Les reins sont les organes cibles de nombreuses molécules toxiques. Les cellules épithéliales du tubule proximal rénal sont particulièrement vulnérables vis-à-vis de xénobiotiques utilisés comme médicaments ou non. Ces agressions peuvent être corrélées à une augmentation du stress oxydatif et induire la mort cellulaire. Elles peuvent également mener à la perte des caractéristiques phénotypiques des cellules épithéliales, initiant leur dédifférenciation en cellules mésenchymateuses et éventuellement en fibroblastes, principaux responsables de la fibrose rénale.<p>Les stratégies de protection – notamment implémentées en clinique lors de l'administration de médicaments néphrotoxiques – reposant sur une approche pharmacologique restent rares.<p>A partir de données de médecines traditionnelles, nous avons sélectionné une série de plantes considérées utiles pour le traitement ou la prévention de troubles associés aux maladies rénales :Angelicae sinensis radix, Eleutherococci radix, Ginseng radix, Schisandrae chinensis fructus et Silybi mariani fructus.<p>A l'aide d'un modèle in vitro reposant sur l'emploi de la lignée cellulaire HK-2, nous avons examiné si ces produits pouvaient apporter une protection efficace vis-à-vis de 3 xénobiotiques néphrotoxiques :les acides aristolochiques, le cisplatine et la ciclosporine. Cinq phénomènes impliqués dans la néphrotoxicité et couramment retrouvés lors du développement de la fibrose rénale ont été investigués :(i) la mortalité cellulaire et l'apoptose ;(ii) la génération de stress oxydatif ;(iii) la modulation des capacités de régénération ;(iv) la production de matrice extracellulaire ;et (v) l'activation de la voie de signalisation de la β-caténine. <p>Parmi les 5 plantes étudiées sur ce modèle, celle présentant l'activité la plus intéressante vis-à-vis de l'un des 3 toxiques a été investiguée plus en détails afin d'identifier le(s) composé(s) responsable(s) de sa bioactivité. Les résultats ont indiqué que l'extrait méthanolique d'Angelica sinensis était le plus efficace pour réduire la néphrotoxicité induite par le cisplatine. Ces principes actifs – l'acide férulique, le Z-ligustilide et le E-ligustilide – ont été testés selon la même méthodologie. <p>L'acide férulique a été le plus efficace pour améliorer la survie cellulaire et diminuer l'apoptose induite par le cisplatine. Il a également permis de réduire la production de matrice extracellulaire, de stimuler les capacités de régénération de cellules saines et d'inhiber partiellement la voie de signalisation de la β-caténine. Il n'a toutefois pas été capable de limiter la génération de stress oxydatif induite par le traitement au cisplatine. <p>L'acide férulique semble être un candidat prometteur pour protéger les tubules rénaux vis-à-vis du cisplatine et pourrait contribuer à limiter l'initiation et le développement de la fibrose rénale. <p>/<p>The kidneys are targets of numerous toxic compounds. Proximal tubular epithelia cells are particularly vulnerable to xenobiotics used as drugs or not. These injuries can be associated with an increased oxidative stress and can trigger cell death. They can also lead to the loss of phenotypic characteristics of epithelial cells and initiate their dedifferentiation in mesenchymal cells, eventually evolving in fibroblasts, major actors responsible for renal fibrosis. <p>Protective strategies – including those implemented in clinical practice during the administration of nephrotoxic drugs – relying on a pharmacological approach remain seldom.<p>By means of data issuing from traditional medicines, we selected a series of herbs potentially useful for the treatment or prevention of troubles associated with kidney diseases: Angelicae sinensis radix, Eleutherococci radix, Ginseng radix, Schisandrae chinensis fructus and Silybi mariani fructus.<p>Using an in vitro model based on HK-2 cell line, we examined if these herbal products could bring an effective protection towards 3 nephrotoxic drugs: aristolochic acids, cisplatin and ciclosporin. Five phenomena involved in nephrotoxicity and regularly occurring during the progression of renal fibrosis were investigated: (i) cell death and apoptosis; (ii) oxidative stress generation; (iii) modulation of regeneration capacities; (iv) extracellular matrix production; and (v) β-catenin pathway activation.<p>Among the 5 herbs that were studied, the one presenting the most interesting effects towards one of the 3 toxicants has been investigated in details in order to identify the compound(s) responsible for its bioactivity. Results indicated that the crude methanolic extract of Angelica sinensis was the most potent for reducing cisplatin-induced nephrotoxicity. Its active principles – ferulic acid, Z-ligustilide and E-ligustilide – were tested according to the same methods.<p>Ferulic acid was the most potent compound for improving cell survival and for alleviating cisplatine-induced apoptosis. It also allowed to restrain the extracellular matrix production, enhanced the regeneration capacities of healthy cells and partially inhibited the activation of the β-catenin pathway. It was however ineffective in preventing the generation of oxidative stress induced during cisplatin treatment. <p>Ferulic acid appears as a promising candidate for protecting renal tubules against cisplatin's nephrotoxicity and could contribute to limit the onset and progression of renal fibrosis. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La drépanocytose est, sous sa forme grave, une pathologie très invalidante pour les personnes qui en sont porteuses. Elle est rythmée par la récurrence de crises vaso-occlusives (CVO) et autres symptomatiques qui en découlent (accident vasculaire cérébral, syndrome thoracique aigu, hypertension pulmonaire, etc.). En participant, chez des sujets sains et pathologiques, à la limitation de certains facteurs impliqués dans les CVO (inflammation, adhésion vasculaire, stress-oxydatif), l'entrainement physique régulier pourrait hypothétiquement être bénéfique au sujets drépanocytaires et participer à améliorer leurs qualités de vie. C'est l'hypothèse qui a été étudiée durant ce travail de thèse chez des sujets porteurs du trait drépanocytaire (PTD) puis sur un modèle de souris transgéniques drépanocytaires, les souris SAD. La première étude a permis de montrer que des sujets PTD entrainés présentaient, au repos et en réponse à un exercice incrémental maximal, des concentrations en molécules solubles d'adhérence vasculaire (sVCAM-1) inférieures à celles des sujets PTD sédentaires. Ces concentrations sont par ailleurs comparables à celles de sujets sains. Ce résultat allant dans le sens d'une limitation de l'activation endothéliale par l'entrainement chez les PTD, des études plus poussées ont été réalisées sur les souris SAD. Deux études de caractérisation ont été nécessaires pour mettre en place notre expérimentation sur les souris SAD. La première a permis de valider un protocole de 8 semaines en roue d'activité physique volontaire sur des souris saines C57Bl/6. La deuxième a permis de caractériser le déclenchement de la CVO chez des souris SAD à l'aide d'un protocole d'hypoxie/réoxygénation (H/R) du point de vue de l'inflammation, l'adhérence vasculaire et du stress-oxydatif. Ces deux études ont alors permis la mise en place du dernier protocole de cette thèse : l'entrainement par roue d'activité physique volontaire des souris SAD. Huit semaines d'activité physique ont induit, chez les souris SAD entrainées, une limitation des dysfonctionnements endothéliaux induit par le stress d'H/R et observé chez les souris SAD sédentaires. Cette thèse tend donc à montrer que l'activité physique régulière pourrait être bénéfique pour les souris SAD en limitant certains facteurs impliqués dans la CVO. D'autres études seront nécessaires sur d'autres modèles murins drépanocytaires plus sévères et dans un plus long terme chez l'Homme pour adapter ces conclusions au sujets drépanocytaires / Sickle cell disease is, in its severe form, a very disabling disease. lt is punctuated by recurrent vaso- occlusive crisis (VOC) which may induce other symptomatics (stroke, acute chest syndrome, pulmonary hypertension, etc ...). By participating, in healthy and pathological subjects, in the limitation of some factors involved in the VOC (inflammation, vascular adhesion, oxidative stress), habitual physical training could hypothetically be beneficial in subjects with sickle cell disease and participate in improving their quality of life. This hypothesis has been investigated during this thesis on sickle cell trait (SCT) carriers and on a transgenic sickle mice model, SAD mice. The first study showed that trained SCT carriers displayed, at rest as in response to an incremental and maximal exercise, lower plasma vascular cell adhesion molecules (sVCAM-1) compared to sedentary SCT carriers. Moreover, these concentrations were similar to that of healthy subject. These results confirm a possible limitation of endothelial activation in SCT carriers. This potential benefic effect has further been investigated in sickle SAD mice. Two characterization studies were necessary to establish our experiments on SAD mice: the first permitted to validate a 8 weeks voluntary wheel running (VWR) protocol on healthy C57Bl/6 mice while the second characterized the VOC induced by a hypoxia/reoxygenation (H/R) stress in SAD mice from the inflammation, vascular adhesion molecule and oxidative stress points of view. Thanks to these studies, a 8 weeks VWR protocol has been performed in SAD mice. Thus, physical activity permitted to reduce in VWR SAD mice the endothelial dysfunction induced by the H/R stress and observed in sedentary SAD mice. This thesis shows that habitual physical activity may be beneficial in sickle SAD mice in limiting some factors involved in VOC. Further studies will be necessary, on more severe sickle mice models and in a longer term in Humans, to adapt these findings to SCD subjects

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est l’une des principales causes de la perte de vision chez les personnes âgées. Dans la DMLA de forme sèche, le stress oxydatif, l’inflammation et la dysfonction lipidique causent la perte des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) qui sont essentielles au maintien des photorécepteurs. Nous avons précédemment démontré qu’un ligand sélectif du CD36 permet de préserver la fonction rétinienne dans un modèle murin de la DMLA. Cependant, l’effet des ligands synthétiques du CD36 dans la protection du RPE n’a jamais été vérifié. L’objectif de cette étude était de caractériser l’effet cytoprotecteur du ligand du CD36 MPE-001 sur le RPE contre le stress oxydatif. Le stress oxydatif a été induit chez la lignée humaine hTERT RPE-1 par le NaIO3. Il a été observé que le MPE-001 diminue la production de superoxydes mitochondriaux et l’apoptose des cellules du RPE sans toutefois affecter le système antioxydant au niveau transcriptionnel. Des essais par immunobuvardage et par immunocytochimie ont montré que le NaIO3 perturbe le flux autophagique, alors que le MPE-001 le rétablit. L’effet protecteur du MPE-001 était complètement aboli par les inhibiteurs de l’autophagie wortmannin et bafilomycine A1. En conclusion, nous avons démontré pour la première fois qu’un ligand du CD36 protège les cellules du RPE contre le stress oxydatif de façon autophagie-dépendante. Nous proposons la modulation du stress oxydatif chez le RPE par l’activation du CD36 comme stratégie potentielle pour traiter la DMLA de forme sèche. / Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of irreversible blindness in the elderly population. The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of epithelial cells that are critical in maintaining retinal neurons. Oxidative stress, inflammation and defects in lipid clearance are thought to cause damages to the RPE and the eventual loss of photoreceptors in the dry form of AMD. CD36 is a scavenger receptor that plays an important role in inflammation and lipid homeostasis. We have previously shown that stimulation of CD36 by a selective ligand preserves photoreceptor function in high fat high cholesterol diet-fed Apoe-/- mice, a mouse model of AMD. The effect of CD36 ligands on RPE cells protection from oxidative insults, however, had yet to be investigated. In this study, we aimed to study the cytoprotective effect of the CD36 ligand MPE-001 in RPE cells exposed to oxidative stress. Oxidative stress was induced in the human RPE cell line hTERT RPE-1 using NaIO3. MPE-001 was observed to decrease NaIO3-induced mitochondrial superoxide production and apoptosis, with no transcriptional effect on antioxidant enzymes. Immunoblotting and immunostaining showed that NaIO3 disrupts autophagic flux while MPE-001 co-treatment restores it. The protective effect of MPE-001 was completely abolished by the autophagy inhibitors wortmannin and bafilomycin A1. In conclusion, we report for the first time that a CD36 ligand confers protection to RPE cells under oxidative stress through the improvement of autophagic process. We therefore propose modulation of oxidative stress by CD36 ligands as a potential strategy to treat dry AMD.

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Les effets respiratoires aigus des expositions journalières à des particules fines et ultrafines ne sont pas pleinement documentés pour les expositions professionnelles, même si de nombreux travailleurs sont exposés à des niveaux de particules considérablement plus élevés que dans l'environnement. Cela est en partie attribuable au manque de données sur l'exposition. Actuellement, les études évaluant les expositions professionnelles aux particules fines et ultrafines sont peu nombreuses et manquent de méthodes standardisées pour permettre une conclusion générale sur l'exposition des travailleurs. Les paramètres pour améliorer l'évaluation de l'exposition incluent l'harmonisation des stratégies d'échantillonnage et l'évaluation de la distribution des tailles (e.g. particules de diamètres médians de 2.5 et 4 µm et particules ultrafines), de la composition chimique et du potentiel oxydatif de ces particules. Ainsi, dans un contexte d'incertitude sur les risques respiratoires aigus, et considérant le grand nombre de travailleurs potentiellement exposés en l'absence de données d'exposition comparables entre les milieux de travail, les besoins de produire des nouvelles connaissances dans ce domaine sont énormes. Ainsi, l'objectif principal de cette thèse était d’estimer les risques associés à l’exposition journalière aux particules fines et ultrafines dans divers milieux de travail avec les trois sous-objectifs suivant: (1) estimer des niveaux de particules fines et ultrafines dans différents milieux de travail; (2) évaluer le potentiel oxydatif et le fardeau du potentiel oxydatif des expositions professionnelles aux particules fines dans deux milieux d'une école des métiers de la construction; (3) estimer, par une revue systématique et une méta-analyse, la relation entre les expositions professionnelles et environnementales à court terme (c.-à-d. journalière) aux particules fines et leurs effets respiratoires aigus sur la fonction pulmonaire. Pour le premier objectif, des mesures ont été effectuées pendant 12 jours d'échantillonnage dans une mine souterraine, un tunnel de métro, un atelier de réparation de camions et une fonderie. Des instruments à lecture directe et des mesures intégrées ont été utilisés et comprenaient des mesures de la concentration numérique, la concentration massique, la distribution granulométrique, la microscopie électronique à transmission et la composition (par exemple, le carbone total (CT) et le carbone élémentaire (CE)) des particules. Pour le deuxième objectif, le potentiel oxydatif (OPAA) et le fardeau oxydatif (OBAA) ont été évalués par le test d'ascorbate en utilisant un fluide de revêtement des voies respiratoires synthétique. Des échantillons personnels de PM4 (Nsoudage = 53; Nconstruction = 54) ont été prélevés dans la zone respiratoire, tandis que des mesures en postes fixes de PM4 (Nsoudage = 54; Nconstruction = 33) et de PM2.5 (Nsoudage = 53; Nconstruction = 34) ont été collectées à une distance d'environ 1,5 mètre des apprentis. Pour le troisième objectif, nous avons recherché des bases de données bibliographiques pour identifier les études portant sur les associations entre les expositions journalières aux particules fines (c.-à-d. PM2.5 et PM4) et les paramètres de la fonction pulmonaire (e.g. volume expiratoire forcé en 1 sec, FEV1) chez les adultes en bonne santé. Séparément pour les études environnementales et professionnelles, nous avons résumé les résultats à l'aide de méta-analyses à effets aléatoires lorsque cinq estimés d’association ou plus étaient disponibles. Les concentrations en nombre de particules les plus élevées ont été observées dans la mine souterraine, l’atelier de soudage et la fonderie. Pour les milieux de travail avec une exposition au diesel, la mine souterraine présentait la concentration numérique la plus élevée (134 000 particules/cm3) par rapport au tunnel de métro (32 800 particules/cm3) et à l'atelier de réparation de camions (22 700 particules/cm3). De plus, les concentrations massiques des particules fines, du CT et du CE étaient également plus élevées dans la mine souterraine par rapport aux autres milieux. Le ratio CT/CE était de 1,4 dans la mine, 2,5 dans le tunnel et 8,7 dans l'atelier, indiquant la présence d’une importante source de carbone organique non associée aux émanations de moteur diesel dans les milieux de travail non miniers. Cette source de carbone organique peut affecter l'estimation de l'exposition lorsque le CT est utilisé comme indicateur d'exposition au diesel. Les mesures de la distribution de la taille et les images capturées par microscopie à transmission électronique ont indiqué que les particules trouvées dans tous les milieux de travail étaient majoritairement dans la fraction ultrafine. Les particules collectées dans les milieux de travail ont été associés à différents niveaux de potentiel oxydatif. Les particules de soudage présentaient des niveaux plus élevés de OPAA (3,3 ρmol /min/µg) et OBAA (1750 ρmol/min/m3) que le site de construction (OPAA = 1,4 ρmol/min/µg; OBAA = 486 ρmol/min/m3). Ces niveaux d'OBAA dépassaient largement les niveaux trouvés dans l'environnement général. Dans les deux milieux de travail, les niveaux d'OPAA n'ont pas été influencés par les différentes stratégies d'échantillonnage (c.-à-d. mesures personnelles et en postes fixes) ou par la taille des particules (c.-à-d. PM2.5 et PM4). Cependant, en raison des concentrations de particules plus élevées, l'OBAA des échantillons personnels était significativement plus grand que celui des mesures d’ambiance dans l'atelier de soudage. La revue systématique et méta-analyse a montré que les associations entre les expositions journalières aux particules fines dans l’environnement général étaient plus prononcées qu’en milieu de travail pour un même incrément d'exposition. Une qu'une augmentation de 10 ug/m3 des expositions journalières aux particules fines respirables était associée à des réductions du FEV1 de 0,87 ml (IC à 95%: -1,36 à -0,37 ml; I2 = 54 %) dans les études professionnelles, et une augmentation similaire des particules fines était associée à une réduction de 7,62 mL (IC à 95%: -10,62 à -4,63 mL; I2 = 0%) dans les études environnementales. Des résultats similaires ont été observés pour les associations avec la capacité vitale forcée. En résumé, les résultats de cette thèse montrent que les travailleurs sont exposés à des niveaux importants de particules exprimées en termes de concentrations massiques et numériques, et que ces particules se trouvent principalement dans la fraction ultrafine. Les concentrations élevées de ces particules combinées à un potentiel oxydatif important entrainent un fardeau oxydatif qui dépasse largement celui d’études environnementales. De plus, les expositions professionnelles pendant un quart de travail entraineraient des effets sur la santé respiratoire décrits en termes de réduction de la fonction pulmonaire des travailleurs. À la lumière de ces résultats, des améliorations des pratiques d'hygiène industrielle et de la surveillance de l'exposition aux particules fines et ultrafines dans les milieux de travail sont nécessaires pour contrôler et limiter les risques sanitaires potentiels des expositions journalières à ces polluants. / Respiratory effects, such as lung function, of short-term exposures to fine and ultrafine particles are not well documented for occupational exposures, even though many workers are exposed daily to levels considerably higher than in the general environment. This limited understanding can be attributed to the lack of exposure data. Currently, studies assessing occupational exposures to fine particles and ultrafine fraction are few and lack standardized methods to allow a general conclusion about workers’ exposures. The steps for improving exposure assessment include the harmonization of sampling strategies and the assessment of additional information related to the size distribution (e.g. particles of median diameter of 2.5 and 4 µm, and ultrafine particles), chemical composition, and the oxidative potential of these particles. Thus, in a context of uncertainty about the acute respiratory risks, with many potentially exposed workers and in the absence of comparable exposure data, the needs for developing knowledge in this field are enormous. Hence, the main objective of this thesis was to estimate the risk of daily exposures to fine and ultrafine particles in various workplaces with three specific objectives: (1) to quantify and characterize exposures to fine and ultrafine particles in different workplaces in Québec by an innovative multi-metric approach; (2) to estimate the oxidative potential and oxidative burden of particles in two occupational settings from a construction trades school; (3) to separately estimate, by a systematic review and meta-analysis, the associations between short-term (i.e. daily and sub-daily) occupational and environmental exposures to fine particles and its acute respiratory effects on lung function in healthy adults. For the first objective, measurements were performed in an underground mine, a subway tunnel, a truck repair workshop, and a smelting industry for at least 12 sampling days each. Direct-reading instruments and filter-based methods were used and included measurements of the number concentration, mass concentration, size distribution, transmission electron microscopy and composition (e.g. Total carbon (TC) and elemental carbon (EC)) of particles. For the second objective, the oxidative potential (OPAA) and oxidative burden (OBAA) were assessed by the ascorbate assay with a synthetic respiratory tract lining fluid. Personal PM4 (Nwelding = 53; Nconstruction = 54) samples were collected from the breathing zone, while area samples of both PM4 (Nwelding = 54; Nconstruction = 33) and PM2.5 fractions (Nwelding = 53; Nconstruction = 34) were collected at distances of around 1.5 meter from the apprentices. For the third objective, we searched bibliographic databases to identify studies investigating associations between daily and sub-daily exposures to fine particles (i.e. PM2.5 and PM4) and lung function parameters (e.g. Forced Expiratory Volume in 1 sec, FEV1) in healthy adults. Separately for environmental and occupational studies, we summarized findings using random-effects meta-analyses when five or more independent estimates of association were available. The highest particle number concentrations were observed in the underground mine, welding shop and smelting industry. For the workplaces with diesel exposure, the underground mine had the highest geometric mean of particle number concentration (134,000 particles/cm3) compared to the subway tunnel (32,800 particles/cm3) and the truck repair workshop (22,700 particles/cm3). This same pattern of exposure in these workplaces were also observed for the mass concentration of fine particles, TC and EC. The TC/EC ratio was 1.4 in the mine, 2.5 in the tunnel and 8.7 in the workshop, indicating significant organic carbon interference in the non-mining workplaces that can affect exposure estimation when TC is used as an indicator of diesel exposure. Measurements of the size distribution and images captured by transmission electron microscopy indicated that the particles found in all workplaces were mainly in the ultrafine size fraction. Particles collected in the welding shop and construction site were associated with important levels of redox activity. Welding particles had higher OPAA (3.3 ρmol/min/µg) and OBAA (1,750 ρmol/min/m3) compared to the construction site (OPAA = 1.4 ρmol/min/µg; OBAA = 486 ρmol/min/m3). These levels of OBAA largely exceeded the levels found in environmental settings. In both workplaces, OPAA levels were not influenced by the different sampling strategies (i.e. area versus personal measurements) or size fractions (i.e. PM2.5 and PM4). However, driven by the higher particulate matter concentrations, the OBAA from personal samples was higher compared to area samples in the welding shop. The systematic review and meta-analysis showed that associations between daily exposures to fine particles and lung function in environmental settings were more pronounced than in occupational settings for a same exposure increment. An increase of 10 µg/m3 in the daily and sub-daily exposures to respirable fine particles were associated with FEV1 reductions of 0.87 mL (95% CI: -1.36 to -0.37 mL; I2= 54%) in occupational studies, and a similar increase in fine particles was associated with a reduction of 7.63 mL (95% CI: -10.62 to -4.63 mL; I2= 0%) in environmental studies. Similar results were observed for associations with the forced vital capacity. In summary, this thesis’s results showed that workers are exposed to important levels of particles expressed in terms of mass and number concentrations, and these particles are mainly in the ultrafine size range. The high particulate matter concentrations combined with an elevated oxidative potential resulted in significant levels of oxidative burden that largely exceeded those from environmental settings. Also, occupational exposures during a work shift may result in respiratory health effects described in terms of reduction in workers’ lung function. Based on our results, improvements in industrial hygiene practices and the surveillance of exposure to fine and ultrafine particles in the workplace are needed to control and limit potential health risks of daily exposure to these pollutants.

Contexte et objectifs : L'encéphalopathie hépatique (EH) est un trouble neuropsychiatrique, une complication majeure de la maladie hépatique chronique (MHC). L'EH se manifeste par un large éventail de symptômes, allant d'un léger manque d'attention et de troubles de la mémoire à une léthargie sévère et un coma. L'hyperammoniémie est centrale dans la pathogenèse de l'EH puisque l'ammoniac est neurotoxique et que l'ammoniac dérivé du sang traverse facilement la barrière hémato-encéphalique (BHE). Cependant, d'autres facteurs pathogènes sont également impliqués dans l'EH, notamment le stress oxydatif. Au cours de la MHC, le muscle joue un rôle compensatoire essentiel dans l'élimination de l'ammoniac par l'action de l'enzyme glutamine synthétase (GS), qui transforme le glutamate en glutamine. Étant donné que les cellules endothéliales de la BHE sont l'interface entre le sang et le cerveau, il est plausible qu'elles métabolisent l'ammoniac pour protéger le cerveau de la neurotoxicité induite par l'ammoniac. Cependant, cela n'a jamais fait l'objet d'études. Les thérapies de réduction de l'ammoniac sont les traitements courants de l'EH. Cependant, les réponses des patients aux traitements sont hétérogènes, et les différences de sexe pourraient en être la cause. Par conséquent, nos objectifs étaient 1) d'explorer le métabolisme de l'ammoniac dans les cellules endothéliales de la BHE par la présence de GS et 2) d'évaluer l'impact du sexe sur la MHC et ses complications, y compris la sarcopénie et l'EH. Méthodes : Pour le premier objectif, nous avons évalué l'expression et l'activité de la protéine GS in vitro et ex vivo chez des rats naïfs. Nous avons également évalué l'impact de l'ornithine, du glutamate et du α-kétoglutarate sur l'activité de la GS dans les cellules endothéliales de la BHE via la génération de glutamine 5-13C marquée. Pour le deuxième objectif, nous avons évalué l'impact du sexe sur le neurophénotype (anxiété, mémoire, coordination motrice et activité) chez des rats ligaturés des voies biliaires (BDL) (et contrôles respectifs) ainsi que sur le développement d'une EH sévère (léthargie/perte du réflexe de redressement). Nous avons également évalué les marqueurs des lésions hépatiques, l'hyperammoniémie, le stress oxydatif systémique, la masse et la fonction musculaire et la clairance de l'ammoniac musculaire. Résultats : Nous avons trouvé l'activité et l'expression de la GS in vivo et ex vivo dans les cellules endothéliales de la BHE. L'analyse au microscope confocal a montré que la GS dans les cellules endothéliales est moins abondante que dans les astrocytes. L'exposition de cellules endothéliales cultivées à des substrats marqués a révélé que l'ornithine est la plus efficace pour générer de la glutamine. Chez les femmes, la chirurgie BDL a provoqué une MHC (augmentation des enzymes hépatiques circulantes et de la bilirubine) et de l'EH (altération de la coordination motrice et de l'activité nocturne) par rapport aux rats contrôles respectifs. De plus, le degré d'hyperammoniémie et la clairance musculaire de l'ammoniac étaient similaires entre les sexes. Contrairement aux mâles, les rats femelles n'ont pas développé de perte musculaire, d'œdème cérébral et de perte de mémoire à court terme. De plus, les femelles présentaient un stress oxydatif plus faible et étaient complètement protégées contre les EH sévères précipitées par l'ammoniac par rapport aux mâles BDL. Conclusions : Nous concluons que la GS est exprimée dans les cellules endothéliales de la BHE, jouant peut-être un rôle dans l'atténuation ou le retard de l'entrée de l'ammoniac dans le cerveau et que la supplémentation en ornithine améliore l'activité de la GS en fournissant du glutamate pour la détoxification de l'ammoniac. De plus, nous concluons que le sexe a un impact sur les complications des maladies du foie, y compris la sarcopénie et l'EH, le stress oxydatif systémique jouant un rôle vital dans la susceptibilité à l'EH sévère induite par l'ammoniac. / Background and aims: Hepatic encephalopathy (HE) is a neuropsychiatric disorder and a major complication of chronic liver disease (CLD). HE manifests with a wide range of symptoms, from mild lack of attention and memory impairments to severe lethargy and coma. Hyperammonemia is central in the pathogenesis of HE since ammonia is neurotoxic, and blood-derived ammonia easily crosses the blood-brain barrier (BBB). However, other pathogenic factors are also implicated in HE, including oxidative stress. During CLD, muscle plays an essential compensatory role in removing ammonia by the action of the enzyme glutamine synthetase (GS), which amidates glutamate into glutamine. Since the endothelial cells of the BBB are the interface between the blood and the brain, it is plausible that they metabolize ammonia to protect the brain from ammonia-induced neurotoxicity. However, this has never been investigated. Ammonia lowering therapies are the mainstream treatments for HE. However, patients' response to treatments are heterogeneous, and sex differences might be the cause. Therefore, our aims were 1) To explore ammonia metabolism in BBB’s endothelial cells through the presence of GS and 2) to assess the impact of sex on CLD and its complications, including sarcopenia and HE. Methods: For the first aim, we assessed GS protein expression and activity in vitro and ex vivo in naïve rats. We also evaluated the impact of ornithine, glutamate, and α-ketoglutarate on GS activity in endothelial cells of the BBB via the generation of labeled 5-13C glutamine. For the second aim, we assessed the impact of sex on the neurophenotype (anxiety, memory, motor coordination, and activity) in bile-duct ligated (BDL) rats (and respective SHAMs) as well as on the development of an ammonia-precipitated severe HE (lethargy/loss of righting reflex). We also assessed liver injury markers, hyperammonemia, systemic oxidative stress, muscle mass and function, and muscle ammonia clearance. Results: We found GS activity and expression in vivo and ex vivo in endothelial BBB cells. The confocal microscope analysis showed that GS in endothelial cells is less abundant than astrocytes. Exposing cultured endothelial cells to labeled substrates revealed that ornithine is the most efficient in generating glutamine. In females, BDL surgery caused CLD (increased hepatic enzymes and bilirubin) and HE (impaired motor coordination and night activity) vs. respective SHAMs. Furthermore, the degree of hyperammonemia and muscle ammonia clearance was similar between sexes. Contrary to males, female rats did not develop muscle loss, brain edema, and short-term memory loss. In addition, females had lower oxidative stress and were completely protected against ammonia-precipitated severe HE compared to male BDLs. Conclusions: We conclude that GS is expressed in endothelial cells of the BBB, possibly playing a role in attenuating or delaying ammonia entry into the brain and, ornithine supplementation enhances GS activity by providing glutamate for ammonia detoxification. In addition, we conclude that sex impacts the complications of liver disease, including sarcopenia and HE, with systemic oxidative stress playing a vital role in the susceptibility to ammonia-induced overt HE.

Le chitosane est un polysaccharide naturel, généralement reconnu pour sa biocompatibilité et biodégradabilité. Sa notoriété se doit non seulement à la diversité de ses applications biomédicales, mais aussi à la disponibilité des groupes fonctionnels qui permettent la modification de ses caractéristiques physicochimiques. Dans le contexte de la thérapie génique, le chitosane est reconnu pour son potentiel en tant que nanovecteur, pour transporter du matériel génique à l’intérieur des cellules. Notre laboratoire a mis au point la synthèse d’un diéthylaminoéthyl-chitosane-polyéthylène glycol-acide folique (DEAE12-CH-PEG-FA2), qui a déjà démontré sa capacité de transfection in vitro sur plusieurs lignées cellulaires et son potentiel thérapeutique en tant que nanoparticule dans un modèle animal d’arthrite. Ces résultats prometteurs ont encouragé la suite de nos recherches. Ainsi, l’évaluation des propriétés cytotoxiques et hémotoxiques de notre chitosane modifié et de ses nanoparticules s’est avérée une étape essentielle pour continuer vers une potentielle application clinique. Étant donné les résultats contradictoires des rapports sur les caractéristiques hémocompatibles de ce polymère, en plus du manque de témoins d’interférence, de l’absence de données sur le niveau de contamination aux endotoxines des formulations et l’hétérogénéité des protocoles expérimentaux dans la littérature, nous avons employé les lignes directrices de l’ISO, l’ASTM et le NCL pour estimer son profil toxicologique. Dans cette étude, nous avons approfondi les connaissances sur l'hémocompatibilité des nanoparticules de DEAE12-CH-PEG-FA2/siRNA dans un cadre contrôlé et informatif. Cette évaluation a montré une faible réponse hémolytique et d’agrégation plaquettaire, et aucun effet sur le système du complément et sur le temps de coagulation du plasma. Également, la mesure du niveau de radicaux libres (ROS et NO) n’a pas décelé une réponse biologique reliée au stress oxydatif. Cependant, la viabilité cellulaire et le niveau de libération de la lactate déshydrogénase (LDH) ont révélé une relation en fonction de la concentration, du temps d’exposition et du type cellulaire étudié. Enfin, l’expression de cytokines telles que le TNF-α, l’IL-6, l’IL-4 et l’IL-10 ont été comparables à ceux du témoin négatif, le PBS. Dans cette quête de l’estimation des propriétés biocompatibles de notre chitosane, notre projet s’est dirigé vers l’étude des mécanismes moléculaires. C’est ainsi que nous avons étudié les voies de signalisation reliées aux récepteurs de surface cellulaire susceptibles de reconnaître le chitosane, notamment le récepteur toll-like 4 (TLR-4) et les récepteurs de lectine de type C (CLR). Nos données révèlent que les nanoparticules de DEAE12-CH-PEG-FA2/siRNA, à différentes concentrations et à différentes périodes d’incubation, n’activent pas les voies de signalisation des IKK/NF-κβ, MAPKs, AKT et SYK. Ces résultats ont été supportés par l’absence d’une réponse pro-inflammatoire mesurée à partir de l’expression de médiateurs clés comme le TNF-α, IL-1β, IL-6, COX-2 et iNOS. Au vu de nos découvertes, nous pouvons déduire le potentiel d’innocuité de notre chitosane modifié (DEAE12-CH-PEG-FA2), indispensable pour son application dans la thérapie génique. Également, nous suggérerons la possibilité que des récepteurs cellulaires qui n’ont pas encore été identifiés soient impliqués dans la reconnaissance et l’internalisation du chitosane, ce qui mérite la réalisation d’études plus approfondies. / Chitosan is a natural polysaccharide, generally known for its biocompatibility and biodegradability. Its notoriety is due not only to the diversity of its biomedical applications but also to the presence of functional groups in its chain, which allow the modification of its physiochemical properties. In gene therapy applications, chitosan is known for its potential as a nanovector to transport genetic material to cells. Our laboratory has synthesized a modified-chitosan diethylaminoethyl-chitosan-polyethylene glycol-folic acid (DEAE12-CH-PEG-FA2), which has already shown in vitro transfection efficiency in several cell lines and a therapeutic potential as a nanoparticle in an animal arthritis model. These promising results encouraged further research. Thus, the evaluation of the cytotoxic and hemotoxic properties of our modified chitosan and its nanoparticles became an essential step to continue towards potential clinical applications. Given the existing contradictory outcomes about the hemocompatible characteristics of this polymer, as well as the lack of interference controls, the absence of data on endotoxin levels in nanoformulations and the diversity of the experimental protocols, we used ISO, ASTM and NCL’s guidelines to estimate its toxicological profile. In this study, we discovered new information about DEAE12-CH-PEG-FA2/siRNA nanoparticle hemocompatibility, in a controlled and informative framework. This evaluation showed low hemolytic properties, low platelet aggregation capacity with no effect on the complement and coagulation systems. Moreover, detection of free radical levels (ROS and NO) did not show a biological response related to oxidative stress. Nevertheless, cell viability and the levels of lactate dehydrogenase (LDH) release revealed concentration-, incubation time- and cell-dependent outcomes. Regarding cytokine expression, TNF-α, IL-6, IL-4 and IL-10 levels were equivalent to those of the negative control, PBS. In the quest to evaluate the biocompatible properties of chitosan, our project focused on the study of its molecular mechanisms. Therefore, we studied signaling pathways related to receptors that have been associated to chitosan recognition such as toll-like receptor 4 (TLR-4) and C-type lectin receptors (CLRs). Our data revealed that DEAE12-CH-PEG-FA2/siRNA nanoparticles, at the studied concentrations and time courses, did not activate the IKK/NF-κB, MAPKs, AKT nor SYK signaling pathways. These results were supported by the absence of an inflammatory response measured by the expression of key mediators such as TNF-α, IL-1β, IL-6, COX-2 and iNOS. In view of our findings, we deduced the safety potential of our modified chitosan (DEAE12-CH-PEG-FA2) which is mandatory for gene therapy applications. Moreover, we suggest the involvement of unidentified cellular receptors in the recognition and uptake of chitosan which warrant further investigation.

Cette étude vise trois objectifs majeurs. Elle cherche d’abord à déterminer les mécanismes par lesquels les monomères cycliques d’acides gras (MCAG) issus de la friture des huiles végétales induisent l’accumulation des lipides dans le foie des rats. Ensuite, elle évalue les effets des MCAG sur les marqueurs de l’inflammation et du stress oxydant chez ces mêmes rats. Enfin, elle vise à déterminer si ces effets peuvent être modulés par la qualité des lipides alimentaires. Pour atteindre ces objectifs, cette étude compare les effets des quatre diètes sur la composition corporelle, les profils d’acides gras et de lipides hépatiques et plasmatiques, l’activité ou l’expression d’enzymes hépatiques, les marqueurs d’homéostasie glucidique, d’inflammation et de stress oxydant. Les quatre diètes diffèrent par la source de lipides alimentaires et l’ajout ou non de MCAG (0,5% des lipides alimentaires totaux) : huile de canola (CO), huile de canola avec MCAG (CC), huile de soya (SO) et huile de soya avec MCAG (SC). Les rats sont nourris avec ces diètes (n = 9 par groupe) pendant 28 jours et des paramètres biochimiques sont analysés dans le foie, le plasma et les urines. Les rats nourris aux MCAG manifestent une hausse des TG hépatiques, du cholestérol total plasmatique et du cholestérol de VLDL+LDL, une baisse de la phosphatidylcholine hépatique et du cholestérol des HDL plasmatique par rapport aux rats nourris avec les diètes sans MCAG. En plus, les rats nourris aux MCAG montrent des concentrations plus élevées en 15-F2t-IsoP et son métabolite, le 2,3-dinor-15-F2t-IsoP, que les rats non nourris aux MCAG. Enfin, les rats nourris avec la diète SC ont des concentrations plasmatiques et urinaires plus élevées d’isoprostanes, de neuroprostanes et d’Interleukine-6 que ceux nourris avec l’huile de canola et MCAG. Cette étude montre que les MCAG perturbent l’homéostasie des lipoprotéines sanguines et causent l’accumulation des TG dans le foie des rats en lien avec une réduction de la phosphatidylcholine hépatique. Par ailleurs, la consommation de MCAG favorise le développement d’un stress oxydant, et cet effet ainsi que l’impact des MCAG sur l’inflammation sont exacerbés par une diète riche en acide linoléique (huile de soja) comparée à une diète riche en acide oléique (huile de canola). / This study has three major objectives. It first seeks to determine the mechanisms by which cyclic fatty acid monomers (CFAM), which are derived from the frying of vegetable oils, induce the accumulation of lipids in the liver of rats. Then, it evaluates the effects of CFAM on the markers of inflammation and oxidative stress in these same rats. Finally, it aims to determine if these effects can be modulated by the quality of dietary lipids. To achieve these objectives, this study compares the effects of four diets on body composition, hepatic and plasma fatty acid and lipid profiles, activity or expression of liver enzymes, markers of carbohydrate homeostasis, inflammation and oxidative stress. The four diets differ in the source of dietary lipids (canola oil or soybean oil) and the addition of CFAM (0.0 or 0.5% of total dietary fat). Rats were fed these diets (n = 9 per group) for 28 days and biochemical parameters are analyzed in liver, plasma and urine. CFAM-fed rats showed increased hepatic triglycerides and plasma total cholesterol and VLDL+LDL cholesterol, decreased plasma HDL cholesterol and liver phosphatidylcholine, compared to rats fed CFAM-free diets. In addition, CFAM-fed rats showed higher concentrations of plasma 15-F2t-IsoP and 2,3dinor-15-F2t-IsoP than non-CFAM-fed rats. Finally, rats fed soybean oil and CFAM had elevated plasma and urinary concentrations of isoprostanes, neuroprostanes and interleukin-6 as compared to those fed canola oil and CFAM. This study shows that CFAM disrupt blood lipoprotein homeostasis and cause triglyceride accumulation in rat liver related to reduced liver phosphatidylcholine. In addition, the consumption of CFAM promotes the development of oxidative stress, and this effect and the impact of CFAM on inflammation are exacerbated by a diet rich in linoleic acid (soybean oil) compared to a diet rich in oleic acid (canola oil).

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Une étude épidémiologique menée en 1992 chez les Inuit du Nunavik rapportait une faible prévalence des maladies coronariennes et du diabète de type 2, probablement grâce à la consommation d’acides gras oméga-3, dont les apports sont élevés dans l’alimentation traditionnelle. Par ailleurs, cette même alimentation est source d’exposition aux contaminants environnementaux comme les biphényles polychlorés (BPC) et le méthyle mercure (MeHg). La première hypothèse de l’étude était que ces contaminants environnementaux pourraient induire un stress oxydant et ainsi contribuer au risque de maladies cardiovasculaires. Par ailleurs, la seconde hypothèse de l’étude suggère que la consommation de cette alimentation traditionnelle pourrait avoir des effets bénéfiques pour la santé malgré tout, grâce aux acides gras oméga-3 et au sélénium, également contenus dans l’alimentation traditionnelle. L’initiation de la recherche sur les contaminants environnementaux chez la population Inuit a mis en lumière une autre variable pouvant affecter la santé des Inuit : la prévalence élevée de l’obésité. En effet, suite à l’observation que plusieurs participants souffraient d’obésité, il a été suggéré d’effectuer certaines mesures afin de caractériser le syndrome métabolique, le statut inflammatoire et la fonction endothéliale chez cette population afin de discriminer les effets potentiellement délétères des contaminants des effets reliés à l’obésité. De la même manière, les effets des acides gras oméga-3 sur les composantes du syndrome métabolique ont été investigués. Les résultats obtenus rapportent, d’abord, que les contaminants n’ont pas un impact direct sur le stress oxydant tel que mesuré dans cette population, malgré que les BPC étaient associés à la lipoprotéine de faible densité (LDL) oxydée. En effet, les contaminants stimuleraient plutôt la défense antioxydante. Par ailleurs, une association positive entre les acides gras oméga-3 et la glycémie à jeun suggère que l’introduction d’une alimentation occidentale riche en sucre raffiné pourrait induire l’expression d’une hyperglycémie et d’une hyperinsulinémie sans la dyslipidémie habituellement rapportée chez les Caucasiens. En effet, le profil lipidique des Inuit restait favorable avec des triglycérides et des acides gras libres faibles et une concentration de cholestérol de haute densité (HDL) élevée. De plus, près de la moitié des sujets étudiés présentaient une hyperinsulinémie à jeun, sans toutefois démontrer une inflammation périphérique et une dysfonction endothéliale, conditions habituellement rencontrées lors de l’hyperinsulinémie. / The Inuit of Nunavik are exposed by their traditional diet to environmental contaminants including methylmercury (MeHg) and polychlorinated biphenyls (PCBs), at levels potentially noxious for health. Nevertheless, this diet is rich in omega-3 fatty acids and selenium. We formulated the hypothesis that these dietary factors could have beneficial effects counteracting the potentially pro-oxidant effects of contaminants. An epidemiological study conducted in 1992 retrieved a relatively low prevalence of ischemic heart diseases and type 2 diabetes in these Inuit, maybe because of their high consumption of omega-3 fatty acids. The initiation of research on the Inuit and environmental contaminants to which they are exposed to revealed another factor that might affect their health: a high prevalence of obesity. In fact, the observation that several participants suffered from obesity lead us to carry out relevant measurements in order to assess metabolic syndrome components, the inflammatory status and endothelial function in this population, in an attempt to distinguish the potentially harmful effects linked to obesity from those linked to contaminants. The potential effects of omega-3 fatty acids on the components of the metabolic syndrome have therefore also been investigated. Our results indicate, firstly, that the observed levels of contaminants had no evident oxidant effect detectable at the level of the redox couples of vitamin E and coenzyme Q10 in these Inuit. The contaminants were nevertheless associated with an increase of low-density lipoprotein oxidation, and a stimulation of the antioxidant defenses. Besides, a positive association between omega-3 fatty acids and fasting blood glucose suggests that the introduction of a western diet rich in refined sugars could induce the expression of hyperglycemia and hyperinsulinemia phenotypes without concomitant dyslipidemia usually reported for Caucasians. In fact, the lipid profile of the Inuit remained favourable, characterized by low levels of triglycerides and free fatty acids, and high levels of HDL cholesterol. Moreover, close to half of the studied subjects presented a fasting hyperinsulinemia, without evidence of peripheral inflammation or endothelial dysfunction, which are conditions usually met in hyperinsulinemic and obese Caucasians.