O Plasmodium vivax é a espécie causadora de malária de maior distribuição mundial e maior prevalência nas Américas. A complexidade do ciclo de vida do parasito e sua extensa diversidade antigênica têm dificultado a obtenção de uma vacina eficaz e inferem que seja pouco provável que este objetivo seja alcançado utilizando um único antígeno. Neste contexto, a combinação de regiões imunodominantes de antígenos de um ou mais estágios do ciclo de vida do Plasmodium pode ser uma estratégia com melhor prognóstico na indução de resposta imune protetora e duradoura contra a atividade parasitária. Este trabalho avaliou a imunogenicidade, em camundongos, de uma formulação vacinal composta pela mistura dos antígenos CSP, pré-eritrocítico e AMA-1, o qual é expresso em ambos os estágios, préeritrocítico e eritrocítico assexuado. A proteína quimérica yPvCSAllFL, que contém epítopos para células B da região central (repeats) das 3 variantes alélicas PvCSP-VK210, PvCSP-VK247 e PvCSP-P. vivax-like fusionados, e a yPvAMA-1 foram expressas com sucesso em leveduras Pichia pastoris e purificadas por métodos cromatográficos para a imunização de camundongos BALB/c e C57BL/6, na presença do adjuvante Poly(I:C), agonista de TLR3. Por ELISA, foram determinados os títulos de anticorpos, as subclasses de IgG e a avidez destes pelas proteínas indutoras, administradas isoladamente ou em combinação. A resposta de anticorpos anti-yPvCSAllFL mostrou ser linhagem dependente, tendo sido observado altos títulos de anticorpos IgG (106) em C57BL/6, os quais se mantiveram elevados por até 6 meses após a última dose. Os anticorpos anti-yPvCSAllFL, predominantemente IgG1, foram capazes de reconhecer proteínas representando as 3 variantes alélicas. No geral, a coadministração dos antígenos yPvCSAllFL e yPvAMA-1 não comprometeu a resposta de anticorpos individual. Utilizando este protocolo de vacinação não foi possível detectar resposta proliferativa de células TCD3+TCD4+ ou TCD3+TCD8+ específicas após a estimulação com yPvCSAllFL. Os índices de proliferação (8,31%) e o padrão de secreção das citocinas IFN-γ, IL-2, TNF-α e IL-10, associados à yPvAMA-1, sofreram redução com a coadministração de antígenos (6,33%) e alteração, com elevação de IL-2 em detrimento das demais citocinas. Os dados gerados no estudo das formulações vacinais apresentadas neste trabalho podem ser úteis para o desenvolvimento de uma vacina anti-P. vivax, principalmente por explorarem estratégias de combinação e fusão de antígenos. / Plasmodium vivax is the species of malaria more widely distributed worldwide and with higher prevalence in the Americas. The complexity of the parasite life cycle and its extensive antigenic diversity have hampered the achievement of an effective vaccine and infer that it is unlikely that this goal will be achieved using a single antigen. In this context, the combination of immunodominant regions of antigens of one or more stages of the Plasmodium life cycle can be a strategy with better prognosis at inducing protective and durable immune responses against this parasite. Our study assessed the immunogenicity of vaccine formulations consisting of mixture of antigens CSP, pre-erythrocytic and AMA-1, which is expressed in the both stages, pre-erythrocytic and erythrocytic asexual, in mice. The chimeric protein yPvCSAllFL, which contains B-cell epitopes of the central region (repeats) of the 3 allelic variants PvCSP-VK210, PvCSP-VK247 and PvCSP-P. vivax-like fused, and the yPvAMA-1 were successfully expressed in the yeast Pichia pastoris and purified by chromatographic methods for immunization of BALB/c and C57BL/6 mice in the presence of the adjuvant Poly(I:C), a TLR3 agonist. By ELISA, we determined the titles, IgG subclasses and the avidity of the antibodies to these proteins, administered alone or in combination. The immune response to yPvCSAllFL proved to be dependent on mouse strain, having been observed high titers of IgG antibodies (106) in C57BL/6, which remained high for up to 6 months after the last dose. Anti-yPvCSAllFL antibodies, predominantly IgG1, were able to recognize proteins representing the 3 allelic variants. In general, the co-administration of yPvCSAllFL and yPvAMA-1 antigens did not compromise the individual antibodies response. Using this vaccination protocol, we could not detect cell specific proliferative responses of TCD3+TCD4+ or TCD3+TCD8+ after stimulation with yPvCSAllFL. The proliferation (8.31%) and the pattern of secretion of cytokines IFN-γ, IL-2, TNF-α and IL-10, associated with the yPvAMA-1, were reduced during the co-administration (6.33%) and compensated by the elevation of IL-2. The data generated on the study of vaccine formulations presented in this thesis may be useful for the development of a vaccine anti-P. vivax, mainly by exploiting strategies of combination and fusion of antigens.

No experimento 1, avaliou-se os efeitos da leptina exógena na concentração sérica de leptina e na expressão do gene LEP no tecido adiposo de novilhas zebuínas pré-púberes. Amostras de tecido adiposo (mesentérico, perirenal e subcutâneo) e de sangue foram obtidas de 36 novilhas, distribuídas nos tratamentos: A) dieta de alta energia; B) dieta de baixa energia; BL) dieta de baixa energia + 4,8 g/kg PV de oLeptin subcutânea, duas vezes ao dia, por 56 dias. A concentração de leptina foi determinada com kit comercial ELISA (Cusabio) específico. Amostras de sangue de quatro novilhas por grupo foram coletadas em seis pontos no tempo, sendo um antes e um após o tratamento hormonal. Dois dias após a obtenção da puberdade, oito novilhas por grupo foram abatidas para coleta de tecido. A expressão gênica foi quantificada nos depósitos de gordura por PCR em tempo real. A oLeptina aumentou transitoriamente a concentração de leptina do grupo BL, com pico (11,1 ± 1,4 ng/mL) após 7 dias do início do tratamento. A leptina sérica do grupo A aumentou linearmente no tempo, enquanto no grupo B, manteve-se constante (4,0 ± 2,0 ng/mL). A dieta A aumentou a expressão de leptina no tecido adiposo em 2,4 vezes; e a administração de oLeptina diminuiu a expressão do gene LEP em cerca de 2,5 vezes, comparando com o grupo controle. A redução na expressão do gene LEP explica a redução na leptina sérica do grupo BL após 30 dias de tratamento hormonal. O objetivo do experimento 2 foi clonar a região codificadora da leptina bovina, transformar leveduras Pichia pastoris KM71H e expressar a proteína no meio de cultura. O gene da leptina foi amplificado em reação de PCR, a partir de amostra de tecido adiposo subcutâneo de novilha do grupo A. Os primers 5\' - ATTGAATTCGTGCCCATCTGCAAGGTC - 3\' (senso) e 5\' - ATTGTCGACGCACCCGGGACTGAGGT - 3\' (antisenso), contendo sítios EcoRI e SalI, foram desenhados com base na sequência do mRNA da leptina bovina (NM 173928.2), substituindo a sequência sinal de secreção nativa pela sequência do Fator do Saccharomyces cereviasiae. O inserto foi clonado nos vetores de expressão pPICZαA e pGAPZαA (Invitrogen), sendo as leveduras transformadas por eletroporação. Clones com múltiplas cópias do gene foram selecionados em meio YPD + 500 μg/mL de zeocina, e 22 colônias recombinantes foram selecionadas para análise de expressão em pequena escala. Colônias pPICbLep foram inicialmente cultivadas em meio de crescimento (BMGY), sendo transferidas para meio de indução (BMMY), contendo metanol. A indução durou 144 horas. Alíquotas de 200 μl de sobrenadante foram coletadas diariamente, para análise da presença da bLeptina por SDS-PAGE. As colônias pGAPbLep foram cultivadas em meio YPD por 96 h, com coleta de sobrenadante a cada 24 h. As leveduras foram transformadas com sucesso, com os plasmídeos pPICbLep e pGAPbLep, entretanto, apenas as colônias pGAPbLep expressaram uma proteína de 35 kDa, o dobro do tamanho esperado para a bLeptina (17 kDa), provavelmente por ocorrência de dimerização. Mais estudos são necessários sobre os processos de produção de leptina recombinante bovina em Pichia pastoris. / In experiment 1, the effects of exogenous leptin were evaluated on serum leptin levels and on LEP gene expression in the adipose tissue of prepubertal zebu heifers. Adipose tissue (mesenteric, perirenal and subcutaneous) and blood samples were collected from 36 heifers, distributed among treatments: A) high energy diet; B) low energy diet; BL) low energy diet + 4,8 g/kg BW subcutaneous oLeptin, twice daily, for 56 days. Leptin concentration was determined with specific commercial ELISA kit (Cusabio). Blood from four heifer per group was sampled in six time points, one before and one after the hormonal treatment. Two days after puberty attainment , eight heifers per group were slaughter for tissue sampling. Gene expression was quantified in fat depots by real time PCR. The oLeptin increased transiently leptin concentration in group BL, with a peak (11,1 ± 1,4 ng/mL) after 7 days of treatment. Serum leptin in group A increased linearly in time, while in group B it remained constant (4,0 ± 2,0 ng/mL). Diet A enhanced leptin expression in the adipose tissue 2.4-fold, and oLeptin administration decreased de expression 2.5-fold, comparing to the control group. The decrease in LEP gene expression explains the reduction in serum leptin from group BL after 30 d of hormonal treatment. The objective with experiment 2 was to clone de codifying region of bovine leptin, transform KM71H Pichia pastoris yeasts, and express the protein in culture media. The leptin gene was amplified by PCR, from subcutaneous adipose tissue sample from a heifer in group A. Primers 5\' - ATTGAATTCGTGCCCATCTGCAAGGTC - 3\' (forward) and 5\' - ATTGTCGACGCACCCGGGACTGAGGT 3 (reverse), containing EcoRI and SalI restriction sites, were designed based in the mRNA sequence from bovine leptin (NM 173928.2), replacing the native secretion signal sequence by the -factor sequence from Saccharomyces cereviasiae. The insert was cloned in the expression vectors pPICZαA and pGAPZαA (Invitrogen), and yeasts were transformed by electroporation. Clones with multiple copies of the gene were selected in YPD + 500 μg/mL zeocina, and 22 recombinant colonies were selected for a small-scale expression analysis. pPICbLep colonies were initially cultivated in growth media (BMGY), and then transferred to the induction media (BMMY), containing methanol. The colonies were inducted for 144 h. Supernatant aliquots (200 μl) were collected daily, for bLeptin analysis in SDS-PAGE. pGAPbLep colonies were cultivated in YPD media for 96 h, collecting supernatant samples each 24 h. Yeasts were successfully transformed with the plasmids pPICbLep and pGAPbLep, however, only pGAPbLep colonies expressed a protein with 35 kDa, twice the size expected for the bovine leptin (17 kDa), probably because of dimerization. More studies are necessary about the recombinant bovine leptin production processes in Pichia pastoris.

O papilomavirus humano (HPV) é o agente etiológico da infecção sexualmente transmissível mais comum na população mundial. A prevalência da infecção por HPV é estimada em 660 milhões de pessoas e mais de 50% das mulheres serão acometidas pela infecção ao menos uma vez na vida. O HPV é responsável por virtualmente todos os casos de câncer de colo de útero (99%), além de causar muitos outros tipos de câncer de mucosa. O câncer cervical afeta aproximadamente 1.4 milhões de mulheres e 500 mil novos casos surgem anualmente, resultando em 250 mil mortes por ano. Os maiores índices de incidência são observados na América Latina e na África. Duas vacinas contra o HPV são comercializadas desde 2006 por empresas estrangeiras. Entretanto, o custo mínimo da vacinação é superior a 600 reais. Este preço torna sua incorporação pelo sistema de saúde um processo economicamente inviável. Dessa forma, devem ser buscadas alternativas para a produção de uma vacina eficaz, de qualidade e de baixo custo no Brasil. A proteína L1, principal proteína do capsídeo do HPV, tem a propriedade de se auto agregar em partículas semelhantes às virais (VLPs), que são o principal componente das vacinas atuais e possuem muita semelhança com os vírions nativos, introduzindo inclusive, uma imunização predominantemente tipo-específica. Este projeto se propôs a construir e avaliar vetores de expressão visando à produção em larga escala da proteína L1 do HPV 16, o tipo de HPV de maior risco e incidência na população mundial. Foram construídos cinco plasmídeos para Pichia pastoris, uma das principais plataformas industriais de expressão. Eles se diferenciam pelos marcadores de seleção e pelas sequências de manutenção do vetor, mas têm exatamente o mesmo objetivo: gerar sistemas que possuam múltiplas cópias do gene da L1 e que não necessitem da utilização de antibióticos. Essa estratégia foi escolhida porque a produtividade de muitas das proteínas heterólogas tem grande dependência da dosagem gênica e porque o uso de antibióticos encarece muito o custo da produção. Na primeira etapa do projeto foi avaliado um sistema de expressão epissomal auxotrófico, mas ele não se manteve estável ao longo de 60 gerações. Na segunda parte, dois vetores de integração ao sítio do DNA ribossomal foram testados. O sistema mais estável e produtivo foi caracterizado quanto ao número de cópias integradas ao genoma da P. pastoris e ao nível de expressão. O sistema é capaz de produzir clones com mais de 30 cópias do gene da L1 e dois clones expressaram cerca de 20 a 30 miligramas/litro de L1. Adicionalmente outros dois vetores integrativos que utilizam sequências teloméricas para integração foram construídos. Ainda são necessários estudos conjuntos de fermentação em larga escala e purificação da proteína para verificar a viabilidade do sistema / The human papillomavirus (HPV) is the etiologic agent of the sexually transmitted infection most common worldwide. The prevalence of HPV infection is estimated at 660 million people and over 50% of women will be affected by the infection at least once in their lifetime. HPV is responsible for virtually all cervical cancers cases (99%), and causes many other types of mucosal cancer. Cervical cancer affects approximately 1.4 million women, and 500.000 new cases occur annually, resulting in 250.000 deaths per year. The highest incidence rates are seen in Latin America and Africa. Two HPV vaccines are marketed since 2006 by foreign companies. However, the minimum cost of vaccination is higher than 360 dollar. This price makes its incorporation by the Brazilian Health System economically unfeasible. Thus, alternatives must be found to produce an effective vaccine, with low cost and high-quality in Brazil. The L1 protein, the major capsid protein of HPV, has the ability to self aggregate into virus-like particles (VLPs) which are the main component of current vaccines. The VLPs are very similar to the native virions and can introduce an immunization predominantly type-specific. This project aimed to construct and evaluate expression vectors to produce, at large scale, the L1 protein of HPV 16, which is the HPV type at greater risk and incidence in the world. Five plasmids were constructed for Pichia pastoris, one of the major industrial expression platforms. They differ in the selection markers and the vector maintenance sequences, but they have exactly the same goal: to create systems with multiple copies of the L1 gene and that don\'t require the use of antibiotics. This strategy was chosen because the productivity of many heterologous proteins have heavy dependence on gene dosage and because the use of antibiotics is extremely expensive for its production. In the first stage of the project, it was rated an episomal auxotrophic expression system, but it was unstable after a period of 60 generations. In the second part, two vectors for integration in the ribosomal DNA locus were tested. The most stable and productive system was featured on the number of copies integrated into the P. pastoris genome and on the expression level. It was proved that the system is able to produce clones with more than 30 copies of the L1 gene and two clones expressed approximately 20-30 milligrams/liter of L1. Additionally, two other integrative vectors for integration in telomeric sequences were constructed for future testing. More studies on large-scale fermentation and protein purification will be necessary to determine the feasibility of the system.

Os mastócitos, em associação com outras células inflamatórias se acumulam em locais de tumor. Entretanto, pouco é conhecido sobre o papel exato dos mastócitos e de seus mediadores na progressão tumoral e angiogênese. Resultados recentes do nosso laboratório mostraram que a expressão das triptases específicas de mastócitos está correlacionada com a progressão tumoral (de Souza, Jr, PLosOne 7(7): e40790). Além do mais, existe uma associação entre mastócitos e a angiogênese tumoral. Então, tornou-se interessante investigar o papel das quimases específicas de mastócitos (mMCP-4 e -5) neste processo. Visto que estas quimases não são disponíveis comercialmente, a primeira etapa deste estudo foi produzir as quimases mMCP-4 e -5 recombinantes. Assim, as sequências dos genes respectivos para mMCP-4 e -5, além das sequências para seis resíduos de His e do sítio suscetível a enteroquinase foram clonadas no vetor de expressão pPIC9. A cepa GS115 de Pichia pastoris foi transformada com o respectivo vetor para mMCP-4 ou -5. Os clones transformados foram crescidos em meio BMMY e induzidos com várias concentrações de metanol para a produção de mMCP-4 ou -5 recombinantes. Depois de 96 horas, o meio foi centrifugado e as quimases mMCP-4 ou -5 foram purificadas do sobrenadante usando resina de níquel. A identidade das proteínas foi confirmada por Western Blotting usando o anticorpo anti-his, assim como os anticorpos anti-mMCP-4 e -5. As proteases foram ativadas pela clivagem do sítio suscetível a enteroquinase por cinco horas, a 22°C. A ativação das enzimas foi confirmada através da degradação de seus substratos específicos. Estes resultados mostram que P. pastoris é um organismo eficiente para a expressão de ambas as proteases. Estas proteases recombinantes se constituem em ferramentas importantes para se elucidar o papel da mMCP-4 ou -5 na angiogênese. / Mast cells, in association with other inflammatory cells, are known to accumulate at tumor sites. However, little is known about the exact role that mast cells and their mediators play in tumor progression and angiogenesis. Recent results from our laboratory have shown that expression of mast cell specific tryptases correlates with tumor progression (de Souza, Jr, PLosOne 7(7): e40790). Furthermore, there is an association between mast cells and tumor angiogenesis. It then became of interest to investigate the role of mast cell specific chymases (mMCP-4 and -5) in this process. Since these chymases are not commercially available, the first step in this study was to produce recombinant mMCP-4 and -5. The gene sequences for these chymases along with the sequence for six His residues and an enterokinase susceptible peptide were cloned into the expression vector pPIC9. The GS115 strain of Pichia pastoris was transformed with the respective vector for either rmMCP-4 or -5. The transformed clones were grown in BMMY media and induced to produce rmMCP-4 or -5 with various concentrations of methanol. After 96 hours, the medium was centrifuged and rmMCP-4 or -5 was purified from the supernatant using nickel-nitrilotriacetic acid agarose beads. The identity of the proteins was confirmed by Western blotting using an anti-his antibody as well as anti-mMCP-4 and -5. These results show that P. pastoris is an efficient organism in which to express both proteases.

Utilizada amplamente no tratamento de Leucemias Linfoblásticas Agudas, a L-Asparaginase é uma enzima que atua diminuindo a concentração de L-asparagina livre no plasma e, dessa forma, impede a proliferação de células cancerígenas. Isso ocorre porque tais células, ao contrário das células saudáveis, não conseguem sintetizar o aminoácido L-asparagina que necessitam para a síntese proteica por não possuírem a enzima asparagina sintetase devido a um silenciamento genético. A L-Asparaginase utilizada no Brasil era importada e produzida em bactéria, o que gerava problemas com custo e abastecimento, além de causar algumas reações imunológicas aos usuários. Isso impulsiona a encontrar alternativas para produção nacional de tal enzima e, se possível, com menor potencial alergênico. Para isso, foi estudada a produção da enzima L-Asparaginase do gene ASP1 de Saccharomyces cerevisiae em sistema de expressão heteróloga Pichia pastoris através da clonagem do gene sintético (ASP1), com códons otimizados para expressão em P. pastoris, estudo este nunca antes realizado ao que se sabe. Além disso, a produção da enzima foi realizada com auxílio de um planejamento experimental fatorial em agitador orbital levando em conta as variáveis: pH, temperatura e concentração do indutor. A melhor condição encontrada dentre as estudadas neste trabalho foi, a temperatura de 20°C, pH 6,0 e concentração de indutor de 1,5% que alcançou uma atividade de 6,9 U/g de célula e apesar do esforços, o peptídeo sinal utilizado (alfa da S. cerevisiae) não foi capaz de promover a secreção da enzima para o meio extracelular.Deve-se salientar que a realização de um maior número de ensaios através de um planejamento experimental fatorial fracionário para encontrar uma região de rendimentos máximos talvez melhore o ajuste dos modelos mostrados. Este trabalho foi a primeira tentativa de expressão do gene ASP1 de S. cerevisiae em Pichia pastoris até o momento, e pretende-se aprofundar mais este estudo. / Used widely in the treatment of Acute lymphoblastic leukemia, L-Asparaginase is an enzyme that acts by decreasing the concentration of L-asparagine free in the plasma and thus prevents the proliferation of cancer cells. This is because such cells, in contrast to healthy cells can not synthesize L-asparagine amino acid for protein synthesis need not possess the enzyme asparagine synthetase due to a gene silencing. The L-asparaginase used in Brazil was imported and produced in bacteria, which caused problems with cost and supply, as well as cause some immune responses to users. This boosts find alternatives to domestic production of this enzyme and, if possible, less allergenic potential. For this, the production of L-asparaginase enzyme ASP1 Saccharomyces cerevisiae gene heterologous to Pichia pastoris expression system was investigated by cloning the synthetic gene (ASP1), with codons optimized for expression in P. pastoris, this study never before achieved to what is known. Furthermore, the enzyme production was performed with the aid of a factorial design in an orbital shaker taking into account the following variables: pH, temperature and concentration of inducer. The best condition found among those studied in this work was a temperature of 20 ° C, pH 6.0 and concentration of 1.5% inductor attained an activity of 6.9 U / g cell and despite the efforts, used signal peptide (S. cerevisiae alpha) was not able to promote the secretion of the enzyme into the medium extracelular.Deve be noted that the achievement of a greater number of tests using a fractional factorial design yields to find a region maximum might improve the fit of the models shown. This work was the first attempt to ASP1 gene expression of S. cerevisiae in Pichia pastoris to date, and is intended to further deepen this study.

A malária é um problema de saúde pública no Brasil e no mundo. Em 2016, o número de casos estimado pela Organização Mundial de Saúde foi de 216 milhões. Plasmodium falciparum é a espécie mais prevalente e responsável pelo maior número de mortes no mundo, sobretudo no continente africano. Por outro lado, o Plasmodium vivax é conhecido por sua ampla distribuição geográfica, sendo a espécie que predomina nas Américas, incluindo o Brasil. Nos últimos 20 anos, nosso grupo tem gerado e caracterizado diversas proteínas recombinantes baseadas em antígenos imunodominantes de P. vivax que podem servir como base para o desenvolvimento de uma vacina contra malária. Entre os antígenos de merozoítas, uma das principais proteínas em estudo pelo nosso grupo é o Antígeno 1 de Membrana Apical de P. vivax (PvAMA-1), caracterizado previamente como altamente imunogênico em infecções naturais e em camundongos imunizados, na presença de diferentes adjuvantes. O objetivo do presente estudo foi investigar o efeito da diversidade antigênica dessa proteína no reconhecimento por anticorpos específicos e na indução de imunidade contra o parasita. Para isso, foram geradas seis novas proteínas representando diferentes alelos descritos na natureza: PvAMA-1-Belem, PvAMA-1-Sal-I, PvAMA-1-Chesson-I, PvAMA-1-SK0814-apical, PvAMA-1-Indonesia-XIX e PvAMA-1-PNG_62_MU. As proteínas recombinantes foram expressas em leveduras Pichia pastoris e purificadas em duas etapas cromatográficas. Em seguida, as imunizações em camundongos C57BL/6 foram realizadas com as proteínas administradas de forma isolada, ou em combinação, na presença do adjuvante agonista de TLR3 (Poly I:C). Por ELISA, observamos que todas as formulações foram capazes de induzir anticorpos IgG contra as proteínas homólogas e heterólogas, o que sugere que a diversidade antigênica entre as formas alélicas não compromete o reconhecimento. Os dados gerados no presente trabalho sugerem que uma formulação contendo mistura de diferentes alelos representando a proteína AMA-1 pode ser explorada para o desenvolvimento de uma vacina de ampla cobertura contra o P. vivax. / Malaria is a public health problem in Brazil and throughout the world. In 2016, the World Health Organization estimated there were 216 million cases of malaria. Plasmodium falciparum is the most prevalent species and is responsible for the largest number of deaths, especially in the African continent. However, Plasmodium vivax is known for its wide geographic distribution, being the species that prevails in the Americas, including Brazil. In the last 20 years, our group has generated and characterized several recombinant proteins based on immunodominant antigens of P. vivax that can serve as a basis for the development of a malaria vaccine. Among the merozoite antigens, one of the main proteins studied by our group is P. vivax apical membrane antigen-1 (PvAMA-1), previously characterized as highly immunogenic in natural infections and immunized mice, in the presence of different adjuvants. The objective of this study was to investigate the effect of antigenic diversity of this protein in the recognition of specific antibodies and the induction of immunity against the parasite. For this, six new proteins were generated representing different alleles described in nature: PvAMA-1-Belem, PvAMA-1-Sal-i, PvAMA-1-Chesson-i, PvAMA-1-SK0814-apical, PvAMA-1-Indonesia-XIX, and PvAMA-1-PNG_62_MU. Recombinant proteins were expressed in Pichia pastoris yeast and purified by two chromatographic stages. Then, C57BL/6 mice were immunized with these proteins administered in isolation or in combination, in the presence of the TLR3 agonist adjuvant, Poly I:C. Using an enzyme-linked immunosorbent assay, we observed that all formulations induced IgG antibodies against homologous and heterologous proteins. This indicates that antigenic diversity between allele forms does not compromise recognition. This finding suggests that a formulation containing a mixture of different alleles representing the PvAMA-1 protein can be exploited for developing of a wide coverage vaccine against P. vivax.

A enzima L-asparaginase (ASNase) usada como biofármaco no tratamento de Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) é de origem bacteriana, o que provoca reações imunológicas nos paciente e a ASNase usada no Brasil é importada o que dificulta seu uso por razões de abastecimento e de preço. Por outra parte, dentro dos sistemas de expressão de proteínas recombinantes usados pela biotecnologia, destaca-se a Pichia pastoris, levedura metilotrófica de fácil manipulação, crescimento rápido, alta capacidade de expressão e capaz de realizar modificações pós-traducionais. Neste projeto, o gene de ASNase II de Saccharomyces cerevisiae foi expressa em P. pastoris (Muts), tendo sido analisada a localização da enzima nos meios extracelular, intracelular e espaço periplasmático. Além disso, foram avaliadas diversas condições de crescimento e indução da ASNase em agitador orbital e finalmente foi feito o cultivo em biorreator de 3L operado em batelada. Segundo o analise da expressão, a enzima foi localizada no espaço periplasmático. O crescimento de P. pastoris em diferentes concentrações de glicerol (10,0 - 50,0 g.L-1) mostraram parâmetros cinéticos similares (µmáx = 0,35 h-1; tg= 2,0 h) e o maior fator de conversão de substrato em células (Y x/s = 0,9 g g-1) foi obtido com 10,0 g.L-1 de glicerol. A expressão de ASNase somente ocorreu a 20 °C e melhora com concentrações de metanol acima de 1,0% (v/v), obtendo-se a maior produção da enzima a 3% de metanol durante 48 horas, o que foi corroborado pelo planejamento fatorial fraccionado (3n-k + 2), n = 3 e k =1. Também se observou que o pH de indução, a suplementação com aminoácidos ou casaminoácidos e concentração de glicerol durante a fase de crescimento apresentaram pouca ou nenhuma influência na expressão. Entretanto, as células induzidas imediatamente após o glicerol ter sido consumido melhoraram a produção de ASNase. No cultivo em biorreator, a fase de crescimento foi feita com 10,0 e 40,0 g.L-1-1 de glicerol, e a fase de indução com pulsos de 3,0% (v/v) de metanol durante 120 horas. A maior atividade volumétrica (710,2 U.L-1) de ASNase foi obtida na batelada com 40,0 g.L-1 de glicerol e a atividade periplasmática foi constante durante o tempo de cultivo o que significa que o controle do pH afeta positivamente na expressão de ASNase. / The bacterial L-asparaginase (ASNase) is used as biopharmaceutical in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) and non-Hodgkin lymphoma and because his origin causes immune reactions in patients. The ASNase used in Brazil is imported which hinders its use due to supply availability and price. The methylotrophic yeast Pichia pastoris, is a microrganism easy to handle and with fast growth and high capacity of expression of recombinant proteins and that is able to carry out post-translational modifications. In this work, Saccharomyces cerevisiae ASNase II gene was expressed in Pichia pastoris (Muts) and was analyzed its localization in extra and intracellular medium and periplasmic space. Also, different conditions of growth and induction were evaluated in shaker, that culminated in a cultivation carried out in 3L bioreactor operated in batch. According the expression analysis, the enzyme was localized in periplasmic space; Pichia pastoris growth in different concentrations of glycerol (10 - 50 g.L-1) show similar kinetic parameters (µmáx = 0.35 h-1; tg = 2.0 h), with the higher substrate to biomass yield (Y x/s= 0.9 g.g-1) obtained with 10 g.L-1 of glycerol. The ASNase expression only occurred at 20°C and improves with methanol concentrations above 1.0% (v/v) to yield the highest production ASNase 3.0% methanol for 48 hours, which was corroborated by factorial fractionated design (3n-k + 2), n = 3 and k = 1. Also was observed that the pH of induction, supplementation with amino acids or casaminoacids and glycerol concentration during the growth phase had little or null influence on the expression. However the induction immediately after glycerol depletion improved the ASNase production. In bioreactor, were used 10 and 40 g.L-1 of glycerol in the growth phase and in the induction phase were used methanol pulses of 3.0% (v/v) during 120 hours. The major volumetric activity (710,2 U.L-1) of ASNase occurred in batch cultivation with 40 g.L-1 of glycerol and periplasmic activity was almost constant during the process which means that the control of pH affects positively the ASNase expression.

Os produtos de modificação de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) como a subfração eletronegativa [LDL(-)] desempenham um importante papel na progressão da aterosclerose. O acúmulo massivo de LDL modificada captada por macrófagos resulta em células espumosas que liberam mediadores inflamatórios e contribuem para a aterogênese. O scFv (single chain fragment variable) é um fragmento de anticorpo recombinante que contém o sítio completo de ligação ao antígeno. Diante do papel da LDL(-) na aterogênese e da necessidade de novas intervenções terapêuticas que possam inibir o acúmulo de lipídeos em macrófagos, este trabalho objetivou a expressão do scFv anti-LDL(-) 2C7 em Pichia pastoris, bem como a avaliação do efeito deste fragmento de anticorpo sobre a formação de células espumosas em cultura de macrófagos RAW 264.7. O vetor inicial de expressão pPIgLE apresentava como estratégia de detecção e purificação o fusionamento com a proteína A. No entanto, a alta imunogenicidade da proteína A inviabilizaria o estudo da proteína de fusão em cultura de macrófagos, o que determinou a substituição da estratégia de purificação anterior pela cromatografia com resina de níquel através da inserção de hexahistidina na região C-terminal da proteína. A análise de sequenciamento confirmou a presença da inserção e das regiões determinantes de complementariedade. O cassete de expressão com hexahistidina foi inserido no vetor pPIgLE de P. pastoris e transformado na linhagem SMD1168 (Invitrogen®). Testes preliminares de expressão em pequena escala permitiram a análise entre sete clones diferentes, demonstrando uma banda correspondente ao peso molecular de 28 KDa em SDS-PAGE, confirmado por Western Blot. A separação do scFv 2C7 através de resina de níquel obteve uma proteína pura, conforme foi analisado em SDS-PAGE corado com prata. A afinidade do scFv 2C7 a 9 LDL(-) foi confirmada por Dot Blot. O ensaio de captação de LDL(-) demonstrou que o scFv 2C7 foi eficaz na redução de células espumosas e este efeito foi acompanhado pela diminuição na expressão gênica de CD36, TLR-4 e COX-2. Baseado nestes dados, o scFv 2C7 demonstra uma propriedade importante para uma futura intervenção terapêutica para a aterosclerose. / The modification products of low-density lipoprotein (LDL), as the electronegative subfraction [LDL(-)], play an important role in the progression of atherosclerosis. The massive accumulation of modified LDL uptake by macrophages results in foam cells that release inflammatory mediators and contribute to atherogenesis. The scFv (singlechain fragment variable) is a recombinant antibody fragment that contains the complete site antigen-binding. Considering the role of LDL(-) in atherogenesis and the need for new therapeutic interventions that may inhibit the accumulation of lipids in macrophages, this study aimed the expression of anti-LDL(-) 2C7 scFv in Pichia pastoris and the evaluation of the effect of this recombinant antibody fragment on foam cells formation in cultured RAW 264.7 macrophages. The pPIgLE expression initial vector presented as a strategy for detection and purification the fusion with protein A. However, the high immunogenicity of the protein impairs the study of the fusion protein in cultured macrophages, leading to the replacement of the previous strategy of purification by chromatography with nickel resin by inserting hexahistidine tag at the C-terminus of the protein. The sequence analysis confirmed the presence of insertion and the complementary determining regions. The expression cassete with hexahistidine was inserted into the pPIgLE vector of P. pastoris and transformed in the SMD1168 strain (Invitrogen®). Preliminary tests of expression in small-scale allowed the analysis of seven different clones, showing a band corresponding to the molecular weight of 28KDa on SDS-PAGE, confirmed by Western Blot. The separation of 2C7 scFv by the nickel resin yield a pure protein, as it was shown by SDS-PAGE stained with silver. The affinity of 2C7 scFv was confirmed by Dot Blot. The assay of LDL(-) uptake showed that the 2C7 scFv was effective in reducing foam cells and this effect was determined by the decrease in gene expression of CD36, TLR-4 and COX-2. Based on these data, the 2C7 scFv demonstrates an important property for future therapeutic intervention for atherosclerosis

A produção de proteínas terapêuticas recombinantes compreende moléculas complexas e de alto valor agregado, incluindo a enzima glucocerebrosidase (GCase). Sua deficiência resulta na Doença de Gaucher, passível de tratamento por meio da terapia de reposição enzimática. A forma ativa da GCase recombinante usada na terapia apresenta resíduos terminais de manose expostos no seu perfil de glicosilação. Perfil este que espera-se ser reproduzido por meio da construção de uma linhagem de Pichia pastoris com um padrão de glicosilação humanizado, por meio da deleção de dois genes envolvidos no sistema de glicosilação da levedura: alg3 e och1, responsáveis pela posterior hiper-manosilação característica desse organismo. Assim, a expressão da GCase será usada como modelo no desenvolvimento desta linhagem de Pichia pastoris que permita a expressão de glicoproteínas com um perfil humanizado específico de glicosilação. Além da produção da linhagem mutante pela técnica de CRISPR/Cas9, propomos a construção de duas linhagens controle: uma expressando a proteína GCase para análise do seu padrão selvagem de glicosilação em P. pastoris e outra expressando a proteína Cas9 de Streptoccocus pyogenes (SpCas9). A linhagem P. pastoris/GCase foi construída testando-se duas sequências sinal de secreção diferentes: fosfatase alcalina (PHO1) e albumina humana (Alb). Resultados de western blot mostraram a GCase no lisado celular e baixos níveis de proteína secretada no sobrenadante de cultura, sendo mais expresso na linhagem contendo a sequência PHO1. A linhagem P. pastoris/SpCas9 foi construída e a enzima SpCas9 foi detectada via western blot no lisado celular após indução com metanol. Para a produção da linhagem com padrão de glicosilação humanizado propôs-se a deleção dos genes alg3 e och1 e a inserção, pela via de reparo por recombinação homóloga (HDR), de marcas de resistência aos antibióticos higromicina ou canamicina. Para tal, propusemos a construção de dois vetores finais de expressão do sistema CRISPR/Cas9 em P. pastoris, cada um contendo a enzima SpCas9 e os RNAs guia (gRNAs) para deleção do gene alg3 ou och1, e também a construção de dois fragmentos para HDR contendo o gene de resistência ao antibiótico flanqueado por regiões de 1Kb de homologia com a região de deleção do gene alg3 ou och1. A construção dos vetores e fragmentos para HDR foram inicialmente feitas por meio de técnicas de clonagem clássica. No entanto, apesar de inúmeras tentativas, resultados de PCR e sequenciamento mostraram o insucesso das construções. Partiu-se então para a técnica de Gibson Assembly®, através da qual os dois fragmentos para HDR foram construídos. Porém, os vetores de expressão contendo SpCas9 e os gRNAs ainda apresentam dificuldades na sua construção. Esforços ainda estão sendo feitos para a construção dos vetores e consequente tentativa de estabelecimento das linhagens mutantes. O sucesso no estabelecimento de um sistema de expressão de proteínas heterólogas com este padrão de glicosilação humano específico permitirá a obtenção e possível comercialização da GCase em sua forma terapêutica. Além disso, permitirá possíveis edições genômicas futuras para um padrão de maior complexidade de glicosilação humanizado, criando uma plataforma nacional para produção de outras glicoproteínas terapêuticas de interesse biotecnológico. / The production of therapeutic recombinant protein comprises complex and high valued molecules, including the glucocerebrosidase enzyme (GCase). Its deficiency results in Gaucher Disease, susceptible of treatment by enzymatic replacement therapy. The active form of recombinant GCase employed in therapy presents exposed terminal mannose residues in its glycosylation pattern. We hope to reproduce such pattern by constructing a Pichia pastoris strain with a specific human glycosylation pattern through the deletion of two genes involved in yeast glycosylation system, alg3 and och1, responsible for the final hyper-mannosylation characteristic of this organism. Therefore, the expression of GCase will be a case model for the development of the recombinant Pichia pastoris strain that could allow the expression of glycoproteins with a specific humanized glycosylation profile. Despite the establishment of the mutant strain using the CRISPR/Cas9 technique, we propose the construction of two control strains: one expressing the GCase protein for analysis of its wild type glycosylation pattern and another one expressing the Cas9 protein from Streptoccocus pyogenes (SpCas9). The P. pastoris/GCase strain was constructed testing two different secretion signal sequences: alkaline fosfatase (PHO1) and human albumin (Alb). Western blot results have shown GCase in cell lysate and in low expression levels in culture supernatant, being more expressed in the strain containing the PHO1 signal sequence. P. pastoris/SpCas9 strain was constructed and SpCas9 enzyme was detected via western blot in cell lysate after the induction with methanol. To produce the strain with the humanized glycosylation pattern, the deletion of alg3 and och1 genes was proposed along with the insertion, by homology directed repair pathway (HDR), of hygromycin and kanamycin antibiotics resistance marks. In order to do so, we have proposed the construction of two final expression vectors of the CRISPR/Cas9 system in P. pastoris, each one containing SpCas9 enzyme and the guide RNAs (gRNAs) for deletion of alg3 or och1, and also the construction of two fragments for HDR containing the antibiotics resistance gene flanked by 1Kb regions of homology with the deleted regions of alg3 or och1. Vectors and HDR fragments constructions were initially performed using classic cloning techniques. However, despite numerous tries, PCR and sequencing results have shown the failure of the constructions. Then, we moved on to the Gibson Assembly® technique, through which the two HDR fragments were built. Still, the expression vectors containing SpCas9 and the gRNAs presented difficulties in its assembly. Efforts continue to be made to successfully construct the remaining vectors and to establish the mutant lineage. Success in the establishment of a heterologous protein expression system with specific human glycosylation pattern will allow the obtainment and possible commercialization of the therapeutic form of GCase. Furthermore, it will also allow possible future genomic editing to a high complexity human glycosylation pattern, creating a national platform for the production of other therapeutic glycoproteins of biotechnological interest.

"Expanded Bed Chromatography (EBC) is rapidly becoming the preferred choice for initial product recovery from crude process streams as it enables direct protein recovery from culture broths after appropriate dilution. However, the process is time intensive, and there are still some difficulties with very high cell density cultures in the 500 g/L range. Problems include in-column clogging and poor column efficiency. With the development of a new prototype EBC column capable of product recovery from undiluted culture broth, it is proposed in this study to combine the fermentation with EBC recovery. This strategy was tested using a wild type, non-producing strain of Pichia pastoris. Culture broths were spiked with 200 mg/L lysozyme to mimic an actual production fermentation. Key parameters for the process were identified and tested independently to better assess system performance: potential toxic effects of the resin on the culture, nutrient deprivation of the cells as they pass through the column and binding of the target protein from whole broth. The cation exchanger had a negligible effect on cell proliferation in shake flask studies using YNB Medium. Isolation of the culture from the fermenter for up to two hours appeared to have minimal effect on overall cell viability and the ability to metabolize methanol. The dynamic binding capacity for lysozyme was 50 mg/mL in buffer, and 20 mg/mL in undiluted fermentation broth containing 500 g/L cells. When harvested undiluted fermentation broth was allowed to recirculate through the EBC column, the binding capacity was increased to 30 mg/mL. The combination of the fermentation and recovery process allowed for a binding capacity of 30-40 mg/mL, with no dramatic effects on biomass accumulation or metabolic rate."