Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2009. / Submitted by Jadiana Paiva Dantas (jadi@bce.unb.br) on 2011-06-29T23:42:04Z No. of bitstreams: 1 2009_KellyCristinaRodriguesSimi.pdf: 4029652 bytes, checksum: b826daae737141b32d0d9e55a96db197 (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-07-04T18:29:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_KellyCristinaRodriguesSimi.pdf: 4029652 bytes, checksum: b826daae737141b32d0d9e55a96db197 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-04T18:29:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_KellyCristinaRodriguesSimi.pdf: 4029652 bytes, checksum: b826daae737141b32d0d9e55a96db197 (MD5) / A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) é uma doença pandêmica que atinge diversos países no mundo todo. Atualmente, não existe uma vacina eficiente contra o vírus da imunodeficiência (HIV) devido a habilidade do vírus de escapar do sistema imune. Contudo, estudos recentes têm utilizado glicoproteínas do envelope do HIV como potencial alvo para o desenvolvimento de uma vacina capaz de inibir a entrada do vírus na célula hospedeira. Recentemente, nosso grupo selecionou fragmentos de anticorpos (Fabs) de uma biblioteca combinatória de anticorpos de pacientes com osteosarcoma direcionados para um peptídeo sintético de um epítopo neutralizante da gp41. No presente trabalho, foram clonados os Fabs anti-gp41-HIV em vetor de expressão de Pichia pastoris. Após a obtenção das clonagens dos Fabs nesse vetor as respectivas sequências foram confirmadas. A levedura Pichia pastoris tem sido largamente utilizada para a produção de proteínas recombinantes com sucesso. O nível de expressão obtido para os Fabs na levedura Pichia pastoris foi muito baixo. Esses Fabs demonstraram possuir um bom índice de adaptação de códon para a expressão em Pichia pastoris. Dessa forma, ajustes no protocolo de expressão deverão ser realizados. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) is a pandemic deficiency through out the continent. At the moment there is not an efficient vaccine against immunodeficiency virus (HIV) due the virus efficient escape of from the immune system. However, recent studies have used glycoprotein of HIV as a potential target to development a vaccine to inhibit the virus entry into host cells. Recently, our group selected antibody fragments (Fabs) from an antibody combinatorial library of osteosarcoma patients directed to a synthetic biotinilated peptide gp41 neutralizing epitope (576 to 619 amino acids residues). In this work, the Fabs anti-gp41-HIV into a Pichia pastoris were cloned into expression vector. Three Fabs were cloned into this vector with correct sequence. Pichia pastoris has been used extensively and successfully to express recombinant proteins. Unfortunately, the recombinant proteins were expressed in low levels. However, this Fabs showed to have a good codon adaptation index to be expressed in Pichia pastoris, thus adjustment in the protocol must be performed.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Quitinases sÃo enzimas capazes de hidrolisar quitina, um polissacarÃdeo formado por unidades de N-acetil-β-D-glucosamina, que à extremamente abundante na natureza. ApÃs o sequenciamento do genoma de C. violaceum ATCC 12472, alguns genes referentes a proteÃnas com potencial biotecnolÃgico foram encontrados, dentre eles os que codificam para quitinases. Este trabalho teve como objetivos expressar a proteÃna CV2736 de C. violaceum ATCC 12472 de forma recombinante em cÃlulas de Pichia pastoris KM71H e avaliar seu potencial antimicrobiano frente a microrganismos de importÃncia mÃdica. Para isto, a sequencia completa da ORF (CV2736PS+), bem como uma sequencia parcial, codificando uma proteÃna truncada, sem um possÃvel peptÃdeo sinal N-terminal (CV2736PS‒), foram clonadas no vetor de expressÃo pPICZαA, para expressÃo em P. pastoris KM71H. A proteÃna completa (rCV2736PS+) foi detectada em uma fraÃÃo proteica, contendo as proteÃnas secretadas para o meio de cultura, por cÃlulas de P. pastoris transformadas com o respectivo cassete de expressÃo recombinante. A rCV2736PS+ apresentou-se de forma heterogÃnea, quando analisada por SDS-PAGE, exibindo trÃs bandas com massas moleculares aparentes de 41,3, 38,1 e 36,2 kDa, respectivamente, sendo uma delas (41,3 kDa) maior do que se poderia deduzir a partir da sequencia de aminoÃcidos. ApÃs coloraÃÃo com reagente de Schiff para revelaÃÃo de glicoproteÃnas, constatou-se que essa banda (41,3 kDa) correspondia a rCV2736PS+ na sua forma N-glicosilada. AlÃm disso, rCV2736PS+ teve seus peptÃdeos identificados por espectrometria de massas, na fraÃÃo F0/95 do meio de cultura livre de cÃlulas. A proteÃna recombinante produzida sem os 22 aminoÃcidos iniciais (rCV2736PS‒) apresentou atividade quitinÃsica maior que a encontrada para a fraÃÃo contendo rCV2736PS+, apesar de nÃo ter sido detectada por SDS-PAGE. A fraÃÃo F0/95 do meio de cultura contendo rCV2736PS+ mostrou-se termoestÃvel atà 50ÂC e com pico de atividade quitinolÃtica em pH 3,0. A mesma fraÃÃo apresentou maior atividade endoquitinÃsica e ativa contra os substratos sintÃticos 4-nitrofenil N,Nââdiacetil-β-D-quitobiosÃdeo e 4-nitrofenil N,Nâ,Nâââtriacetilquitotriose. A modelagem molecular evidenciou o dobramento na forma de barril (β/α)8 (barril TIM), tÃpico das proteÃnas da famÃlia GH18. Do mesmo modo, a fraÃÃo F0/95 foi testada contra seis espÃcies de bactÃrias, apresentando atividade microbicida contra Pseudomona aeruginosa, Escherichia coli e Staphylococcus aureus, e foi capaz de inibir o crescimento de Salmonella choleraesuis. A mesma fraÃÃo foi testada contra a levedura Candida albicans, mas nÃo foi detectada inibiÃÃo do crescimento contra este microrganismo no ensaio. Portanto, a proteÃna recombinante rCV2736 pode, assim, ser considerada uma molÃcula com potencial antibacteriano. Palavras-chave: Quitinase; Pichia pastoris; antimicrobiano; ExpressÃo heterÃloga. / Chitinases are enzymes capable of hydrolyzing chitin, a polysaccharide composed of units of N-acetyl-D- glucosamine, which is abundant in nature. The genome sequence of C. violaceum ATCC 12472 has revealed some genes encoding proteins with potential applications in agriculture and medicine, such as those encoding chitinases. This study aimed to express the protein CV2736 in Pichia pastoris KM71H and to evaluate its antimicrobial potential against microorganism of medical importance. To this purpose, the full ORF (encoding rCV2736 PS+) and a partial sequence of it, encoding a truncated protein without its putative signal peptide (rCV2736PS‒), were cloned into the vector pPICZ α A for expression in P. pastoris. The protein rCV2736 PS+ was detected in the cell-free culture medium of P. pastoris cells harboring the corre sponding expression cassete. The recombinant CV2736PS+ was produced in a heterogeneous manner, and when analyzed by SDS-PAGE, three protein bands with apparent molecular masses of 41. 3, 38.1 and 36. 2 kDa were detected. The protein band with the highest molecular mass (41.3 kDa) was stained with the Periodic acid - Schiffâs reagent, thus showing that this band corresponds to N-glycosylated rCV2736PS+. Furthermore, tryptic peptides identified by mass spectrometry (ESI-MS) confirmed the identity of the expressed protein. The recombinant protein produced without the first 22 amino acids(rCV2736PS‒) showed higher chitinase activity than that found for th e fraction containing rCV2736PS+, despite not being detected by SDS-PAGE. The recombinant protein CV2736PS+, present in the fraction F0/95 from the culture medium of induced cells, was active after heat treatment at 50 ÂC and its maximum chitinolytic activity was recorded at pH 3.0. This fraction was also able to degrade the synthetic substrates 4-nitrophenyl N,N'-diacetyl -β-D-chitobioside and 4-nitrophenyl N,N',N''-triacet yl chitotrioside, which characterizes an endochitinase activity. Abinitio molecular modeling demonstrated that the polypeptide of CV2736 likely folds as a(β/α)8 barrel (also known as TIM barrel), which is typical of the GH18 family proteins. The fraction F0/95 showed antimicrobial activity against Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus and growth inhibition against Salmonella cholera-suis. The same fraction were evaluated against the yeast Candida albicans, but was not detectable inhibition of this microorganism in the assay. These results suggest that rCV2736 should be further studied as a new anti-bacterial agent.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-15T13:30:04Z No. of bitstreams: 2 Tese ANDRE LUIZ S JESUS.pdf: 4654280 bytes, checksum: 03100a85f4b9571c1491b58a29a7f395 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-15T13:30:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese ANDRE LUIZ S JESUS.pdf: 4654280 bytes, checksum: 03100a85f4b9571c1491b58a29a7f395 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-05-03 / CAPES; CNPq / Os papilomavírus são conhecidos por causarem lesões em tecidos epiteliais em uma variedade de animais. Em bovinos, as doenças associadas ao papilomavírus bovino (BPV) geram perdas econômicas para os criadores. Até agora não existem vacinas ou tratamentos eficazes contra BPV. Esse trabalho teve como objetivo desenvolver estratégias vacinais contra doenças associadas ao BPV. Para a produção de vacinas de subunidade, a levedura Pichia pastoris tem sido utilizada com sucesso para a produção de várias proteínas recombinantes. Os genes L1 de BPV1, 2 e 4 foram clonados em vetor de expressão, sob regulação do promotor induzível por metanol AOX1. Os recombinantes produziram proteína viral, mas em níveis baixos. Para aumentar a produção, foi utilizada a estratégia de otimização dos códons aliada ao uso de bioreator. Alem disso, o gene L1 de BPV1 foi clonado em vetor não comercial, sob controle do promotor constitutivo PGK1. A proteína L1 foi detectada por imunoblot no sobrenadante da cultura dos recombinantes. Como abordagem terapêutica, a imunização genética tem sido empregada com alguns produtos disponíveis no mercado. Os genes L2 e E5 de BPV1 foram clonados em vetor de expressão pCI-neo e as construções foram utilizadas para transfectar células HEK293. A expressão gênica foi detectada por RT-PCR e a produção das proteínas virais foi confirmada por Western blot. O presente estudo apresenta resultados promissores para o desenvolvimento de uma plataforma vacinal contra infecções pelo BPV.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-08-27T14:33:18Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 789582 bytes, checksum: 2a1d5257736b2d9a9615f6069df6a707 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:33:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 789582 bytes, checksum: 2a1d5257736b2d9a9615f6069df6a707 (MD5) Previous issue date: 2017-07-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A dengue é uma doença amplamente distribuída pelo mundo, e representa um grande problema de saúde pública em vários países. As manifestações clínicas podem variar desde uma síndrome viral inespecífica e benigna, até um quadro grave e fatal de doença hemorrágica com choque. O diagnóstico na sua fase inicial é muito importante, pois auxilia no tratamento sintomático do paciente e na adoção de medidas para o controle do vetor, prevenindo a dispersão da doença. Nesse contexto, a detecção de antígenos virais, especialmente a proteína não estrutural 1 (NS1), é uma alternativa muito eficaz para realizar o diagnóstico da dengue. Essa proteína é sintetizada pelas células infectadas, podendo ser detectada nos sobrenadantes das culturas ou no soro de pacientes infectados. Dessa forma, ela pode ser utilizada como antígeno para o desenvolvimento de kits de diagnóstico. No entanto, um grande problema no desenvolvimento de tais kits, consiste na obtenção desses antígenos, que geralmente é realizado por métodos caros, trabalhosos e de difícil execução. Nesse contexto, objetivou-se nesse trabalho utilizar um sistema de expressão eucariótico para produzir as proteínas NS1 dos vírus dengue-1, -3 e -4, e avaliar a sua antigenicidade. O gene otimizado da proteína NS1 do vírus dengue-4 foi clonado no plasmídeo pPICZαA, o qual foi utilizado para transformar leveduras Pichia pastoris por eletroporação. Posteriormente,a levedura transformada foi submetida á indução da expressão da proteína NS1. Outras duas leveduras transformadas, de maneira independente, com dois plasmídeos diferentes (pPICZαA/NS1DENV1 e pPICZαA/NS1DENV3) também foram induzidas a expressar as proteínas NS1 dos vírus dengue-1 e dengue-3. Proteínas de 60 kDa (NS1 DENV4), e duas de 50 kDa (NS1 DENV-1 e NS1 DENV-3) foram obtidas. Essas proteínas mostraram-se antigênicas no teste de Western Blot, demonstrando o seu potencial para serem utilizadas como antígenos para aplicações diagnósticas. / Dengue is a disease widely distributed throughout the world and represents a major public health problem in several countries. Clinical manifestations may range from a benign non-specific viral syndrome to severe and fatal hemorrhagic shock syndrome. The diagnosis in its initial phase is very important, since it assists in the symptomatic treatment of the patient and in the adoption of measures for the control of the vector, preventing the dispersion of the disease. In this context, detection of viral antigens, especially nonstructural protein 1 (NS1), is a very effective alternative for the diagnosis of dengue. This protein is synthesized by infected cells and can be detected in culture supernatants or in the serum of infected patients. In this way, it can be used as antigen for the development of diagnostic kits. However, a major problem in the development of such kits is the procurement of these antigens, which is usually accomplished by costly, laborious and difficult methods. In this context, the objective of this study was to use a eukaryotic expression system to produce the NS1 proteins of dengue-1, -3 and -4 viruses, and to evaluate their antigenicity. The optimized NS1 protein gene of the dengue-4 virus was cloned into the plasmid pPICZαA, which was used to transform Pichia pastoris yeasts by electroporation. Subsequently, the transformed yeast was subjected to the induction of NS1 protein expression. Two other yeasts independently transformed with two different plasmids (pPICZαA/NS1DENV1 and pPICZαA/ NS1DENV3) were also induced to express the NS1 proteins of the dengue-1 and dengue-3 viruses. Proteins of 60 kDa (NS1 DENV4) and two of 50 kDa (NS1 DENV1 and NS1 DENV3) were obtained. These proteins were shown to be antigenic in the Western Blot test, demonstrating their potential to be used as antigens for diagnostic applications.

As the worldwide demand for recombinant proteins and valuable metabolites continues to grow, and as the biological toolset at our disposal continues to expand, the development of novel, robust, and effective platforms for the production of these bioproducts represents an area of ever-increasing interest. Although many such bioprocesses are currently economically viable, many more, though holding considerable promise, remain uncompetitive. The development of novel, more productive systems increases the versatility and industrial applications of bioprocesses. The work described in this thesis explores several aspects of bioprocessing, both on the upstream side, concerned with the development of novel recombinant protein expression platforms or the isolation of novel genes with products possessing characteristics of interest, and on the downstream side, through the improvement of fermentation-based bioprocesses. Thirty-six homoplasmic recombinant strains of the microalga Chlamydomonas reinhardtii were developed having integrated genes for phytase or xylanase under the control of psbA and psbD promoters, codon optimized using novel algorithms, at two different genetic loci, in chloroplasts, to be used as novel animal feed additives. Enzyme production was characterized, and results, when compared to other published work in this field, may provide insight into the factors impacting recombinant protein production in microalgae. Using a “bio-prospecting approach”, the microflora of the digestive tract of a Canadian beaver was screened for cellulase-producing microorganisms. Although the screening approach did successfully identify a novel β-glucosidase gene from an isolated strain of Bacillus thuringiensis, the sequence was not significantly different from those already characterized. Two bioprocessing studies were performed to improve recombinant protein production in Pichia pastoris. In the first, the composition of standard Basal Salt Medium (BSM) was systematically optimized for the production of recombinant phytase, and the optimized media produced significantly more enzyme than the standard one, while also containing significantly reduced concentrations of KH2PO4 and MgSO4·7H2O (27.9 g/l and 4.8 g/l respectively), lowering the price of process inputs. The second was based on the screening of unconventional carbon sources for candidates that could sustain the growth and enzyme production using the same P. pastoris strain. Fructose and ethanol have shown to be viable alternatives to glucose or glycerol as sole carbon sources, and provide flexibility in terms of process design.

Motivated by the surging demand of recombinant proteins and biofuels derived from renewable substrates, increasing attention has been paid to the development of novel strains via metabolic engineering strategies. Pichia pastoris is a eukaryotic platform suitable for protein expression and potentially for biofuel production due to its advantageous traits over Escherichia coli or Saccharomyces cerevisiae. In this thesis, we constructed a xylanase-producing P. pastoris strain. The fungal xylanase Xyn11A was successfully overexpressed under the constitutive GAP promoter. Biochemical characterization of the xylanase revealed that Xyn11A is optimally active at 70 °C and pH 7.4. This xylanase was stable over a wide range of pH ranging from pH 2 to pH 11. Excellent thermal stability was observed at temperature 60 °C. Enhanced production of Xyn11A was achieved by investigating the effect of carbon source and feeding strategies. The highest xylanase activity was detected at 15000 U/mL using high cell density cultivation. Production of optically pure (2R, 3R)-2, 3-BD was achieved by engineering P. pastoris with a heterologous pathway. The pathway genes consisting of Bacillus subtilis alsS, alsD and S. cerevisiae BDH1 were assembled and transformed into P. pastoris. Cultivation conditions were optimized and the highest titer of 2, 3-BD obtained using YPD media was 45 g/L in fed-batch cultivation. To enhance the economic viability of 2, 3-BD production in P. pastoris, statistical medium optimization was performed. It was found that 75 g/L of 2, 3-BD was produced using optimized media in fed-batch cultivation.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L-asparaginase (EC 3.5.1.1), a therapeutic enzyme used in the treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL). Hence, the goal of this work is study the expression and evaluation of hydrolysis activity of native sequence (X12746) encoding for L-asparaginase from Erwinia chrysanthemi NCPBB1125 in the popular expression system Pichia pastoris. The sequence of asn encoded for mature protein was expressed in P. pastoris SMD1168 and X33. SDS-PAGE analysis showed recombinant L-asparaginase was secreted efficiently. Stable and high hydrolysis activity of extracellular L-asparaginase in P. pastoris SMD1168 making it a potential candidate to produce recombinant protein. After purification, a specific band whose appearance approximately 45 kDa indicating the glycosylated protein with specific activity by 6.251 Umg-1 and about 3 folds purifications. / L-asparaginase (EC 3.5.1.1), một loại enzyme được sử dụng trong điều trị bệng ung thư bạch cầu mãn tính ở trẻ em. Mục tiêu của nghiên cứu này là biểu hiện và đánh giá hoạt tính thủy phân của L-asparaginase mã hóa bởi đoạn gene (X12746) tương ứng từ Erwinia chrysanthemi NCPBB1125 được biểu hiện trong nấm men Pichia pastoris. Gene đã được cắt signal peptide và biểu hiện trong P. pastoris SMD1168 and X33. Qua phân tích kết quả điện di SDS-PAGE của môi trường sau lên men, L-asparaginase tái tổ hợp được tìm thấy trong dịch ngoại bào của P. pastoris. Với khả năng sản xuất protein có hoạt tính cao hơn so với chủng P. pastoris X33, SMD1168 được lựa chọn để biểu hiện L-asparaginase tái tổ hợp. Sau khi tinh sạch, sự xuất hiện của một băng có kích khối lượng phân tử xấp xỉ 45 kDa trên điện di SDS-PAGE cho thấy protein tái tổ hợp đã bị glycosyl hóa với hoạt tính riêng 6.251 Umg-1 và đạt độ sạch 3.471 lần.

O maior desafio para a produção de bioenergia continua sendo a precisa desconstrução da parede celular de vegetal. Tendo em vista viabilizar a produção de etanol de segunda geração (2G) em larga escala, bem como otimizar o procedimento de produção do etanol de primeira geração (1G), estudos vêm sendo desenvolvidos com foco na produção de enzimas lignocelulósicas, principalmente as de origem fúngica. Esses estudos visam o aperfeiçoamento de coquetéis enzimáticos, compostos principalmente por enzimas que atacam celulose e hemiceluloses. No entanto, sabemos que as paredes celulares vegetais possuem também pectinas e recentemente foi demonstrado que pectinases podem melhorar sensivelmente o processo de hidrólise (até 30%). Após o levantamento de dados referentes a diferentes enzimas pectinolíticas denominadas endopoligalacturonases (EPGs) já caracterizadas e catalogadas no banco de dados CAZy, foi possível verificar que aquelas produzidas por fungos filamentosos contabilizam mais de 65%. A partir disso foi realizada uma análise filogenética de todas as EPGs caracterizadas produzidas por diferentes organismos. O resultado demonstrou que enzimas dessa família produzidas por bactérias também com interesse biotecnológico são mais próximas de plantas do que dos próprios fungos. Além disso, a proporção de enzimas caracterizadas de bactérias e plantas era significativamente menor que o observado para EPGs de fungos. Isso evidenciou uma lacuna no conhecimento sobre enzimas de plantas, ainda pouco exploradas no contexto de biotecnologia e bioenergia. Este trabalho apresenta a clonagem, expressão heteróloga e caracterização da EPG de cana-de-açúcar recombinante. O principal objetivo é obter informações a respeito de uma enzima com atividade chave na degradação de parede celular, haja vista ter sido ela isolada de um processo de ataque endógeno à pectina da própria cana-de-açúcar. Como resultado, a endopoligalacturonase de Saccharum sp. foi eficientemente expressa em sistema de expressão heterólogo com Pichia pastoris X33. O clone produtor selecionado gerou os maiores valores de proteínas totais no sobrenadante de cultivo com 96 horas de indução com metanol. A partir do extrato bruto do sobrenadante coleta, os melhores valores de atividade enzimática foram obtidos quando da incubação por 22 horas a 45 C em tampão acetato de sódio pH 5,0. Sais, detergentes e quelantes atuaram como inibidores da atividade enzimática e, por outro lado, o agente redutor ditiotreitol (DTT) foi responsável pelo incremento de atividade enzimática. Por fim, os parâmetros cinéticos obtidos para a enzima caracterizada indicam a possibilidade de utilizá-la como complemento de coquetéis enzimáticos, conhecidamente pobres em pectinases. / The biggest challenge for bioenergy production remains the disassembly of the extracellular matrix of some plant species. For the large-scale production of second generation ethanol (2G), and optimizing the first generation ethanol (1G) production process, studies have been developed focusing on the production of lignocellulosic enzymes, especially those of produced by fungi. These studies aim at the improvement of enzymatic cocktails, composed mainly of enzymes that are capable of attacking cellulose and hemicelluloses. However, it is a known fact that the plant cell walls also contain pectins and it has been recently demonstrated that pectinases could significantly improve the hydrolysis process (up to 30%). After an analysis of different pectinolytic enzymes known as endopoligalacturonases (EPGs), already characterized and cataloged under the CAZy database, it was possible to verify that fungi enzymes account for more than 65% of all of the characterized EPGs. The result has shown that enzymes from this family produced by bacteria - also with biotechnological interest - are closer to plants than fungi. Besides, the proportion of characterized enzymes from bacteria and plants was significantly lower than that observed for fungal EPGs. This evidenced a gap in knowledge about plant enzymes, still little explored in the context of biotechnology and bioenergy. This work presents the cloning, heterologous expression, and characterization of recombinant sugarcane EPG. The primary objective is to obtain information about an enzyme with key activity in cell wall degradation since it has been isolated from a process of an endogenous attack on sugarcane pectin itself. As a result, the endopoligalacturonase of Saccharum sp. was efficiently expressed through the heterologous expression system with Pichia pastoris X33. The selected clone generated the highest total protein values in the culture supernatant at 96 hours of methanol induction. From the crude extract of the supernatant collected, the best enzyme activity values were obtained upon incubation for 22 hours at 45°C in pH 5.0 sodium acetate buffer. Salts, detergents, and chelators acted as inhibitors of the enzymatic activity and, on the other hand, the reducing agent dithiothreitol (DTT) was responsible for the increase of enzymatic activity. Finally, the kinetic parameters obtained for the enzyme characterized indicate that it can be used as a complement to enzymatic cocktails, which are known to be poor in pectinases.

Os escorpiões estão entre os animais peçonhentos mais antigos da Terra, existindo por mais de 400 milhões de anos. As peçonhas desses animais contêm uma mistura complexa de proteínas e peptídeos capazes de interagir com alta complexidade no organismo de suas vítimas. No Brasil, o principal gênero de escorpião responsável pelos acidentes é o gênero Tityus, no qual estão inseridas as espécies T. serrulatus, T. bahiensis, T. obscurus e T. stigmurus. A peçonha do T. serrulatus é composta em sua maioria de peptídeos com ação em canais para sódio e potássio, mas possuem também enzimas como hialuronidases, proteases e outros compostos como hipotensinas, peptídeos antimicrobianos (PAMs) e peptídeos potenciadores de bradicinina. Muitos dos componentes encontrados nas peçonhas de escorpiões têm sido estudados por possuírem importantes atividades farmacológicas, como propriedades analgésicas, antimicrobianas, antitumorais e anti-inflamatórias. Todavia, sabe-se que há uma grande dificuldade na obtenção dessas substâncias em consequência do baixo rendimento dos componentes isolados a partir da peçonha. Com isso, atualmente, tem sido utilizada a expressão heteróloga de proteínas para viabilizar a obtenção de toxinas em quantidades suficientes para uso biotecnológico. Diante desse panorama, o presente trabalho teve como objetivo a expressão de dois peptídeos presentes na peçonha de Tityus serrulatus, bem como sua comparação com os peptídeos nativos com relação à sua estrutura e atividade funcional. As toxinas escolhidas foram a Ts8 e a Ts8-propeptídeo, também chamada de scorpine-like, que atuam em canais para potássio (KTxs). As sequências e os cDNAs moldes das toxinas expressas foram obtidos da biblioteca de cDNA da glândula de Tityus serrulatus construída em nosso laboratório. Os genes sintéticos contendo as toxinas de interesse foram transformados em células de Pichia pastoris da linhagem KM71H. A expressão das Ts8 e Ts8-propeptídeo recombinantes revelou a presença das toxinas, porém as mesmas sofreram degradação proteolítica por enzimas da P. pastoris. Dessa forma, foram realizadas as avaliações das expressões na presença de substrato como os casaminoácidos, bem como na diminuição do pH, temperatura e adição de inibidores de protease. Além disso, foi possível obter a rTs8, embora clivada, com atividade sobre canais para potássio. Novas etapas de purificação em colunas de troca iônica e fase reversa foram padronizadas para a obtenção das toxinas nativas a partir da peçonha de T. serrulatus. Adicionalmente, foi possível identificar a presença da Ts8 e Ts8-propeptídeo (scorpine-like) nativas por espectrometria de massas em uma das frações obtidas da cromatografia da peçonha. A adição de casaminoácidos foi favorável para a expressão das toxinas, porém não foi suficiente para minimizar a degradação proteolítica. Ensaios funcionais com os fragmentos das toxinas recombinantes e com as toxinas nativas demonstraram a liberação de citocinas como TNF-? e IL1-? em algumas das toxinas testadas. Além disso, as toxinas demonstraram inibir o crescimento da Pichia pastoris em teste antifúngico e não foram tóxicas para células de macrófagos alveolares nas concentrações testadas. Assim, esse trabalho contribuiu para demonstrar a atividade de enzimas proteolíticas na expressão em P.pastoris, avaliar as condições em que são liberadas, bem como demonstrar a atividade da rTs8 em ensaio eletrofisiológico e a atividade antifúngica das toxinas recombinantes e nativas. / Scorpions are among the oldest venomous animals on Earth, existing for over 400 million years. The venoms of these animals contain a complex mixture of proteins and peptides that can interact with high complexity with their victims. In Brazil, the main genus of scorpions responsible for accidents is Tityus genus, in which the species T. serrulatus, T. bahiensis, T. obscurus and T. stigmurus are inserted. T. serrulatus venom (Tsv) is composed mostly of peptides with action on sodium and potassium channels, but also have enzymes such as hyaluronidases, proteases and other compounds such as hypotensins, antimicrobial peptides (AMPs) and bradykinin potentiating peptides. Many of the components found in scorpion venoms have been studied for their important pharmacological activities, such as analgesic, antimicrobial, antitumor and anti-inflammatory properties. However, it is known that there is great difficulty in obtaining these substances because of the low yield of the isolated components from the venom. With this, the heterologous expression of proteins has been used to enable the production of toxins in sufficient amount for biotechnological purpose. In this panorama, the aim of this study is the expression of two peptides present in the venom of Tityus serrulatus, as well as their comparison with the native peptides in relation to their structure and functional activity. The toxins chosen were Ts8 and Ts8-propeptide, also called scorpine-like, acting on potassium channels (KTxs). Sequences and cDNAs templates of the expressed toxins were obtained from the cDNA library of the Tityus serrulatus gland constructed in our laboratory. Synthetic genes containing the toxins of interest were transformed into Pichia pastoris cells of strain KM71H. Expression of the recombinant Ts8 and Ts8-propeptide revealed the presence of the toxins, but they underwent proteolytic degradation by P. pastoris enzymes. Thus, we evaluate the expression in the presence of substrate as the casamino acids, as well as in the decrease of pH, temperature and addition of protease inhibitors. In addition, rTs8, although cleaved, could be obtained with potassium channel activity. New purification steps in ion exchange and reverse phase columns were standardized to obtain the native toxins from the venom of T. serrulatus. In addition, it was possible to identify the presence of native Ts8 and Ts8-propeptide (scorpine-like) by mass spectrometry in one of the fractions obtained from the venom chromatography. The addition of casamino acids was favourable for toxin expression, but was not sufficient to minimize proteolytic degradation. Functional assays with recombinant toxin fragments and native toxins have demonstrated the release of cytokines such as TNF-? and IL-1? in some of the toxins tested. In addition, the toxins were shown to inhibit the growth of Pichia pastoris in the antifungal test and were not toxic to alveolar macrophages cells at the concentrations tested. Thus, this work contributed to demonstrate the activity of proteolytic enzymes in P.pastoris expression, to evaluate the conditions under which they are released, as well as to demonstrate the activity of rTs8 in the electrophysiological assay and the antifungal activity of recombinant and native toxins