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Isoflavones have antioxidant activities in vivo, however, their antioxidative potential against oxidative stress initiated by exercise was not explored. The first study investigated the effect of high-genistin isoflavone (HGI) supplementation on erythrocyte antioxidant enzymes and tissues' thiobarbituric reactive substances (TBARS) in acutely exercised one-year old rats. All tissue genistein concentrations increased after exercise. Ingestion of HGI seemingly enhanced running time to exhaustion, and maintained glutathione peroxidase (GPx) and catalase (CAT) activities decreased due to exercise. The second study investigated the dose effect of HGI supplementation. Genistein concentrations were significantly higher (P<0.05) in tissues of rats fed the 1045 PPM HGI diet than in rats fed 522 or 209 PPM HGI diets and increased the glutathione (GSH)/total glutathione (TGSH) ratio (P<0.03). Reductions of the in vivo MDA concentrations (P<0.05) were observed only in the plasma of rats fed 522 and 1045 PPM HGI diets compared to those fed 0 PPM (-1.08, -0.82, and 0.03 mM, respectively). Therefore, isoflavones at 522-1045 PPM HGI diet have antioxidative effects in rats. The last two studies investigated the effect of isoflavone supplementation on the modulation of erythrocyte antioxidant enzyme activities, glutathione homeostasis, and other oxidative biomolecules in healthy young men undergoing 80%VO2pk exercise. In Study 3 exercise at 80%VO2pk increased oxidative stress which was best demonstrated by increased superoxide dismutase (SOD) activity (16.5%), GSH/TGSH ratio, in vivo MDA (12.6%), plasma uric acid (4.9%) and ferric reducing/antioxidant ability (FRAP) ( 7.8%). Therefore, 30 minutes 80% VO2pk exercise induced oxidative stress in moderately active college men. In study 4, four-week HGI supplementation produced plasma genistein and daidzein concentrations of 499 and 415 ng/ml, which were significantly increased to 633 and 539 ng/ml by exercise (P=0.04 and P=0.05). Isoflavones significantly decreased in vivo pre-exercise plasma MDA (P<0.05), increased pre-exercise blood TGSH (P=0.01) and pre-exercise erythrocyte SOD activity (P=0.0006), and maintained the decreased activities of GPx due to exercise at pre-exercise levels. Results demonstrated that isoflavones had antioxidant activity in vivo under normal physiological conditions in healthy young men. They also maintaining GPx activity which was decreased due to exercise, however, isoflavones may not overcome all oxidative stress initiated by intense exercise. / Ph. D.

Lipoxygenasen sind nichthämeisenhaltige Dioxygenasen, die die Bildung von Hydroperoxiden aus molekularem Sauerstoff und mehrfach ungesättigten Fettsäuren katalysieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Lipoxygenase-Ligand-Wechselwirkungen untersucht: a) Durch gezielte Substratveränderungen und ortsgerichtete Mutagenese konnte gezeigt werden, dass Fettsäuren normalerweise mit dem Methylende in der Bindungstasche tierischer Lipoxygenasen gebunden werden. Unterschiedliche Positionsspezifitäten basieren demzufolge auf dem Volumen der Substratbindungstasche (Volumenhypothese). Darüber hinaus konnte bei der 15-Lipoxygenase eine inverse Substratbindung (Carboxylgruppe im aktiven Zentrum) durch Modifikation beider Enden der Fettsäure erzwungen werden, wodurch ausschließlich 5-Lipoxygenierung katalysiert wurde. b) Untersuchungen mit dem Hemmstoff Ebselen ergaben unterschiedliche Hemmmechanismen für verschiedene Enzymzustände. Die Hemmung der Lipoxygenase im Grundzustand (Fe[II]) erfolgt durch kovalente Bindung und Veränderung der Eisenligandensphäre irreversibel nach einem nicht-kompetitiven Mechanismus. Dagegen wird die aktive Lipoxygenase (Fe[III]) nur noch kompetitiv durch Ebselen gehemmt. c) Die Membranbindung der tierischen 15-Lipoxygenase erfolgt über hydrophobe Wechselwirkungen, vermittelt durch oberflächenexponierte, hydrophobe Aminosäuren aus beiden Enzymdomänen. Die Expression einer enzymatisch aktiven Trunkationsmutante, der die N-terminale Domäne fehlt, zeigte, dass diese nicht essentiell ist für die Membranbindung. / Lipoxygenases are nonheme iron-containig dioxygenases that catalyze the oxygenation of polyunsaturated fatty acids to hydroperoxy derivatives. Here, the interaction of lipoxygenases with various ligands was investigated: a) From substrate modifications and site directed mutagenesis it was concluded that fatty acids are bound with their methyl end in the substrate binding pocket of mammalian lipoxygenases. The positional specificity is therefore related to different volumes of this binding pocket (space-based hypothesis). For the 15-lipoxygenase an inverse substrate binding (carboxy terminus in the pocket) could be forced by simultaneous modification of both ends of the fatty acid. This lead to an exclusive 5-lipoxygenation by the 15-lipoxygenase. b) The mechanism of lipoxygenase inhibition by ebselen depends on the enzyme's state. The groundstate lipoxygenase (containing Fe[II]) is irreversibly inhibited in a non-competetive manner due to covalent modification and alteration of the iron ligand sphere. The active enzyme (containing Fe[III]) on the other hand is only competetively inhibited. c) The membrane binding of the mammalian 15-lipoxygenase is based on hydrophobic interactions mediated by solvent exposed, hydrophobic amino acid residues of both enzyme domains. The expression of an enzymatically active truncation mutant, which lacks the entire N-terminal domain, showed that this domain is not essential for membrane binding.

Studies were conducted to investigate the effects of in ovo injection of selenium (Se) either as seleno-methionine (Se-Met) or sodium selenite (Na2SeO3) into the yolk of incubating eggs on tissue Se concentration, embryo livability, lipid peroxidation, immune response and growth performance. When white-shelled eggs were injected with 0.1ml of solutions providing 0, 2.5, 5, 10 or 20 μg Se/egg, no detrimental effects on embryo viability at 20 days of incubation were noted. The effects on tissue Se concentrations suggested that Se-Met and Na2SeO3 were metabolized differently by the chick embryo. In a subsequent study using injection doses up to 60 μg/egg, a greater linear response in tissue Se was obtained with Se-Met, compared with Na2SeO3 (P < 0.01). Minimal changes in heart and breast muscle Se concentrations were noted above the 40 μg dose when Na2SeO3 was used (P > 0.05). In a study with broiler eggs, injection doses of 0, 2.5, 5, 10, 20 and 40 μg Se/egg were used. Se-Met or Na2SeO3 at doses up to 40 μg Se/egg had little effect on embryo viability. Injecting Se-Met resulted in greater tissue Se accumulation than Na2SeO3 at 20 days of incubation. In another study with broiler eggs using injection doses up to 40 μg Se/egg, Se-Met injection resulted in higher hatchability, reduced lipid peroxidation in the lung and heart muscle of the embryos after 20 days incubation and higher Se concentrations in heart and breast muscle of hatched chicks through 7 days and in lung through 21 days of growth. In a feeding trial with broiler breeder hens, adding 0.3 mg/kg of Se as Se yeast or Na2SeO3 to the diet improved tissue Se status at hatching of progeny chicks. Taken together, these results indicate that injection of Se into the yolk of incubating eggs may be useful for enhancing Se status during embryonic and early post-hatch development. Therefore, the improvement in Se status using this method in conjunction with dietary Se supplementation of breeder hens would be much greater than with only using dietary supplementation.

Orientador: Fabiana Ferreira de Souza / Resumo: O plasma seminal e suas proteínas influenciam a qualidade espermática do sêmen refrigerado e congelado em várias espécies, porém sua influência no sêmen refrigerado de cães ainda não está esclarecida. Ainda, diferenças interraciais na expressão de proteínas do plasma seminal que podem interferir na qualidade do sêmen canino não foram relatadas. O objetivo deste estudo foi verificar se a raça canina interfere na composição proteica do plasma seminal e das proteínas espermáticas e correlacioná-las com a refrigeração do sêmen canino na presença e ausência do plasma seminal. Desta maneira, dois experimentos foram realizados. No primeiro experimento as proteínas do plasma seminal e das células espermáticas de 4 raças caninas foram caracterizadas. O sêmen foi colhido, avaliado macro e microscopicamente. O plasma seminal e as células espermáticas foram separadas por centrifugação, refrigerados a 5 ºC e transportados ao laboratório para análise proteômica. Proteínas do plasma seminal e das células espermáticas foram digeridas, submetidas à espectrometria de massas, identificadas e caracterizadas quanto à ontologia gênica. A relação entre as proteínas encontradas e as raças caninas foi avaliada por análise multivariada. Foram encontradas 10 proteínas no plasma seminal e cinco proteínas espermáticas consideradas relevantes. Notou-se diferença na expressão de proteínas espermáticas e do plasma seminal de diferentes raças caninas. Para o segundo experimento, 3 pools do ejaculado de 8 cãe... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Seminal plasma and its proteins influence the sperm quality of chilled and frozen semen in several species, but its influence on the cooled semen of dogs has not yet been clarified. Furthermore, interracial differences in the expression of seminal plasma proteins that may interfere with the quality of canine semen have not been reported. The objective of this study was to verify if the racial pattern interferes in the protein composition of seminal plasma and sperm proteins and to correlate them with the cooling of canine semen in the presence and absence of seminal plasma. In this way, two experiments were performed. In the first experiment the seminal plasma proteins of 5 canine breeds and sperm proteins of 4 breeds were characterized. The semen was collected, evaluated macro and microscopically. Seminal plasma and sperm cells were separated by centrifugation, refrigerated at 5° C and transported to the laboratory for proteomic analysis. Seminal plasma and spermatozoa proteins were digested, submitted to mass spectrometry, identified and characterized for gene ontology. The relationship between the proteins found and the canine breeds was evaluated by multivariate analysis. In the seminal plasma, 10 relevant proteins were found and in the spermatozoa five proteins were considered relevant. Differences were observed in the expression of sperm proteins from different canine breeds. For the second experiment, 3 ejaculate pools of 8 dogs from experiment 1 were used. The morphol... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

As Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) conferem proteção aos seres vivos contra os contínuos ataques de microrganismos, além de serem responsáveis por diversos eventos fisiológicos. No entanto um desequilíbrio entre a produção das EROs e os agentes antioxidantes resulta diversos processos patológicos nos mais variados sistemas em seres humanos e em animais. Durante a gestação ocorrem alterações do metabolismo que podem levar a um aumento de subprodutos da oxidação. Assim como a gestação, o nascimento também impõe um período com alta demanda energética, alta tensão de oxigênio e, por consequência, determina um momento crítico na vida do neonato, por ser exigida uma rápida adaptação da condição hipóxica (intra útero) para hiperóxica (extra útero). Desta forma, o objetivo desta dissertação foi verificar o estado oxidativo das éguas no terço final da gestação, no periparto e no pós-parto levando em consideração o efeito da paridade, bem como a condição oxidativa de neonatos durante os primeiros sete dias de vida. Como indicadores de oxidação foram mensurados os níveis de TBARS e oxidação de proteína. Foi quantificado o ferro total e como parâmetros antioxidantes, foram medidas as atividades das enzimas GPx e SOD, e as concentrações de bilirrubina. Nos potros verificamos que a SOD não apresentou diferença significativa no periodo analisado. As concentrações de bilirrubina foram mais baixas no primeiro tempo avaliado, e tanto a bilirrubina total quanto a indireta elevaram-se às 12 horas e então caíram entre as 72h e 168h. Já a GPx demonstrou aumento da sua atividade nos tempos 12 e 72h quando comparada ao tempo 0h. Verificou-se altos níveis de TBARS no primeiro momento pós-nascimento, uma conseguinte diminuição às 12h seguida de estabilização nos demais tempos. Já a avaliação do período gestacional das éguas indicou um efeito de interação entre paridade e tempo gestacional apenas para o ferro total. SOD e oxidação proteica não apresentaram alterações significantes no período estudado. Tanto a GPx quanto as TBARS apresentaram efeito de tempo, com evidente alteração entre o parto, apresentando aumento e o pós-parto apresentando diminuição de atividade e das concentrações dessas variáveis. Concluímos que em potros, a peroxidação lipídica ao nascimento apresentou-se alta sugerindo um balanço pró-oxidativo durante tal período, o que poderia caracterizar um aumento nos níveis de EROs com finalidade de completar importantes eventos fisiológicos. Quanto a bilirrubina indireta e a GPx podemos sugerir que frente aos altos níveis da peroxidação lipídica houve um estímulo para ativação dos sistemas antioxidantes que envolvem essas biomoléculas e que as duas tenham agido concomitantemente visando equilibrar os níveis de EROs. Com relação às éguas, apontamos que a paridade não tem influencia sobre o estabelecimento da homeostase oxidativa em éguas e que no momento do parto as mesmas passam por um desbalanço oxidativo transiente. Ou seja, o desbalanço oxidativo faz parte tanto do momento do parto quanto da primeira semana de vida dos potros, possivelmente desempenhando um papel fisiológico em abas categorias. / Reactive Oxygen Species (ROS) produced protect living beings against the continuous attacks of microorganisms, as well as being responsible for several physiological events, so oxidative homeostasis is a premise. However, an imbalance between the production of ROS and the antioxidant agents causes several pathological processes in the most varied systems in humans and animals. During pregnancy it is suggested that alterations of the metabolism take place, consequently the increase of by-products of the oxidation during the gestational period. Like gestation, the birth also imposes a period with high energy demand, high oxygen tension and, consequently, it determines a critical moment in the life of the newborn because it is required a rapid adaptation of the same to the change of hypoxic condition (intra uterus) To hyperoxic (extra uterus). The aim of this dissertation was to verify the oxidative status of mares in the final third of gestation, peripartum and postpartum, taking into account the parity effect, as well as the oxidative condition of neonates during the first seven days of life. As oxidation indicators, the levels of TBARS and protein oxidation were measured. Total iron was quantified and as antioxidant parameters, activities of GPx and SOD enzymes, and bilirubin concentrations were measured. In the foals we verified that the SOD showed no significant difference in the analyzed time. Bilirubin concentrations were lower in the first time evaluated, and both total and indirect bilirubin increased at 12 hours and then fell between 72h and 168h. On the other hand, GPx showed an increase in its activity in times 12 and 72h when compared to time 0h. There were high levels of TBARS at the first post-birth moment, a consequent decrease at 12h, followed by stabilization at the other times. The results with mares indicated interaction effect between parity and gestational time only for total iron. SOD and protein oxidation did not present significant alterations in the studied period. Both GPx and TBARS presented a time effect, with an evident alteration between childbirth and postpartum, and there was an increase and decrease, respectively, in the activity and concentrations of these variables. We conclude that in foals, lipid peroxidation at birth was high suggesting a pro-oxidative balance during such period, which could characterize an increase in the levels of ROS in order to complete important physiological events. Regarding indirect bilirubin and GPx, we can suggest that in the face of the high levels of lipid peroxidation there was a stimulus for the activation of the antioxidant systems that involve these biomolecules and that the two have acted concomitantly in order to maintain the high levels of EROs at non detrimental levels. Regarding mares, we pointed out that parity has no influence on the establishment of oxidative homeostasis in mares and that at the time of delivery they undergo transient oxidative imbalance. That is, oxidative imbalance is part of both the calving moment and the first week of life of foals, possibly playing a physiological role in categories.

O aumento da incidência do câncer de pele está associado à maior exposição à luz solar e a adoção de ações de proteção ao Sol é uma estratégia para minimizar os níveis cumulativos de danos à pele. Os raios ultravioletas (UV), ao alcançarem o tecido cutâneo, podem causar eritema, inflamação, fotoenvelhecimento, formação de rugas e imunossupressão, entre outros, devido à formação de espécies reativas de oxigênio (ERO´s). A formação de ERO´s, como o oxigênio singleto, radical ânion superóxido, peróxido de hidrogênio e radical hidroxil, elevam o risco dos danos foto-oxidativos. O desequilíbrio entre a formação de ERO´s e os mecanismos antioxidantes do organismo desencadeia o estresse oxidativo. Na pele, as ERO´s são as responsáveis pelo dano oxidativo no DNA, proteínas e lipídeos. Identificar e quantificar biomarcadores do estresse oxidativo cutâneo é essencial para a correlação entre os raios UV e seus efeitos. Deve-se isto, em parte, à limitação de métodos para quantificar os parâmetros que são diretamente afetados pela exposição aos raios UV, tais como a peroxidação lipídica. São necessários métodos complementares para avaliação da eficácia de fotoprotetores perante os danos causados por este tipo de estresse. Esta pesquisa projeto compreendeu a avaliação ex vivo da eficácia de filtros solares UVB por meio da quantificação da peroxidação lipídica proveniente do estrato córneo removido por tape stripping. Foram preparados sistemas emulsionados do tipo O/A com os filtros octocrileno, metoxicinamato de octila e salicilato de octila. A caracterização funcional da eficácia fotoprotetora in vitro demonstrou que o filtro octocrileno manteve-se estável, mesmo após exposição solar artificial. Os filtros octocrileno (10% p/p), metoxicinamato de octila (10% p/p) e salicilato de octila (5% p/p) alcançaram, após irradiância, respectivamente, os valores de FPS 5,7 &#177; 2,1; 4,7 &#177; 1,5 e 1,0&#177; 0,0. As formulações foram utilizadas na avaliação da eficácia fotoprotetora ex vivo. O método por CLAE, para quantificação da peroxidação lipídica no estrato córneo, possuiu linearidade e demonstrou exatidão e precisão satisfatórias. O estresse pela radiação UV desencadeou a peroxidação lipídica no estrato córneo. Em função do protocolo aplicado, não houve diferenças entre as amostras. A eficácia, com relação à inibição da peroxidação lipídica, foi similar em todas as amostras. / The increasing of incidence of skin cancer is associated with greater exposure to sunlight and the adoption of sun protection actions is a strategy to minimize cumulative levels of skin damage. Ultraviolet (UV) rays, when they reach the cutaneous tissue, can cause erythema, inflammation, photoaging, wrinkling and immunosuppression, among other things, due to the formation of reactive oxygen species (ROS). The formation of ROS, such as singlet oxygen, superoxide anion radical, hydrogen peroxide and hydroxyl radical, raise the risk of photooxidative damage. The variation between the formation of ROS and the antioxidant mechanisms of the organism triggers oxidative stress. In the skin, ROS are responsible for oxidative damage in DNA, proteins and lipids. Identifying and quantifying biomarkers of cutaneous oxidative stress is essential for the correlation between UV rays and their effects. This is partially due to the limitation of methods for quantifying parameters that are directly affected by exposure to UV rays, such as lipid peroxidation. Complementary methods are needed to evaluate the effectiveness of photoprotectors because of the damage caused by this type of stress. This research project had the ex vivo evaluation of the efficacy of UVB sunscreens by quantifying the lipid peroxidation from the stratum corneum removed by tape stripping. Emulsified O/A type systems were prepared with the octocrylene, octyl methoxycinnamate and octyl salicylate filters. The functional characterization of photoprotective efficacy in vitro revealed that the octocrylene filter remained stable even after artificial sun exposure. Octocrylene (10% w / w), octyl methoxycinnamate (10% w / w) and octyl salicylate (5% w / w) respectively reached the values of FPS 5.7 &#177; 2.1; 4.7 &#177; 1.5 and 1.0 &#177; 0.0. The formulations were used in the evaluation of ex vivo photoprotective efficacy. The method by HPLC, for quantification of the lipid peroxidation in the stratum corneum, had linearity and demonstrated satisfactory accuracy and precision. UV radiation stress triggered lipid peroxidation in the stratum corneum. Due to the protocol applied, there were no differences between the samples. The efficacy, compared to the inhibition of lipid peroxidation, was similar in all samples.

A utilização de fatores hepatotróficos (FH) tem trazido importantes avanços no tratamento de algumas doenças hepáticas. A avaliação dos efeitos dessas substâncias pode ser feita com o uso de modelos in vivo, como a regeneração hepática após a hepatectomia parcial ou in vitro, como a cultura de hepatócitos, células estreladas ou outros tipos celulares do fígado. O modelo de cultura demonstra ser útil por possibilitar a análise individualizada de determinadas substâncias ou soluções diretamente nas células-alvo, facilitando o delineamento de seu mecanismo de ação. Dessa forma, o presente trabalho estudou in vitro os efeitos da administração de fatores hepatotróficos (FH) em hepatócitos isolados de fígados de ratos, avaliando seu metabolismo e proliferação celular. Trinta ratos Wistar fêmeas foram utilizados, o fígado retirado e, por digestão enzimática in situ, suas células foram dissociadas e os hepatócitos separados em gradiente de Percoll 45%; cultivados em meio DMEM/F12, tratadas com diferentes concentrações dos FH (1X, 5X e 10X) e analisadas em intervalos de 24, 48 e 72 horas. A viabilidade e a proliferação celular foram avaliadas pelo método colorimétrico MTT, a toxicidade pelo iodeto de propídeo, o potencial elétrico da membrana mitocondrial pela Rodamina 123 e a expressão da citoqueratina 8, 18 e desmina como marcadores do citoesqueleto. O metabolismo hepático foi avaliado pela depuração do verde de indocianina (VIC), pela quantificação de colágeno tipo I e pela formação de radicais lipídicos poliinsaturados peroxidados. A técnica utilizada para a obtenção de hepatócitos mostrou-se eficaz com viabilidade superior a 90%, sem apresentar toxicidade, com manutenção do potencial mitocondrial e com marcação positiva para citoqueratinas 8, 18 e desmina. A adição dos FH aumentou a proliferação dos hepatócitos nos três períodos analisados em relação ao grupo controle. Os FH não demonstraram toxicidade em cultura primária de hepatócitos em nenhuma das concentrações avaliadas ao longo de todos os períodos experimentais. A adição dos FH na concentração de 10X evitou a formação de radicais livres, protegendo os hepatócitos da lipoperoxidação. Por outro lado, a avaliação funcional das culturas primárias pelo teste VIC mostrou-se eficaz na determinação do metabolismo dos hepatócitos, como a manutenção dos níveis das transaminases e amilase. Os hepatócitos mantidos em cultura primária após a adição dos FH em todos os períodos analisados aumentaram a produção de colágeno, e também foram capazes de modificar a distribuição da população de células nas fases quiescentes, aumentando sua capacidade de síntese. A adição dos FH nas concentrações estudadas nas culturas de hepatócitos mostrou-se eficaz na manutenção dessas células, mantendo-se funcionalmente ativos, com a expressão dos marcadores de seu metabolismo e diferenciação. / The use of hepatrotophic hic factors (HF) has provided important advances in the treatment of several hepatic disorders. The evaluation of this treatment may be carried out by in vivo models, as experiments on hepatic regeneration after partial hepatectomy; or in vitro models as culture of hepatocytes, stellate cells or any other hepatic cell. This last model allows an individual analysis of the studied substances on their target cells, providing the possibility of further investigation on the mechanisms involved. Therefore, the present study evaluated the in vitro effects of the hepatotrophic factors administration on the metabolism and proliferation of cultured hepatocytes from normal rat liver. Liver from 30 Wistar rats were used, and after in situ enzimatic dissociation, hepatocytes were collected and separated by 45% Percoll density gradient, cultivated in DMEN/F12 media supplemented with different HF concentrations (1×, 5× and 10×) and finally analyzed at 24, 48 and 72hs intervals. Cell viability and proliferation were assessed by MTT colorimetric assay, cell toxicity by propidium iodide, mitochondrial membrane electrical potential by 123 rodamine test and cytokeratin 8, 18 and desmin as cytoskeleton markers. Hepatic metabolism was evaluated by infusion of indocianine green (ICG), by type I collagen quantification and by peroxided polyunsaturated lipid radicals production. The techniques used in order to collect hepatocytes proved to be efficient, with a viability higher than 90%, no toxicity, and the maintenance of the mitochondrial membrane potential and positive labeling for cytokeratins (CK) 8, 18 and desmin. The HF addition increased the proliferation of hepatocytes in the three periods analyzed, when compared to the control group. The HF did not show any toxicity in primary hepatocytes culture regardless of the concentration evaluated along the experimental periods. The HF addition impaired the production of free radicals, protecting the hepatocytes from the lipid peroxidation. On the other hand, the functional evaluation of primary hepatocytes cultures using the ICG test proved to be efficient in the determination of the hepatocytes metabolism, as the maintenance of the transaminase and amylase levels. The hepatocytes kept in primary culture after HF addition in all the analyzed periods increased the collagen production and were also able to shift the distribution of quiescent cells population of, thus increasing their synthesis capacity. The HF addition in the studied concentrations in hepatocytes cultures proved to be efficient in the maintenance of these cells, that remain functionally active and expressing their metabolism and differentiation characteristic markers.

Submitted by Angela Maria de Oliveira (amolivei@uepg.br) on 2018-10-31T18:51:28Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Bruno Cesar do Espirito Santo.pdf: 2235147 bytes, checksum: 5db508200dcf5ab4b625cfd66f7d76d3 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-31T18:51:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Bruno Cesar do Espirito Santo.pdf: 2235147 bytes, checksum: 5db508200dcf5ab4b625cfd66f7d76d3 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Fundação Araucária de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Paraná / O aumento na produção agrícola deve-se, em boa parte, pelo uso intensivo de agroquímicos, os quais assumem papel relevante. Porém, um dos impactos gerados pelo seu uso é a mudança estrutural e populacional das microbiotas do solo, que precisam de alguma forma tolerar esse xenobióticos para subsistir. São questionados se mecanismos de tolerância são selecionados por pressão seletiva sobre fenótipos específicos ou se existem mecanismos plásticos de adaptação, prescindindo de agentes seletivos específicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar os mecanismos de adaptação e respostas celulares, particularmente de isoenzimas de catalase em Escherichia coli, ao contato com o herbicida glifosato, sem seleção prévia para esse herbicida. Resultados mostraram que a deleção em katG permitiu uma tolerância a doses mais elevadas do herbicida, e que a linhagem katE responde melhor as espécies reativas de oxigênio. Taxas de crescimento nos tratamentos com doses elevadas do herbicida se mostraram menores em relação ao controle, mostrando o efeito tóxico sobre as células bacterianas. As taxas de peróxido de hidrogênio foram aumentadas nos tratamentos com herbicidas, o que provavelmente contribuiu para a diminuição no crescimento bacteriano. A linhagem katE foi a mais eficiente em responder aos níveis de peróxido de hidrogênio induzidos pelo glifosato. Os níveis de MDA mostraram-se parecidos em tratamentos com 50 x glifosato em katE e em katG, corroborando a efetividade e especificidade da enzima HPI (katG) na fase log. Considerando que a E. coli não apresentou um contato prévio com o glifosato, sendo uma linhagem desenvolvida para estudos de laboratório, e não adaptada ao ambiente, o sistema de defesa encontrado nessas linhagens pode ser considerado como modelo para outras bactérias de solo, amplo, não específico para o glifosato. Um sistema de respostas não específicas como esse podem aumentar o valor adaptativo de bactérias em solos agrícolas, nos quais são aplicadas diferentes espécies químicas de herbicidas em um tempo relativamente curto. / The increase in agricultural production is due, in large part, by the intensive use of agrochemicals, which assume a significant role. However, one of the impacts generated by its use is structural change and population of the microbiota of the soil, they need somehow tolerate this xenobiotics to subsist. They are asked whether tolerance mechanisms are selected by selective pressure on specific phenotypes or if there are plastic coping mechanisms, regardless of especific. The selective agents aim of this study was to evaluate the mechanisms of adaptation and cellular responses, particularly isozymes of catalase in Escherichia coli when contact with the herbicide glyphosate, without prior selection for this herbicid.Results showed that deletion in katG allowed a tolerance to higher doses of the herbicide, and that katE lineage responsive reactive oxygen species. Growth rates in the treatments with high doses of the herbicide were lower compared to the control, showing the toxic effect on cells As hydrogen peroxide rates were increased in the treatments with herbicides, which probably contributed to the decrease in bacterial growth . The katE strain was more efficient to respond to hydrogen peroxide levels induced by glyphosate. MDA levels were shown to be similar in treatments with 50 x glyphosate in katE and katG, confirming the effectiveness and specificity of the HPI enzyme (katG) in log. Considering phase that E. coli showed no previous contact with glyphosate, a strain being developed for laboratory studies, and not adapted to the environment, the defense system found that strains can be considered as a model for other soil bacteria, broad, not specific to glyphosate. A system of non-specific responses as this may increase the adaptive value of bacteria in agricultural soils, which are applied in different chemical species of herbicide in a relatively short time.

Doenças desencadeadas ou agravadas pela contaminação ambiental resultante dos poluentes atmosféricos vêm se tornando cada vez mais preocupantes, entre as quais se destacam as doenças respiratórias e cardiovasculares. Vários estudos têm mostrado uma associação entre poluição atmosférica e o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, especialmente devido ao material particulado no ar. Este material, por sua vez, possui diversas substâncias em sua composição química, dentre eles os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), os quais têm sido fortemente associados com o processo inflamatório em estudos in vitro. O benzo[a]pireno (BaP) é um dos HPAs mais importantes, sendo que seu metabólito mais utilizado como biomarcador de exposição é o 1-hidroxipireno (1-HP) urinário. Considerando as doenças cardiovasculares, o infarto agudo do miocárdio (IAM) é um dos desfechos clínicos mais relevantes pela sua alta morbidade e mortalidade. Sabe-se que, além dos efeitos da poluição atmosférica, outros fatores são considerados determinantes no desenvolvimento de doenças cardiovasculares, como o tabagismo, sedentarismo, dislipidemias, histórico familiar, entre outros. Neste contexto, o presente trabalho avaliou a possível associação entre exposição ambiental ao benzo[a]pireno, inflamação e biomarcadores do estresse oxidativo em pacientes com IAM. Fizeram parte deste estudo indivíduos diagnosticados com IAM (N=58) e indivíduos não infartados controles (N=41), sendo cada grupo dividido em fumantes e não fumantes. A concentração urinária de 1-HP foi quantificada por CLAE e os resultados corrigidos pela excreção urinária de creatinina. Análises laboratoriais de rotina como exames hematológicos, bioquímicos, bem como biomarcadores inflamatórios (PCRus) foram quantificados, além de biomarcadores do estresse oxidativo (MDA, SOD, δ-ALA-D, CAT, GPx), antioxidantes não-enzimáticos exógenos (β-caroteno, licopeno, vitamina E e retinol) e carboxihemoglobina (COHb), todos em amostras sangüíneas. Os resultados demonstram aumentos significativos dos níveis de 1-HP urinário, PCRus, MDA e das atividades das enzimas CAT e GPx em pacientes pós-infarto (fumantes e não fumantes) e ainda uma inibição da δ-ALA-D somente no grupo pós-infarto não fumantes, comparados aos grupos controles. Além disso, uma diminuição na atividade enzimática de SOD e dos níveis de β-caroteno foram encontrados nos dois grupos pós-infarto comparados aos grupos controles. Os níveis de COHb não apresentaram alterações significativas nos grupos estudados, exceto para os fumantes, independente do infarto. Correlações positivas de MDA (r=0,326, p=0,01) e CAT (r=0,474, p=0,001) com os níveis urinários de 1-HP foram encontradas. Por outro lado, δ-ALA-D (r=-0,353, p=0,01) e β-caroteno (r=-0,309, p=0,05) foram negativamente correlacionados com a excreção urinária de 1-HP; as correlações foram obtidas somente para os grupos não-fumantes. Os resultados indicam que os indivíduos com IAM apresentam maiores níveis do biomarcador inflamatório PCRus, além de alterações em vários biomarcadores de dano oxidativo em conjunto com um aumento da excreção urinária de 1-HP. Desta forma, estes resultados sugerem que, para uma melhor compreensão da exposição ao benzo[a]pireno e eventos cardiovasculares, o tabagismo deve ser excluído. Ainda, os resultados demonstram que o BaP tende a aumentar a peroxidação lipídica, apesar de aumentar a atividade da catalase. Além disso, o BaP demonstrou inibir a enzima δ-ALA-D e atuar na depleção de β-caroteno. Desta forma, sugere-se que o BaP induz o estresse oxidativo e que este aumento, isoladamente e/ou em conjunto com o metabólitos ativos do benzo[a]pireno, podem contribuir para o desfecho clínico do infarto agudo do miocárdio em indivíduos não-fumantes. / Diseases caused or aggravated by environmental pollutants are becoming increasingly worrisome, especially respiratory and cardiovascular diseases. Several studies have shown an association between air pollution and the development of cardiovascular diseases, considering the existence of particulate matter in the air pollution. Particulate matter presents various substances in its chemical composition, e.g. polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), which have been strongly associated with the inflammatory process in in vitro studies. Benzo[a]pyrene (BaP) is one of the most important PAHs, whose most commonly utilized biomarker of exposure is the urinary metabolite 1-hydroxypyrene (1-HP). Regarding cardiovascular diseases, acute myocardial infarction (AMI) is clinically relevant due to its high morbidity and mortality. In addition to air pollution effects, several other factors are determinant in the development of cardiovascular diseases, for instance, smoking, sedentary lifestyle, dyslipidemia, family history, etc. In this context, the present study evaluated the possible association of environmental exposure to BaP, inflammation and oxidative stress biomarkers in AMI patients. Patients diagnosed with AMI (N=58) and controls (N=41) were enrolled in this study and divided into smokers and non smokers. The urinary excretion of 1-hydroxypyrene (1-HP) was analyzed by HPLC and results were corrected by urinary creatinine values. Hematological and biochemical parameters, inflammatory (hsCRP) and oxidative stress (MDA, SOD, δ-ALA-D, CAT, GPx) biomarkers, exogenous non-enzymatic antioxidants (β-carotene, lycopene, vitamin E e retinol) and carboxyhemoglobin (COHb) were determined in blood samples. We report increases in 1-HP urinary excretion, hsCRP and MDA levels, in CAT and GPx enzymatic activities in post-infarction patients (smokers and non smokers) and also an inhibition of δ-ALA-D activity only in the post-infarction non smoker group, compared to the control groups (p<0.05). Furthermore, decreases in SOD enzymatic activity and β-carotene levels have been found in the post-infarction groups compared to controls. COHb levels did not change significantly in both groups, except for smokers which increased independently from the infarction. MDA (r=0.326, p=0.01) and CAT (r=0.474, p=0.001) were positively correlated with the levels of urinary 1-HP. On the other hand, δ-ALA-D (r=-0.353, p=0.01) and β-carotene (r=-0.309, p=0.05) were negatively correlated with 1-HP urinary excretion; correlations were obtained only with non smoker groups. Thus these results suggest that in order to better understand the exposure to BaP and cardiovascular events, smoking must be excluded. Moreover, BaP was shown to increase lipid peroxidation despite the increase in catalase activity; BaP was also able to inhibit δ-ALA-D enzymatic activity and deplete β-carotene levels. Therefore, our findings suggest that BaP increases oxidative stress by itself or in conjunction with its active metabolites, which may contribute to the clinical outcome of the AMI in non smokers.