Thiazole biosynthetic protein (THI1) is involved in the synthesis of the thiazole ring, a thiamine (vitamin B1) component. Thiamine is an essential co-factor in several carbohydrate and amino acid metabolic pathways. Prokaryotes and a few eukaryotes, such as fungi and plants, are able to synthesize thiamine de novo. These organisms contain the genes that encode the corresponding enzymes (such as THI1) that perform this metabolic function. THI1 actually functions as a reagent rather than as a conventional catalytic enzyme, as the THI1 polypeptide itself serves as the sulfide donor for thiazole formation. This gene also plays a role in organelle DNA damage tolerance. Arabidopsis thaliana has only one copy of the thi1 gene (At-thi1). Transcripts derived from At-thi1 are targeted simultaneously to chloroplasts and mitochondria by differential usage of two in-frame initiation codons. The tz-201 A. thaliana thi1 mutant has been shown to accumulate more sucrose in its tissues than wild-type plants. This suggests that a better understanding of thi1 genes and the role they play in cellular sucrose accumulation may be relevant for improving commercially important crops such as sugarcane. Sugarcane (Saccharum spp.) is a C4 photosynthesis monocot. Unlike A. thaliana, sugarcane has at least two thi1 copies (sc-thi1.1 and sc-thi1.2), as do the other C4 grasses. This thesis concerns the molecular and functional analyses of sugarcane thi1 (sc-thi1) gene homologues. The identified alleles related to sc-thi1.2 have some differences in sequence and seems to be diverging into two subgroups (sc-thi1.2a and sc-thi1.2b), based on phylogenetic analyses. Expression analysis showed that each sc-thi1 copy is expressed differentially in individual tissues and in developing stages levels. Subcellular analysis showed that sc-thi1.1 and sc-thi1.2b have the same cellular distribution pattern, distinct from the observed for sc-thi1.2a. Sc-thi1.1 and sc-thi1.2b were also able to partially complement thiamine auxotrophy in a yeast mutant deficient in thiamine biosynthesis. A similar complementation assay is not possible in the A. thaliana tz-201 mutant owing to low transformation efficiencies. Thus, Physcomitrella patens was chosen to generate thi1 mutant lines for future functional complementation studies. P. patens is a moss used as a plant model, with a small size, short life cycle and a haploid dominant phase. Despite its simplicity, it has six thi1 homologues copies. Homologous Recombination was used to generate P. patens thi1 mutants. In each case, a target thi1 gene was disrupted by replacing its coding region with an antibiotic resistance gene cassette. Single mutants were obtained for all six thi1 gene copies. All the knockout lines were able to survive and grow with only minor effects on morphology and physiology. Deletion of one of the thi1 gene copies (PpThi1.20F) drastically affected protoplast survival and regeneration, suggesting a role for this gene in early (polar) cell division and differentiation. The experimental design, which permits recycling of the selectable marker cassettes, provides a research platform for the construction of double, triple, quadruple or quintuple mutants in the future. The individual mutants line generated in this work, as well as the possible multiple mutants, will be useful for thi1 functional complementation experiments and for discerning the specific functions of individual thi1 gene family members. / THI1 (proteína da biossíntese de tiazol) está envolvida na síntese do anel de tiazol, um componente de tiamina (vitamina B1). A tiamina é um cofator essencial em várias vias metabólicas de carboidratos e aminoácidos. Somente procariontes e alguns eucariontes, como fungos e plantas, são capazes de sintetizar a tiamina de novo. A proteína THI1 atua mais como um reagente do que como uma enzima catalítica convencional, pois usa a si mesmo como doador de sulfeto para a formação do anel de tiazol. Este gene também está envolvido na tolerância ao dano no DNA das organelas. A. thaliana apresenta apenas uma cópia do gene thi1. Seu transcrito primário é direcionado simultaneamente aos cloroplastos e mitocôndrias através do uso diferencial de dois códons de iniciação, presentes no mesmo quadro aberto de leitura. Além disso, o mutante tz-201 de A. thaliana acumula mais sacarose em seus tecidos do que a planta selvagem. Isso sugere que um melhor entendimento do gene thi1 e seu papel no acúmulo de sacarose podem ser importantes para o melhoramento comercial de cultivares, como cana-de-açúcar. Cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma monocotiledônea de metabolismo fotossintético C4. Diferentemente do observado em A. thaliana, a cana-de-açúcar possui pelo menos duas cópias (sc-thi1.1 e sc-thi1.2) homólogas a thi1, como observado também para outras gramíneas C4. Nesta tese são discutidas análises moleculares e funcionais dos homólogos do gene thi1 (sc-thi1) de cana-de-açúcar. Os alelos identificados como relativos a sc-thi1.2 apresentam algumas diferenças em suas sequências e, baseado em análises filogenéticas, parecem estar divergindo em dois subgrupos (sc-thi1.2a e sc-thi1.2b). As análises de expressão mostraram que cada cópia de sc-thi1 é diferencialmente expressa em diferentes tecidos e estágios de desenvolvimento. A análise de localização subcelular mostrou sc-thi1.1 e sc-thi1.2b apresentam o mesmo padrão de distribuição, distinto do observado para sc-thi1.2a. Sc-thi1.1 e sc-thi1.2b também foram capazes de complementar parcialmente a auxotrofia para tiamina em leveduras mutantes, deficientes na via de biossíntese de tiamina. Um teste similar de complementação funcional mutante tz-201 de A. thaliana não é possível no devido à baixa eficiência de transformação. Assim, Physcomitrella patens foi escolhida para gerar linhagens mutantes de thi1 para futuros estudos de complementação funcional. P. patens é um musgo usado como planta modelo, apresenta tamanho pequeno, um ciclo de vida curto e uma fase dominante haploide. Apesar de sua simplicidade, possui seis cópias homólogas a thi1. A técnica de Recombinação Homóloga foi escolhida para gerar os mutantes thi1 de P. patens. Em cada mutante, uma das cópias de thi1 foi interrompida, substituindo sua região codificante por um cassete de gene de resistência. Mutantes individuais foram obtidos para as seis cópias do gene thi1. As linhagens knockouts foram capazes de sobreviver e crescer apenas com alguns pequenos efeitos em sua morfologia e fisiologia. A deleção de uma das cópias de thi1 (PpThi1.20F) afetou drasticamente a sobrevivência e regeneração dos protoplastos, sugerindo um papel deste cópia gênica no inicio da divisão e diferenciação celular. O desenho experimento utilizado para a geração destes mutantes permite a reciclagem dos cassetes de seleção, fornecendo uma plataforma para a construção de duplos, triplos, quádruplos, quíntuplos e sêxtuplos mutantes no futuro. Os mutantes individuais para cada cópia de thi1 gerados nesse trabalho, bem como os possíveis mutantes múltiplos, serão úteis para experimentos de complementação funcional e o discernimento de funções específicas de diferentes membros da família gênica thi1.

Thiazole biosynthetic protein (THI1) is involved in the synthesis of the thiazole ring, a thiamine (vitamin B1) component. Thiamine is an essential co-factor in several carbohydrate and amino acid metabolic pathways. Prokaryotes and a few eukaryotes, such as fungi and plants, are able to synthesize thiamine de novo. These organisms contain the genes that encode the corresponding enzymes (such as THI1) that perform this metabolic function. THI1 actually functions as a reagent rather than as a conventional catalytic enzyme, as the THI1 polypeptide itself serves as the sulfide donor for thiazole formation. This gene also plays a role in organelle DNA damage tolerance. Arabidopsis thaliana has only one copy of the thi1 gene (At-thi1). Transcripts derived from At-thi1 are targeted simultaneously to chloroplasts and mitochondria by differential usage of two in-frame initiation codons. The tz-201 A. thaliana thi1 mutant has been shown to accumulate more sucrose in its tissues than wild-type plants. This suggests that a better understanding of thi1 genes and the role they play in cellular sucrose accumulation may be relevant for improving commercially important crops such as sugarcane. Sugarcane (Saccharum spp.) is a C4 photosynthesis monocot. Unlike A. thaliana, sugarcane has at least two thi1 copies (sc-thi1.1 and sc-thi1.2), as do the other C4 grasses. This thesis concerns the molecular and functional analyses of sugarcane thi1 (sc-thi1) gene homologues. The identified alleles related to sc-thi1.2 have some differences in sequence and seems to be diverging into two subgroups (sc-thi1.2a and sc-thi1.2b), based on phylogenetic analyses. Expression analysis showed that each sc-thi1 copy is expressed differentially in individual tissues and in developing stages levels. Subcellular analysis showed that sc-thi1.1 and sc-thi1.2b have the same cellular distribution pattern, distinct from the observed for sc-thi1.2a. Sc-thi1.1 and sc-thi1.2b were also able to partially complement thiamine auxotrophy in a yeast mutant deficient in thiamine biosynthesis. A similar complementation assay is not possible in the A. thaliana tz-201 mutant owing to low transformation efficiencies. Thus, Physcomitrella patens was chosen to generate thi1 mutant lines for future functional complementation studies. P. patens is a moss used as a plant model, with a small size, short life cycle and a haploid dominant phase. Despite its simplicity, it has six thi1 homologues copies. Homologous Recombination was used to generate P. patens thi1 mutants. In each case, a target thi1 gene was disrupted by replacing its coding region with an antibiotic resistance gene cassette. Single mutants were obtained for all six thi1 gene copies. All the knockout lines were able to survive and grow with only minor effects on morphology and physiology. Deletion of one of the thi1 gene copies (PpThi1.20F) drastically affected protoplast survival and regeneration, suggesting a role for this gene in early (polar) cell division and differentiation. The experimental design, which permits recycling of the selectable marker cassettes, provides a research platform for the construction of double, triple, quadruple or quintuple mutants in the future. The individual mutants line generated in this work, as well as the possible multiple mutants, will be useful for thi1 functional complementation experiments and for discerning the specific functions of individual thi1 gene family members. / THI1 (proteína da biossíntese de tiazol) está envolvida na síntese do anel de tiazol, um componente de tiamina (vitamina B1). A tiamina é um cofator essencial em várias vias metabólicas de carboidratos e aminoácidos. Somente procariontes e alguns eucariontes, como fungos e plantas, são capazes de sintetizar a tiamina de novo. A proteína THI1 atua mais como um reagente do que como uma enzima catalítica convencional, pois usa a si mesmo como doador de sulfeto para a formação do anel de tiazol. Este gene também está envolvido na tolerância ao dano no DNA das organelas. A. thaliana apresenta apenas uma cópia do gene thi1. Seu transcrito primário é direcionado simultaneamente aos cloroplastos e mitocôndrias através do uso diferencial de dois códons de iniciação, presentes no mesmo quadro aberto de leitura. Além disso, o mutante tz-201 de A. thaliana acumula mais sacarose em seus tecidos do que a planta selvagem. Isso sugere que um melhor entendimento do gene thi1 e seu papel no acúmulo de sacarose podem ser importantes para o melhoramento comercial de cultivares, como cana-de-açúcar. Cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma monocotiledônea de metabolismo fotossintético C4. Diferentemente do observado em A. thaliana, a cana-de-açúcar possui pelo menos duas cópias (sc-thi1.1 e sc-thi1.2) homólogas a thi1, como observado também para outras gramíneas C4. Nesta tese são discutidas análises moleculares e funcionais dos homólogos do gene thi1 (sc-thi1) de cana-de-açúcar. Os alelos identificados como relativos a sc-thi1.2 apresentam algumas diferenças em suas sequências e, baseado em análises filogenéticas, parecem estar divergindo em dois subgrupos (sc-thi1.2a e sc-thi1.2b). As análises de expressão mostraram que cada cópia de sc-thi1 é diferencialmente expressa em diferentes tecidos e estágios de desenvolvimento. A análise de localização subcelular mostrou sc-thi1.1 e sc-thi1.2b apresentam o mesmo padrão de distribuição, distinto do observado para sc-thi1.2a. Sc-thi1.1 e sc-thi1.2b também foram capazes de complementar parcialmente a auxotrofia para tiamina em leveduras mutantes, deficientes na via de biossíntese de tiamina. Um teste similar de complementação funcional mutante tz-201 de A. thaliana não é possível no devido à baixa eficiência de transformação. Assim, Physcomitrella patens foi escolhida para gerar linhagens mutantes de thi1 para futuros estudos de complementação funcional. P. patens é um musgo usado como planta modelo, apresenta tamanho pequeno, um ciclo de vida curto e uma fase dominante haploide. Apesar de sua simplicidade, possui seis cópias homólogas a thi1. A técnica de Recombinação Homóloga foi escolhida para gerar os mutantes thi1 de P. patens. Em cada mutante, uma das cópias de thi1 foi interrompida, substituindo sua região codificante por um cassete de gene de resistência. Mutantes individuais foram obtidos para as seis cópias do gene thi1. As linhagens knockouts foram capazes de sobreviver e crescer apenas com alguns pequenos efeitos em sua morfologia e fisiologia. A deleção de uma das cópias de thi1 (PpThi1.20F) afetou drasticamente a sobrevivência e regeneração dos protoplastos, sugerindo um papel deste cópia gênica no inicio da divisão e diferenciação celular. O desenho experimento utilizado para a geração destes mutantes permite a reciclagem dos cassetes de seleção, fornecendo uma plataforma para a construção de duplos, triplos, quádruplos, quíntuplos e sêxtuplos mutantes no futuro. Os mutantes individuais para cada cópia de thi1 gerados nesse trabalho, bem como os possíveis mutantes múltiplos, serão úteis para experimentos de complementação funcional e o discernimento de funções específicas de diferentes membros da família gênica thi1.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_filipe_de_carvalho_victoria.pdf: 30767989 bytes, checksum: d4b2b8995ad70a6cbd4d6e6ff672fa95 (MD5) Previous issue date: 2011-05-27 / Iron is an essential element for plant development, involved in metabolic processes, such respiration and photosynthesis. However, data regarding the genotype by environment interaction are lacking. Comparative analysis with lower plant groups and crop plants can increase the understanding about these processes. The use of bryophytes as model plants rise as a promising strategy since they present simpler patterns of development. The present work aimed to identify the occurrence patterns of molecular markers in model plant species, as well as to infer about the phylogenetical relationships of gene families related with iron homoestasis in plants, allowing the development of tranfer strategies of genomic data across model and orphan species. Using bioinformatics tools, a survey analysis was performed to detect repetitive elements in EST banks of eleven plant species. To validate the SSR markers found, 100 primer pairs were developed on the microsatelite sequences obtained for Physcomitrella patens Brid. and tested against genomic DNA of Polytrichum juniperinum Hedw. Phylogenetic and divergence time analysis was performed for the gene families Iron Regulated Transporter (IRT), Ferric Redectase Oxidase (FRO), Nicotinamide synthase (NAS), Yellow Stripe-Like (YSL) and Natural Resistance-Associated Macrophage Protein (NRAMP), related to the iron homoestasis, with help of the Bayesian inference and using the rice, Arabidopsis and P. patens genes for the Blast search in distinct land plants species. Also, primers for transposable elements recognizably related to Ysl genes were developed and applied jointly with the SSR primers by the IRAP/REMAP technic searching to find microsatellite markers associated to copies of this gene family. A total of 13,133 SSR markers were discovered in non- redundant EST databases made for all eleven species chosen for this study. The dimer motifs are more frequent in lower plant species, such as green algae and mosses, and the trimer motifs are more frequent for the majority of higher plant groups, such as monocots and dicots. Thirty percent of EST-SSE were successfully transferred with a relative polimorphism information across Physcomitrella patens Brid. and P. juniperinum, being promising for mapping and comparative genome analyses in plants. A total of 243 iron uptake gene sequences for 30 plant species were found using rice and Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. homologues as queries. The evolutionary fingerprinting analyses suggested a positive selective pressure on iron uptake genes for most of the plant homologues analyzed, enabling an optimization and maintenance of gene function. The divergence time analysis indicates IRT as the most ancient gene family and FRO as the most recent. NRAMP and YSL genes appear as a close branch in the evolution of iron uptake gene families. No recent duplication in grasses were found based in the bayesian inference, and paralogue copies were only observed for dicot species. The Nramp cis-acting homology search indicated an ancestral duplication hypothesis for this gene family in grasses. Using IRAP/REMAP techniques, it was observed that YSL homologues in Physcomitrella are surrounded by copia-like retrotransposons as occurs in the maize ZmYSL1 copy. Also Polytrchum juniperinum Hedw. in vitro cultures were estabilished using spores as explants. Protonemal and gametophyte development were obtained using a growth regulator free culture medium. / O ferro é um elemento essencial para o crescimento e desenvolvimento das plantas, envolvido em processos metabólicos essenciais, como fotossíntese e respiração. Porém, são poucos os dados relacionando a interação entre diferentes genótipos e ambientes. Análises comparativas entre plantas inferiores e plantas cultivadas podem possibilitar o melhor entendimento destes processos. O uso de briófitas como modelo para estudos de processos biológicos em plantas surge como uma estratégia promissora devido ao padrão relativamente simples de desenvolvimento destas plantas. O presente trabalho objetivou identificar padrões de ocorrência de marcadores moleculares em plantas modelo, bem como inferir acerca da filogenia das famílias gênicas envolvidas na homoestase do ferro em plantas, possibilitando a criação de estratégias de transferência de informação genômica entre espécies modelo e espécies órfãs. Utilizando ferramentas de bioinformática foram realizadas análises exploratórias para detectar as ocorrências de elementos repetitivos em bancos de ESTs de onze espécies de plantas. Para a validação destes marcadores moleculares foram desenvolvidos 100 conjuntos de iniciadores a partir das sequências contendo microssatélites obtidas para Physcomitrella patens Brid. e testadas contra o DNA genômico de Polytrichum juniperinum Hedw. Foram realizadas análises filogenéticas e de divergência das famílias gênicas Iron Regulated Transporter (IRT), Ferric Redectase Oxidase (FRO), Nicotinamide synthase (NAS), Yellow Stripe-Like (YSL) e Natural Resistance-Associated Macrophage Protein (NRAMP), envolvidas na homoestase de ferro por meio de inferência bayesiana, utilizando genes de arroz, Arabidopsis e Physcomitrella patens Brid. na busca de homólogos em diferentes espécies de plantas terrestres, com o auxílio da ferramenta Blast (NCBI). Também foram desenvolvidos iniciadores para elementos transponíveis reconhecidamente associados a genes Ysl de milho e utilizados conjuntamente com os iniciadores EST-SSR por meio da técnica IRAP/REMAP buscando encontrar marcadores microssatélites associados a cópias desta familia gênica. Como resultados foram identificados 13.133 marcadores microssatélites em bancos de dados não redundantes de regiões expressas (EST) de onze espécies de plantas. Os motivos dinucleotídeos foram mais frequentes em espécies basais, enquanto os motivos trinucleotídeos foram mais frequentes em espécies derivadas. Em 30% dos conjuntos de iniciadores EST SSR testados contra o DNA de P. juniperinum, foi obtido bandas polimórficas promissoras para estudos de mapeamento comparativo e de diversidade genética. Foram encontrados 243 homólogos de genes relacionados as famílias gênicas envolvidas com a homoestase de ferro em trinta espécies de plantas. A análise de fingerprinting realizada sugere que a maioria destes genes estão submetidos a seleção positiva, indicando acúmulo de mutações adaptativas, essencial para a manutenção e otimização da resposta gênica. A análise de tempo de divergência indica que os genes IRT são mais basais e os genes FRO os mais recentes entre as familias gênicas estudadas. As famílias NRAMP e YSL são evolutivamente próximas. A análise bayesiana das sequências e de regiões promotoras dos genes NRAMP não indica duplicações recentes em gramíneas, sendo as duplicações provenientes de divergência ancestral a origem do grupo. Parálogos foram identificados somente em dicotiledôneas. Por meio da transferência de marcadores IRAP/REMAP é observado que genes YSL de P. patens estão cercados por retroelementos do tipo cópia, a exemplo do que ocorre com o gene ZmYSL1 em milho. Também foi estabelecido o cultivo, em condições axênicas, de Polytrichum juniperinum Hedw. utilizando esporos como explantes, onde foi observado que protonemas são obtidos utilizando meio de cultura livre de fitorreguladores, regenerando gametófitos em cultivo in vitro.

Aboveground plant community dynamics in the oligohaline marsh at Big Branch Marsh National Wildlife Refuge, Louisiana, USA, were assessed in response to nutrient loading (3 N x 3 P treatments) and disturbance (both planned lethal disturbance and stochastic tropical storm/hurricane disturbance). Sampling was conducted seasonally from April 2004 to September 2006. Spartina patens and Schoenoplectus americanus are co-dominant plant species in this marsh. Low N-loading additions resulted in increased S. patens cover. However, increased N loading did not result in a shift in plant community composition despite S. americanus consistently having higher leaf tissue N than S. patens. Our results indicate that S. americanus may be more resilient than S. patens to disturbances that do not increase marsh surface elevation. Hurricane Katrina deposited significant amounts of sediment into remaining plots (August 29, 2005). By 2006, this disturbance resulted in a significant increase in both species richness and S. patens cover.

As plantas têm sido utilizadas para fins terapêuticos desde a antiguidade, sendo que atualmente, através de estudos de segurança, de eficácia e de qualidade, são alternativas como possíveis fitoterápicos, ou através de triagens prospectivas, promissoras fontes de moléculas-protótipo candidatas a fármacos. Nos últimos anos, o surgimento de micro-organismos multi-resistentes aos agentes antimicrobianos disponíveis na prática médica tem sido razão de constante preocupação por parte da comunidade cientifica, direcionando a busca por novos antimicrobianos. Talinum patens (L.) Willd (Talinaceae) uma planta encontrada na flora brasileira é amplamente utilizada na culinária e com finalidades terapêuticas na medicina popular. Neste contexto, o objetivo desta pesquisa foi realizar o estudo farmacognóstico de T. patens, incluindo a avaliação das atividades antibacteriana, antifúngica, anti-micobacteriana, leishmanicida e sequestrante de radicais do extrato hidroetanólico seco das folhas, e suas frações: hexânica, acetato-etílica, butanólica e aquosa, além da citotoxicidade. A avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada através dos métodos de difusão em agar e microdiluição em caldo, com obtenção através deste último da concentração inibitória mínima (CIM). O extrato seco apresentou CIM de 250 e 500 µg/ml contra Serratia marcescens e Staphylococcus aureus respectivamente; a fração hexânica, por sua vez, mostrou-se mais eficaz contra bactérias Gram-positivas e leveduras com CIM de 31,2 µg/ml para Micrococcus luteus e Candida albicans e a fração acetato-etílica, contra bactérias Gram-negativas, CIM de 31,2 µg/ml para Escherichia coli. Adicionalmente, na triagem fitoquímica, o extrato seco mostrou reação positiva para saponinas, esteroides e taninos, a fração hexânica mostrou reação positiva para esteroides e a acetato-etílica para saponinas e esteroides. Portanto, as frações hexânica e acetato-etílica das folhas de T. patens apresentaram promissora atividade antimicrobiana, sendo candidatas a estudos futuros na busca de substâncias com ação antimicrobiana, na busca por novos fármacos com atividade frente a bactérias Gram negativas, positivas e fungos patogênicos. Adicionalmente, o extrato seco demonstrou boa atividade sequestrante de radicais DPPH e quantidade significativa de polifenóis (17,4 mg GAE/g de extrato). O extrato seco e as frações com melhor ação antimicrobiana mostraram baixa citotoxicidade. Foram propostos, por espectrometria de massas, os esteroides estigmasterol, b-sitosterol e campesterol como metabólitos presentes nas folhas de T. patens. / Plants have been used for therapeutic purposes since ancient times, and currently, through studies of safety, efficacy and quality they become possible alternatives as herbal medicines, or through prospective trials, promising sources of molecules prototype drug candidates. In recent years, the emergence of multi-resistant micro-organisms to antimicrobial agents available in medical practice has been the reason for continued concern by the scientific community, directing search for new antimicrobials. Talinum patens (L.) Willd (Talinaceae) is a plant widely used in cooking and for therapeutic purposes in folk medicine. In this context, the objective of this research was to carry out a pharmacognostic study of T. patens, including the evaluation of antibacterial, antifungal, anti-mycobacteria, leishmanicidal and radical scavenger from dry leaves hydroethanolic extract and its fractions: hexane, ethyl acetate, butanol and water. Evaluation of the antimicrobial activity was performed by the methods of agar diffusion and broth microdilution, getting through the minimum inhibitory concentration (MIC). Dried extract showed MIC of 250 and 500 mg/​​ml against Serratia marcescens and Staphylococcus aureus respectively, and the hexane fraction was more effective against Gram-positive bacteria and yeasts with MIC of 31.2 mg /ml for Micrococcus luteus and Candida albicans. Ethyl acetate fraction was active against Gram-negative bacteria with MIC of 31.2 mg/ml for Escherichia coli. In addition, at phytochemical screening, dried extract showed a positive reaction for saponins, steroids and tannins. The hexane fraction showed a positive reaction for steroids and ethyl acetate to saponins and steroids. Therefore, hexane and ethyl acetate fractions from T. patens leaves showed promising antimicrobial activity, being candidates for future studies in research for substances with antimicrobial activity and new drug candidates against Gram-negative and positive bacteria and pathogenic fungi. Additionally, dried extract showed good scavenging activity of DPPH radicals and significant concentration of polyphenols (17.4 mg GAE/g extract). It was proposed by mass spectrometry, as secondary metabolites, the steroids stigmasterol, kaempsterol and b-sitosterol. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Photoperiodism refers to the organism’s ability to detect and respond to seasonal changes in the daily duration of light and dark and thus constitutes one of the most significant and complex examples of the interaction between the organism and its environment. This thesis attempts to describe the prevalence of variation in a photoperiodic response, its adaptive value, and its putative genetic basis in a common cruciferous weed, Capsella bursa-pastoris (Brassicaceae). Furthermore, the thesis presents a first comprehensive comparative overview of the circadian clock mechanism in an early land plant, Physcomitrella patens (Bryophyta), thus providing insights into the evolution of the plant circadian system. In an introductory survey of global gene expression changes among early- and late flowering accessions of C. bursa-pastoris we found an enrichment of genes involved in photoperiodic response and regulation of the circadian clock. Secondly, by phenotyping circadian rhythm variation in a worldwide sample of accessions with known flowering time, we detected robust latitudinal clines in flowering time and circadian period length, which constitute strong indications of local adaptation to photoperiod in the shaping of flowering time variation in this species. In an attempt to elucidate putative genetic causes for the correlated variation between circadian rhythm and flowering time, we found that sequence variation and diverged expression in components regulating light input to the clock, PHYTOCHROME B (PHYB) and DE-ETIOLATED 1 (DET1) make them strong candidate genes. Finally, we present a comparative study of circadian network topology in the moss P. patens. Phylogenetic analyses and time series expression studies of putative clock homologues indicated that several core clock genes present in vascular plants appeared to be lacking in the moss. Consequently, while the clock mechanism in higher plants constitutes at least a three-loop system of interacting components, the moss clock appears to comprise only a single loop. We conclude that C. bursa-pastoris is a highly suitable model system for the further elucidation of the molecular variation that influences adaptive change in natural plant populations. Furthermore, we believe that the continuing study of the seemingly less complex circadian network of P. patens not only can provide insights into the evolution of the plant circadian system, but also may help to clarify some of the remaining issues of the circadian clock mechanism in higher plants.

En la tesis se estudian las normas de competencia judicial internacional aplicables por parte de los tribunales españoles en relación a los litigios relativos a la nulidad e infracción tanto de la patente nacional como de las patentes europea y comunitaria. En el primer capítulo se delimita el concepto de competencia judicial internacional y se determinan los intereses rectores de su regulación en el actual momento histórico. Se hace especial hincapié en el estudio del papel que corresponde a los conceptos de soberanía y territorialidad, habida cuenta que ambos han sido utilizados tradicionalmente por la doctrina y la jurisprudencia para rechazar la posibilidad de que las controversias sobre patentes de invención pudieran dirimirse ante jurisdicciones extranjeras.El estudio tiene como principal objeto el análisis del Derecho positivo actualmente en vigor en España (convenio de Bruselas de 1968, así como las normas establecidas al respecto en la Ley Orgánica del Poder Judicial) o con muchas posibilidades de entrar en vigor en un futuro más o menos próximo (Convenio de Lugano de 1988 y el Protocolo de litigios del Acuerdo de patentes comunitarias de 1989). Del estudio de dicha normativa se deduce en primer lugar la exclusión de los litigios relativos al procedimiento de oposición de tercero a la concesión de la patente europea y comunitaría, puesto que estas controversias se atribuyen a las Cámaras de recursos de la Oficina Europea de Patentes, esto es, a instancias administrativas pertenecientes a una Organización internacional. En relación a la patente europea cabe destacar quedel artículo 16.4 del Convenio de Bruselas en relación con el art. V de su Protocolo anejo deriva la necesidad de interponer demandas de nulidad paralelas en cada uno de los Estados para los que se ha otorgado la patente, por lo que hemos considerado oportuno postular, "de lege ferenda", la apertura de un foro concurrente que por razones de proximidad debería radicar en la República Federal de Alemania, Estado sede de la Oficina europea de concesión. Plantea también dificultades la relación existente entre las disputas sobre la validez del derecho de exclusiva y aquellas controversias que tienen por objeto su infracción. La interposición de una excepción o reconvención de nulidad es, de hecho, la defensa natural del demandado por infracción de la patente. De ahí que en el ámbito internacional creen especiales dificultades los sistemas de separación vigentes en Estados como Holanda y Alemania, puesto que tales sistemas se basan precisamente en la atribución de competencia material exclusiva en relación a la validez del derecho a tribunales especiales, mientras que los litigios sobre la violación se dirimen ante los tribunales civiles por las concomitancias de la infracción con la responsabilidad civil extracontractual. Existen asimismo dificultades que derivan de la regulación que establece él Convenio de Bruselas respecto al control de oficio de la competencia judicial internaciohal de carácter exclusivo. A consecuencia del art. 19 del Convenio del 68 el tribunal que conoce de la controversia relativa a la usurpación de la patente debe declinar, de oficio, el conocimiento de la misma, en cuanto se interponga una reconvención de nulidad, puesto que ésta equivale a una demanda priñcipal respecto a una materia reservada de forma exclusiva al conocimiento de los tribunales del Estado de protección.En las disputas que se suscitan en torno a la violación de un derecho de exclusiva son de suma importancia las medidas cautelares de cesación. Al respecto hay que destacar que los artículos 24 del Convenio de Bruselas y Lugano así como la disposición correspondiente de la Ley Orgánica del Poder Judicial posibilitan la solicitud de medidas cautelares ante jurisdicciones distintas a las competentes respecto al litigio sobre el fondo. El "forum praesentiae" debe, sin embargo, construirse de forma que únicamente quepa otorgar medidas cautelares de carácter territorial. Es decir, las medidas cautelares dictadas en virtud de los foros de este tipo se excluirían del régimen de reconocimiento y ejecución establecido por los convenios de Bruselas y Lugano y coexistirían con las medidas provisionales dictadas por los tribunales competentes respecto a las disputas sobre el fondo. Éstas últimas podrían tener carácter extraterritorial y participarían del régimen de libre circulación de decisiones judiciales instaurado por el Convenio de Bruselas.El foro que reviste mayor utilidad en materia de infracción de patentes nacionales y europeas es el foro del domicilio del demandado. Sería, sin embargo, conveniente una interpretación de la norma de conflicto que con carácter unilateral establece el art. 10.4 del Título Preliminar del Código Civil e implícita según la mayor parte de la doctrina en el Convenio de París para la protección de la propiedad industrial que tuviera en cuenta la pérdida de independencia de los derechos de exclusiva en el ámbito comunitario como consecuencia del principio de agotamiento comunitario que ha establecido el Tribunal de Justicia de la Comunidad como consecuencia de la libre circulación de mercancías.En virtud de tal dato es posible acuñar un concepto de "acto de infracción" propio del ámbito conflictual que tenga como eje la localización de la infracción en el mercado nacional en el que se introducen en el comercio los productos protegidos por la patente o directamente derivados del procedimiento protegido por la misma. De esta manera se conseguiría superar al menos en un número considerable de supuestos la fragmentación a la que inexorablemente conduce el principio de territorialidad propio del Derecho material de patentes.En relación a la patente comunitaria destaca la diferente función desempeñada por las normas de competencia judicial internacional establecidas por el Protocolo de litigios del Acuerdo de patentes comunitarias. Dichas normas se subordinan parcialmente a la regulación que el propio Acuerdo introduce respecto a la competencia material puesto que favorecen en todo caso la intervención de los así denominados "tribunales de patentes comunitarias", que no son más que órganos judiciales nacionales designados por los Estados parte en el Acuerdo.Mediante la regulación de la competencia judicial internacional de tales tribunales se trata asimismo de conseguir reducir al máximo el "forum shopping" a través de la reducción de las competencias concurrentes puesto que es la existencia de las mismas lo que posibilita que el actor tenga varias posibilidades de cara a la interposición de la demanda y es lógico que la elección que realice favorezca su interés en detrimento del demandado.El trabajo estudia asimismo las aparentes contradicciones existentes entre el Convenio de Lugano y el acuerdo de patentes comunitarias. Se llega a la conclusión de que desde el punto de vista jurídico se trata de una situación prevista por los redactores del Convenio de Lugano, lo que por ello no produce especiales dificultades de tipo jurídico. Sin embargo, el Acuerdo de patentes comunitarias pone en tela de juicio la propia viabilidad del Convenio de Lugano que puede verse derogado a través de los actos de las instituciones comunitarias que establezcan normas de competencia judicial internacional especiales y derogatorias de las disposiciones del Convenio de Lugano. / The dissertation deals with jurisdiction in patent validity and infringement disputes concerning national patent rights as well as the European patent and the future Community patent. After defining the concept and role of jurisdiction the study analyzes the rules applied by Spanish judges, that is the rules laid down by the 1968 Brussels Convention, the 1988 Lugano Convention and the Spanish "Ley Orgánica del Poder Judicial" as well as the regulation of the 1989 Agreement on the Community patent which is to enter into force in the near future.Patent validity disputes on the European and the Community patent are sometimes dealt with by administrative bodies of the European Patent Office, so that national judges do not interposes. Difficulties arise, nevertheless, about the European patent: in the first place because European patents are invalidated by each national jurisdiction separately and, secondly, because validity is often questioned in infringement disputes and judges with jurisdiction over infringement often lack jurisdiction over validity.Infringement disputes concerning parallel patent rights can be concentrated at the domicile forum of the alleged infringer. This causes, however, some difficulties as regards applicable laws, which could be overcome if the concept of infringement were interpreted in connection with the introduction into commerce of the patent object.Jurisdiction rules plays very different role as regards the Community patent. Due to the regional scope of the patent there is a need to ensure uniform interpretation as well as a desire to avoid as far as possible "forum shopping".

Non-specific lipid transfer proteins is a large and diverse protein family found in plants, with roles in biological systems ranging from long distance signaling to plant pathogen defense. Little is known about the roles of nsLTPs, but recent studies have cast some light on the issue, among other things proposing that they may be involved in the cutice formation on land-living liverworts, mosses and non-seedbearing plants. Increased cuticle formation is thought to be a part of a plants defense system against stress. In this experiment, the expression of nsLTPs type G in the moss Physcomitrella patens was examined by qRT-PCR on cDNA synthesized from already existing mRNA samples from moss under different abiotic stresses. The different stresses were UV-light, salt (ion toxicity), heavy metal, cold drought, plant hormone and osmosis. House-keeping gene P. patens beta-tubuline 1 was used as reference and relative expression analysis was performed. The study showed a general down-regulation of PpLTPg's in the abiotically stressed samples, and the possible coupled regulatory response of PpLTPg3 and PpLTPg5. The results imply that the PpLTPg's in Physcomitrella patens could be connected to biological processes that cease during stress, or that they worl through negative feedback to support plant defense against stress.

Plants are sessile organisms and thus more exposed to stressful environments. By changing the expression of stress related genes, plants are able to cope with stress. Alternative splicing (AS) of pre-mRNA is a major contributor to proteome diversity in eukaryotes. It has been shown that different abiotic stresses affect AS patterns, suggesting a functional role of AS in stress tolerance. The Serine/Arginine-rich proteins (SR proteins) are a conserved family of splicing regulators in eukaryotes. SR proteins are essential for AS and studies have shown that they are themselves subjects to AS after stress exposure which means that they can control their own splicing. In this study, the aim was to characterize the different SR-proteins in the SR subfamily in P. patens, analyze their phylogeny and measure the change in expression of the genes after exposure to five types of stress; osmotic, salinity, dehydration, cold and hormonal. The result showed both individual and overlapping changes in their expression profiles of the three genes. Furthermore, there was an alteration in the alternative splicing pattern for two genes during three of the stresses which resulted in intron retention and possibly a premature termination codon and subseqent non-sense mediated decay.

During the water-to-land transition, that occurred approximately 450 MYA, novel habitats wererevealed to the emerging plants. This terrestrial habitat was a harsh environment compared to theaquatic, with shifting substrate content, irregular supply of water, damaging UV-radiation andrapid fluctuating temperatures. Non-specific lipid transfer proteins (nsLTP) are today only foundin the land living plants and not in the green algae. This suggests that these genes might haveevolved to help the plants cope with the stressful conditions. In this study the expression patternhas been analysed of the nsLTPs in the moss Physcomitrella patens during the possible conditionsthat raised during the water-to-land transition. The moss was exposed to salt, UV-B, drought, copper, cold and osmotic stress. Quantitative real-time PCR was used to analyse the transcription levels. I found that six genes were upregulated during either cold, dehydration or UV-B stress. This suggest that these genes are involved in the plant defense against these abiotic stresse