized cathode and an adapted GDH-based anode. It could generate up to 240 μW.cm-2 at 5mMglucose in Pipes/CaCl2 buffer. The biofuel cell was then tested in whole human blood. A maximum of 129 μW.cm-2 was obtained in a sample with 8,2 mM glycaemiaunder air. In addition we observed that the delivered power density increased proportionally with the glycaemia of the different blood samples tested, making the biofuel cell both a power source and a glucose biosensor at the same time which had never been shown before.

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La forme canadienne-française du syndrome de Leigh (LSFC) est une maladie métabolique associée à une déficience en cytochrome oxydase (COX) et caractérisée par des crises d’acidose lactique, menant à une mort prématurée. Les mécanismes qui sous-tendent l’induction des crises restent inconnus et il n’existe aucune thérapie efficace pour les prévenir. Cette étude vise à caractériser l'effet de facteurs métaboliques périphériques potentiellement altérés chez les patients LSFC sur la mort de lignées cellulaires issues de ces patients et de témoins puis, à identifier des agents thérapeutiques pouvant la prévenir. Nous postulons que (i) ces facteurs métaboliques induiront une mort prématurée des cellules de patients et que (ii) les interventions susceptibles de la prévenir pallieront les conséquences de la déficience en COX, soit la diminution des taux d’adénosine triphosphate (ATP) et l’augmentation du stress oxydant, du nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et des lipides toxiques. Un criblage de 8 facteurs sanguins et 10 agents thérapeutiques a été réalisé. Les paramètres mesurés incluent la nécrose, l’apoptose, l’ATP et l’activité de la COX. Les fibroblastes LSFC sont plus susceptibles à la mort par nécrose (39±6%) induite par du palmitate plus lactate, un effet associé à des niveaux d’ATP diminués (53±8%). La mort cellulaire est réduite de moitié par l’ajout combiné d’agents ciblant le NADH, l’ATP et les lipides toxiques, alors que l’ajout d’antioxydants l’augmente. Ainsi, un excès de nutriments pourrait induire la mort prématurée des cellules LSFC et, pour atténuer cette mort, il serait important de combiner plusieurs interventions ciblant différents mécanismes. / Leigh syndrome French-Canadian variant (LSFC) is a metabolic disease associated with cytochrome c oxidase (COX) deficiency and characterized by episodes of lactic acidosis, referred to as “crisis”, leading to death at an early age. The mechanisms underlying a crisis and its cellular consequences remain elusive, and there is no effective therapy. The aim of this study was to characterize the effect of peripheral metabolic factors that are potentially altered in patients with LSFC on their cells death and to identify therapeutic agents able to prevent them using cell-lineage from LSFC patients and controls. The hypothesis are that (i) these metabolic factors can induce premature death in patient cells, and (ii) interventions that could rescue these cells may target potential consequences of COX deficiency, namely low adenosine triphosphate (ATP), high nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and toxic lipids, as well as oxidative stress. A screening of 8 blood factors and 10 therapeutic agents was conducted in fibroblasts. Parameter measured included cell death by necrosis and apoptosis, as well as ATP level and COX activity. LSFC fibroblasts were more susceptible to necrosis (39±6%) induced by high palmitate plus lactate and this was associated with a lower ATP (53±8%). Cell death decreased 2-fold with combined interventions, which presumably act on NADH, ATP, and the accumulation of toxic lipids, but increased with antioxidants. Collectively, our results emphasize the importance of nutrient overload as a factor eliciting premature cell death in LSFC cells and of combining interventions acting through various mechanisms for cell death rescue.

Les triacylglycérols d'algues (TAG) représentent une source prometteuse de biocarburants. Les principales étapes de la synthèse des acides gras et du métabolisme du TAG des algues ont été déduites de celles des plantes terrestres, mais on en sait peu sur les sources de carbones et d’énergie intervenant dans la synthèse de lipides de réserve. Nous avons donc étudié la synthèse des acides gras chez l’algue modèle Chlamydomonas reinhardtii en utilisant une combinaison d'approches génétiques, biochimiques et microscopiques. Plus précisément, j'ai d'abord examiné la localisation subcellulaire de gouttelettes de lipides dans des cellules d'algues exposées à une forte lumière, conditions où une plus grande quantité de pouvoir réducteur est produite. J'ai ensuite contribué à mettre en évidence que la bêta-oxydation des acides gras est un processus peroxysomal, et que pendant une carence en azote réalisée en conditions photoautotrophe, des mutants dépourvus de la malate déshydrogénase 2 peroxysomale (mdh2) accumulent 50% plus TAG que les souches parentales. Ces résultats nous ont permis de mettre en évidence l'importance du contexte redox cellulaire sur la synthèse lipidique. Cette étude a également permis de révéler l’existence d'un échange d’énergie entre le peroxysome et le chloroplaste. Enfin, en caractérisant des mutants déficients dans la dégradation des acides aminés à chaîne ramifiée (BCAA), j'ai montré que le catabolisme des BCAAs joue un double rôle dans la synthèse de TAG en fournissant des précurseurs carbonés et de l'ATP. L'ensemble de ces travaux ouvert de nouvelles pistes pour l'amélioration génétique future de souches d'algues pour la production de biocarburants. / Algal triacylglycerols (TAG) represent a promising source for biofuel. The major steps for fatty acid synthesis and TAG metabolism have been deduced based on that of land plants, but little is known about carbon and energy sources. To address this question, we investigated fatty acid synthesis in algal cells using a combination of genetic, biochemical and microscopic approaches in the model microalga Chlamydomonas reinhardtii. Specifically, I first examined subcellular localization of lipid droplets in algal cells exposed to high light, a condition favoring production of reducing power. Secondly, I contributed to put on evidence that the beta-oxidation of fatty acids is a peroxisomal process, and that during photoautotrophic nitrogen starvation, knock-out mutants of the peroxisomal malate dehydrogenase 2 (mdh2) made 50% more TAG than parental strains, highlighting the importance of cellular redox context on lipid synthesis. This study also revealed for the first time the occurrence of an energy trafficking pathway from peroxisome to chloroplast. And finally, by characterizing mutants defected in degradation of branched-chain amino acids (BCAAs), I showed that BCAA catabolism plays a dual role in TAG synthesis via providing carbon precursors and ATP. Taken together, this work highlighted the complex interplay between carbon and energy metabolism in green photosynthetic cells, and pointed future directions for genetic improvement of algal strains for biofuel productions.