Vienas pagrindinių biomedicininės paskirties baltymų gamybos iššūkių yra pigių ir saugių ekspresijos sistemų, tinkamų glikoproteinų sintezei, paieška bei esamų sistemų tobulinimas. Vaistai, sukurti baltymų pagrindu, sudaro apie ketvirtadalį naujai patvirtinamų vaistų rinkos, o apie 60% jų sudaryti iš glikoproteinų. Dabar glikoproteinų sintezei naudojamos žinduolių kultūros turi keletą trūkumų. Jose gaunamų rekombinantinių baltymų kaina yra didelė, ribotas tūrinis našumas, ląstelės lėtai dauginasi ir auga, būna užkrėstos retrovirusais, gaunamas heterogeniškas produktas ir užima daug laiko sukurti stabilią ląstelių liniją. Itin intensyviai vykstantis tinkamų ekspresijos sistemų kūrimas kol kas nedavė norimų rezultatų. Mielių, kaip ir augalų bei vabzdžių, ekspresijos sistemos, dėl keletos priežasčių yra įvardijamos kaip vienos pagrindinių kandidatų užimti šią vietą. Visų pirma, mielės yra pripažintos kaip saugus organzimas, jų gentika, biochemija ir fiziologija yra gerai ištirta, be to, sėkmingai pradėti kurti rekombinantiniai mielių kamienai su sudėtingu žinduolių tipo N-glikozilinimu. Vis tik mielėse susintetintų glikoproteinų, tinkamų farmacijos pramonei, skaičius yra labai nedidelis, dažniausiai glikoproteinai nebūna tinkamai suvynioti ir modifikuoti, o esmininės priežastys, paaiškinančios mielių trūkumus sintetinant tokio tipo baltymus, nėra išaiškintos. Eukariotų genų inžinerijos laboratorijoje jau yra sukaupta nemaža patirties sintetinant mielėse virusinius glikoproteinus... [toliau žr. visą tekstą] / Growing market of the glycoprotein based drugs increases demands of safe, cheap and effective expression systems for production of glycoproteins. Mammalian cell cultures, which are being used for this purpose, are very expensive and ineffective. Yeasts are rising as one of the best alternatives. Well known genetics, biochemistry and physiology are only few advantages. Yeasts are also considered to be safe and easy to manipulate organism. Still, despite introducing humanized glycosylation pathways, yeast based expression systems are not able to produce glycoproteins for pharmaceutics, with a very few exceptions. So, further researches in adapting yeast for glycoproteins synthesis must be made. This work is directed for this purpose. In this work mumps, measles and influenza virus surface glycoproteins were expressed in yeast Pichia pastoris. Results show, that mumps virus hemagliutinin-neuraminidase is not synthesized in P.pastoris. Synthesis of measles virus (MeV) hemagliutinin (H) glycoprotein was not effective, with recombinant protein not possessing characteristics of native analogue. MeV-H was found in two forms: unglycosylated polypeptide precursor and glycosylated form, both aggregated and insoluble in non-ionic detergent. Increase in MeV-H expression level resulted in extensive accumulation of unglycosylated MeV-H protein precursors in the cytoplasm of yeast cells. Addition of S.cerevisiae α-factor secretion signal sequence to globular part of MeV-H made... [to full text]

Thesis (MScIng)--University of Stellenbosch, 2007. / Bibliography. Also available via the Internet.

Stuttgart, Univ., Diss., 2002.

Thesis (M.S.)--Worcester Polytechnic Institute. / Keywords: expanded bed chromatography; Pichia pastoris. Includes bibliographical references (leaves 44-45).

Thesis (Ph. D.)--University of Chicago, Pritzker School of Medicine, Department of Molecular Genetics and Cell Biology, June 2002. / Includes bibliographical references. Also available on the Internet.

Thesis (Ph. D.)--University of Chicago, Dept. of Molecular Genetics and Cell Biology, June 2003. / Includes bibliographical references. Also available on the Internet.

Techn. Hochsch., Diss., 2003--Aachen.

NEPOMUCENO, D. R. Expressão em Escherichia coli e Pichia pastoris de uma quitinase antifúngica da família 19 das glicosídeo hidrolases de Chromobacterium violaceum. 2012. 171 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-27T19:39:14Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_drnepomuceno.pdf: 4357475 bytes, checksum: 975d138d8ff4d3744499261b825e0ff2 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-02-27T20:00:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_drnepomuceno.pdf: 4357475 bytes, checksum: 975d138d8ff4d3744499261b825e0ff2 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-27T20:00:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_drnepomuceno.pdf: 4357475 bytes, checksum: 975d138d8ff4d3744499261b825e0ff2 (MD5) Previous issue date: 2012 / Chromobacterium violaceum is a Gram-negative, saprophytic, non-pathogenic and free living bacterium. The annotation of the genome of this species revealed many genes encoding products with potential applications in many areas. Among these products are several chitinases, which are enzymes capable of degrading chitin, a polysaccharide of N-acetyl-β-D-glucosamine. Chitin is found in the cell wall of many fungi and in the exoskeleton of insects and crustaceans. Chitinases are of great biotechnological interest because these enzymes can be used to produce useful derivatives from chitin, and also to be exploited for the control of fungi and insects that cause damages in crops. This study aimed to carry out the biochemical, biological and structural characterization of a recombinant chitinase (CV1897) belonging to family GH19 from C. violaceum ATCC 12472. The complete sequence of the ORF CV1897 (encoding CV1897SP+, with the native signal peptide) was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the vectors pET302/NT-His and pPICZαA, for expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, respectively. The partial sequence of the ORF CV1897 (encoding CV1897SP-, without the native signal peptide) was expressed only in P. pastoris. In E. coli the rCV1897SP+ was mainly produced as insoluble inclusion bodies. In P. pastoris, the two versions of the protein (rCV1897PS+ and rCV1897PS-) were secreted into the culture medium, in their soluble and functional form. The enzymes were purified by affinity chromatography on immobilized nickel ions, with yields of 1.8 mg/L (rCV1897PS+) and 2.1 mg/L (rCV1897PS-), being detected by electrophoresis as two isoforms with different molecular weights. The recombinant chitinase (rCV1897PS+) showed optimal hydrolytic activity at pH 5.0 and was active after treatement at temperatures up to 40 °C for 30 min. The rCV1897 showed chitinolytic activity against colloidal chitin and glycol-chitin on SDS-PAGE. Circular dichroism spectra showed that the protein has predominantly α-helical arrangements (37%), also having 26% of β-strands and 38% disordered structure. The fluorescence spectra revealed that the protein was produced in their folded conformation. The rCV1897PS+ inhibited the conidial germination and mycelial growth of the phytopathogenic fungi Penicillium herquei and Colletotrichum lindemuthianum. Both rCV1897PS+ and rCV1897PS- in combination with fluconazole acted synergistically against different strains of the human pathogenic yeast Candida tropicalis. The biochemical, structural and biological studies of rCV1897 may be useful for biotechnological application of this enzyme. / Chromobacterium violaceum é uma bactéria Gram-negativa, saprófita, não patogênica e de vida livre. A anotação do genoma dessa espécie revelou muitos genes codificando produtos com potenciais aplicações em diversas áreas. Dentre esses produtos estão várias quitinases, enzimas capazes de degradar quitina, um polissacarídeo de N-acetil-β-D-glucosamina presente na parede celular de muitos fungos e no exoesqueleto de insetos e crustáceos. As quitinases são de grande interesse biotecnológico, podendo ser utilizadas para converter quitina em derivados úteis, e também para o controle de fungos e insetos que causam danos em culturas agrícolas. O presente trabalho teve como objetivo realizar a caracterização bioquímica, estrutural e biológica de uma quitinase recombinante (CV1897), da família 19 das glicosil hidrolases, de C. violaceum ATCC 12472. A sequência completa da ORF CV1897 (codificando CV1897PS+, com o peptídeo sinal nativo) foi amplificada por reação em cadeia da polimerase (PCR) e clonada nos vetores pET302/NT-His e pPICZαA para expressão em Escherichia coli e Pichia pastoris, respectivamente. A sequência parcial da ORF (rCV1897PS-, sem o peptídeo sinal nativo) foi expressa apenas em P. pastoris. Em E. coli, a rCV1897PS+ foi produzida principalmente em corpos de inclusão, de forma insolúvel e inativa. Em P. pastoris, as proteínas (rCV1897PS+ e rCV1897PS-) foram secretadas para o meio de cultura de forma solúvel e funcional. As enzimas foram purificadas por cromatografia de afinidade em níquel imobilizado, com rendimentos de 1,8 mg/L (rCV1897PS+) e 2,1 mg/L (rCV1897PS-), sendo detectadas por eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE) como duas isoformas com massas moleculares diferentes (43,2 kDa e 51,4 kDa; 44 e 50 kDa, respectivamente). A quitinase recombinante (CV1897PS+) mostrou atividade ótima em Ph 5,0 e foi ativa quando tratada a temperaturas de até 40 °C por 30 min. A Rcv1897 apresentou atividade quitinásica frente a quitina coloidal e glicol-quitina (em gel SDS-PAGE). Os espectros de dicroísmo circular revelaram que a estrutura da proteína possui predominantemente estrutura secundária do tipo α-hélice (37%), com 26% de fitas-β e 38% de estrutura desordenada. Os espectros de fluorescência revelaram que a proteína foi produzida na sua conformação enovelada. A rCV1897PS+ inibiu a germinação de conídios e o crescimento micelial dos fungos fitopatogênicos Penicillium herquei e Colletotrichum lindemuthianum. As quitinases rCV1897PS+ e rCV1897PS- em associação com o fluconazol atuaram de forma sinérgica contra diferentes cepas da levedura patogênica Candida tropicalis. Os estudos bioquímicos, estruturais e biológicos da rCV1897 poderão ser úteis para aplicação biotecnológica dessa enzima.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2015-12-03T16:47:27Z No. of bitstreams: 1 2015_IaraHolandaValença.pdf: 1038288 bytes, checksum: 2c2ec6fed1c12e7de341a325f0860f59 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-05-19T16:57:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_IaraHolandaValença.pdf: 1038288 bytes, checksum: 2c2ec6fed1c12e7de341a325f0860f59 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-19T16:57:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_IaraHolandaValença.pdf: 1038288 bytes, checksum: 2c2ec6fed1c12e7de341a325f0860f59 (MD5) / Os peptídeos antimicrobianos são importantes moléculas do sistema imune inato dos organismos. Essas moléculas podem interagir com membranas lipídicas, levando a formação de poros ou a desestabilização da mesma, resultando no extravazamento e morte celular. Essa característica revela que os peptídeos antimicrobianos apresentam um possível potencial contra microrganismos patogênicos. No entanto, adquirir essas moléculas para serem imediatamente aplicadas na indústria farmacêutica de seu habitat natural é inviável, já que as quantidades obtidas são muito baixas. Sendo assim, uma opção é a produção por meio da utilização de sistemas heterólogos de expressão. A levedura metilotrófica Pichia pastoris é um dos sistemas de expressão heterólogos mais utilizados. Os peptídeos anticongelantes (antifreeze peptide – AFP), são uma classe de peptídeos antimicrobianos multifuncionais isolados de animais de regiões polares, onde essas moléculas impedem a formação de cristais de gelo nos fluídos corporais desses organismos. O sintético AFP 1.5 é um peptídeo anticongelante retirado do peixe Pleuronectes americanus. Esse peptídeo foi expresso no sistema heterólogo de produção Pichia pastoris. Foi realizada uma expressão com indução por metanol à 0,5% por 48 horas e um ensaio antimicrobiano por disco de difusão contra Escherichia coli. O ensaio antimicrobiano contra E. coli apresentou resultados positivos, com a formação de halos de inibição nos sobrenadantes dos clones 1, 2 e 4. Com o resultado positivo em E. coli se torna necessário novos testes de expressão, a fim de melhorar a produção da proteína recombinante. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Antimicrobial peptides are important molecules of the innate immune system of the organisms. These molecules may interact with lipid membranes, leading to pore formation or the destabilization of the membrane, resulting in leakage and cosnequently cell death. This feature reveals that the antimicrobial peptides are potential drug candidates for antimicribal diseases. However, in order to apply those molecules in the pharmaceutical industry it is not feasible to isolate them from its natural habitat since the relevant amounts are very low. Thus, one option is its production using heterologous expression systems. The methylotrophic yeast Pichia pastoris is one of the most utilized heterologous expression systems. The antifreeze peptides - AFP are a class of multifunctional antimicrobial peptides isolated from animals polar regions, where these molecules prevent the formation of ice crystals in the body fluids of these organisms. The synthetic AFP 1.5 is an antifreeze peptide removed from the fish Pleuronectes americanus. This peptide was produced in Pichia pastoris. An expression induction with 0.5% methanol for 48 hours and an antimicrobial disc diffusion assay against Escherichia coli was performed. The antimicrobial test against E. coli showed positive results with the formation of inhibition zones in the supernatants of clones 1, 2 and 4. With a positive result in E. coli, it is necessary to test new expression, in order to improve production of the recombinant protein.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-08-12Bitstream added on 2014-06-13T18:09:34Z : No. of bitstreams: 1 aizemberg_r_me_arafcf.pdf: 685654 bytes, checksum: d058342c2d66649275266dc34dcb968d (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A levedura Pichia pastoris vem sendo largamente utilizada como um eficiente sistema de expressão para a produção de proteínas heterólogas, pois é um sistema seguro, fácil e mais barato que sistemas de expressão de outros eucariotos. Neste trabalho, a enzima de interesse é a glicerol quinase (GK), que cataliza a transferência do fosfato terminal do ATP para o glicerol originando glicerol-3-fosfato e ADP. Esta reação pode ser utilizada na determinação da concentração de glicerol, subproduto da fermentação alcoólica. A leitura do consumo de glicerol é realizada pela determinação espectrofotométrica do NADH gerado na reação de oxido-redução catalizada pela enzima glicerol-3-fosfato desidrogenase. Este estudo de indução foi realizado em diferentes condições de crescimento da levedura Pichia pastoris. Os resultados mostraram a seleção do melhor clone da levedura Pichia pastoris para a expressão extracelular da enzima glicerol quinase, e a determinação das melhores condições do meio de cultura para a produção da enzima de interesse foram: concentração do meio de cultura BMMY (20 vezes), densidade inicial de célula (0,1 mg/mL), concentração de metanol na fase de indução (1%), natureza do tampão (fosfato de potássio), pH (6,0), suplementação de glicerol no meio BMMY (1%), peptona (marca Difco), sem adição de sulfato de amônio, caseína e glicina, uso do meio BMMY e liofilização do mesmo. Estudos de parâmetros cinéticos foram realizados e a atividade máxima da GK foi obtida em pH 9,8, a 50ºC e 2,5 μM de substrato, por metodologia clássica, além da presença de sulfato de magnésio e diluição da enzima de 30 vezes. A enzima apresentou alta estabilidade térmica ― a atividade foi completamente... / The yeast Pichia pastoris has been widely used as an efficient expression system for production of heterologous proteins because it is a safe, easy and cheaper than expression systems in other eukaryotes.In this studie, the enzyme of interest is glycerol kinase (GK), which catalizes the transfer of terminal phosphate from ATP to glycerol resulting glycerol-3-phosphate and ADP. This reaction can be used in determining the concentration of glycerol, a byproduct of fermentation. The reading of the consumption of glycerol is carried out by spectrophotometric determination of NADH generated in the redox reaction catalyzed by the enzyme glycerol-3-phosphate dehydrogenase. This study of induction was performed in different conditions of growth of the yeast Pichia pastoris. The results show that selecting the best clone of the yeast Pichia pastoris for the expression of extracellular enzyme glycerol kinase, and determining the best conditions of the culture medium for producing the enzyme of interest were: concentration of the culture medium BMMY (20 times), initial cell density (0.1 mg/mL), methanol concentration in the induction phase (1%), nature of buffer (potassium phosphate), pH (6.0), glycerol supplementation in BMMY medium (1%), peptone (Difco), without addition of ammonium sulfate, casein and glycine in BMMY and lyophilized medium. Studies of kinetic parameters were conducted and the GK maximum activity was obtained at pH 9.8 at 50°C and 2.5 μM substrate by conventional method, besides the presence of magnesium sulfate and diluting the enzyme 30 times. The enzyme showed high thermal stability - the activity was fully maintained up to 50°C for one hour - and at pH 7.0 for 7 days and kept under refrigeration, freeze-dried extract showed a decrease in enzymatic activity. Calculated by... (Complete abstract click electronic access below)