A acidez do solo é um dos principais fatores limitantes à produção vegetal. A toxicidade por alumínio, que ocorre apenas a pH baixo, tem sido extensamente investigada, enquanto o estresse causado pelo pH baixo tem recebido pouca atenção. Os estudos nesta área quase sempre presumem efeitos aditivos, e portanto independentes, da toxicidade por Al3+ e H+. Este provavelmente não é o caso, sendo que o pH baixo pode ser um fator de predisposição das células ao Al3+. As evidências indicam que o pH baixo causa desarranjos na parede de células em crescimento, gerando estresse que pode comprometer a sua funcionalidade e integridade. É provável que a susceptibilidade a este estresse deve ser dependente da pressão de turgor. Por sua vez, o metabolismo oxidativo e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) na parede celular podem modular a sua extensibilidade por romper ou criar ligações dentro ou entre cadeias de polissacarídeo. Há grande interesse em se conhecer se, à semelhança do que ocorre em leveduras, as células vegetais possuem um sistema de percepção e resposta a estresse da parede. Os pêlos radiculares em crescimento são sensíveis a pH baixo e estresse hipo-osmótico e constituem um bom modelo experimental para estes estudos. Os objetivos deste trabalho foram: a) Otimizar um sistema experimental para o estudo de pêlos radiculares de tomateiro (Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom); b) Avaliar as respostas dos pêlos radiculares ao estresse por pH baixo e hipo-osmolaridade; c) Examinar o papel da modulação oxidativa da parede celular nestas respostas; e d) Avaliar a resposta de diferentes mutantes hormonais de Micro-Tom a estes fatores de estresse. Os principais parâmetros avaliados foram a taxa de alongamento (µm.min-1) e a freqüência de rompimento dos pêlos. Tanto o estresse por pH baixo quanto choques hipo-osmóticos resultaram em taxas de alongamento significativamente diminuídos e o rompimento de pêlos radiculares, mas os efeitos dos tratamentos hipo-osmóticos foram mais marcantes. Uma curva de resposta frente à osmolaridade da solução externa revelou que a taxa de alongamento aumentou com a diminuição da osmolaridade até alcançar um limiar em que houve redução drástica da taxa de alongamento e começou-se a observar o rompimento de pêlos. Também se observou uma interação entre hipo-osmolaridade e pH baixo. O emprego do inibidor difenileno iodônio não forneceu evidências do envolvimento de NADPH oxidases da membrana plasmática na resposta de pêlos radiculares a choque hipo-osmótico ou pH baixo. Já no caso do inibidor ácido salicilhidroxâmico, encontrou-se evidências do envolvimento de peroxidases da parede. Nos mutantes hormonais dgt (pouco sensível a auxina) e epi (super produtor de etileno), mas não em not (deficiente em ácido abscísico), os pêlos radiculares apresentaram uma melhor resposta de ajustamento a choque hipo-osmótico do que Micro-Tom, reduzindo o alongamento e o rompimento dos pêlos. Este trabalho fornece fortes evidências de que os pêlos radiculares possuem um mecanismo de percepção e resposta a estresse da parede visando à manutenção de sua integridade e que apresentam bom potencial como sistema modelo nesta linha de pesquisa / Soil acidity is a major factor limiting plant growth worldwide. Aluminum toxicity, which occurs only at low pH, has been extensively studied, whereas low pH stress has received much less attention. Studies on Al3+ and H+ toxicity make the underlying assumption that the effects of these stress factors are additive, and, therefore independent of each other. However, this is most likely not the case and low pH may be a factor which increases susceptibility to further injury by Al3+. There is evidence that low pH causes disruption in cell wall structure of growing cells, which might jeopardize cell wall functionality and integrity. It is likely that turgor pressure plays an important role in cell wall stress caused by low pH. The apoplastic metabolism of reactive oxygen species (ROS) can modulate cell wall extensibility by making or breaking bonds within and between cell wall polysaccharides. A major question is whether, similarly to yeast, plant cells have a cell wall integrity signaling and response system. Growing root hairs are sensitive to low pH and hypo-osmotic stress and are potentially good experimental systems for such investigations. The objectives of this study were: a) Optimize an experimental system to examine tomato (Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom) root hairs; b) Examine the response of root hairs to low pH and hypo-osmotic stress; c) Examine the role of oxidative modulation of the cell wall in these responses; and d) Evaluate the response of different hormonal mutants of Micro-Tom to these stress factors. Root hair elongation rates (µm.min-1) and the frequency of cell bursting were the major experimental parameters which were evaluated. Both low pH and, more markedly, hypo-osmotic stress caused significant reductions in elongation rates and the bursting of root hair tips. In a response curve to varying osmolarities of the external medium, root hair elongation rates increased with decreasing osmolarities until a threshold was reached and elongation rates decreased drastically and the bursting of root hairs began to be observed. Interactions between low pH and hypo-osmolarity were observed. The use of the inhibitor diphenylene iodonium (DPI) did not provide evidence for the involvement of plasma membrane NADPH in the response of root hairs to low pH and hypo-osmotic shock. However, a role for cell wall peroxidases was provided by use of the inhibitor salicylhydroxamic acid (SHAM). Root hairs of the hormonal mutants dgt (low sensitivity to auxin) and epi (ethylene super producer), but not not (deficient in abscisic acid), displayed a more effective response to hypo-osmotic shock than Micro-Tom, by decreasing elongation rates and cell bursting to a greater degree. This study provides strong evidence to suggest that root hairs have a cell wall integrity response system and that root hairs are potentially good cell model systems for such research

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kelly Pacheco de Castro.pdf: 746240 bytes, checksum: b56c21e04b1a4191824bfab81746d0d2 (MD5) Previous issue date: 2008-01-31 / The dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of the most frequent systemic mycosis in Latin America. In humans, infection starts by inhalation of fungal propagules, which reach the pulmonary epithelium and differentiate into the yeast parasitic phase. Here we describe the characterization of a proline-rich protein (PRA/Ag2) homologue of P. brasiliensis, a predictable cell wall protein, first identified in Coccidioides immitis. The protein, the cDNA and genomic sequences were analyzed. Southern blot analysis suggested that there is one copy of the gene in P. brasiliensis. The cloned cDNA was expressed in Escherichia coli and the purified rPbPRA/Ag2 was used to obtain polyclonal antibody. The purified recombinant protein was recognized by sera of patients with proven paracoccidioidomycosis and not by sera of healthy individuals. Immunoelectron microscopy and biochemical studies demonstrated the presence of PbPRA/Ag2 in the fungal cell wall, linked through a GPIanchor. The expression of the Pbpra/ag2 gene was analyzed by real time PCR and results demonstrated developmental regulation in phases of P. brasiliensis, with a higher expression in the mycelium saprobic phase. The protein expression analyses corroborate the transcript levels. / O fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente causador da micose sistêmica mais prevalente na América Latina. Em humanos, a infecção se dá pela inalação de propágulos do fungo, que ao alcançarem o epitélio pulmonar transformam se na fase leveduriforme, parasitária, do fungo P. brasiliensis. Neste trabalho,descrevemos a caracterização de um homólogo de PRA/Ag2 (Antígeno rico em prolina), uma proteína predita de parede celular, primeiramente identificada em Coccidioides immitis. A proteína, o cDNA e a seqüência genômica foram analisados. Análises através de Southern blot sugerem que há somente uma cópia do gene em P.brasiliensis. O cDNA clonado foi expresso em Escherichia coli e a rPbPRA/Ag2 purificada foi utilizada para obtenção do anticorpo policlonal. A proteína recombinante purificada foi reconhecida pelo soro de pacientes com paracoccidioidomicose comprovada e não foi reconhecida pelo soro de pacientes saudáveis. Microscopia eletrônica e estudos bioquímicos demonstraram a presença do PbPRA/Ag2 na parede celular de P. brasiliensis, ligada através de uma âncora de GPI. A expressão do gene que codifica Pbpra/ag2 foi analisada através de PCR em Tempo Real e os resultados demonstraram regulação da expressão nas fases de P. brasiliensis, com maior nível de expressão na fase miceliana. Análises da expressão protéica corroboram os resultados da RT-PCR em Tempo Real.

Sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. acumulam suas reservas de carbono no endosperma na forma de um polissacarídeo de parede celular, o galactomanano. Os galactomananos são polissacarídeos constituídos de uma cadeia principal de resíduos de D-manose ligadas β-1,4, ramificada por resíduos de D-galactose α-1,6 ligados. A mobilização deste ocorre após a germinação e envolve três enzimas hidrolíticas (α-galactosidase, endo-β-mananase e exo-β-manosidase). A α-galactosidase é a primeira enzima atuar sobre o galactomanano hidrolisando as ligações α-1,6 das galactoses ramificadas a cadeia principal de manano (ligados β-1,4), permitindo a ação da endo-β-mananase, que hidrolisará o polissacarídeo a oligossacarídeos, onde a β-manosidase atuará (ligações β-1,4), transformando oligossacarídeos a monossacarídeos a serem utilizados no desenvolvimento do embrião. Buscando a compreensão das características da α-galactosidase e modo de ação sobre o galactomanano, procedeu-se com a purificação, em três etapas,e caracterização bioquímica (pH ótimo, temperatura ótima e aspectos cinéticos) da α-galactosidase de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. Além disso, visando evidenciar a modulação da enzima endo-β-mananase pela distribuição de ramificações de galactose no galactomanano (estrutura fina do galactomanano), procedeu-se com hidrólises enzimáticas do galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers. utilizando a enzima endo-β-mananase de Aspergillus niger (Megazyme®) somente ou em conjunto com a α-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. (Capítulo 1) ou com a α-galactosidase comercial de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®), seguido de análise dos oligossacarídeos por HPAEC-PAD (High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection). Também procedeu-se com hidrólises enzimáticas de galactomananos de 6 espécies com razão manose:galactose variando de 1:1 a 150:1 com endo-β-mananase de Aspergillus niger (Megazyme®) e análise dos oligossacarídeos produzidos por HPAEC-PAD. A α-galactosidase semipurificada possui, aproximadamente, 42 kDa de peso molecular em condições desnaturantes e, aproximadamente 72 kDa de peso molecular na forma nativa, sugerindo que a enzima assuma estrutura quartenária. A temperatura ótima apresentada se encontra na faixa de 50°C a 55°C, pH ótimo na faixa de 4,4 a 5,4, Km= 1,8276 mM e a velocidade máxima de 0,5024 μmolGal.min-1.mgprot-1. A espectrometria de massas gerou os fragmentos: ALADYV-HSK-RMPGSLGHEE-QDAK-TT-GDIEDNWNSM-TSIADS NDKW-ASYAGPGGWN-DPDMLEVGNG-GMTTEEYR-AP-LLVGCDIR-VAVIL-WNR, estando a proteína referente a esta sequência relacionada à mobilização de reserva. Durante a purificação e sequenciamento interno da α-galactosidase e demais proteínas foram detectadas isoformas da α-galactosidase de pesos moleculares variados (42 kDa a 20 kDa). Sugere-se que estas isoformas encontradas inicialmente na purificação estejam relacionadas com outras funções da α-galactosidase, enquanto as isoformas encontradas após todas as etapas de purificação e identificação por espectrometria de massas estejam relacionadas com ativação e adaptação da α-galactosidase durante todo o processo de mobilização de reservas. Os dados gerados das comparações dos oligossacarídeos produzidos em cada hidrólise sugerem que as ramificações do galactomanano podem modular o reconhecimento de sítios de clivagem pela endo-β-mananase: (1) existe a produção de oligossacarídeos limites de digestão F1, F2 e F3 após hidrólise do galactomanano com endo-β-mananase, como demonstrado para xiloglucanos; (2) os oligossacarídeos F1 possuem proporções distintas quando da hidrólise do galactomanano com endo-β-mananase em diferentes concentrações (ExP I e EXP IV), evidenciando preferência por sítios com menor grau de galactosilação; (3) a presença da α-galactosidase diminui a produção dos oligossacarídeos F2 e F3, mostrando que estes não possuem resistência intrínseca a hidrólise e que a reação atinge o equilíbrio mesmo quando ainda existem sítios de clivagem ainda disponíveis (EXP III); (4) polissacarídeos com estruturas diferentes, razão manose:galactose variando entre 150:1 a 1:1, são digeridos em diferentes taxas de hidrólise pela mesma enzima, evidenciando que a ramificação com galactose dificulta a ação da endo-β-mananase. Dessa forma, sugere-se que a estrutura do polissacarídeo galactomanano também contenha, pelo menos, parte da informação requerida para seu próprio metabolismo, código para a sua degradação, estando esta informação contida na distribuição das ramificações com resíduos de D-galactose. Sendo assim, sugere-se que as diferentes isoformas da α-galactosidase relacionadas à degradação da reserva de galactomanano de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. seriam produto da ação proteolítica da própria enzima a fim de melhorar a afinidade da α-galactosidase ao substrato durante o processo de mobilização de reserva. O aumento da afinidade da α-galactosidase ao substrato durante todo o processo de mobilização garantiria a liberação das ramificações com galactose de forma contínua, permitindo e aumentando a eficiência da ação da enzima endo-β-mananase aos sítios de clivagem, garantindo a degradação do polissacarídeo a oligossacarídeos de forma regulada, passível de bloqueio, pelo acúmulo de oligossacarídeos e galactose livre que inibem a ação das enzimas endo-β-mananase e α-galactosidase, respectivamente, e dificultando a ação de microorganismos, propiciando ao embrião a maior quantidade de açúcares para o seu desenvolvimento, aumentando as chances de sucesso no estabelecimento da plântula / The seeds of Sesbania virgata (Cav.) Pers. have an endosperm which accumulates galactomannan as a storage polysaccharide in the cell walls. Galactomannans are composed of a linear backbone of β-(1,4)-linked D-mannose residues with D-galactose α-(1,6)-linkages substitutions. The galactomannans are hydrolysed after protrusion of the radicle. This process is perfomed by three enzymes (α-galactosidase, endo-β-mannanase and exo-β-manosidase). The α-galactosidase is the first enzyme to cleave the polysaccharides, removing the D-galactose residues, allowing the performance of the endo-β-mannanase, which hydrolyses the mannan backbone to mannan oligosaccharides. The last part of the process includes exo-β-manoside, that cleaves the mannan oligosaccharides to mannose residues, which could be used by the embryo during growth. Aiming at understanding the function of ?-galactosidase in the process of galatomanannan degradation, we studied its mode of action on mannans and galactomannans. The α-galactosidase of Sesbania virgata (Cav.) Pers. was purified and characterized (pH and temperature optimum and the enzyme kinetics). We found that the semipurified α-galactosidase molecular weight was 42kDa at denaturating conditions, but in native conditions was 72kDa, suggesting that the enzyme has a quaternary structure. The enzyme optimum pH was between 4,4-5,4, optimum temperature between 50°C-55°C, Km= 1,8276 mM and Vmáx= 0,5024 μmolGal.min-1.mgprot-1. Mass spectrometry measures resulted the following fragments: ALADYV-HSK-RMPGSLGHEE-QDAK-TT-GDIEDNWNSMTSIADS-NDKW-ASYAGPGGWN-DPDMLEVGNG-GMTTEEYR-AP-LLVGCDIR-VAVIL-WNR, being the protein from this sequence related with storage mobilization. Possible α-galactosidase isoforms were detected during the purification, suggesting other functions for the enzyme. The α-galactosidase isoforms detected after all purification steps and with measured mass spectrometry (from 42kDa to 20kDa) should be related to the storage mobilization. We suggest that the α-galactosidase isoforms in Sesbania virgata (Cav.) Pers. seeds represents products of the enzyme self-digestion, this process being correlated with the enzyme/polysaccharide affinity and at last, correlated to the galactomannan mobilization. An extract semipurified from Sesbania virgata (Cav.) Pers. and enriched with α-galactosidase activity, was used along with endo-β-mannanase from Aspergillus niger (Megazyme®) or both endo-β-mannanase and α-galactosidase (semipurified from Sesbania virgata seeds - Chapter 1- or commercial enzyme from Cyamopsis tetragonoloba - Megazyme®) were used to study the fine structure of galactomannans. Hydrolysis of galactomannans from six species with different mannose:galactose (1:1 to 150:1) ratio were performed with endo-β-mananase from Aspergillus niger. The oligosaccharides from all hydrolysis were analyzed by HPAEC-PAD (High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection). The hydrolysis fragments data (HPAEC-PAD) suggest that the side-chains of the polysaccharides can modulate the hydrolytic sites recognition on the galactomannan by the endo-β-mannanase. This conclusion is supported by: (1) the presence of limited digest oligosaccharides F1 and dimmers (F2) and trimers (F3) of the F1 oligosaccharides; (2) the presence of different F1 oligosaccharides proportions after hydrolysis with endo-β-mannanase at different concentrations, showing preference on less-branched hydrolytic sites; (3) the α-galactosidase digestion avoided the accumulation of oligosaccharides F2 and F3, showing that these oligosaccharides do not present intrinsic resistance to hydrolysis and that the reaction reaches an equilibrium even when sites of hydrolysis are still available; (4) polymers with different fine structure (ratio mannose:galactose 1:1 to 150:1) were hydrolysed at different rates by the endo-β-mannanase, showing that galactose branching interferes on the enzyme action. Considering that, the branching pattern of the polysaccharide seems to have direct influence on the interaction of the enzyme with substrate; we suggest that the structure of the galactomannan holds part of information required for its own degradation. The higher enzyme x substrate affinity, ensure the galactose branches digestion, improving the endo-β-mannanase action, ensuring the degradation of the polysaccharides to oligosaccharides. This highly regulated degradation process prevents microorganisms predation and increases the plantlet establishement

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 patricia de sousa.pdf: 7071029 bytes, checksum: 82c8213b4442879d206467555a97c3c4 (MD5) Previous issue date: 2010-01-29 / Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic disorder geographically restricted to Central and South America, and one of the most important endemic mycoses in these regions, especially among the male rural populations. The disease is most likely caused by the inhalation of asexual spores (conidia) produced by the mycelia form of the fungus, propagules that once in the lungs undergo differentiation towards the parasitic yeast form. The cell wall of P. brasiliensis is a dynamic structure, essentially composed of branched glucan (β-1,3 and β-1,6 glucans), chitin, lipids and mannoproteins. Many enzymes are responsible for cell wall remodeling. One of them is the Beta-1,3- glucanosyltransferase 2 (PbGel2p) presented here. The amino acid deduced sequence of PbGel2p presented similarity to others proteins involved in fungal cell wall biosynthesis and morphogenesis and it was characterized as a member of GH72 family, GH72_ subfamily. The recombinant rPbGel2p was overexpressed in Escherichia coli and the polyclonal antibody was obtained. The PbGel2p mRNA, as well as the protein, were detected at the highest level in the mycelium phase. The potencial role of PbGel2p in cell wall biosynthesis and morphogenesis was analyzed by assessing its ability to rescue the phenotype of the Saccharomyces cerevisiae GAS1Δ. The results indicated that PbGel2p is a cell wall-associated protein that probably works as a β-1,3-glucan elongase capable of mediating fungal cell wall integrity. In addition, predicted protein-protein interactions between PbGel2p and others proteins of the fungus P. brasiliensis were assessed by using a S. cerevisiae two hybrid system and pull-down assay. The proteins that were found to interact with PbGel2p are: anthranilate synthase component 2 (involved in the tryptophan pathway), MYND domain protein SamB (related to fungal morphogenesis), mitotic spindle checkpoint protein Mad2B (required of the organization of the cytoskeleton and control of cell cycle), G protein complex beta subunit CpcB (organize the cytoskeleton of actin), WD repeat protein (involved in the control of cell cycle), phosphatidylinositol-4-phosphate-5-kinase its3 (required of the organization of the actin cytoskeleton), Hsp60 (related of stress conditions like temperature) and ATPase (localized in the plasma membrane / involved in the glucose metabolism). This suggested the relation of PbGel2p in other process to maintenance of cell wall integrity. / Paracoccidioides brasiliensis é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM), prevalente em países da América Central e do Sul sendo considerada uma das mais importantes micoses endêmicas, especialmente entre a população rural masculina. A doença é causada pela inalação dos esporos assexuais (conídios) produzidos pela forma miceliana do fungo. Nos pulmões, os propágulos tendem à diferenciação para a forma leveduriforme parasitária. A parede celular de P. brasiliensis é uma estrutura dinâmica, composta essencialmente por glicanas ramificadas (ligações β-1,3 e β-1,6), quitina, lipídeos e manoproteínas. Muitas enzimas estão envolvidas no seu remodelamento. Uma delas é a Beta-1,3-glicanosiltransferase 2 (PbGel2p), apresentada aqui. A sequência deduzida de aminoácidos de PbGel2p mostrou similaridade com outras proteínas envolvidas na morfogênese e biossíntese da parede celular fúngica e foi caracterizada como parte da família GH72, subfamília GH72_ . A proteína recombinante rPbGel2p foi superexpressa em Escherichia coli e o anticorpo policlonal obtido. Os níveis de transcritos que codificam para PbGel2p, assim como os de proteína, foram detectados em maior teor na fase miceliana do fungo. O papel de PbGel2p na morfogênese e biossíntese da parede celular foi analisado pela habilidade da proteína em resgatar o fenótipo mutante para GAS1Δ de Saccharomyces cerevisiae. Os resultados indicaram que PbGel2p é uma proteína associada à parede celular que provavelmente atua no alongamento da β-1,3- glicana mediando a integridade da parede celular. Ainda, as interações proteína-proteína preditas entre PbGel2p e outras proteínas de P. brasiliensis usando o sistema de duplo híbrido e pull-down foram: componente 2 da antranilato sintase (envolvida na via do triptofano), proteína SamB com domínio MYND (relacionada com a morfogênese fúngica), proteína Mad2B (requerida na organização do citoesqueleto e controle do ciclo celular), subunidade beta da CpcB (organiza o citoesqueleto de actina), proteína com repetição WD (envolvida no controle do ciclo celular), fosfatidilinositol-4-fosfato-5-quinase (requerida para organização do citoesqueleto de actina), Hsp60 (relacionada à condições de estresse como temperatura) e ATPase (localizada na membrana plasmática/ involvida no metabolismo de glicose). Essas interações sugerem a relação de PbGel2p em outros processos celulares para manutenção da integridade da parede celular.