A cultura algodoeira tem significativa participação na economia mundial. O algodão (Gossypium hirsutum) é predado por uma grande variedade de insetos, entre eles o percevejo manchador Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae). O hábito alimentar deste inseto provoca danos nas sementes e fibras depreciando-as para a utilização comercial. Como alternativa para o aumento da resistência das plantas ao ataque de insetos predadores, estratégias biotecnológicas vêm sendo consideradas. A Canavalia ensiformis é fonte de proteínas com atividade inseticida como a urease, a canatoxina e a concanavalina-A. Tanto a canatoxina como a urease exercem efeitos tóxicos em ninfas deste percevejo, causando mortalidade e atraso no desenvolvimento dos insetos sobreviventes. De maneira análoga a outros modelos de insetos já estudados, a toxicidade em D. peruvianus dependeria da ativação proteolítica das proteínas por enzimas digestivas (catepsinas) do inseto e formação de um peptídeo tóxico. Neste trabalho, estudos de hidrólise in vitro na presença de inibidores seguidos por SDS-page e Western-blot confirmaram a ativação proteolítica da urease por enzimas do tipo catepsina-B. O homogeneizado de intestinos de ninfas hidrolisa também substratos típicos para catepsinas, como hemoglobina e Abz-AIAFFSRQ-EDDnp, e a atividade proteolítica é bloqueada por pepstatina-A e E-64, inibidores específicos para aspártico e cisteíno proteinases, respectivamente. Duas cisteíno proteinases (DpQ-NR e DpQ-E) de intestinos de ninfas de D. peruvianus foram parcialmente purificadas e caracterizadas. Ambas apresentaram pH ótimo de atividade proteolítica entre 4,5 e 6,5, na presença de DTT e foram totalmente inibidas por E-64. No entanto o perfil de inibição evidencia a presença de outras enzimas nas frações. Ensaios de especificidade da fração DpQ-NR revelaram a preferência da enzima por substratos contendo resíduo hidrofóbico em P2, enquanto a enzima DpQ-E tem preferência por substratos contendo aminoácidos básicos em P1. Assim, o trabalho desenvolvido sugere a presença de proteinases múltiplas no sistema digestivo de D. peruvianus e o possível envolvimento destas peptidases na ativação proteolítica da urease. / Cotton (Gossypium hirsutum), an important agricultural commodity, is attacked by a number of pests, such as the cotton stainer bug Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae) which may cause severe losses in cotton plantations. Bug feeding on the cotton seeds and stains the cotton fibers resulting in damage to the seed, besides being a vector for phytopathogenic bacteria and fungi. Biotechnology strategies focusing on plant defensive molecules are being considered as an alternative to increase host plant resistance against this pest. The jack bean Canavalia ensiformis is the source of proteins displaying insecticidal activity such as urease, canatoxin and concanavalin-A. Canatoxin and urease were shown to cause lethality and severe detrimental effects in surviving insects, delaying the development stages of D. peruvianus. As in other insect models studied previously, this would depend on the proteolytic activation of the protein by insect cathepsin-like digestive enzymes to produced toxic peptides. The in vitro hydrolysis of urease in the presence of inhibitors, followed by SDS-page and Wester-blot confirm the proteolytic activation by insect cathepsin B-like enzymes. A nymphal gut extract hydrolysed typical cathepsin substrates, such as hemoglobin and Abz-AIAFFSRQ-EDDnp, and hydrolysis was blocked by pepstatin-A and E-64, specific inhibitors of aspartic and cysteine proteinases. Two cysteine peptidases (DpQ-NR and DpQ-E) of D. peruvianus nymphs were partially purified and characterized. Both enzymes showed maximum activities at pH 4.5-5.0 and 5.5-6.5 in the presence of dithiotreitol and were totally inhibited by E-64. However, the inhibition profile points out to the presence of other types of proteinases in both fractions. DpQ-NR preferentially hydrolysed substrate with hydrophobic amino acids in P2, while DpQ-E had preference for substrate with basic residues in P1. Therefore, our work suggests the presence of multiple proteinases with distinct biochemical properties in the digestive system of D. peruvianus and the potencial involvement of these peptidases on the proteolytic activation of urease.

O controle biológico pode ser definido como a utilização de antagonistas naturais para a diminuição ou redução de determinado organismo indesejado. Atualmente, esta estratégia constitui uma ferramenta segura e efetiva tanto para o controle de pragas da agricultura e da pecuária, quanto para vetores de doenças que atingem a saúde pública. O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae tem se destacado neste âmbito devido às suas características entomopatogênicas e acaricidas, sendo utilizado comercialmente no Brasil para o controle da cigarrinha da cana-de-açúcar e estudado, mundialmente, como potencial biopesticida. Não se sabe quais são os fatores que definem a predileção do fungo a determinados hospedeiros, mas se acredita que fatores tais como uma maior adaptação do patógeno, a composição e a morfologia da cutícula possam influenciar. Neste trabalho foi avaliada a capacidade entomopatogênica de 8 linhagens de M. anisopliae sobre dois artrópodes: o percevejo manchador do algodão Dysdercus peruvianus e a lagarta da soja Anticarsia gemmatalis. Todas as linhagens testadas de M. anisopliae foram mais efetivas contra D. peruvianus, quando comparadas à A. gemmatalis. A linhagem CG47 mostrou-se eficaz contra ambos os artrópodes testados. As linhagens C12, CG47, CG97 e Nordeste foram ativas contra A. gemmatalis, sendo C12 a mais virulenta. A secreção de proteases e quitinases durante o cultivo do fungo, em presença de cutículas de artrópodes, foi avaliada e parece ter sido influenciada pelo tipo de fonte de carbono disponível no meio de cultivo. A secreção de quitinases, ao contrário das proteases, pareceu não sofrer repressão tão acentuada, com a utilização de fontes facilmente metabolizáveis como a glicose; e, embora existam grandes diferenças entre as linhagens na capacidade de secreção de ambas as enzimas, a virulência observada nos bioensaios pareceu não estar correlacionada com a capacidade quitinolítica ou proteolítica das diferentes linhagens. Levando-se em conta que o processo de infecção de M. anisopliae em hospedeiros é multifatorial e dependente também dos artrópodes-alvo, foi feita a contagem total de hemócitos, sendo possível verificar um aumento destas células de defesa logo após o desafio com o patógeno. Neste trabalho, fica evidente o potencial de determinadas linhagens de M. anisopliae para o controle de D. peruvianus e A. gemmatalis. Também é sugerida a utilização do percevejo manchador do algodão como um novo modelo de pesquisa para os estudos que envolvem as interações patógeno-hospedeiro, mediante a análise de novos fatores de virulência desse patógeno e da resposta do hospedeiro à infecção. / Biological control can be defined as the utilization of natural enemies to reduce or to diminish some unwanted organism. Nowadays, this strategy is a safe and effective tool to control plagues from agriculture and pecuary and also for vectors of some important diseases of public health. The filamentous fungi Metarhizium anisopliae have been standed out in this field because its entomopathogenic and acaricide characteristics, being commercially used in Brazil to control the sugar cane bugs and being studied worldwide as a potential biopesticide. The factors that define the fungi specificity for some hosts are not known, although, is believed that factors as a greater adaptation of the pathogen and the cuticle composition and morphology may influence. In this work the entomopathogenic activity of 8 strains of M. anisopliae was evaluated against two arthropods: the cotton stainer Dysdercus peruvianus and the velvet bean caterpillar Anticarsia gemmatalis. All M. anisopliae strains tested were more efficient against D. peruvianus when compared to A. gemmatalis. Strain CG47 was active for both arthropods tested. Strains C12, CG47, CG97 and Nordeste were active against A. gemmatalis and C12 was the most virulen strain. Protease and chitiunase secretion during fungi growth with arthropod cuticles was tested and seem to be influenced by the kind of carbon source available in the media. Chitinase secretion, on the contrary to proteases seem not to respond so effectively to repression by the utilization of simple carbon compounds as glucose and, despite there are big differences between strains in the capacity to secret both enzymes, the virulence observed during bioassays seemed not to be correlacionated to their proteolitic or chitinolitic activity. Aware that the M. anisopliae infection process on hosts is multifactorial and also depends on arthropod response, the total hemocytes count were made and was possible to detect an increase on cellular counts after challenge with the pathogen. In this work is evident the potential of some M. anisopliae strains to control D. peruvianus and A. gemmatalis and it also suggests the utilization of the cotton stainer as a model for researches about host-pathogen interactions, studies about pathogen virulence factors as well studies to elucidate the host response to infection.

La especie Dysdercus peruvianus comúnmente conocido como “arrebiatado” constituye una de las plagas de mayor importancia en el cultivo del algodón debido a que ocasiona pérdidas estimadas en un 16% en el Perú. El objetivo del presente trabajo fue aislar y evaluar cepas de hongos entomopatógenos como agentes potenciales para el control del “arrebiatado” en condiciones de laboratorio. Se aislaron 7 cepas de mohos: 6 de Acremonium sp. y 1 de Scopulariopsis sp, a partir de insectos adultos infectados naturalmente en el campo de D. peruvianus de la localidad de Mala Provincia de Cañete. Para determinar la patogenicidad y virulencia sobre D. peruvianus de las cepas aisladas se seleccionaron una del género Acremonium y una de Scopulariopsis. Además se evaluó una cepa de Beauveria sp. proveniente de Schistocerca piceifrons peruviana (Orthoptera). Los bioensayos se realizaron sobre ninfas del 4to estadío de Dysdercus peruvianus y las concentraciones de conidias empleadas fueron 3.7 x 108, 1.9 x 108, 9.4 x 107 conidias/mL para Beauveria sp, Acremonium sp y Scopulariopsis sp respectivamente. Con estas concentraciones se encontró que el porcentaje de mortalidad a los 20 días post tratamiento fue de 83.3%, 80% y 23.3% para Beauveria sp, Acremonium sp y Scopulariopsis sp., respectivamente. La cepa Beauveria sp fue la que presentó mayor virulencia sobre D. peruvianus al alcanzar el mayor porcentaje de mortalidad (83.3%), mientras que la cepa Acremonium sp fue la mas agresiva sobre el insecto, ya que el tiempo de letalidad para el 50% (TL50) de la población tratada fue de solo 3.8 días. El hongo Scopulariopsis sp. a la concentración de conidias evaluada solo presentó una mortalidad de 23.3% sobre ninfas del cuarto estadio del “arrebiatado”. / The specie Dysdercus peruvianus commonly know as “cotton stainer” constitute one of de plagues of great importance in the cultivation of cotton because it cause losses estimated in 16% in Peru. The objective of this study was to isolated and to evaluated strains of entomopathogenic fungi as potential agents to the control of the “cotton stainer” under laboratory conditions. From the “cotton stainer” D. peruvianus (Hemiptera: Pirrhocoridae) naturally infected in the field, it were obtained 6 strains from Acremonium sp and 1 from Scopulariopsis sp. to determinate the pathogenicity and virulence on D. peruvianus one strain from genus Acremonium and another from Scopulariopsis were selected. Besides was tested an isolated from Beauveria sp. obtained from Schistocerca piceifrons peruviana (Orthoptera). Bioassays were performed on fourth instar nymphs of Dysdercus peruvianus and the conidial concentrations used were 3.7x108, 1.9x108, 9.4x107 conidia/mL to Beauveria sp, Acremonium sp and Scopulariopsis sp respectively. At these concentrations was found that the mortality percentage at twenty days after treatment was of 83.3%, 80% and 23.3% to Beauveria sp, Acremonium sp and Scopulariopsis sp respectively. The strain Beauveria sp showed more virulence against D. peruvianus since it reached the highest mortality (83.3%), whereas the strain Acremonium sp was the most aggressive on the insect, because when the lethality time was determined for the 50% (LT50) of the locust population, it needed only 3.8 days The fungus Scopulariopsis sp. to the concentration of conidia tested did not show an important mortality against the fourth instar nymphs of the “cotton stainer”.

La especie Dysdercus peruvianus comúnmente conocido como “arrebiatado” constituye una de las plagas de mayor importancia en el cultivo del algodón debido a que ocasiona pérdidas estimadas en un 16% en el Perú. El objetivo del presente trabajo fue aislar y evaluar cepas de hongos entomopatógenos como agentes potenciales para el control del “arrebiatado” en condiciones de laboratorio. Se aislaron 7 cepas de mohos: 6 de Acremonium sp. y 1 de Scopulariopsis sp, a partir de insectos adultos infectados naturalmente en el campo de D. peruvianus de la localidad de Mala Provincia de Cañete. Para determinar la patogenicidad y virulencia sobre D. peruvianus de las cepas aisladas se seleccionaron una del género Acremonium y una de Scopulariopsis. Además se evaluó una cepa de Beauveria sp. proveniente de Schistocerca piceifrons peruviana (Orthoptera). Los bioensayos se realizaron sobre ninfas del 4to estadío de Dysdercus peruvianus y las concentraciones de conidias empleadas fueron 3.7 x 108, 1.9 x 108, 9.4 x 107 conidias/mL para Beauveria sp, Acremonium sp y Scopulariopsis sp respectivamente. Con estas concentraciones se encontró que el porcentaje de mortalidad a los 20 días post tratamiento fue de 83.3%, 80% y 23.3% para Beauveria sp, Acremonium sp y Scopulariopsis sp., respectivamente. La cepa Beauveria sp fue la que presentó mayor virulencia sobre D. peruvianus al alcanzar el mayor porcentaje de mortalidad (83.3%), mientras que la cepa Acremonium sp fue la mas agresiva sobre el insecto, ya que el tiempo de letalidad para el 50% (TL50) de la población tratada fue de solo 3.8 días. El hongo Scopulariopsis sp. a la concentración de conidias evaluada solo presentó una mortalidad de 23.3% sobre ninfas del cuarto estadio del “arrebiatado”. / The specie Dysdercus peruvianus commonly know as “cotton stainer” constitute one of de plagues of great importance in the cultivation of cotton because it cause losses estimated in 16% in Peru. The objective of this study was to isolated and to evaluated strains of entomopathogenic fungi as potential agents to the control of the “cotton stainer” under laboratory conditions. From the “cotton stainer” D. peruvianus (Hemiptera: Pirrhocoridae) naturally infected in the field, it were obtained 6 strains from Acremonium sp and 1 from Scopulariopsis sp. to determinate the pathogenicity and virulence on D. peruvianus one strain from genus Acremonium and another from Scopulariopsis were selected. Besides was tested an isolated from Beauveria sp. obtained from Schistocerca piceifrons peruviana (Orthoptera). Bioassays were performed on fourth instar nymphs of Dysdercus peruvianus and the conidial concentrations used were 3.7x108, 1.9x108, 9.4x107 conidia/mL to Beauveria sp, Acremonium sp and Scopulariopsis sp respectively. At these concentrations was found that the mortality percentage at twenty days after treatment was of 83.3%, 80% and 23.3% to Beauveria sp, Acremonium sp and Scopulariopsis sp respectively. The strain Beauveria sp showed more virulence against D. peruvianus since it reached the highest mortality (83.3%), whereas the strain Acremonium sp was the most aggressive on the insect, because when the lethality time was determined for the 50% (LT50) of the locust population, it needed only 3.8 days The fungus Scopulariopsis sp. to the concentration of conidia tested did not show an important mortality against the fourth instar nymphs of the “cotton stainer”.

A partir da identificação de catepsinas L em ensaios in vitro e em zimogramas partimos para purificação desta enzima no inseto. A região V2 foi selecionada como fonte de obtenção da cisteína proteinase já que dentre os três ventrículos o segundo apresentou maior atividade específica. Após diversas tentativas de isolar esta proteinase, foi estabelecida uma marcha de purificação que envolvia em todas as etapas a participação de metil metanosulfonato (MMTS), o que inativa a proteinase evitando assim autólise ao longo do processo de purificação. A marcha consistiu de três passos cromatográficos (troca-iônica, filtração em gel e afinidade, nesta ordem) onde foi observada a presença de duas cisteína proteinases, cada uma apresentando respectivamente as seguintes massas moleculares 32 e 45 kDa (SDSPAGE). As duas cisteína proteinases possuem o mesmo pH ótimo igual a 6,3. Além disso, estas enzimas foram termicamente inativadas a 40 ºC segundo uma cinética de primeira ordem aparente, sugerindo a existência de apenas uma espécie molecular de cada enzima na preparação com meia vida de 5 minutos para cis 1 e 4,8 minutos para cis 2. Foi determinada a constante de dissociação entre enzimainibidor, onde foi observado os valores de 17,3 nM para cis 1 e 7,11 nM para cis 2 através da titulação por E-64. A eficiência de catálise cis 1 e cis 2 é maior para o substrato sintético Z-FR-MCA do que para Z-RR-MCA, indicando que tratava-se de catepsinas L. Com o intuito de descrever os mecanismos moleculares por trás dos fenômenos fisiológicos no intestino médio do Hemiptera Dysdercus peruvianus foi construída uma biblioteca de cDNA a partir de mRNA deste tecido. Utilizamos ESTs provenientes desta biblioteca com o objetivo de identificar genes transcritos relacionados com proteínas de transporte de glicose além de enzimas digestivas. Após o processamento das leituras, surgiram 1053 ESTs úteis. Montando estes ESTs por alinhamento de bases, foram produzidos 62 contíguos e 841 singletos, o que totaliza 903 seqüências únicas. Entre as seqüências homólogas encontradas as mais relevantes para o nosso estudo foram: β-glicosidase (marcadora de membranas microvilares), α-glicosidase (marcadora de membranas 8 perimicrovilares), aminopeptidase (espaço perimicrovilar), catepsina L (conteúdo de vesículas secretoras) e proteína transportadora de açúcar do tipo GLUT. Estas seqüências encontradas tiveram a sua transcrição específica (ou preferencial) averiguada por RT-PCR semiquantitativo nos diferentes tecidos do inseto estudado (intestino médio, túbulo de Malpighi, corpo gorduroso, glândula salivar, ventrículo 1, ventrículo 2 e ventrículo 3 do intestino médio). O transporte de glicose e água in vivo foi estudado. Para isso, os insetos foram alimentados com uma solução contendo glicose e corante não absorvível seguido de dissecação e análise do conteúdo luminal. O transporte de água e glicose foi inibido por floretina 0,2 mM (inibidor do uniportador GLUT) e por florizina 0,1 mM (inibidor do simportador SGLT) e ativado por K2SO4 50 mM. Isto sugere a presença do transportador do tipo uniportador (GLUT), e do simportador K+-glicose (SGLT), ambos co-transportando água. O transcriptoma revelou proteína homóloga a transportador GLUT cuja seqüência está parcialmente completa e foi analisada com ferramentas de bioinformática / After identification of cathepsins L in vitro assays and in zimograms we began to purify this enzyme in insect midgut. The region V2 was selected as a source of material for purifying a cysteine proteinase because it contains most of the activity of that proteinase. After several attempts to purify this proteinase, an effective process was developed that avoid autolysis with methyl methanethiosulfonate (MMTS), a sulfhydryl-reactive and reversible sulfonating reagent for thiol-containing molecules. The purify process was made by three chromatographic steps (anion-exchange column, gel filtration column and affinity column in this order), where two cysteine proteinase were purified, cys 1 and cys 2 with 32 and 45 kDa (SDS-PAGE). The two cysteine proteinases have the same pH optimum of 6.3. Besides that, these enzymes were thermicaly inactivated following apparent first-order kinetics with a half-life of 5 min (cys1) and 4.8 min (cys2) at 40 ºC. Both Cys are inhibited by E-64 with a KD of 17.3 nM (Cys 1) and 7.11 nM (Cys2). Both Cys are more active on Z-FR-MCA than on Z-RR-MCA, suggesting they are cathepsins-L. With purpose of describe the molecular mechanisms underlying physiological phenomena in midgut of the Hemiptera Dysdercus peruvianus a cDNA library was prepared from midgut mRNA. We used ESTs from this library to identify transcripts genes related with glucose transport proteins besides digestive enzymes. Analysis of 1053 high-quality expressed sequence tags (ESTs) yielded 903 unique sequences comprised of 62 contigs and 841 singlets. Among the homologous sequences found the following are more relevant to our aim: β-glucosidase (microvillar membrane marker), α-glucosidase (perimicrovillar membrane marker), aminopeptidase (perimicrovillar space marker), cathepsin L (vesicles content) and sugar transporter protein, GLUT. These sequences had its specific transcription (or preferential) verified by semi-quantitative RT-PCR on different insect tissues (malpighian tubules, salivary gland, fat body, midgut, midgut first ventriculus, second ventriculus and third ventriculus). The glucose and water absorption across the first ventriculus of the midgut of the Hemiptera Dysdercus peruvianus were determined. The insects were fed with a 10 glucose-non-absorbable dye solution, followed by periodical dissection of insects and analysis of ventriculus contents. The transport of water and glucose can be inhibited by 0.2 mM phloretin (GLUT inhibitor) and by 0.1 mM phlorizin (SGLT inhibitor) and is activated by 50 mM K2SO4 The results suggest that D. peruvianus has a transporter uniporter like (GLUT) and K+-glucose symporter like SGLT, both co-transporting water. The transcriptome showed a GLUT homologous protein which sequence is almost complete and was analyzed by bioinformatics tools

A partir da identificação de catepsinas L em ensaios in vitro e em zimogramas partimos para purificação desta enzima no inseto. A região V2 foi selecionada como fonte de obtenção da cisteína proteinase já que dentre os três ventrículos o segundo apresentou maior atividade específica. Após diversas tentativas de isolar esta proteinase, foi estabelecida uma marcha de purificação que envolvia em todas as etapas a participação de metil metanosulfonato (MMTS), o que inativa a proteinase evitando assim autólise ao longo do processo de purificação. A marcha consistiu de três passos cromatográficos (troca-iônica, filtração em gel e afinidade, nesta ordem) onde foi observada a presença de duas cisteína proteinases, cada uma apresentando respectivamente as seguintes massas moleculares 32 e 45 kDa (SDSPAGE). As duas cisteína proteinases possuem o mesmo pH ótimo igual a 6,3. Além disso, estas enzimas foram termicamente inativadas a 40 ºC segundo uma cinética de primeira ordem aparente, sugerindo a existência de apenas uma espécie molecular de cada enzima na preparação com meia vida de 5 minutos para cis 1 e 4,8 minutos para cis 2. Foi determinada a constante de dissociação entre enzimainibidor, onde foi observado os valores de 17,3 nM para cis 1 e 7,11 nM para cis 2 através da titulação por E-64. A eficiência de catálise cis 1 e cis 2 é maior para o substrato sintético Z-FR-MCA do que para Z-RR-MCA, indicando que tratava-se de catepsinas L. Com o intuito de descrever os mecanismos moleculares por trás dos fenômenos fisiológicos no intestino médio do Hemiptera Dysdercus peruvianus foi construída uma biblioteca de cDNA a partir de mRNA deste tecido. Utilizamos ESTs provenientes desta biblioteca com o objetivo de identificar genes transcritos relacionados com proteínas de transporte de glicose além de enzimas digestivas. Após o processamento das leituras, surgiram 1053 ESTs úteis. Montando estes ESTs por alinhamento de bases, foram produzidos 62 contíguos e 841 singletos, o que totaliza 903 seqüências únicas. Entre as seqüências homólogas encontradas as mais relevantes para o nosso estudo foram: β-glicosidase (marcadora de membranas microvilares), α-glicosidase (marcadora de membranas 8 perimicrovilares), aminopeptidase (espaço perimicrovilar), catepsina L (conteúdo de vesículas secretoras) e proteína transportadora de açúcar do tipo GLUT. Estas seqüências encontradas tiveram a sua transcrição específica (ou preferencial) averiguada por RT-PCR semiquantitativo nos diferentes tecidos do inseto estudado (intestino médio, túbulo de Malpighi, corpo gorduroso, glândula salivar, ventrículo 1, ventrículo 2 e ventrículo 3 do intestino médio). O transporte de glicose e água in vivo foi estudado. Para isso, os insetos foram alimentados com uma solução contendo glicose e corante não absorvível seguido de dissecação e análise do conteúdo luminal. O transporte de água e glicose foi inibido por floretina 0,2 mM (inibidor do uniportador GLUT) e por florizina 0,1 mM (inibidor do simportador SGLT) e ativado por K2SO4 50 mM. Isto sugere a presença do transportador do tipo uniportador (GLUT), e do simportador K+-glicose (SGLT), ambos co-transportando água. O transcriptoma revelou proteína homóloga a transportador GLUT cuja seqüência está parcialmente completa e foi analisada com ferramentas de bioinformática / After identification of cathepsins L in vitro assays and in zimograms we began to purify this enzyme in insect midgut. The region V2 was selected as a source of material for purifying a cysteine proteinase because it contains most of the activity of that proteinase. After several attempts to purify this proteinase, an effective process was developed that avoid autolysis with methyl methanethiosulfonate (MMTS), a sulfhydryl-reactive and reversible sulfonating reagent for thiol-containing molecules. The purify process was made by three chromatographic steps (anion-exchange column, gel filtration column and affinity column in this order), where two cysteine proteinase were purified, cys 1 and cys 2 with 32 and 45 kDa (SDS-PAGE). The two cysteine proteinases have the same pH optimum of 6.3. Besides that, these enzymes were thermicaly inactivated following apparent first-order kinetics with a half-life of 5 min (cys1) and 4.8 min (cys2) at 40 ºC. Both Cys are inhibited by E-64 with a KD of 17.3 nM (Cys 1) and 7.11 nM (Cys2). Both Cys are more active on Z-FR-MCA than on Z-RR-MCA, suggesting they are cathepsins-L. With purpose of describe the molecular mechanisms underlying physiological phenomena in midgut of the Hemiptera Dysdercus peruvianus a cDNA library was prepared from midgut mRNA. We used ESTs from this library to identify transcripts genes related with glucose transport proteins besides digestive enzymes. Analysis of 1053 high-quality expressed sequence tags (ESTs) yielded 903 unique sequences comprised of 62 contigs and 841 singlets. Among the homologous sequences found the following are more relevant to our aim: β-glucosidase (microvillar membrane marker), α-glucosidase (perimicrovillar membrane marker), aminopeptidase (perimicrovillar space marker), cathepsin L (vesicles content) and sugar transporter protein, GLUT. These sequences had its specific transcription (or preferential) verified by semi-quantitative RT-PCR on different insect tissues (malpighian tubules, salivary gland, fat body, midgut, midgut first ventriculus, second ventriculus and third ventriculus). The glucose and water absorption across the first ventriculus of the midgut of the Hemiptera Dysdercus peruvianus were determined. The insects were fed with a 10 glucose-non-absorbable dye solution, followed by periodical dissection of insects and analysis of ventriculus contents. The transport of water and glucose can be inhibited by 0.2 mM phloretin (GLUT inhibitor) and by 0.1 mM phlorizin (SGLT inhibitor) and is activated by 50 mM K2SO4 The results suggest that D. peruvianus has a transporter uniporter like (GLUT) and K+-glucose symporter like SGLT, both co-transporting water. The transcriptome showed a GLUT homologous protein which sequence is almost complete and was analyzed by bioinformatics tools

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Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / A planta Calotropis procera pertencente à famÃlia Asclepiadaceae à encontrada em vasta extensÃo do Nordeste Brasileiro. à uma planta laticÃfera e sua produÃÃo endÃgena de lÃtex à extraordinÃria. Embora haja na literatura cientÃfica diversas publicaÃÃes que relatam o potencial medicinal de diversas partes da planta, principalmente de seu lÃtex, nÃo hà ainda uma abordagem bioquÃmica e funcional de seu fluido laticÃfero. Esta pesquisa foi desenvolvida no sentido de proceder a um estudo bioquÃmico parcial de atividades endÃgenas da fraÃÃo protÃica majoritÃria do lÃtex e de avaliar seus efeitos inseticidas sobre diferentes modelos de pragas agrÃcolas. A fraÃÃo protÃica majoritÃria do lÃtex foi preparada a partir de um protocolo previamente desenvolvido no laboratÃrio em que sÃo envolvidas etapas de centrifugaÃÃo e diÃlise. A fraÃÃo protÃica isenta de borracha e de molÃculas de baixa massa molecular foi testada para atividades enzimÃticas endÃgenas proteolÃticas, quitinÃsicas e a-amilÃsica e atividades inibitÃrias para proteases e a-amilase. Ensaios enzimÃticos de digestÃo das proteÃnas do lÃtex por extratos digestivos de insetos foram tambÃm realizados. Bioensaios utilizando-se dietas artificiais contendo diferentes proporÃÃes das proteÃnas do lÃtex Ãntegras, digeridas por pronase ou aquecidas a 98 ÂC foram realizados com seis insetos pertencentes a quatro ordens. Nos bioensaios foram avaliados parÃmetros tais como desenvolvimento, sobrevivÃncia, tempo de emergÃncia dos indivÃduos alÃm de ser avaliado o efeito cumulativo de proteÃnas do lÃtex na dieta por sucessivas geraÃÃes. Na fraÃÃo protÃica do lÃtex foram encontradas atividades proteolÃticas do tipo cisteÃnica e serÃnica, alÃm de atividade quitinolÃtica. NÃo foi detectada atividade a-amilÃsica. SoluÃÃes de proteÃnas do lÃtex nÃo exibiram atividade inibitÃria do tipo a-amilÃsica e tripsÃnica ou quimiotripsÃnica. ApÃs tratamento tÃrmico, proteÃnas do lÃtex ainda solÃveis foram capazes de inibir a atividade da papaÃna. Posteriormente esta atividade inibitÃria foi capaz de inibir as atividades proteolÃticas de Callosobruchus maculatus e Dysdercus peruvianus. As proteÃnas do lÃtex foram inseticidas para C. maculatus, Zabrotes subfasciatus, Anticarsia gemmatalis e Ceratitis capitata enquanto que nÃo foram para Spodoptera frugiperda e D. peruvianus. NÃo houve efeito deletÃrio acumulativo em insetos submetidos a uma dieta contendo proteÃnas do lÃtex durante seis geraÃÃes. Quando digeridas por pronase e aquecidas por 30 min a 98 ÂC, a aÃÃo inseticida das proteÃnas do lÃtex ainda foi mantida sobre o C. maculatus. As proteÃnas do lÃtex foram completamente resistentes à proteÃlise por enzimas digestivas de Dysdercus peruvianus e Callosobruchus maculatus. Entretanto, a aÃÃo proteolÃtica endÃgena do lÃtex promoveu a proteÃlise do extrato enzimÃtico de C. maculatus embora isto nÃo tenha ocorrido no extrato intestinal de D. peruvianus. O lÃtex de C. procera apresenta forte atividade proteolÃtica e resistÃncia à proteÃlise por enzimas digestivas de insetos. Atividade quitinolÃtica foi tambÃm observada. O lÃtex possui atividade inseticida para diferentes pragas agrÃcolas e esta atividade parece estar associada à presenÃa de um inibidor de atividade proteolÃtica do tipo cisteÃnica, alÃm da presenÃa de quitinases e elevada atividade proteolÃtica endÃgena. Assim, a fraÃÃo protÃica do lÃtex pode ser considera como parte constituinte da defesa da planta contra insetos. / The plant Calotropis procera belonging to Asclepiadaceae is found around a vast extension of the Northeast from Brazil. It is a lactifers plant and its endogenous production of latex is admirable. Despite continuous reports appearing in the literature give mention to the medicinal properties of different parts of the plant, including the latex, there is not scientific approaches comprising biochemical of functional aspects of the latex from C. procera. The aims this work was determine the presence of endogenous enzymatic activities and inhibitory activity against different proteases and a-amylase, to evaluate insecticidal properties against different crop pests and to correlate enzymatic content and insecticidal action with possible role of the latex in protecting the plant to insect pathogens. The major soluble protein fraction from the latex was prepared following the protocol previously defined that includes centrifugations and dialysis steps. The protein fraction devoided of rubber and low molecular mass molecules was assayed to the presence of endogenous proteolytic activities as well as a-amylase activity. Even, the presence of inhibitor of such activities was investigated. Additionally the latex proteins were submitted to proteolysis by digestive content of different insects. Bioassays base on artificial diets with different contents of native, pronase digested or heated treated (98 ÂC) latex proteins were performed against six insects belonging to 4 different orders. Increment in bodyweight of larvae, time of development and percentage of survive were the parameters considered to analyze detrimental effects of latex proteins upon insects. The effect of latex proteins upon Callosbruchus maculatus insects by continuous exposure until F-6 generation was reached was performed. It was found strong endogenous proteolytic activity and latex proteins were resistent to proteolysis by insect digestive extracts. In addition chitinolytic activity was also detected. The latex exhibited insecticidal activity against different insect groups and this effect may be correlated to the presence of a cysteine protease inhibitor associated to its proteolytic properties and chitinolytic activity. It is suggested that the protein fraction of the latex from Calotropis procera plays a relevant role in defending the plant against pathogens.

Phenacoccus peruvianus (Hemiptera: Pseudococcidae) is an invasive mealybug of Neotropical origin, first reported in the Mediterranean Basin in Almeria (Spain) in 1999. In the following years the mealybug spread into other Mediterranean regions and has also been recorded in Portugal and France, as well as in Sicily, Corsica and the Balearic Islands. Phenacoccus peruvianus is a polyphagous species and damages economically important ornamental plants. Since this was a relatively unknown species, during the first years of invasion, the mealybug was managed by the application of chemical treatments with wide-spectrum pesticides. However, the latest European directive on pesticide use reduces or even forbids pesticide applications in a wide range of urban green areas, giving significant priority to biological control (European Parliament and Council 2009). This thesis sets the basis for introducing biological control into a P. peruvianus management program in urban landscapes, focusing on its characterization, sampling, biology and control. In order to facilitate the identification of this and other mealybug species, we characterised 33 mealybug populations infesting crops and ornamental plants in Eastern Spain, using a combination of molecular and morphological techniques. This characterisation led to the identification of ten mealybug species and made routine identification possible through DNA sequencing or the use of derived species-specific molecular tools. The sequences obtained also add to the phylogenetic knowledge of the Pseudococcidae family and provide insight into the invasion history of some species. Phenacoccus peruvianus populations were high in bougainvillea plants during spring and summer, declining to almost undetectable levels in autumn and winter. The mealybug was mainly found in bracts and there were no significant migrations between plant strata. Phenacoccus peruvianus showed a high aggregated distribution on bracts, leaves and twigs. We recommend a binomial sampling of 200 leaves and an action threshold of 55% infested leaves for IPM purposes in urban landscapes. Its most abundant natural enemies were found to be the primary parasitoids Acerophagus n. sp. near coccois and Leptomastix epona Walker (Hymenoptera: Encyrtidae). We also identified several predator species from the Anthocoridae, Coccinellidae, Chamaemyiidae, and Chrysopidae families. Phenacoccus peruvianus populations were lower during the second and third year of the survey, coinciding with an increase in the parasitoid Acerophagus sp. populations, which displaced the native L. epona. Differential female offspring and resource preemption are discussed as the main reasons for this displacement. To obtain further information on the biology of the new parasitoid Acerophagus sp. we determined some traits of its reproductive and feeding strategies. Acerophagus sp. egg load reached its maximum when it was 5 days old with almost 30 mature eggs. Phenacoccus peruvianus second and third nymphal instars and adults were suitable for parasitism and efficient encapsulation was low (10.76 ± 0.31 %). The parasitoid always preferred older instars when different host instars were available. Acerophagus sp. developed as a solitary parasitoid in the second instar and as a gregarious parasitoid in older instars (2¿4 parasitoids per host). Moreover, it reproduced parthenogenetically and all the emerged offspring were females. Immature development lasted between 20 and 22 days at 25°C and 65% HR. Under these conditions, adults lived for longer than 20 days when fed on honey, but fewer than 3 days when fed on naturally occurring sugar sources (host honeydew and Bougainvillea glabra flowers). / Beltrà Ivars, A. (2014). Biology and management of the invasive mealybug Phenacoccus peruvianus (Hemiptera: Pseudococcidae) in urban landscapes [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/37233