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Développement de biocapteurs pour la détermination de substances biologiquement actives / Development of biosensors for the determination of biologically active substancesKucherenko, Ivan 03 June 2016 (has links)
Les biocapteurs sont des moyens d’analyse en plein essor à la fois rapides, sélectifs et peu coûteux applicables à des domaines extrêmement variés (environnement, santé, agroalimentaire,…). Dans ce type d’outil, un élément sensible de nature biologique (anticorps, enzyme, microorganisme, ADN…) doté d’un pouvoir de reconnaissance pour un analyte ou un groupe d’analytes est associé à un transducteur pouvant être de type électrochimique, optique ou thermique.Dans ce travail, nous nous sommes intéressés au développement de trois biocapteurs pour la détection de substances biologiquement actives. Le premier permet la détermination simultanée de l’adénosine triphosphate (ATP) et du glucose par ampérométrie, le deuxième celle de la créatine kinase, et le troisième est un biocapteur conductimétique pour la quantification de l’ATP. Dans les deux premiers biocapteurs, deux enzymes (l’hexokinase et la glucose oxydase) sont immobilisées à la surface de microélectrodes constituées d’un disque de platine. Le troisième biocapteur est basé sur l’immobilisation de l’hexokinase sur des microélectrodes interdigitées en or. L’immobilisation est réalisée dans tous les cas par co-réticulation des enzymes en présence d’albumine de sérum bovin à l’aide de glutaraldehyde. Les caractéristiques analytiques des biocapteurs ont été déterminées et différentes procédures ont été développées pour l’analyse d’échantillons réels. Les biocapteurs ont pu être appliqués avec succès à la quantification de l’ATP, du glucose et de la créatine kinase dans des préparations pharmaceutiques et du sérum sanguin / Biosensors are rapid, selective and inexpensive devices that combine a biological recognition element, the so-called bioreceptor (e.g. enzymes, antibodies, DNA or microorganisms) to a physical transducer (e.g. electrochemical, optical, thermal or piezoelectrical). They can be used to detect one specific analyte or one family of analytes for a wide range of applications (e.g. environment, food, health). In this work, the detection of biologically active substances was targeted. A biosensor system for simultaneous determination of adenosine triphosphate (ATP) and glucose, a biosensor for creatine kinase analysis, and a novel conductometric biosensor for ATP determination were developed. In the first two biosensors, two enzymes (hexokinase and glucose oxidase) were immobilized at the surface of platinum disc microelectrodes for amperometric detection. The third biosensor was based on hexokinase immobilized onto gold interdigitated microelectrodes for conductometric detection. In all cases, the enzymes were co-immobilized with bovine serum albumin by cross-linking using glutaraldehyde. Analytical characteristics of the biosensors were determined and different procedures were developed for real samples analysis. The biosensors could be successfully applied to the determination of ATP, glucose, and creatine kinase in pharmaceutical samples and blood serum
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Biopiles enzymatiques H2-O2 : nanostructuration de l'interface électrochimique pour l'immobilisation des enzymes redox / H2/O2 Biofuel cells : nanostructuration of the electrochemical interface for the immobilisation of redox enzymesDe poulpiquet de Brescanvel, Anne 04 December 2014 (has links)
Dans la nature, la réduction de l'oxygène et l'oxydation de l'hydrogène sont catalysées par des enzymes oxydoréductases. Ces catalyseurs spécifiques, efficaces, renouvelables et biodégradables constituent une alternative séduisante au platine dans les piles à combustible. L'immobilisation à des interfaces nanostructurées de l'hydrogénase membranaire tolérante à l'oxygène de la bactérie hyperthermophile Aquifex aeolicus, et de la bilirubine oxydase thermostable de la bactérie Bacillus pumilus, a été étudiée dans ce sens.L'électrochimie et la dynamique moléculaire ont permis d'affiner le modèle d'orientation de l'hydrogénase sur les surfaces planes. L'efficacité de l'immobilisation de l'hydrogénase sur différents nanomatériaux carbonés (nano-particules, tubes et fibres de carbone) structurant la surface de l'électrode a été évaluée. Les nanofibres de carbone (CNFs) ont permis de former une bioanode efficace pour l'oxydation de l'H2 en l'absence de médiateurs redox. L'étude a souligné l'importance d'un transport efficace du substrat dans le film carboné mésoporeux. Les CNFs ont également été utilisées comme matériau d'électrode pour réaliser la 1ère connexion directe de la bilirubine oxydase. L'existence d'une forme resting alternative de l'enzyme, influencée par les ions chlorures, le pH et la température, a été mise en évidence. Une biocathode efficace pour la réduction de l'oxygène a été développée.Les deux électrodes thermostables ont permis le développement de la 1ère biopile H2/O2 qui délivre des densités de puissance supérieures au mW.cm-2 sur une large gamme de température. Ce résultat ouvre la voie à l'alimentation électrique de dispositifs de faibles puissances. / The oxygen reduction and the hydrogen oxidation reactions are realized in nature by oxidoreductase enzymes. These highly efficient, specific, renewable and biodegradable catalysts appear as a seducing alternative to platinum in fuel cell devices. The immobilization at nanostructured interfaces of the membrane-bound oxygen-tolerant hydrogenase from the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus, and of the thermostable bilirubin oxidase from Bacillus pumilus, has been studied within this objective.Electrochemistry and molecular dynamics have been used to validate the orientation model of the hydrogenase at planar electrodes. Hydrogenase immobilisation in 3D-networks based on various carbon materials (nanoparticles, nanotubes and nanofibers) has been especially studied. Fishbone carbon nanofibers were demonstrated to provide an efficient platform for mediatorless H2 oxidation. Mass transport inside the carbon mesoporous film has been especially studied and demonstrated to be one of the limitations of the catalytic efficiency. Direct electrical connection of bilirubin oxidase has also been realized for the first time thanks to its immobilization on carbon nanofiber films. An alternative resting form of the enzyme, influenced by chlorides, pH and temperature, has been evidenced. An efficient biocathode for the oxygen reduction reaction has been developed. Thanks to the two thermostable electrodes, the first H2-O2 bio fuel cell able to deliver power densities over 1 mW.cm-2 over a large temperature range has been developed. This result paves the way for the electrical alimentation of low-power devices.
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Etude biophysique, structurale et fonctionnelle d'une protéine à cuivre issue de la bactérie acidophile Acidithiobacillus ferrooxidans / Biophysical, structural and functional study of a copper-binding protein from Acidithiobacillus ferrooxidans, an acidophile organism.Roger, Magali 29 April 2015 (has links)
Les protéines à cuivre jouent un rôle crucial dans de nombreux processus biologiques essentiels à la vie tels que la respiration. De nombreuses études ont été menées afin de décrypter le lien entre la structure de leur centre actif, les propriétés électroniques qui en découlent et la fonction de ces protéines.Les travaux réalisés au sein du laboratoire sur l’étude de la chaîne respiratoire d’un organisme acidophile, A. ferrooxidans, ont permis de mettre en évidence une protéine à cuivre (AcoP), appartement à la vaste famille des cuprédoxines, indispensable au fonctionnement de cette voie. Une approche pluridisciplinaire mêlant des méthodes de spectroscopies, d’électrochimie, de cristallographie aux rayons X combinée à des expériences de mutagénèse dirigée, a permis de dévoiler la présence d’un centre cuivre atypique associé à des propriétés électroniques et d’oxydoréduction rarement retrouvées au sein de cette vaste famille. Le rôle d’une telle protéine au sein de la chaîne respiratoire d’A. ferroxidans a par la suite fait l’objet de notre attention. AcoP interagit avec le cytochrome c et l’enzyme terminale de la chaîne respiratoire, la cytochrome c oxydase. L’étude du complexe cytochrome c – AcoPcytochrome c oxydase nous a permis de proposer un rôle d’AcoP dans le recrutement du cytochrome c au sein de ce complexe, ainsi que dans le transfert d’électron entre ces deux partenaires. Ces travaux de recherche démontrent que l’étude de la biodiversité permet non seulement la découverte de nouveaux systèmes permettant la vie dans des environnements extrêmes, mais également la découverte de nouvelles protéines aux propriétés remarquables. / Copper proteins play key roles in many biological processes, such as in respiratory chains. Although many studies have been carried out to decipher the relationship between their active site structure, electronic properties and function, these features are still not fully understood. Previous studies on the respiratory chain of an acidophilic organism, Acidithiobacillus ferrooxidans, have revealed the presence of a new copper-binding protein: AcoP. This cupredoxin is critical for the correct functioning of this respiratory pathway. Using site-directed mutagenesis and a wide-range of biophysical approaches, electrochemistry and X-ray crystallography, we can show that an unconventional copper-active site in AcoP might underlie its rare electronic and redox features. The function of such a protein in the respiratory chain of A. ferrooxidans has subsequently raised our curiosity. It was shown that AcoP interacts with cytochrome c and the cytochrome c oxidase. We showed that AcoP could act as a linker between the cytochrome c and the cytochrome c oxidase, by recruiting the former, and could also participate in the electron transfer between these two partners. This work shows how exploring biodiversity leads to the discovery of new systems that allow life in extreme environments, as well as of new proteins with remarkable features.
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Structure et interactions de la lysyl oxydase et de fragments de la matrice extracellulaire / Structure and interactions of lysyl oxidase and extracellular matrix fragmentsVallet, Sylvain D. 14 December 2018 (has links)
La matrice extracellulaire est un réseau tridimensionnel complexe qui joue le rôle de support aux cellules ainsi que de réservoir de molécules bioactives régulant le comportement cellulaire. Elle est composée de 1027 protéines chez l’Homme (Naba et al., Matrix Biol. 2016), 274 protéines constituant le matrisome et 753 associées (facteurs de croissance et protéines régulatrices de la matrice extracellulaire) et de 6 glycosaminoglycanes dont 5 sulfatés. La matrice extracellulaire est impliquée dans de nombreuses pathologies (Bonnans et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2014). La lysyl oxydase, responsable de la réticulation des collagènes et de l’élastine est impliquée dans de nombreux cancers. La matrice extracellulaire est un réservoir de fragments bioactifs, nommés matricryptines, qui sont libérés par protéolyse des biomolécules de la matrice et régulent de nombreux processus biologiques tels que l’angiogenèse et l’adipogenèse (Ricard-Blum et Vallet Matrix Biol. 2017). Nous avons exprimé en cellules humaines plusieurs matricryptines dont les ectodomaines des collagènes membranaires XIII, XVII, XXIII et XXV et identifié leurs partenaires extracellulaires. Nous avons caractérisé le propeptide de la lysyl oxydase par SEC-MALS, diffusion dynamique de la lumière et par SAXS et avons modélisé à partir des données de SAXS sa structure tridimensionnelle. Nous avons identifié 17 nouveaux partenaires de ce fragment et analysé le mutant Arg158Gln dépourvu d’activité biologique. Cette mutation identifiée chez l’Homme inhibe les activités anti-prolifératives du propeptide et est associée à un risque accru de cancer du sein (Min et al., Cancer Res. 2009). Nous avons exprimé la lysyl oxydase mature et modélisé sa structure tridimensionnelle en utilisant toutes les données disponibles. Les interactions identifiées au cours de ce travail ont été associées à celles obtenues par curation manuelle de la littérature pour construire la première version de l’interactome extracellulaire humain / The extracellular matrix is an intricate tridimensional network supporting cells and a bioactive molecule reservoir involved in the regulation of cell behavior. It is composed of 1027 proteins in humans (Naba et al., Matrix Biol. 2016), including 274 of the core matrisome and 753 associated proteins (growth factors and extracellular matrix regulators) and 6 glycosaminoglycans including 5 sulfated. The extracellular matrix is altered in numerous pathologies (Bonnans et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2014). The lysyl oxidase is responsible for the cross-linking of collagens and elastin and is involved in many cancers. The extracellular matrix is a reservoir of bioactive fragments named matricryptins which are released by proteolysis of extracellular matrix proteins and regulate numerous biological processes like angiogenesis and adipogenesis (Ricard-Blum et Vallet, Matrix Biol. 2017). We have expressed under a recombinant form in human cells some matricryptins including the ectodomains of the membrane collagens XIII, XVII, XXIII and XXV and have identified their extracellular partners. We have characterized the propeptide of lysyl oxidase by SEC-MALS, dynamic light scattering, and SAXS and have built a coarse-grained 3D model by SAXS-derived constraints. We have identified 17 new partners of this fragment and analyzed the mutant Arg158Gln which has no biological activity. This mutation has been identified in humans and inhibits the propeptide anti-proliferative properties. It is associated to an increased risk of breast cancer (Min et al., Cancer Res. 2009). We have expressed the mature lysyl oxidase and modelled its tridimensional structure using available data. All the interactions identified in this study were associated to manually curated interactions described in the literature to build the first version of the human extracellular interactions network
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Imagerie quantitative de l'assemblage de la NADPH oxydase des phagocytes en cellules vivantes par des approches FRET-FLIM / Imaging the assembly of the phagocyte NADPH oxidase in live cells - a quantitative FRET-FLIM approachZiegler, Cornelia 14 March 2016 (has links)
La NADPH oxydase des phagocytes (NOX2) est responsable de la production d’anions superoxydes qui sont les précurseurs des autres formes réactives de l’oxygène. NOX2 est une enzyme majeure de la réponse immunitaire. Les dysfonctionnements de NOX2 sont associés à de nombreuses pathologies et donc il convient d’en comprendre les détails de la régulation. Cette oxydase est composée de cinq sous-unités : deux protéines membranaires, gp91phox et p22phox et 3 protéines cytosoliques p47phox, p67phox et p40phox. D’après les études in vitro avec des protéines purifiées, les protéines cytosoliques sont supposées former un complexe ternaire qui se déplace à la membrane avec une petite protéine G, Rac, au moment l’activation.L’objectif de ce projet est de caractériser les interactions spécifiques entre les sous-unités cytosoliques de NOX2 en cellules vivantes en utilisant le phénomène de transfert résonant d’énergie de type Förster (FRET) entre deux fluorophores, un donneur et un accepteur. Ici les fluorophores seront des protéines fluorescentes de la famille de la GFP. Elles sont fusionnées à deux sous-unités. L’efficacité du FRET dépend de la distance entre les fluorophores et permet ainsi de caractériser les interactions entre les protéines d’intérêt. Une méthode rapide d’identification des situations où le FRET est positif a été mise au point par cytométrie en flux. Des études détaillées et quantitatives ont ensuite été réalisées en utilisant l’imagerie de durée de fluorescence (FLIM) du donneur. Le FLIM, combiné à l’utilisation de donneurs présentant une durée de vie mono-exponentielle, permet de déterminer directement des efficacités de FRET apparentes et moléculaires, qui contiennent, toutes les deux, des informations qualitatives et quantitatives sur l’interaction et la structure des protéines impliquées. De ces données, il est possible d’extraire la fraction des donneurs interagissant avec un accepteur. Les informations obtenues à partir des données de FRET-FLIM permettent une meilleure compréhension de l’organisation et de la régulation de NOX2 tout en permettant une estimation des constantes de dissociation (Kd). Afin de confirmer ces résultats, des expériences de spectroscopie de corrélation de fluorescence à deux couleurs (FCCS) ont été réalisées. Cette méthode complétement indépendante n’est pas basée sur la distance entre fluorophores comme le FRET mais sur leur co-diffusion à travers un petit volume d’observation dans le cytoplasme cellulaire.L’approche FRET-FLIM nous a tout d’abord permis d’observer les interactions entre hétéro-dimères formés de deux sous-unites différentes en cellules vivantes et d’exclure la formation d’homo-dimères entre deux sous-unités identiques. Etant donné la bonne précision des mesures de FLIM, nous avons pu comparer les informations structurales obtenues en cellules avec les données structurales issues d’études sur les protéines purifiées in vitro et nous avons constaté qu’elles sont en bon accord. Nous avons ensuite aligné les structures disponibles pour proposer un premier modèle 3D du complexe cytosolique de la NADPH oxydase au repos dans le cytosol cellulaire.Les fractions de protéines en interaction sont pour tous les hétéro-dimères autour de 20% ce qui n’est pas en accord avec l’hypothèse courante qui propose que toutes les sous-unités cytosoliques soient sous forme de complexe. Toutefois nos premiers résultats de FCCS confirment ce résultat extrait des données de FRET-FLIM. Nous proposons donc que la complexation des sous-unités cytosolique pourrait être impliquée dans la régulation de la NADPH oxydase. Des études complémentaires seront nécessaires pour valider cette nouvelle hypothèse. Les constantes de dissociation Kd estimées à partir de nos résultats sont micromolaires et donc un ordre de grandeur plus élevé que les valeurs nanomolaires déterminées in vitro. Des mesures plus détaillées de FCCS pourront compléter et valider ces résultats. / The phagocyte NADPH oxidase (NOX2) is a key enzyme of the immune system generating superoxide anions, which are precursors for other reactive oxygen species. Any dysfunctions of NOX2 are associated with a plethora of diseases and thus detailed knowledge about its regulation is needed. This oxidase is composed of five subunits, the membrane-bound gp91phox and p22phox and the cytosolic p47phox, p67phox, and p40phox. The latter are assumed to be in a ternary complex that translocates together with the small GTPase Rac to the membranous subunits during activation.Our aim was to discover and to characterize specific interactions of the cytosolic subunits of NOX2 in live cells using a Förster Resonance Energy Transfer (FRET) based approach: Since FRET depends on the distance between two fluorophores, it can be used to reveal protein-protein interactions non-invasively by studying fluorescent protein tagged subunits. To have a rapid method on hand to reveal specific interactions, a flow cytometer based FRET approach was developed. For more detailed studies, FRET was measured by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), because it allows a direct determination of the apparent and molecular FRET efficiency, which contains both qualitative and quantitative information about the interaction and the structure of the interacting proteins. Furthermore, the FRET-FLIM approach enables an estimation of the fraction of bound donor. This information itself is important for a better understanding of the organisation and regulation of the NOX2, but it is also necessary for the calculation of the dissociation constant Kd from the FRET-FLIM data. To confirm the findings obtained by FRET-FLIM fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) experiments were performed. This completely independent method is not based on distances like FRET but on the observation of the co diffusion of the fluorescently labelled samples when they move across a small observation volume inside the cells.The FRET-FLIM approach allowed us in a first step to discover heterodimeric interactions between all cytosolic subunits in live cells. Due to the good precision of the results, we were able to extract structural information about the interactions and to compare them with available structural data obtained from in vitro studies. The information from FRET-FLIM was coherent with in vitro data. We then aligned the available structures leading to the first 3D model of the cytosolic complex of the NADPH oxidase in the resting state in live cells.Additionally, the bound fraction for all heterodimeric interactions derived by FRET-FLIM is around 20 %, which is in contrast to the general belief that all cytosolic subunits are bound in complex. The first FCCS results support our findings. Therefore, we believe that the complexation of the cytosolic subunits could be involved in the regulation of the NADPH oxidase and should be investigated further. The estimated Kd derived from the FRET-FLIM approach is in the low micomolar range, which is an order of a magnitude higher than the nanomolar range of in vitro studies.In conclusion, we showed that our quantitative FRET-FLIM approach is not only able to distinguish between specific and unspecific protein-protein interactions, but gives also information about the structural organisation of the interacting proteins. The high precision of the FRET-FLIM data allow the determination of the bound fraction and an estimation of the Kd in live cells. FCCS is a complementary method, which can verify these quantitative findings. However, it cannot replace FRET-FLIM completely as it does not give any structural information.With respect to the biological outcome of this project, we can propose for the first time a 3D-model of the cytosolic complex of the NADPH oxidase covering the in vitro as well as the live cell situation. Additionally, the small bound fraction found here may raise new ideas on the regulation of this vital enzyme.
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Mesures de l'activité de l'enzyme NADPH oxydase du neutrophile (NOX2) en système compartimenté et mise au point de protéoliposomes géants pour l'étude concertée de son assemblage et de sa fonction / Neutrophil NADPH oxidase enzyme (NOX2) activity measurements in compartmented system and development of giant proteoliposomes for the concerted study of its assembly and its functionSerfaty, Xavier 01 October 2018 (has links)
La métalloenzyme multimérique membranaire NADPH oxydase du neutrophile (NOX2), est impliquée dans plusieurs fonctions physiologiques vitales incluant la réponse immunitaire, en contribuant fortement à la destruction des pathogènes ou autres envahisseurs du corps humain. Les fonctions physiologiques de NOX2 sont assurées par sa fonction chimique de catalyseur de la production d’anions superoxyde via la réduction monoélectronique du dioxygène à une face de la membrane, simultanément à l’oxydation biélectronique du NADPH à l’autre face de la membrane. L’étude des caractéristiques biochimiques de l’enzyme entière, incluant ses mécanismes d’activation et de régulation, en lien avec l’assemblage macromoléculaire, est réalisée in vitro en utilisant des fractions membranaires de neutrophile (FM), petites vésicules contenant NOX2, ainsi que les protéines cytosoliques recombinantes (p67phox, p47phox et Rac1/2) indispensables à sa fonction, en présence d’une molécule activatrice comme l’acide arachidonique (AA), un acide gras. La technique historiquement privilégiée de mesure de l’activité enzymatique de NOX2 implique la détection des anions superoxyde par une sonde protéique, le Cytochrome c (Cytc). Dans ce système, les anions superoxyde, dont la production est catalysée par NOX2 vers l’intérieur des vésicules de FM, sont détectés à l’extérieur. En corrélation avec la littérature, ces recherches montrent que l’activité enzymatique déterminée via la détection des anions superoxyde par le Cytc est plus faible que lorsqu’elle est déterminée via la mesure de la consommation du NADPH. L’origine du problème inclut potentiellement des contraintes de perméabilité membranaire, de structure de la membrane et des protéines, d’interactions des protéines entre-elles et avec les lipides membranaires, de pertinence de la sonde utilisée et de réactions secondaires. Ces hypothèses ont été testées par différents moyens incluant notamment des mesures de cinétiques globales et de l’activité de NOX2 dans différentes conditions et avec différentes observables (NADPH, Cytc, dioxygène), en présence de détergent ou d’ionophore, en faisant varier la température de mesure, la concentration en Cytc, la concentration en substrat, la concentration en AA ou le temps de préincubation. La présence de réactions secondaires a également été testée par électrochimie. Cette étude montre que la mesure de la production des anions superoxyde est limitée par la perméabilité membranaire et par les réactions secondaires. Il a aussi été mis en exergue que la concentration en Cytc usuelle pour ces mesures n’est pas saturante et de façon inattendue que les FM catalysent intrinsèquement la dismutation du peroxyde d’hydrogène à l’aide d’un composant thermolabile. Il est aujourd’hui très compliqué de mesurer de façon concomitante l’activité de la NADPH oxydase et son assemblage. Le deuxième objectif de cette thèse était donc la mise au point de vésicules géantes unilamellaires (GUV) intégrant NOX2 dans leur membrane, ce qui permettrait d’observer par microscopie de fluorescence l’assemblage du complexe NADPH oxydase et de simultanément mesurer la production des anions superoxyde par électrochimie sous microscope. La formation de GUV possédant des FM (FM-GUV) à leur membrane est un succès mais sans confirmation de l’intégration de NOX2 à la membrane des GUV. L’assemblage des protéines cytosoliques à la face externe de la membrane a été étudié sur GUV et sur FM-GUV, ce qui a permis de montrer que l’ancrage membranaire de ces protéines est possible seulement en présence d’AA et dû de façon prépondérante aux lipides et que NOX2 joue un rôle minoritaire. L’étude des interactions entre les protéines cytosoliques et la face interne de la membrane des GUV reste à optimiser. Il a été possible de détecter en GUV qualitativement une activité de NOX2 par électrochimie et par fluorescence (Amplex-Red), mais ce point reste aussi à optimiser. / The membrane multimeric metalloenzyme NADPH oxidase (NOX2) from neutrophil is implied in several essential physiological functions including the immune response, by strongly contributing to the destruction of pathogens or other invaders of the human body. Physiological functions of NOX2 are fulfilled by its chemical function of catalyst of superoxide anion production via the monoelectron dioxygen reduction on one face of the membrane, simultaneously to the NADPH bielectron oxidation on the other face of the membrane. Studies of biochemical features of the whole enzyme, including its activation and regulation mechanisms linked to the macromolecular assembly, is done in vitro by using neutrophil membrane fractions (MF), which are small vesicles containing NOX2, and by using the recombinant cytosolic proteins (p67phox, p47phox, p40phox and Rac1/2) essential for its function, in presence of an activator molecule such as arachidonic acid (AA), a fatty acid. The historical technics to measure the NOX2 enzyme activity is the superoxide anion detection by a protein probe, the Cytochrome c (Cytc). In this system, NOX2 catalyses the production of superoxyde anions towards the inside of MF vesicles and the superoxide anions are detected outside. In correlation with literature, the present research shows that the enzyme activity determined via the detection of superoxide anions by the Cytc is lower that the activity determined from NADPH consumption measurement. The source of the problem includes potentially constraints of membrane permeability, of membrane and protein structure, of protein-protein and protein-membrane interactions, of the relevance of the probe and of secondary reactions. These hypotheses have been tested by various means including notably global kinetics measurements and NOX2 activity measurements in various conditions with three different observables (NADPH, Cytc, dioxygen), in presence of detergent or ionophore, by varying temperature, Cytc concentration, substrate concentration, AA concentration or still preincubation time. Secondary reactions existence has also been probed by electrochemistry. This study shows that the measurement of the superoxide anion production is limited by membrane permeability and secondary reactions and that the usual Cytc concentration is non-saturating, and unexpectedly that the MF catalyses the disproportionation of hydrogen peroxide by a thermolabile component. It is currently very hard to measure simultaneously the NADPH oxidase activity and the assembly of the whole complex. The second objective of my thesis was consequently to develop giant unilamellar vesicles (GUV) with NOX2 integrated into their membranes. This to be able to observe the complex assembly by fluorescence microscopy and simultaneously to measure the superoxide anion production by electrochemistry under microscope. The development of GUV with MF at the membrane (MF-GUV) has been successful, but without confirmation of NOX2 integration in the GUV membrane. The assembly of cytosolic proteins on the external face of the membrane was studied on GUV and on MF-GUV, leading to the discovery that membrane anchor of these proteins is possible only in presence of AA and is mostly due to lipids, NOX2 playing a minor role. Study of interactions between cytosolic proteins and internal face of the GUV membrane must be optimised. It was possible in GUV to detect qualitatively NOX2 activity by electrochemistry and by fluorescence, (Amplex-Red), but this point should still be optimised.
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Etude de l’implication de la NADPH oxydase NOX4 et du stress oxydatif dans la radiorésistance des cancers papillaires de la thyroïde exprimant l’oncogène BRAFV600E / The Study of the Involvement of NADPH Oxidase NOX4 and Oxidative Stress in the Radioresistance of Papillary Thyroid Cancers Harboring BRAFV600E OncogeneAzouzi, Naima 19 November 2016 (has links)
Une des propriétés majeures de la thyroïde est de capter l’iode de la circulation sanguine grâce à la présence d’un transporteur d’iodure (NIS pour Natrium Iodide Symporter). Cette capacité d’accumulation d’iode par les thyrocytes joue un rôle clé dans la synthèse des hormones thyroïdiennes ainsi dans le diagnostic et le traitement des cancers de la thyroïde. Cependant, en raison d’une diminution ou de l’absence de l’expression du NIS dans certaines tumeurs et métastases, des patients deviennent réfractaires à la radiothérapie métabolique et présentent une radiorésistance, causant ainsi un problème de santé publique.L’oncogène BRAFV600E, un puissant activateur de La voie MAP kinase, est détecté dans 40 - 60% des cancers thyroïdiens de type papillaires (CPT) qui représentent 80% de la totalité des cancers thyroïdiens. La mutation BRAFV600E est associée aux tumeurs thyroïdiennes les plus agressives. Cependant l’inhibition pharmacologique de la voie MAP kinase induite constitutivement par l’oncogène BRAFV600E ne permet pas, à elle seule, de rétablir l’expression du NIS chez des patients atteints d’un cancer de la thyroïde muté BRAFV600E. Ceci suggère que d’autres mécanismes compensatoires peuvent contribuer à la radiorésistance. Une étude récente menée sur un modèle murin a montré que la régulation négative du NIS par l’oncogène BRAFV600E est médiée par la voie du TGF beta. Une autre a montré que l’expression du NIS serait dépendante de l’état redox de la cellule, suggérant un rôle des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Dans les cellules les ROS peuvent être produites par les NADPH oxydases (NOX/DUOX). La thyroïde en exprime trois : DUOX2 nécessaire à la synthèse des hormones thyroïdiennes ainsi que DUOX1 et NOX4 dont le rôle physiologique reste inconnu. NOX4, surexprimé dans les CPTs, a été montré être un nouvel effecteur clé de la voie du TGF beta dans d’autres cancers.Dans mon projet de thèse, je me suis intéressée à l’étude du rôle de NOX4 dans la régulation négative du NIS dans les CPT mutés BRAFV600E. L’étude du mécanisme, réalisée à partir de deux lignées humaines issues de cancers papillaires mutés pour BRAF (BCPAP et 8505C), a permis d’établir que l’oncogène BRAFV600E contrôle l’expression de NOX4 au niveau transcriptionnel via la voie TGF-beta/Smad3. Ces résultats ont été validés sur une lignée de rat exprimant de manière conditionnelle BRAFV600E ainsi que sur des thyrocytes humains en culture primaire. De manière importante, l’utilisation d’antioxydants tels que le N-acetyl cystéine (NAC) ou l’inhibition spécifique de l’expression de NOX4 par ARN interférence permet de réinduire l’expression du NIS. Ces résultats qui montrent que les ROS produites par NOX4 inhibent l’expression du transporteur de l’iode (NIS) établissent un lien entre l’oncogène BRAFV600E et NOX4. Une analyse comparative de l'expression de NOX4 effectuée à partir de 500 cancers papillaires de la thyroïdes mutés ou non pour BRAF (données TCGA) confirme que NOX4 est significativement augmenté dans les cancers porteurs de la mutation BRAF et que ceci est corrélé à une diminution de l’ARNm du NIS. Par ailleurs, le niveau de NOX4 est inversement corrélé au score de différenciation thyroïdien, suggérant que NOX4 pourrait être impliqué dans le processus de dédifférenciation. Cette étude ouvre une nouvelle opportunité pour l’optimisation de l’utilisation de la radiothérapie métabolique dans le traitement des cancers thyroïdiens réfractaires à l’iode I131 et présente NOX4 comme une cible thérapeutique potentielle. / One of the major properties of the thyroid is iodine uptake from the bloodstream through an iodide transporter (NIS for Natrium Iodide Symporter). This capacity plays a key role in the thyroid hormones synthesis, but also in both diagnosis and treatment of thyroid cancer. However, due to a decrease or absence of the NIS expression in some tumors and metastases, patients become refractory to the metabolic radiotherapy and present a radioresistance, which cause a public health problem.The BRAFV600E oncogene, a potent activator of the MAP kinase pathway, is detected in 40-60% of papillary thyroid cancer (PTC), which represent 80% of total thyroid cancers. The BRAFV600E mutation is associated with the more aggressive thyroid tumors. However, the pharmacological inhibition of the MAP kinase pathway, constitutively induced by the BRAFV600E oncogene, is not able to restore alone the expression of NIS in patients with BRAFV600E mutated thyroid cancer. This suggests that other compensatory mechanisms may contribute to the radioresistance. A recent study in a mouse model demonstrated that downregulation of NIS by BRAFV600E oncogene is mediated through the TGF beta activation. An other showed that the expression of NIS is dependent on the redox status of the cell, suggesting a role for the reactive oxygen species (ROS). In cells, ROS can be produced by the NADPH oxidases (NOX/DUOX). The Thyroid gland expresses three of them: DUOX2, which is necessary for the thyroid hormones synthesis, but also DUOX1 and NOX4 whose the physiological role remains unknown. NOX4, which is overexpressed in the PTCs, has been shown to be a new key effector of the TGF beta pathway.In my thesis project, I was interested in studying the role of NOX4 in the negative regulation of NIS in BRAFV600E mutated CPT. The study of the mechanism, made from two human cell lines derived from BRAF-mutated papillary thyroid cancers (BCPAP and 8505C), has revealed that the oncogene BRAFV600E controls the expression of NOX4 at the transcriptional level via the TGF-beta/Smad3 pathway. These results were validated on both a rat thyroid cell line conditionnaly expressing BRAFV600E and on human thyrocytes in primary culture. Importantly, the use of antioxidants such as N-acetyl cysteine (NAC) or specific inhibition of NOX4 expression by RNA interference allow reinduction of NIS expression. These results, which show that ROS produced by NOX4 inhibit the expression of iodine transporter (NIS), establish a link between the oncogene BRAFV600E and NOX4. A comparative analysis of the NOX4 expression, made from 500 papillary thyroid cancers mutated or not for BRAF (TCGA data), confirms that NOX4 is significantly increased in BRAF-mutated cancers and that this is correlated with a decrease of NIS mRNA. Furthermore, the level of NOX4 is inversely related to thyroid differentiation score, suggesting that NOX4 might be involved in the dedifferentiation process. This study opens a new opportunity for optimizing the use of metabolic radiotherapy in the treatment of thyroid cancers refractory to radioiodine I131and makes NOX4 as a potential therapeutic target.
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Caractérisation des gènes cytochrome oxydase (I, II et III) ainsi que des 22 ARN de transfert mitochondriaux dans la maladie d'AlzheimerChagnon, Pierre 09 1900 (has links)
Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative caractérisée par la détérioration progressive et irréversible de toutes les facultés intellectuelles. Les récents développements scientifiques, et en particulier les apports de la génétique moléculaire, ont permis des avancées considérables dans la compréhension de l'étiologie de cette maladie. En fait, il s'agit d'une maladie dont les causes, tant environnementales que génétiques, sont nombreuses. Malgré ces progrès remarquables, les causes précises de la majorité des cas de MA demeurent en cette année 1999, inconnues. Il faut en déduire que d'autres facteurs restent à être identifiés. Plusieurs indices biochimiques et génétiques suggèrent qu'une anomalie mitochondriale pourrait être impliquée dans le développement de la MA. Ainsi, on rapporte que l'activité de l'un des maillons de la chaîne respiratoire mitochondriale (complexe cytochrome oxydase) est diminuée en comparaison d'individus normaux du même âge. La littérature scientifique suggère très fréquemment que le génome mitochondrial pourrait être la cause de ce déficit enzymatique. Cependant, aucune publication n'a pu jusqu'à ce jour lever le voile sur le rôle exact que joue ce génome dans la MA. Pour cette raison, nous avons amorcé un programme de recherche ayant pour but premier d'étudier la séquence de l'ADN mitochondrial (ADNmt) d'un nombre important de patients et de témoins provenant, pour la grande majorité, de la population fondatrice du Saguenay-Lac-St-Jean. Notre objectif était de déterminer si le déficit de l'activité cytochrome oxydase (CO) était associé à des variations de l'ADNmt situées dans les gènes pouvant affecter directement l'activité de cette enzyme (gènes COI, COII, COIII et les 22 ARN de transfert mitochondriaux). Avant de débuter l'analyse du génome mitochondrial, nous avons mesuré l'activité CO dans différentes régions du cortex cérébral de patients décèdes de la MA et comparé l'activité mesurée à celle d'individus normaux ou décèdes suite au développement d'une autre maladie neurodégénérative (démence à corps de Lewy, maladie de Parkinson ou démence cérébrovasculaire). Ainsi, nous avons démontré que l'activité CO était significativement diminuée dans le cortex frontal et pariétal des patients Alzheimer. Par contre, nous ignorons pourquoi certaines régions cérébrales, comme l'hippocampe qui est une structure très affectée par la MA, présentent une activité CO comparable à celle des témoins. D'autres part, nous avons observé que les patients Alzheimer de type sénile ayant une durée de maladie très courte ont une activité CO dans le cortex frontal et pariétal encore plus faible que ceux qui sun/ivent plus de dix ans à la maladie. Comme le niveau d'activité CO est un reflet de l'activité neuronale, on ne peut dire si cette diminution de fonction du complexe CO est réellement impliquée dans le développement de la MA ou si elle n'en est qu'une conséquence. Pour pouvoir incriminer ce déficit enzymatique, il faudrait pouvoir l'associer à une ou plusieurs anomalies génétiques, comme c'est le cas dans les cytopathies mitochondriales. Puisque le complexe CO est composé d'unités codées par le génome nucléaire et mitochondrial, la cause du déficit enzymatique pourrait se situer à l'intérieur de l'un de ces deux génomes. Pour notre étude, nous avons analysé toutes les régions du génome mitochondrial pouvant influencer le niveau d'activité de cette enzyme. C'est-à-dire les trois gènes indispensables à la formation du complexe CO (CO l, II et III) ainsi que les 22 ARN de transfert mitochondriaux (ARNt) qui servent à leur traduction. Au total, nous avons détecté la présence de 95 variations différentes à l'intérieur du génome mitochondrial de 69 patients Alzheimer et de 83 individus témoins. Ce qui ressort essentiellement de cette analyse génétique, c'est qu'il n'y a pas de différence majeure dans la séquence de l'ADNmt (gènes CO l, II, III et les 22 ARNt) entre les patients et les témoins. Nous pouvons donc affirmer que la baisse d'activité CO observée dans le cortex cérébral de la majorité des patients Alzheimer n'est pas causée directement par une anomalie de ces gènes mitochondriaux. En conséquence, l'hypothèse voulant que le génome mitochondrial soit la cause de ce déficit enzymatique et qu'il ait un rôle dans la MA est rejetée. Il existe seulement deux autres possibilités principales qui pourraient expliquer l'origine de ce déficit enzymatique. Soit que l'un des gènes nucléaires impliqués dans la formation ou le fonctionnement du complexe CO est défectueux ou finalement soit que cette diminution d'activité CO ne résulte que d'une adaptation de la chaîne respiratoire à une diminution importante de l'activité synaptique et du métabolisme cellulaire dans le cortex des patients Alzheimer. Néanmoins, nous ne pouvons pas totalement exclure la possibilité que l'ADNmt soit impliqué dans l'étiologie de la MA. En effet, nous avons observé qu'un nombre restreint de sujets sont porteurs de variations que l'on retrouve uniquement chez les individus qui ont développé la MA. Cependant, puisque ces variations sont relativement rares, elles ne sont certainement pas la cause du déficit CO présent chez la majorité des patients. Une de ces variations est un haplotype composé des polymorphismes situés aux positions 5633 (ARNtA'a), 7476 (ARNtSer) et 15812 (cytochrome b) que l'on a détecté chez 4,7% des patients mais chez aucun des 83 témoins. Étant donné que l'une de ces variations (15812) est déjà associée à une autre maladie neurodégénérative, que ces trois modifications sont modérément conservées et que leur fréquence dans différentes populations a été établie à environ 0,1%, nous pensons que la présence de cet haptotype pourrait représenter un risque de développer la MA. Il est donc possible que cette anomalie de l'ADNmt explique un faible pourcentage des cas de MA. Cependant, cette affirmation n'est pour l'instant que spéculative et ne serrait vérifiée que lorsque d'autres groupes de recherche auront confirmé ou infirmé cette association. D'autres résultats ont également été obtenus concernant, entre autres, 2 modifications de l'ADNmt qui avaient déjà été associées à la MA dans des études antérieures. Nous avons détecté ces deux variations (4336/ARNtQ et 5460/ND2) aussi bien chez les patients que chez les témoins; elles ne sont donc pas associées à la MA, du moins pas dans notre population. Par ailleurs, le troisième article (Chagnon étal., 1999) de la section résultat de cette thèse, rapporte que nous avons observé une différence significative (p Dans la dernière portion de notre étude, nous avons mesuré le taux de mutations somatiques (mutations ponctuelles qui s'accumulent au cours de la vie d'un individu) de plusieurs sujets et démontré qu'il n'y a pas plus de mutagenèse dans le gène COIII de l'ADNmt chez les patients que chez les témoins. Ce mécanisme, souvent cité dans la littérature pour sa participation au phénomène du vieillissement cellulaire, ne serait pas la cause du déficit CO et ne jouerait aucun rôle dans l'étiologie de la MA. En conclusion, cette étude du génome mitochondrial a nécessité l'analyse de la séquence de près de 10 kb d'ADN chez plus de 150 individus (au total, plus de 1 million de nucléotides analysés). Malgré l'ampleur de cette tâche, nous savions dès le départ que cette étude complète des trois gènes CO et des 22 ARNt mitochondriaux était, en quelque sorte, préliminaire. En effet, comme la MA est une maladie complexe et que les gènes connus faisant partie de son étiologie n'expliquent qu'un faible pourcentage de cas Alzheimer, il était peu probable de trouver un gène muté pouvant expliquer une majorité de cas. Le mieux que nous pouvions espérer était d'identifier des variations présentes chez certains patients mais pas chez les témoins. Le problème avec ce type de résultats, c'est qu'il est pratiquement impossible d'arriver à des conclusions fermes. Ainsi, pour l'haplotype que nous avons détecté chez un certain nombre de patients, il faudra attendre la confirmation de d'autres études ultérieures pour conclure définitivement de son implication dans la MA. -2- Quoi qu'il en soit, cette étude a déjà atteint un objectif très important puisque nous savons maintenant que les trois gènes CO et les 22 ARNt mitochondriaux, qui étaient des gènes candidats importants, ne sont pas la cause du déficit CO qui est observé chez la majorité des patients Alzheimer.
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Régulation de la voie Jak/STAT par les récepteurs couplés aux protéines G : rôle des petites protéines G de la famille RhoPelletier, Stéphane January 2003 (has links)
Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.
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Rôle du 4-hydroxynonénal dans la régulation du métabolisme des chondrocytes arthrosiquesCôté, Véronique January 2007 (has links)
Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.
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