L’émergence de nouveaux contaminants dans les eaux usées requiert le développement de nouvelles techniques. En effet, les traitements classiques des stations d’épuration des eaux usées laissent entrer dans les matrices environnementales de nombreux contaminants organiques de faibles concentrations tels que les produits pharmaceutiques. Nous avons donc étudié l’élimination d’une variété de pharmaceutiques, représentatifs de leur classe, ou bien présentant une forte occurrence, ou encore des composés récalcitrants. Parmi ces pharmaceutiques on retrouve des anti-inflammatoires non stéroïdiens (acétaminophène, naproxène, acide méfénamique, kétoprofène, indométacine, diclofénac), un stimulant (caféine) deux antibiotiques (ciprofloxacine et triméthoprime), un anticonvulsif et régulateur de l’humeur (carbamazépine), un anxiolytique (diazépam) et deux fibrates (fénofibrate et bézafibrate). Parmi les techniques novatrices permettant de réaliser ce type d’élimination on retrouve certaines enzymes oxydatives qui sont capables de transformer de nombreux contaminants organiques que l’on retrouve dans les eaux usées. L’utilisation de trois enzymes de ce type, la laccase, la versatile peroxydase et la glucose oxydase, dans différentes combinaisons, a permis d’obtenir une élimination satisfaisante de la plupart des pharmaceutiques auxquels nous nous sommes intéressés, avec une efficacité optimale pour la combinaison des trois enzymes. Partant de ce constat, une combinaison plus stable de ces trois enzymes a été produite par une technique de co-aggrégation permettant de les insolubiliser tout en les regroupant par réticulation. Ceci facilite la réutilisation de ces biocatalyseurs, et augmente leur stabilité, ce qu’une caractérisation du biocatalyseur a permis de vérifier. Le biocatalyseur a alors pu être testé pour le traitement d’un cocktail des produits pharmaceutiques précédemment énoncés et a permis de réaliser une élimination de plus de 60 % de la plupart des composés dans des conditions qui ont été optimisées. Testé dans des eaux résiduaires urbaines prélevées à l’affluent de la station d’épuration de Magog (Québec), le biocatalyseur a permis une élimination de l’ordre de 25 % pour des concentrations très faibles (ppb) en acétaminophène.

La maturation épididymaire est un élément clé dans le développement de l'aptitude du gamète mâle à féconder l'ovocyte. Parmi, les nombreux composants impliqués dans ce processus, les espèces oxygénées réactives (EOR) sont essentielles car bénéfiques par certains aspects, cependant elles sont toxiques en excès. GPx5, une forme épididymaire de la glutathion peroxydase, pourrait jouer un rôle dans le contrôle redox de l'environnement spermatique. Une production in vitro de GPx5 par un baculovirus recombinant a été réalisée, mais le virus s'est révélé très instable et n'a donc pas permis d'analyser biochimiquement cette protéine. Une approche in vivo initiée par immunisation passive n'a pas montré d'altération de la fertilité des souris. Elle a été complétée par le dévelopement d'une étude plus générale basée sur la production de souris inactivées pour le gène gpx5. Ces dernières ont une fertilité normale, toutefois, des altérations développementales sont observées dans la descendance de mâles âgés. Des perturbations sont associées à des changements de l'expression de nombreuses enzymes antioxydantes comme les GPxs et la catalase, mais seulement dans la queue de l'épididyme. De plus, un accroissement des dommages oxydatifs à l'ADN est visualisé dans l'épithélium de la queue de l'épididyme et dans les spermatozoïdes de cette région. Une carence en sélénium a été initiée pour contrecarrer une éventuellle compensation fonctionnelle provenant des autres GPx épididymaires. Une initiation des voies apoptotiques est observée chez les animaux KO pour gpx5 et carencés dans la queue de l'épididyme. De façon surprenante, des perturbations redox sont aussi visualisées dans d'autres organes comme le foie et le testicule.

En utilisant des approches moléculaires variées, nous avons montré que le gène gpx5 possède au moins trois transcrits dans l'épididyme de souris adulte. A coté d'un messager long codant pour la protéine GPX5 mature, existent en effet deux transcrits tronqués. Les variants de la protéine GPx5, qui correspondent à ces transcrits courts, subissent dans l'épididyme de souris, une maturation post-transcriptionnelle qui repose essentiellement sur des processus de O-glycosylation. Ce travail a aussi permis de préciser que l'expression du gène gpx5 dépasse le territoire épididymaire puisque les transcrits gpx5 peuvent détectés à des niveaux faibles dans d'autres tissus de la sphère génitale chez la souris adulte. C'est le cas par exemple au niveau du testicule ou de la prostate. L'obtention, par des gestations datées, d'embryons de souris à différents stades, a permis de mettre en évidence une expression du gène gpx5 pendant les phases précoces du développement embryonnaire. Cette expression embryonnaire de gpx5 concerne un quatrième variant dont la séquence 3' UTR n'a pu être précisée. Des analyses immunohistochimiques complémentaires sont nécessaires pour confirmer la détection de la protéine GPx5 dans l'embryon précoce de souris et sa localisation dans l'endoderme pariétal.

P. chrysosporium est un champignon saprophyte capable de dégrader de nombreux xénobiotiques, ce qui le rend particulièrement intéressant pour des applications en bioremédiation. Plusieurs publications mettent en avant l'importance de la maîtrise de l'homéostasie métallique dans la production de certaines enzymes lignolytiques. La présence de manganèse est en effet nécessaire à la production des manganèses peroxydases, alors qu'à l'inverse une carence permettra la production de lignines peroxydases. Cependant, la caractérisation de transporteurs impliqués dans le contrôle de l'homéostasie métallique n'a fait l'objet de recherches poussées que chez le champignon modèle S. cerevisiae. L'analyse des transporteurs putatifs de manganèse de 26 espèces fongiques représentant 20 ordres fongiques a permis de constituer un répertoire de 281 transporteurs de manganèse. L'analyse phylogénétique a permis de mettre en évidence que des processus de duplication, mais également de délétion, avaient eu lieu en particulier chez S. cerevisiae. Cependant ce dernier ne possède pas de transporteurs de manganèse appartenant à la famille des Cation Diffusion Facilitator. Dans le génome de P. chrysosporium, onze transporteurs de manganèse appartenant à différentes familles de gènes ont été identifiés. Le niveau d'expression de ces différents gènes a été étudié notamment en condition lignolytique. Ces transporteurs ont également été clonés afin de vérifier leurs fonctions par complémentation en système hétérologue. Cette étude a permis de mettre en évidence les transporteurs de manganèse putatifs de nombreux organismes fongiques, ainsi que l'absence d'une famille de transporteurs impliquée dans les mouvements de manganèse chez S. cerevisiae / P. chrysosporium is a saprophytic fungus able to degrade many xenobiotics which makes it particularly attractive for applications in bioremediation. Several publications highlight the importance of metal homeostasis in the production of lignolytics enzymes. Indeed the presence of manganese is required for the production of manganese peroxidase. Conversely, deficiency allows the production of lignins peroxidases. Characterization of transporters involved in the control of manganese homeostasis has been only researched in the model S. cerevisiae. Analysis of putative manganese transporters of 26 fungal species representing 20 orders of fungus was used to form a repertory of 281 transporters of manganese. Phylogenetic analysis allowed to highlight that duplication process, but also deletion, had occurred particularly in S. cerevisiae. However this one is devoid of transporters belonging to the manganese Cation Diffusion Facilitator. Eleven transporters belonging to gene families in which manganese transporters have been found were identified in the P. chrysosporium?s genome. Expression level of these genes was examined particularly in ligninolytic condition. Transporters have also been cloned in order to verify their functions by complementation in heterologous system. This study allowed to identify putative manganese transporters of numerous fungal organisms and the lack of a transporters family involved in the manganese transport in S. cerevisiae

Les biomatériaux insérés dans la cavité orale, tout particulièrement les prothèses dentaires amovibles en résine, constituent des surfaces propices à la formation de biofilms incorporant des levures du genre Candida, à l’origine de candidose. Les levures, comme d’autres micro-organismes, adaptent leur prolifération à l’environnement par des molécules dites du quorum sensing. D’autre part, la contamination du milieu oral est contrôlée par de nombreuses protéines sécrétées par les glandes salivaires, mais leur utilisation en hygiène est peu documentée. Le but de ce travail est d’étudier l’effet anti-biofilm de molécules du quorum sensing et de protéines exocrines, le lysozyme et la lactoperoxydase, dans la perspective de réduire la colonisation des surfaces de prothèses dentaires par des levures du genre Candida et par conséquent de prévenir une stomatite prothétique. A cette fin, des biofilms à Candida ont été produits dans des plaques multi-puits à fond plat en polystyrène et quantifiés par coloration au cristal violet. L’effet de deux molécules du quorum sensing - tyrosol et farnésol - sur la formation des biofilms à Candida a été investigué in vitro sur la souche de référence ATCC 10231 et sur des souches cliniques isolées à partir de prothèses dentaires. Le tyrosol et le farnésol à hautes concentrations (> 6 mM et > 1 mM respectivement) entraînent une limitation de la formation de biofilms sans altérer la croissance fongique tandis que des concentrations plus faibles (~ 1 mM et ~ 1 µM respectivement) favorisent la formation de biofilms. Le lysozyme présente aussi un effet dépendant de la dose sur la formation de biofilms par Candida: promoteur de la formation de biofilms à une concentration de 1000 µg/ml et inhibiteur de la formation de biofilms à des concentrations plus faibles (3 et 10 µg/ml). Les composés hypohalogéneux (> 500 µM) produits par un système peroxydase limitent la croissance des levures et par conséquent leur capacité à former des biofilms in vitro. Un seul trempage ex vivo de prothèses amovibles pendant 5 minutes dans une solution d’ions hypohalogéneux (2000 µM) entraîne une diminution d’au moins 1 unité logarithmique du nombre de Candida dans 58,3 % des cas (N = 23) alors qu’un trempage dans de l’eau n’a aucun effet sur la colonisation de la prothèse :cet effet est statistiquement significatif (Chi carré, p = 0,0006, test de Fisher, p = 0,0009). / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le cancer du sein est considéré comme le cancer le plus dangereux jamais diagnostiqué chez les femmes dans le monde. Plusieurs équipes de recherche essaient de délivrer le mystère de ce cancer en étudiant plusieurs facteurs qui y sont impliqués. Dans notre laboratoire on a essayé d'étudier les interactions entre les gènes antioxydants : SOD l , SOD2, GPx 1 et CA T et de comprendre la relation qui peut exister entre ces gènes et le cancer du sein. Ces enzymes, malgré qu'elles accomplissent des fonctions similaires, elles se localisent dans des compartiments cellulaires différents. Pour cette étude on a utilisé des outils bio-informatiques jugés de très intéressants et très efficaces pour répondre à trois questions principales: a) Les quels des différents variants de SOD2 et de GPxI qui sont surexprimés dans les cellules mammaires cancéreuses (ER+)? b)Y'a-t-il des régions similaires entre les différentes régions codantes et non codantes entre ces gènes, si oui, est-ce que ces ressemblances ont des effets sur leurs niveaux d'expressions et est ce que ces ressemblances peuvent expliquer les mécanismes de régulation de nos quatre gènes et déterminer par quel moyen ils communiquent entre eux? c) Est-ce que la régulation de l'expression de nos quatre gènes peut être due à certains facteurs de transcription communs entre eux, si oui les quels? Notre étude a réussi à répondre à ces trois questions pour donner des bonnes perspectives au niveau des études scientifiques sur ce type de cancer, mais des études plus approfondis en laboratoire seront très intéressants pour mieux comprendre la relation entre les gènes antioxydants et le cancer du sein.

Les observations de radicaux organiques dans les enzymes et de leur implication dans les cycles catalytiques n'ont cessé de croître ces dernières années. La spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE) à champ intense est un outil de choix pour l'étude de radicaux organiques car elle permet de résoudre la faible anisotropie du tenseur g pour ces espèces paramagnétiques. Un spectromètre fonctionnant à 285 GHz / 10.5 teslas a été construit dans la Section de Bioénergétique du centre d'études du CEA de Saclay. Le travail présentée dans ce mémoire de thèse a porté sur l'application de la RPE à champ intense à l'étude de radicaux organiques présents dans le photosystème II, qui est l'enzyme de dégagement d'oxygène, ainsi que dans les composés I de deux peroxydases, la cytochrome c peroxydase et la prostaglandine synthase.<br />Le premier chapitre présente la technique de RPE à champ intense de façon générale et introduit l'instrumentation. Les aspects généraux du photosystème II utiles dans la suite du mémoire sont également présentés.<br />Le second chapitre montre comment les propriétés anisotropes du tenseur g ont été utilisées pour obtenir des informations structurales quant à l'orientation de radicaux organiques dans le photosystème II.<br />Les enzymes étudiées dans ce travail de thèse sont des métalloprotéines. Les situations de couplages magnétiques entre les centres métalliques et les radicaux organiques présents sont souvent rencontrées dans ces cas-là. Les chapitres 3 à 5 portent sur l'étude de tels systèmes couplés.<br />Le dernier chapitre présente des situations pour lesquelles l'étude des valeurs de g permet d'obtenir des informations sur l'environnement électrostatique du radical étudié. Cette propriété déjà connue pour les radicaux tyrosyles et semiquinones est étendue aux radicaux anions de phéophytines.

Ce travail vise à étudier l'intérêt duchauffage micro-ondes pour l'inactivation desenzymes dans les jus de fruit, à travers desapproches numériques et aussi expérimentales.En premier lieu, une étude sur les propriétésdiélectriques des jus de fruits modèles est menée,démontrant leur forte sensibilité à la température,à la fréquence et à la composition du produit. Dansune seconde partie, l'inactivation de la peroxydaseest étudiée par chauffage conventionnel et lesdonnées sont ajustées par un modèle cinétique dupremier ordre. Dans la troisième et principalepartie de ce travail, un modèle tridimensionnel,résolu par éléments finis, est proposé pour simulerle chauffage par micro-ondes du jus, en couplantélectromagnétisme, transfert de chaleur etécoulement, avec la cinétique d'inactivation de laperoxydase précédemment déterminée.Cette simulation permet de prédire la distributionspatiale de la température, le profil d’écoulementet l'inactivation de la peroxydase. L’accord entre lemodèle et les expériences est très satisfaisant, cequi confirme la pertinence de l’approche. Dans ladernière partie, les réactivations de la peroxydaseaprès chauffage conventionnel et micro-ondessont évaluées et comparées. Enfin, l’éventuelleexistence d’effets non thermiques des microondesest discutée via des expériencesadditionnelles. En conclusion, ces travauxmontrent tout l’intérêt de la simulation numériquecomme outil de compréhension du processusmultiphysique du chauffage par micro-ondes pourl’inactivation des enzymes, ce qui peut êtreparticulièrement intéressant pour la conception etl’optimisation de traitements micro-ondes. / This work aims at studying the use ofmicrowave heating for enzyme inactivation in fruitjuices by means of numerical and experimentalapproaches. In the first part, a study on thedielectric properties of model fruit juices isconducted, evidencing their high dependence onthe temperature, frequency and composition of theproduct. Then in the second part, the inactivation ofperoxidase is studied using conventional heatingand the data are fitted by a first order kinetic model.In the third and main part of this work, a threedimensionalfinite element model is developed tosimulate the microwave heating of juices, couplingelectromagnetics, heat transfer and fluid flow aswell as the peroxidase inactivation kineticspreviously determined.As a result, spatial temperature distribution, flowpattern and peroxidase inactivation are obtained.The model is experimentally validated and goodagreement is observed, confirming the relevanceof the approach. Finally, in the last part, thepotential peroxidase reactivations afterconventional and microwave heating areassessed and compared. Also, the possibleexistence of non-thermal effects of microwaves isdiscussed thanks to additional experimentations.In conclusion, this work shows the large interest ofcomputer simulation as a tool for understandingthe multiphysics process of microwave heating forenzyme inactivation, which can be particularlyinteresting for further design of optimizedmicrowave processing.

Les macrophages peuvent transiter entre les états pro et anti-inflammatoires, un processus appelé de polarisation. Les molécules sécrétées par les macrophages sont capables d'induire différents profils métaboliques. Les analyses transcriptomiques de macrophages pro et anti-inflammatoires humains ont identifié nouvelles molécules avec un peptide sécrétoire. Parmi ces candidates, les sélénoprotéines étaient l’une des plus exprimés dans les macrophages anti-inflammatoires. Ainsi, nous évaluons l’impact des sélénoprotéines sur la polarisation des macrophages, secondaires à l’inflammation et leur implication au cours de la régénération musculaire. Une fois établi que les cytokines stimulent les transitions des macrophages, nous avons utilisé IFN-gamma et IL10 pour explorer ces différents profils inflammatoires in vitro. Les macrophages dérivés de la moelle osseuse de WT et de sélénoprotéines KO ont été polarisés avec les deux cytokines pour obtenir un phénotype pro et anti-inflammatoire, respectivement. Nos résultats ont montré que, en absence de sélénoprotéines, les macrophages réduisaient leur capacité à migrer d'un état d'activation à l’autre par rapport au contrôle, soulignant ainsi l'importance de ces molécules pour contrôler les états d’alternance des macrophages. Le modèle de lésion en réponse à la cardiotoxine a été utilisé pour examiner, in vivo, la capacité des macrophages à modifier leur phénotype au cours de la régénération du muscle squelettique. Trois jours après une lésion, la population pro est remplacé par une anti-inflammatoire, comme l'a déjà montré l'analyse par cytométrie en flux. Cependant, les modèles de macrophages pro-inflammatoires sélénoprotéines KO étaient présent trois fois plus nombreux relativement à la population anti-inflammatoire, indiquant que ces macrophages n’ont pas acquis le phénotype anti-inflammatoire. De plus, nous évaluons la fonction des macrophages en absence de sélénoprotéines. Suite à la polarisation avec les cytokines, décrites ci-dessus, les expériences ont démontré que les macrophages anti-inflammatoires WT favorisaient la fusion des myoblastes, alors que les sélénoprotéines KO n'étaient pas en mesure de maintenir cette fusion. En conclusion, les sélénoprotéines modulent la polarisation des macrophages, impliquant leur capacité à acquérir différents phénotypes in vitro et in vivo, ainsi que leurs effets sur la fusion des myoblastes / Macrophages can go through transitions between pro and anti-inflammatory states, one process called polarization skewing. Molecules secreted by macrophages are able to induce different metabolic profiles. Transcriptomic analyses of human pro and anti-inflammatory macrophages identified new molecules with a secretory peptide. Selenoproteins were one of the most expressed in anti-inflammatory macrophages. Thus, we evaluate the respective roles of selenoproteins on macrophage polarization parameters in inflammation and their implication in regenerative processes. Once established that cytokines largely spur macrophage transitions we used IFN-gamma and IL10 to explore these different inflammatory profiles in vitro. Bone marrow derived macrophages from WT and selenoproteins KO models were polarized with both cytokines to obtain a pro and anti-inflammatory phenotype, respectively. Our results showed that without selenoproteins, macrophages had impairment of their capacity to switch from one activation state to another as compared with the control, emphasizing the importance of these molecules to control macrophage transitional states. The cardiotoxin injury model was use to in vivo examine the macrophages capability to switch their phenotype during skeletal muscle regeneration. Three days after an injury pro is replaced by anti-inflammatory population, as has already been shown by flow cytometry analysis. However, macrophages from selenoproteins KO presented three-fold increase of pro-inflammatory macrophages while anti-inflammatory population decreased, indicating that they did not acquire an anti-inflammatory phenotype. In addition, we evaluate the macrophage function in absence of selenoproteins. After polarization with cytokines, experiments demonstrated that WT anti-inflammatory macrophages promoted myoblast fusion, whereas selenoproteins KO were not able to sustain their fusion. In conclusion, selenoproteins modulate macrophage polarization implicating their ability to acquire different phenotypes in vitro and in vivo as well as their effects on myoblast fusion

Les peroxyrédoxines (PRXs) forment une famille de peroxydases communes à tous les organismes vivants et ubiquitaires dans la cellule. Leur particularité provient d’un ou deux résidus cystéines accomplissant un cycle d’oxydo-réduction à l’aide d’un donneur d’électron. Ces protéines thiols sensibles au potentiel redox sont impliquées dans le mécanisme de détoxification du H2O2, une molécule oxydante induite lors de situations de stress. Les PRXs pourraient être induites par le stress et régulées par phosphorylation. En effet, des expérimentations in vitro ont démontré que la nucléoside diphosphate kinase 1 (NDPK1) a la capacité de phosphoryler une PRX cytosolique de pomme de terre. Ce mémoire décrit les travaux expérimentaux effectués pour caractériser la fonction de la PRX. Pour cela, le clonage d’une isoforme a été effectué, suivi d’une caractérisation biochimique et d’une étude d’expression de la protéine. Les données de séquençage révèlent qu’il s’agit d’une PRX de type II phylogénétiquement liée aux PRXs cytosoliques. L’ADNc codant pour cette peroxyrédoxine (PRX1) a été cloné chez Solanum chacoense. Une protéine recombinante portant une étiquette (6xHis) en N-terminale a été produite. Des essais enzymatiques ont confirmé la fonction antioxydante de la protéine recombinante et un anticorps polyclonal a été généré chez le lapin puis utilisé en conjonction avec un anticorps anti-NDPK1 pour déterminer les patrons d’expression généraux de ces protéines chez Solanum lycopersicum et Solanum tuberosum lors de situations de stress. Les données démontrent que les deux protéines sont généralement co-exprimées mais pas co-régulées et que la PRX1 est induite en certaines situations de stress. / The peroxiredoxins (PRXs) are a recently discovered family of peroxidases found in all organisms and ubiquitous in the cell. An important particularity of these proteins is the presence of one or two active cysteines that accomplish an oxydo-reduction cycle with an electron donor. The PRXs are sensitive to the redox potential and are implicated in the detoxification of the H2O2, an oxidante molecule induced in stress situations. The PRXs should be induced in stress situations and regulated by phosphorylation. Indeed, in vitro experimentations have shown that the NDPK1 can phosphorylate a cytosolic PRX isoform of the potato. This dissertation describes the experimentation made to acquire a preliminary understanding of the function of the PRX. For this purpose, we cloned a PRX isoform, followed by a biochemical characterization and expression studies of the protein. The sequencing data shown a type II PRX phylogenetically related to the cytosolic isoforms. The cDNA of this peroxiredoxin (PRX1) has been cloned in Solanum chacoense. The recombinant protein produced had a N-terminal (6xHis) tag. Enzymatic assays confirmed the antioxidant activity of the recombinant protein and a polyclonal antibody has been generated from the rabbit. This antibody was used in conjunction with an antibody anti-NDPK1 to determine the general expression patterns of those proteins during stresses in Solanum lycopersicum and Solanum tuberosum. The results obtained showed that the two proteins are generally co-expressed but not co-regulated. Obvious experimental facts displayed an induction of the PRX1 in biotic and abiotic stresses situations.