Univ., Diss., 2006--Giessen

Einleitung: Mesenchymale Stromazellen (MSC) werden zunehmend für klinische Anwendungen bei Pferdepatienten eingesetzt. Für die MSC-Isolation und Expansion ist ein Laborschritt obligatorisch, danach werden die Zellen an den teilnehmenden Tierarzt zurückgesandt. Die Erhaltung der biologischen Eigenschaften von MSCs bzw. die Erhaltung der Qualität der MSCs ist für den Erfolg der Therapie während dieses Transports von größter Bedeutung. Ziele der Untersuchung: Das Ziel der Studie war es, transportbezogene Parameter (Transportbehälter, Medien, Temperatur, Zeit, Zellkonzentration) zu vergleichen, die potenziell Einfluss auf die Eigenschaften der in Kultur expandierten MSC während des Transportes in Suspension haben können. Material und Methoden: Diese Studie wurde in drei Teile geteilt, in welchen (I) fünf verschiedene Transportbehälter (Kryotube, zwei Arten von Plastikspritzen, Glasspritze, CellSeal), (II) sieben verschiedene Transportmedien, vier Temperaturen (4 °C gegen Raumtemperatur, - 20 °C vs. - 80 °C), zwei verschiedene Zeitrahmen (24 h gegen 48 h im positiven Temperaturbereich, 48 h gegen 72 h im negativen Temperaturbereich) und (III) drei MSC-Konzentrationen (5 x 106, 10 x 106, 20 x 106 MSC/ml) für den positiven und negativen Temperaturbereich verglichen wurden. Jeder Teil der Studie wurde unter Verwendung von Proben von sechs Pferden (n = 6) ausgewertet und Differenzierungsprotokolle (adipogene, osteogene und chondrogene) sowie Untersuchung der Vitalität und Proliferationsfähigkeit der MSC wurden für jeden Teil der Studie in doppeltem Einsatz bzw. verdoppelt bestimmt. Die Ergebnisse wurden als Median und mittlerer Interquartilabstand (IQR) dargestellt (p ≤ 0,05). Eine Anpassung des Signifikanzniveaus bei multiplen Vergleichen wurde mittels Bonferroni- Korrektur durchgeführt. Die Überprüfung der Daten auf Normalverteilung erfolgte mittels Shapiro- Wilk-Test. Ergebnisse: In Teil I der Studie lieferten die Spritzenmodelle die höheren Werte hinsichtlich des Endvolumens und gleichzeitig erzielte die Glasspritze die beste Zellvitalität. Dieser Behälter wurde für die nachfolgenden Teile der Studie ausgewählt. In Teil II der Studie wurde die höchste Zelllebensfähigkeit mit autologen Knochenmarküberständen als Transportmedium bei 4 °C für 24 h beobachtet (70,6 % gegenüber der Kontrollgruppe 75,3 %). Im Gegensatz dazu war die Lebensfähigkeit für alle Gefrierprotokolle bei -20 °C oder -80 °C, insbesondere bei Knochenmarküberstand oder Plasma und DMSO, unannehmbar niedrig (< 40 %). In Teil III der Studie zeigten die untersuchte Zellkonzentrationen keinen Einfluss auf die ausgewerteten Parameter. Diskussion: In dieser Studie wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt, möglicherweise war dies durch die hohe Anzahl von Transportbedingungen, welche gleichzeitig verglichen wurden, sowie die Anzahl der Stichproben (n=6) bedingt. Jedoch ergaben sich wichtige Hinweise zur Verbesserung des Transports der MSC für die klinisch-therapeutische Anwendung. Eine Einschränkung der chondrogenen Differenzierungsfähigkeit der MSC trat unter allen untersuchten Bedingungen auf. Im Vergleich zu früheren Pferdestudien wurde eine niedrigere Lebensfähigkeit der MSC nach dem Auftauen beobachtet. Mögliche Ursachen können unterschiedliche Protokolle beim Einfrieren und Auftauen der MSC sowie die große Anzahl an gleichzeitig bearbeiteten Proben sein. Zukünftige Studien könnten die möglicherweise negativen Auswirkungen des Transports auf die chondrogene Differenzierung klären. Schlussfolgerung: Trotz fehlender signifikanter Unterschiede ist eine deutliche Tendenz erkennbar, dass MSC aus dem Knochenmark schnellstmöglich bei 4 °C in autologem bzw. eigenem Knochenmark-Überstand aus dem Labor zum Patienten, in dem in dieser Studie untersuchten Glasspritzenmodell, zurückgesandt werden sollten.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ...................................................................................................................1 2 Literaturübersicht ......................................................................................................2 2.1 Der Ursprung mesenchymaler Stromazellen .........................................................2 2.2 Klassifizierung der MSC .........................................................................................3 2.3 Charakterisierung der MSC ....................................................................................4 2.4 Quellen von MSC ...................................................................................................4 2.5 Ablauf der MSC-Therapie beim Pferd ....................................................................4 2.6 Empfehlungen der EMA zur klinisch-therapeutischen Anwendung zellbasierter Therapien ..........................................................................................6 2.7 Rechtliche Aspekte ................................................................................................7 2.8 Tetrazoliumsalze zur Bestimmung der Zellaktivität (WST-1-Reagenztest) .............9 2.9 Zielstellung dieser Arbeit.......................................................................................10 2.10 Hypothese dieser Arbeit......................................................................................10 3 Material und Methoden............................................................................................11 3.1 Versuchspferde ....................................................................................................11 3.2 Allgemeine Schritte für die gesamte Studie ........................................................11 3.2.1 Knochenmarkentnahme beim Pferd .................................................................11 3.2.2 Blutentnahme beim Pferd ..................................................................................13 3.2.3 Probenverarbeitung und Zellkultur ....................................................................13 3.2.4 Isolation der MSC ..............................................................................................14 3.2.5 Bestimmung der Zellzahl ...................................................................................15 3.2.6 Expansion der MSC ..........................................................................................16 3.2.7 Kryokonservierung ............................................................................................16 3.2.8 Auftauen der MSC ............................................................................................16 3.2.9 Bestimmung der Zellvitalität .............................................................................17 3.2.10 Kumulative Populationsverdopplungen (kPV) der MSC ..................................18 3.2.11 Differenzierungspotentiale der MSC ...............................................................18 3.2.11.1 Differenzierung in Monolayer-Zellkultur für die adipogene und osteogene Linie ............................................................................................................................19 3.2.11.1.1 Adipogene Differenzierung ........................................................................19 3.2.11.1.2 Osteogene Differenzierung ........................................................................22 3.2.11.2 Chondrogene Differenzierung (dreidimensionales Modell) ...........................25 3.3 Studiendesign – allgemeine Darstellung ..............................................................32 3.3.1 Teil 1: Untersuchung zur Ermittlung des optimalen Transportbehälters ...........33 3.3.1.1 Studiendesign zum ersten Teil der Studie ......................................................33 3.3.1.2 Zeit0: Vorbereitung der Kontrolle ...................................................................33 3.3.1.3 Zeit0: Vorbereitung der Versuchsbedingungen nach 24 Stunden .................34 3.3.1.4 Transportbehälter ......................................................................................... 34 3.3.1.5 Zeit1: Auswertung der Transportbehälter nach 24 Stunden Inkubationszeit 35 3.3.2 Teil 2: Untersuchung zum optimalen Verhältnis von Medium-Temperatur-Zeit 36 3.3.2.1 Studiendesign zum zweiten Teil der Studie ................................................. 36 3.3.2.2 Untersuchungsbedingungen .........................................................................37 3.3.2.3 Auswertung der Kontrolle und der Konditionsbedingungen ........................ 37 3.3.3 Teil 3: Untersuchung zur optimalen Zellkonzentration ..................................... 38 3.3.3.1 Studiendesign zum dritten Teil der Studie .................................................... 38 3.3.3.2 Untersuchungsbedingungen ......................................................................... 39 3.3.3.3 Auswertung der Kontrolle und der Konditionsbedingungen ......................... 39 3.4 Statistische Auswertung ..................................................................................... 40 4 Ergebnisse ............................................................................................................. 41 4.1 Teil 1: Behälter .................................................................................................... 41 4.1.1 Evaluierung der Endvolumen pro Behälter ....................................................... 41 4.1.2 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 42 4.1.2.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 42 4.1.2.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 43 4.1.3 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 44 4.1.4 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 45 4.1.4.1 Adipogene Differenzierung ............................................................................ 45 4.1.4.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 47 4.1.4.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 49 4.2 Teil 2: Medium, Temperatur und Zeit .................................................................. 53 4.2.1 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 53 4.2.1.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 53 4.2.1.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 54 4.2.2 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 56 4.2.3 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 58 4.2.3.1 Adipogene Differenzierung ............................................................................ 58 4.2.3.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 59 4.2.3.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 61 4.3 Teil 3: Zellkonzentration ...................................................................................... 64 4.3.1 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 64 4.3.1.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 64 4.3.1.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 65 4.3.2 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 66 4.3.3 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 67 4.3.3.1 Adipogene Differenzierung .......................................................................... 67 4.3.3.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 69 4.3.3.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 71 5 Diskussion .............................................................................................................. 74 5.1 Zielsetzung der geplanten Durchführung ............................................................ 74 5.2 Diskussion zum Material ..................................................................................... 75 5.3 Vorversuche ........................................................................................................ 76 5.3.1 Inkubationsbedingungen ................................................................................. 76 5.3.2 Sechster Behälter ............................................................................................. 76 5.3.3 WST-1-Reagenztest ......................................................................................... 77 5.3.4 Adipogene Differenzierung ............................................................................... 77 5.3.5 Chondrogene Differenzierung .......................................................................... 78 5.3.6 Kryokonservierungsmedium in der Pferdereproduktionsmedizin..................... 79 5.3.7 Die Auswirkung von Druck auf die Zellmembran ............................................. 80 5.4 Diskussion der Ergebnisse und Vergleich mit der Literatur ................................ 80 5.4.1 Diskussion des ersten Teils der Studie............................................................. 80 5.4.2 Diskussion des zweiten Teils der Studie........................................................... 82 5.4.3 Diskussion des dritten Teils der Studie............................................................. 87 5.4.4 Schlussfolgerungen ..........................................................................................87 6 Zusammenfassung ................................................................................................ 89 7 Summary ............................................................................................................... 91 8 Literaturverzeichnis ................................................................................................ 93

Der Freistaat Sachsen engagiert sich seit 1999 im Reittourismus. Schwerpunkte sind die Schaffung eines attraktiven Wegenetzes, die Entwicklung und Qualifizierung reittouristischer Angebote und deren Vermarktung. Die Marke 'Sachsen mit Pferd' ist konsequent weiterentwickelt worden und Bestandteil des Marketings der Landestouristik. Die Zwischenbilanz der Förderung des Reittourismus weist vielfältige Erfolge auf: Die Marke 'Sachsen mit Pferd' wurde entwickelt (Logo, PR, Angebote), rd. 600 Anbieter sind unter dem Produkt 'Sachsen mit Pferd'; zusammengefasst, Leitbild und Marketingstrategie wurden entwickelt, die reittouristischen Angebote wurden in die Marketingkampagne „SACHSENLand erleben“ aufgenommen, ein Zertifizierungssystem für die Reittourismusbetriebe wurde eingerichtet, das Internetportal „Sachsen mit Pferd“ ist seit 2003 online. Etwa 7 000 km Reitwege wurden beschildert. 15 (von 23 geplanten) Reitkarten sind erschienen. Der FN-Wettbewerb 'Pferdefreundliche Gemeinde'; wird auch in Sachsen durchgeführt, der Landes-Wettbewerb 'Pferdefreundliche Gaststätte' findet seit 2003 statt. Weiterbildungsmaßnahmen für Reitbetriebe (und reiterfreundliche Anbieter) wurden entwickelt, 2006 wurde der IHK-Zertifikatskurs 'Fachkraft für Reittourismus' etabliert, im Oktober 2007 gab es die beiden ersten erfolgreichen Absolventinnen. Die Förderung des Reittourismus in Sachsen verfolgt - neben den markenstrategischen und imagebezogenen Zielen - das Ziel der Förderung des ländlichen Raumes und die Unterstützung derlandwirtschaftlichen Betriebe. Stichworte sind u. a. Agrartourismus, Diversifizierung des Angebotes der landwirtschaftlichen Betriebe, Stärkung des Tourismus im ländlichen Raum. Die vorliegende Studie dient als Grundlage, um eine Zwischenbilanz der bisherigen Aktivitäten zu ziehen. Im Mittelpunkt der Überlegungen steht die Weichenstellung für die zukünftige Ausrichtung des Projektes 'Sachsen mit Pferd'.

Die Synoviauntersuchung ist von großer Bedeutung für die Diagnose, Verlaufskontrolle und Prognose von Gelenkerkrankungen und aufgrund des häufigen Auftretens von Gelenkproblemen beim Pferd von großer Relevanz für die Pferdepraxis und von ökonomischer Bedeutung für den Pferdebesitzer. Ein großes Problem für die Synoviadiagnostik stellt die Tatsache dar, dass in der Literatur sehr uneinheitliche Normwerte angegeben werden, die zudem meist nicht für die einzelnen Gelenke differenziert aufgeführt werden. Insbesondere über die Zusammensetzung der Gelenkflüssigkeit der Huf- und Krongelenke ist noch sehr wenig bekannt, da es bei diesen Gelenken schwierig ist, bei physiologischer Gelenkfüllung ausreichende Mengen an Untersuchungsmaterial zu gewinnen. Ein weiteres Problem stellt die Tatsache dar, dass die Bestimmungsmethoden und die Maßeinheiten nicht einheitlich sind, und daher die Vergleichbarkeit der Werte eingeschränkt wird. Aus diesem Grund war es Ziel dieser Arbeit, für einige der beim Pferd am häufigsten erkrankten Gelenke physiologische Befunde für einige makroskopische, biochemische und zelluläre Parameter aufzustellen, die laut Schrifttum eine gute Beurteilung des synovialen Systems erlauben. Des weiteren sollte die von HEILMANN 1984 für die Humanmedizin entwickelten Verdünnungsmethode zur Ermittlung des Synoviavolumens hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit beim Pferd geprüft werden. Das Gelenkflüssigkeitsvolumen ist insofern von Bedeutung, als fast alle Gelenkerkrankungen mit einer Veränderung des Synoviavolumens einher gehen und weil bei bekanntem Gelenkflüssigkeitsvolumen die gewünschte Wirkstoffkonzentration bei intraartikulärer Applikation erzielt werden kann. Die Proben stammten von 39 Pferden und Ponys unterschiedlicher Größe (Stockmaß: 110-178 cm, Gewicht: 120-680 kg KG) und Rasse (22 Warmblutpferde, 12 Ponys und Kleinpferde, 4 Kaltblüter, 1 Vollblüter), verschiedenen Alters (9 Monate-20 Jahre) und Geschlechts (16 Stuten, 15 Wallache, 8 Hengste), die aus variierenden Gründen der Schlachtung zugeführt wurden. Einzige Voraussetzung für die Probanden war, dass sie bei der klinischen und anschließenden pathologischen Untersuchung keinen Hinweis auf eine Gelenkerkrankung zeigen durften. Untersucht wurden Vorderfußwurzel-Mittelgelenke (n = 78), Fessel- (n = 78), Kron- (n = 77) und Hufgelenke (n = 74) jeweils beider Vordergliedmaßen. Insgesamt gingen 307 Gelenke in die Messungen ein. Die Gelenkpunktate wurden adspektorisch (Farbe, Trübung, Beimengungen, Gerinnung, Fadenziehvermögen), biochemisch (Totalprotein, Albumin, Globulin, Albumin/Globulin-Verhältnis, Aktivität der alkalischen Phosphatase und der Laktatdehydrogenase, pH, Glucose, Lactat) und hinsichtlich des Differenzialzellbildes (Leukozyten, Monozyten/Makrophagen, Granulozyten, Synoviozyten) untersucht. Die Parameter wurden so zusammengestellt, dass sowohl entzündliche (einschließlich septische) als auch degenerative Gelenkerkrankungen erkannt werden können. Zusätzlich wurde das Synoviavolumen mittels des "Biochemischen Gelenkfunktionstests nach HEILMANN" bestimmt, wobei ein definiertes Volumen einer Markersubstanz (Hydroxyethylstärke (HES)-Lösung, 0,5 %) intraartikulär appliziert und das Synovia-HES-Gemisch nach einer Durchmischungsphase gewonnen wird. Über die Konzentrationsabnahme der Markersubstanz lässt sich dann das Synoviavolumen bestimmen und mittels des Verdünnungsfaktors die Konzentration der gewünschten Parameter berechnen. Die Untersuchung zeigte zum Teil deutliche Unterschiede zwischen den Mittelwerten der verschiedenen Gelenke, wobei insgesamt folgende Durchschnittswerte festgestellt wurden: Gesamtprotein: 15,30 g/l (15,08-16,03 g/l), Albumin/Globulin: 1,54 (1,46-1,60), Albumin: 60,03 % (58,43-61,28 %), Globulin: 39,97 % (38,72-41,57 %), Glukose: 6,67 mmol/l (6,35-9,98 mmol/l), Laktat: 7,69 mmol/l (6,69-8,14 mmol/l), pH: 7,67 (7,60-7,79), alkalische Phosphatase: 113,00 U/l (108,29-115,95 U/l), Laktatdehydrogenase: 216,53 U/l (207,70-231,15 U/l), Monozyten/Makrophagen: 54,9 % (53,5-56,4 %), Lymphozyten: 17,2 % (159-18,2 %), Granulozyten: 1,0 % (0,7-1,2 %), Synoviozyten: 27,0 % (23,8-30,2 %). Im Durchschnitt betrug das punktierbare Volumen 3,09 ml (0,58-6,21 ml) und das via Verdünnungsmethode ermittelte absolute Synoviavolumen 10,15 ml (6,07-14,90 ml). Die Mittelwertunterschiede der verschiedenen Gelenke sind für das Fadenziehvermögen, Gesamtprotein, Albumin/Globulin-Verhältnis, Albumin, Globulin, Glucose, Lactat, pH, Synoviozytenanteil, punktierbares und absolutes Synoviavolumen signifikant. Außerdem unterscheiden sich die Gelenke signifikant hinsichtlich des Auftretens von Beimengungen und Trübungen. Die ermittelten Werte stimmen weitgehendst mit den in der Literatur zu findenden Angaben überein, sofern diese vorhanden sind und soweit trotz unterschiedlicher Einheiten und Bestimmungsmethoden überhaupt verglichen werden kann. In jedem Fall leistet diese Arbeit einen Beitrag zur Vereinheitlichung der Angaben über physiologische Synoviabefunde und die Besonderheiten der unterschiedlichen Gelenke. Der "Biochemische Gelenkfunktionstest nach HEILMANN" ist als Verdünnungsmethode zur Bestimmung des absoluten Gelenkflüssigkeitsvolumens prinzipiell auch beim Pferd anwendbar, jedoch für die Praxis nicht unbedingt relevant, da das Synoviavolumen individuell stark variiert und auch beim Seitenvergleich in einzelnen Fällen um bis zu 3,79 ml schwankt. Diese Verdünnungsmethode ermöglicht es aber, auch aus den kleinen Gelenken in jedem Fall ausreichende Mengen an Untersuchungsmaterial zu gewinnen, so dass auch diese einer Untersuchung zugänglich gemacht werden. / Synovial fluid analysis is very important for the diagnosis, prognosis and monitoring the progress of arthropathies in all species. It is especially important in the horse in which inappropriate diagnosis and prognosis can have serious financial implications for the owner. In the horse, the interpretation of synovial fluid analyses is hampered by the lack of uniformity in both the analytical methods and the units of measurement in the published values. In addition, these reports frequently do not distinguish between different joints, and the studies on the biochemical and cellular values of the proximal and distal interphalangeal joints are particlularly poor. There is also a paucity of information on the total volume of synovial fluid of different joints. Knowledge of normal joint fluid volumes would allow concentrations of intra-articular injected medications to be determined accurately. The objective of this study was to determine the normal biochemical and cellular values of synovial fluid collected from certain joints of the distal equine limb. A second goal was to examine the applicability of the dilution method described by HEILMANN (1984) in human joints using hydroxy-ethyl starch to determine the total volume of synovial fluid of joints. Samples were collected from 39 horses and Ponys of different breeds and sex (16 females, 15 geldings, 8 entire males) and of varying age (9 months-20 years), height (110-178 cm), and weight (120-680 kg), that had been sent to slaughter for various reasons. All animals were examined clinically and pathologically and no animal with evidence of joint disease was included in the study. Samples of synovial fluid were collected from the following joints: middle carpal (n = 78), fetlock (n = 78), proximal interphalangeal (n = 77) and distal interphalangeal (n = 74). In total, samples from 307 joints were examined. The synovial fluid was assessed for colour, cloudiness, viscosity and particulate matter. The following parameters were determined by standard methods: total protein, albumin, globulin, albumin/globulin ratio, glucose, lactate, pH, alkaline phosphatase, lactate dehydrogenase and a differential cell count. Abnormalities in these parameters are considered to be indicative of synovitis, infectious arthritis, degenerative joint disease and synovial effusion. The total volume of joint fluid was determined by the HEILMANN method: A sample of fluid was withdrawn from each joint and the punctionable volume noted. A known volume and concentration of hydroxy-ethyl starch was injected into the joint; the joint was manipulated and a second sample of fluid removed. By the decrease of the concentration of the hydroxy-ethyl starch the synovial fluid volume can be calculated. The total synovial fluid was determined by adding the initial volume of fluid removed and the volume obtained by the dilution method. The values varied between the different joints and the range of mean values for the four joints examined were: total protein 15,30 g/l (15,08-16,03 g/l); albumin 60,03 % (58,43-61,28 %); globulin 39,97 % (38,72-41,57 %); albumin/globulin ratio 1,54 (1,46-1,60); glucose 6,67 mmol/l (6,35-9,98 mmol/l); lactate 7,69 mmol/l (6,69-8,14 mmol/l); pH 7,67 (7,60-7,79); alkaline phosphatase 113,00 U/l (108,29-115,95 U/l) and lactate dehydrogenase 216,53 U/l (207,70-231,15 U/l). On cytology, the mean values were: monocytes 54,9 % (53,5-56,4 %); lymphocytes 17,2 % (15,9-18,2 %); granulocytes 1,0 % (0,7-1,2 %) and synovial cells 27,0 % (23,8-30,2 %). The mean total volume of joint fluid was 10,15 ml and varied from 14,9 ml (middle carpal) to 6,07 ml (distal interphalangeal). Significant differences in the mean values of viscosity, total protein, albumin/globulin ratio, albumin, globulin, glucose, lactate, pH, lactate dehydrogenase, punctionable volume and the total volume of joint fluid occurred among the four joints. On cytology, only the mean values of synovial cells differed significantly among joints. As far as comparison is possible, the results of this study are in accord with published values. The study, however, does show that there are normal, physiological differences, especially in the biochemical parameters, among the four joints examined and that the values for one joint may not be appropriate for all joints. Furthermore, the dilution method developed by HEILMANN for human joints can be applied to the horse, although it may not be a useful measure of synovial system dysfunction as, in some horses, the difference in volume for the same joint of both legs was up to 3,79 ml. The addition of the hydroxy-ethyl starch to the smaller joints did allow the collection of sufficient fluid for a complete examination without interfering with the analysis.

Die Dualenergie-Röntgenabsorptiometrie (DEXA, Dual Energy X-Ray Absorptiometry) ist ein in der Humanmedizin und Teilen der Veterinärmedizin etabliertes Verfahren zur Untersuchung der Knochenmineraldichte, des Knochenmineralgehaltes und der Körperzusammensetzung. Für das Pferd existieren bisher lediglich vereinzelte Studien zur Untersuchung des Knochens mittels der DEXA-Methode, welche allesamt auf nur sehr geringen Versuchstierzahlen beruhen. Ziel dieser Arbeit war es daher die DEXA-Methode für die Untersuchung am Pferd zu validieren. Hierfür wurden die Röhrbeine von 103 Schlachtpferden mittels des Densitometers PIXI LUNAR®, welches aus der Humanmedizin stammt und dort zur Untersuchung des Unterarmes dient, untersucht und die densitometrische Knochenmineraldichte (BMD) und der densitometrische Knochenmineralstoffgehalt (BMC) ermittelt. Als Messpunkt wurde standar-disiert die Mitte zwischen der Basis und dem Caput des Os metacarpale tertium bzw. des Os metatarsale tertium gewählt. Im Anschluss an die densitometrische Messung wurde als Referenzverfahren eine chemische Analyse durchgeführt, in welcher der Rohasche- sowie der Calcium- Phosphor- und Magnesiumgehalt der Röhrbeine bestimmt wurden. Die Angabe der Ergebnisse erfolgt als Median und 25-/75-Perzentil. Der Rohaschegehalt lag im Mittel über alle Röhrbeine bei 698 (69,1 - 70,3) g/kg TS. Für die Mineralstoffe konnten folgende Gehalte ermittelt werden: Calcium 265 (259 - 272) g/kg TS, Phosphor 123 (121 - 126) g/kg TS und Magnesium 2,40 (2,19 - 2,66) g/kg TS. Das Calcium-Phosphor-Verhältnis lag in einem Bereich von 2,14 - 2,18. Die Resultate der DEXA-Methode werden neben dem Mineralstoffgehalt auch vom Knochenumfang beeinflusst, so dass die folgenden Ergebnisse für die Vorder- und Hintergliedmaße (VGM, HGM) separat dargestellt werden: BMD: VGM 3,22 (2,80 - 3,65) g/cm², HGM 4,21 (3,76 - 4,65) g/cm²; BMC: VGM 26,5 (22,8 - 30,1) g, HGM 32,9 (29,0 - 36,3) g. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Reproduzierbarkeitsstudien durchgeführt, bei denen für die BMD bei der Reproduzierbarkeit ohne Reposition Abweichungen in einem Bereich von 1,06 - 1,85 % und mit Reposition in einem Bereich von 3,51 - 4,48 % gefunden wurden. Für die BMC lag die Abweichung für die Reproduzierbarkeit ohne Reposition in einem Bereich von 1,28 - 2,79 % und mit Reposition schwankte sie zwischen 3,38 und 3,94 %. Um für den Einsatz der DEXA-Methode bei Verlaufsuntersuchungen den Einfluss der exakten Messlokalisation zu eruieren, wurden Messungen in einem Abstand von ein, zwei und drei Zentimetern proximal und distal des ursprünglichen Messpunktes vorgenommen. Die Ergeb-nisse dieser Studie wichen für die BMD um 3,53 - 9,16 % und für den BMC um 4,21 - 12,5 % von den Ergebnissen des zentralen Messpunktes in der Mitte der Diaphyse ab. Diese Abweichung liegt innerhalb der 25-/75-Perzentile der Messergebnisse des zentralen Messpunktes. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie führen zu dem Schluss, dass es möglich ist die Knochenmineraldichte und den Knochenmineralgehalt des Röhrbeines des Pferdes mittels der DEXA-Methode zu ermitteln. Die guten Ergebnisse der Reproduzierbarkeitsstudien und der Abstandsmessungen vom zentralen Messpunkt legen die Durchführbarkeit am stehenden, sedierten Pferd nahe. Bei der DEXA-Methode wird ein Knochenabschnitt mit einem sehr hohen Kortikalisanteil erfasst, welcher auf Einflüsse, wie beispielsweise Training oder Ruhigstellung mit einer Veränderung des Knochenumfanges bei gleichbleibenden Mineralstoffkonzentrationen reagiert. Diese Eigenschaft führt zu einem geringen Zusammenhang zwischen der DEXA-Methode und der chemischen Analyse, so dass sich die Ergebnisse der beiden Messverfahren zwar gut in den Kontext anderer Studien einfügen, der direkte Vergleich der beiden Methoden jedoch nicht möglich ist. / DXA (dual energy X-ray absorptiometry) is an established method for the measurement of bone mineral density (BMD), bone mineral content (BMC) and whole body composition in human and partly in veterinary medicine. However, there are only a small number of studies that examine the bone in horses using DXA. All these studies are based on small samples. Therefore, the objective of this study was to validate the use of DXA for the measurement of BMD and BMC in the horse. In total the cannons of 103 horses were scanned ex vivo, using the PIXI LUNAR® densitometer. In human medicine this densitometer is used for the exami-nation of the forearm. The measuring point was the exact middle between basis and caput of the third metacarpal/metatarsal bone. In a second step the DXA measurements were complemented with a chemical analysis, analyzing the ash content, calcium, phosphorus and magnesium content of the bones. The results are presented as median and 25-/75-percentile. The average ash content of the cannon bones was 698 (691 - 703) g/kg DM. The average mineral content was measured in the following order: calcium 265 (259 - 272) g/kg DM, phosphorus 123 (121 - 126) g/kg DM und magnesium 2.44 (2.19 - 2.66) g/kg DM. The ratio of calcium to phosphorus ranged from 2.14 to 2.18. The DXA results are influenced not only by the bone´s mineral content, but also by its diameter. Because of this the results are separated into the results of the forelimb (fl) and the hindlimb (hl) which generates the following results: BMD: fl 3.22 (2.80 - 3.65) g/cm², hl 4.21 (3.76 - 4.65) g/cm²; BMC: fl 26.5 (22.8 - 30.1) g, hl 32.9 (29.0 - 36.3) g. Several robustness checks of the measurements were conducted. For the BMD measurements, the range of measurements diverged by 3.51-4.48 % for measurements with limb repositioning, and by 1.06-1.85 % for measurements without limb repositioning. For the BMC measurements, the range of measurements diverged by 3.38-3.94 % for measurements with limb repositioning, and by 1.28-2.79 for measurements without limb repositioning. To determine the importance of the exact bone position for follow-up investigations, measurements in a distance of one, two and three centimeters proximal and distal of the original measuring point were performed. The results of these measurements deviated from the result of the central measuring point at the centre of the diaphysis in a range of 3.53 – 9.16 % for BMD and a range of 4.21 – 12.5 % for BMC. This variation falls within the percentiles of the central measuring point. Overall, the results of this study indicate that DXA is useable for determining BMD and BMC at the third metacarpal/metatarsal bone of the horse. The high reproducibility of the results and the distance measurements suggest that DXA is suitable for measurements at the standing, tranquilized horse. However, the cannon bone is a bone with a high content of cortical bone. This means that the diameter of the bone changes as a result of training or immobilization, while the BMD and BMC remain unchanged by such influence. This leads to a weak correlation between the results from the DXA and chemical analyses. Thus, while these two types of analysis fit well into the context of prior studies, a direct comparison between these measurements is not possible.

Zugl.: Oldenburg, Univ., Diss.

Die Dualenergie-Röntgenabsorptiometrie (DEXA, Dual Energy X-Ray Absorptiometry) ist ein in der Humanmedizin und Teilen der Veterinärmedizin etabliertes Verfahren zur Untersuchung der Knochenmineraldichte, des Knochenmineralgehaltes und der Körperzusammensetzung. Für das Pferd existieren bisher lediglich vereinzelte Studien zur Untersuchung des Knochens mittels der DEXA-Methode, welche allesamt auf nur sehr geringen Versuchstierzahlen beruhen. Ziel dieser Arbeit war es daher die DEXA-Methode für die Untersuchung am Pferd zu validieren. Hierfür wurden die Röhrbeine von 103 Schlachtpferden mittels des Densitometers PIXI LUNAR®, welches aus der Humanmedizin stammt und dort zur Untersuchung des Unterarmes dient, untersucht und die densitometrische Knochenmineraldichte (BMD) und der densitometrische Knochenmineralstoffgehalt (BMC) ermittelt. Als Messpunkt wurde standar-disiert die Mitte zwischen der Basis und dem Caput des Os metacarpale tertium bzw. des Os metatarsale tertium gewählt. Im Anschluss an die densitometrische Messung wurde als Referenzverfahren eine chemische Analyse durchgeführt, in welcher der Rohasche- sowie der Calcium- Phosphor- und Magnesiumgehalt der Röhrbeine bestimmt wurden. Die Angabe der Ergebnisse erfolgt als Median und 25-/75-Perzentil. Der Rohaschegehalt lag im Mittel über alle Röhrbeine bei 698 (69,1 - 70,3) g/kg TS. Für die Mineralstoffe konnten folgende Gehalte ermittelt werden: Calcium 265 (259 - 272) g/kg TS, Phosphor 123 (121 - 126) g/kg TS und Magnesium 2,40 (2,19 - 2,66) g/kg TS. Das Calcium-Phosphor-Verhältnis lag in einem Bereich von 2,14 - 2,18. Die Resultate der DEXA-Methode werden neben dem Mineralstoffgehalt auch vom Knochenumfang beeinflusst, so dass die folgenden Ergebnisse für die Vorder- und Hintergliedmaße (VGM, HGM) separat dargestellt werden: BMD: VGM 3,22 (2,80 - 3,65) g/cm², HGM 4,21 (3,76 - 4,65) g/cm²; BMC: VGM 26,5 (22,8 - 30,1) g, HGM 32,9 (29,0 - 36,3) g. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Reproduzierbarkeitsstudien durchgeführt, bei denen für die BMD bei der Reproduzierbarkeit ohne Reposition Abweichungen in einem Bereich von 1,06 - 1,85 % und mit Reposition in einem Bereich von 3,51 - 4,48 % gefunden wurden. Für die BMC lag die Abweichung für die Reproduzierbarkeit ohne Reposition in einem Bereich von 1,28 - 2,79 % und mit Reposition schwankte sie zwischen 3,38 und 3,94 %. Um für den Einsatz der DEXA-Methode bei Verlaufsuntersuchungen den Einfluss der exakten Messlokalisation zu eruieren, wurden Messungen in einem Abstand von ein, zwei und drei Zentimetern proximal und distal des ursprünglichen Messpunktes vorgenommen. Die Ergeb-nisse dieser Studie wichen für die BMD um 3,53 - 9,16 % und für den BMC um 4,21 - 12,5 % von den Ergebnissen des zentralen Messpunktes in der Mitte der Diaphyse ab. Diese Abweichung liegt innerhalb der 25-/75-Perzentile der Messergebnisse des zentralen Messpunktes. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie führen zu dem Schluss, dass es möglich ist die Knochenmineraldichte und den Knochenmineralgehalt des Röhrbeines des Pferdes mittels der DEXA-Methode zu ermitteln. Die guten Ergebnisse der Reproduzierbarkeitsstudien und der Abstandsmessungen vom zentralen Messpunkt legen die Durchführbarkeit am stehenden, sedierten Pferd nahe. Bei der DEXA-Methode wird ein Knochenabschnitt mit einem sehr hohen Kortikalisanteil erfasst, welcher auf Einflüsse, wie beispielsweise Training oder Ruhigstellung mit einer Veränderung des Knochenumfanges bei gleichbleibenden Mineralstoffkonzentrationen reagiert. Diese Eigenschaft führt zu einem geringen Zusammenhang zwischen der DEXA-Methode und der chemischen Analyse, so dass sich die Ergebnisse der beiden Messverfahren zwar gut in den Kontext anderer Studien einfügen, der direkte Vergleich der beiden Methoden jedoch nicht möglich ist.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Das Röhrbein des Pferdes 2.1.1 Knochenaufbau 2.1.2 Knochenzusammensetzung 2.1.3 Knochenbildung 2.1.4 Knochenumbau 2.1.5 Einfluss des Alters auf den Knochen 2.1.6 Unterschiede zwischen und innerhalb der Gliedmaßen 2.1.7 Einfluss des Geschlechtes auf den Knochen 2.1.8 Einfluss von Haltung auf den Knochen 2.1.9 Einfluss von Belastung/Training auf den Knochen 2.1.10 Einfluss der Ernährung auf den Knochen 2.2 DEXA-Methode 2.3 Einsatz der DEXA-Methode in der Humanmedizin 2.4 Nicht-medizinische Einsatzgebiete der DEXA-Methode 2.5 Einsatz der DEXA-Methode in der Veterinärmedizin 2.5.1 Anwendung der DEXA-Methode bei Maus und Ratte 2.5.2 Anwendung der DEXA-Methode beim Geflügel 2.5.3 Anwendung der DEXA-Methode bei Hund und Katze 2.5.4 Anwendung der DEXA-Methode beim Schwein 2.5.5 Anwendung der DEXA-Methode beim Rind 2.6 Einsatz der DEXA-Methode beim Pferd 2.7 Weitere Methoden der Osteodensitometrie 2.7.1 In-vivo-Methoden 2.7.2 In-vitro-Methoden 3 Tiere, Material und Methoden 3.1 Tiere und Material 3.1.1 Tiere 3.1.2 Probenentnahme und –aufbewahrung 3.2 Methoden 3.2.1 Physikalische Grundlagen der DEXA-Methode 3.2.2 Dichtebestimmung mittels DEXA 3.2.3 Chemische Knochenanalyse 3.3 Statistische Auswertung 3.4 Darstellung der Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Ergebnisse der chemischen Analyse 4.1.1 volumetrische Knochendichte, Rohasche-, Calcium-, Magnesium- und Phoshorgehalte im Gliedmaßenvergleich (Angabe in Median und 25-/75-Perzentil) 4.1.2 Einfluss des Alters auf den Rohasche-, Calcium-, Magnesium- und Phosphorgehalt im Röhrbein (Angabe in Median und 25-/75-Perzentil) 4.1.3 Einfluss der Rasse auf den Rohasche-, Calcium-, Magnesium- und Phosphorgehalt im Röhrbein (Angabe in Median und 25-/75-Perzentil) 4.1.4 Einfluss des Geschlechtes auf den Rohasche-, Calcium-, Magnesium- und Phosphorgehalt im Röhrbein (Angabe in Median und 25-/75-Perzentil) 4.2 Ergebnisse der DEXA-Methode 4.2.1 Abweichung vom zentralen Messpunkt 4.2.2 Reproduzierbarkeit 4.3 Vergleich der Densitometrie mit der chemischen Analyse 5 Diskussion 5.1 Kritik der Methoden 5.1.1 Versuchspferde 5.1.2 DEXA-Methode 5.2 Diskussion der Ergebnisse 5.3 Schlussbetrachtung 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Tabellenanhang 10 Danksagung / DXA (dual energy X-ray absorptiometry) is an established method for the measurement of bone mineral density (BMD), bone mineral content (BMC) and whole body composition in human and partly in veterinary medicine. However, there are only a small number of studies that examine the bone in horses using DXA. All these studies are based on small samples. Therefore, the objective of this study was to validate the use of DXA for the measurement of BMD and BMC in the horse. In total the cannons of 103 horses were scanned ex vivo, using the PIXI LUNAR® densitometer. In human medicine this densitometer is used for the exami-nation of the forearm. The measuring point was the exact middle between basis and caput of the third metacarpal/metatarsal bone. In a second step the DXA measurements were complemented with a chemical analysis, analyzing the ash content, calcium, phosphorus and magnesium content of the bones. The results are presented as median and 25-/75-percentile. The average ash content of the cannon bones was 698 (691 - 703) g/kg DM. The average mineral content was measured in the following order: calcium 265 (259 - 272) g/kg DM, phosphorus 123 (121 - 126) g/kg DM und magnesium 2.44 (2.19 - 2.66) g/kg DM. The ratio of calcium to phosphorus ranged from 2.14 to 2.18. The DXA results are influenced not only by the bone´s mineral content, but also by its diameter. Because of this the results are separated into the results of the forelimb (fl) and the hindlimb (hl) which generates the following results: BMD: fl 3.22 (2.80 - 3.65) g/cm², hl 4.21 (3.76 - 4.65) g/cm²; BMC: fl 26.5 (22.8 - 30.1) g, hl 32.9 (29.0 - 36.3) g. Several robustness checks of the measurements were conducted. For the BMD measurements, the range of measurements diverged by 3.51-4.48 % for measurements with limb repositioning, and by 1.06-1.85 % for measurements without limb repositioning. For the BMC measurements, the range of measurements diverged by 3.38-3.94 % for measurements with limb repositioning, and by 1.28-2.79 for measurements without limb repositioning. To determine the importance of the exact bone position for follow-up investigations, measurements in a distance of one, two and three centimeters proximal and distal of the original measuring point were performed. The results of these measurements deviated from the result of the central measuring point at the centre of the diaphysis in a range of 3.53 – 9.16 % for BMD and a range of 4.21 – 12.5 % for BMC. This variation falls within the percentiles of the central measuring point. Overall, the results of this study indicate that DXA is useable for determining BMD and BMC at the third metacarpal/metatarsal bone of the horse. The high reproducibility of the results and the distance measurements suggest that DXA is suitable for measurements at the standing, tranquilized horse. However, the cannon bone is a bone with a high content of cortical bone. This means that the diameter of the bone changes as a result of training or immobilization, while the BMD and BMC remain unchanged by such influence. This leads to a weak correlation between the results from the DXA and chemical analyses. Thus, while these two types of analysis fit well into the context of prior studies, a direct comparison between these measurements is not possible.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Das Röhrbein des Pferdes 2.1.1 Knochenaufbau 2.1.2 Knochenzusammensetzung 2.1.3 Knochenbildung 2.1.4 Knochenumbau 2.1.5 Einfluss des Alters auf den Knochen 2.1.6 Unterschiede zwischen und innerhalb der Gliedmaßen 2.1.7 Einfluss des Geschlechtes auf den Knochen 2.1.8 Einfluss von Haltung auf den Knochen 2.1.9 Einfluss von Belastung/Training auf den Knochen 2.1.10 Einfluss der Ernährung auf den Knochen 2.2 DEXA-Methode 2.3 Einsatz der DEXA-Methode in der Humanmedizin 2.4 Nicht-medizinische Einsatzgebiete der DEXA-Methode 2.5 Einsatz der DEXA-Methode in der Veterinärmedizin 2.5.1 Anwendung der DEXA-Methode bei Maus und Ratte 2.5.2 Anwendung der DEXA-Methode beim Geflügel 2.5.3 Anwendung der DEXA-Methode bei Hund und Katze 2.5.4 Anwendung der DEXA-Methode beim Schwein 2.5.5 Anwendung der DEXA-Methode beim Rind 2.6 Einsatz der DEXA-Methode beim Pferd 2.7 Weitere Methoden der Osteodensitometrie 2.7.1 In-vivo-Methoden 2.7.2 In-vitro-Methoden 3 Tiere, Material und Methoden 3.1 Tiere und Material 3.1.1 Tiere 3.1.2 Probenentnahme und –aufbewahrung 3.2 Methoden 3.2.1 Physikalische Grundlagen der DEXA-Methode 3.2.2 Dichtebestimmung mittels DEXA 3.2.3 Chemische Knochenanalyse 3.3 Statistische Auswertung 3.4 Darstellung der Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Ergebnisse der chemischen Analyse 4.1.1 volumetrische Knochendichte, Rohasche-, Calcium-, Magnesium- und Phoshorgehalte im Gliedmaßenvergleich (Angabe in Median und 25-/75-Perzentil) 4.1.2 Einfluss des Alters auf den Rohasche-, Calcium-, Magnesium- und Phosphorgehalt im Röhrbein (Angabe in Median und 25-/75-Perzentil) 4.1.3 Einfluss der Rasse auf den Rohasche-, Calcium-, Magnesium- und Phosphorgehalt im Röhrbein (Angabe in Median und 25-/75-Perzentil) 4.1.4 Einfluss des Geschlechtes auf den Rohasche-, Calcium-, Magnesium- und Phosphorgehalt im Röhrbein (Angabe in Median und 25-/75-Perzentil) 4.2 Ergebnisse der DEXA-Methode 4.2.1 Abweichung vom zentralen Messpunkt 4.2.2 Reproduzierbarkeit 4.3 Vergleich der Densitometrie mit der chemischen Analyse 5 Diskussion 5.1 Kritik der Methoden 5.1.1 Versuchspferde 5.1.2 DEXA-Methode 5.2 Diskussion der Ergebnisse 5.3 Schlussbetrachtung 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Tabellenanhang 10 Danksagung

1. Einleitung Multipotente mesenchymale Stromazellen (MSC) stellen eine interessante Therapieoption in der regenerativen Medizin verschiedener Erkrankungen dar. Aufgrund ihrer Herkunft aus mesodermalem Gewebe ist ihr Einsatz in der Therapie von Sehnenerkrankungen als günstig anzusehen, wo sie bei Pferden bereits erfolgreich verwendet werden. Da dieser Erkrankungskomplex mit degenerativen Veränderungen der Achillessehne des Menschen vergleichbar ist, wäre eine Translation der gewonnenen Ergebnisse in die Humanmedizin wünschenswert. Die zugrunde liegenden Wirkmechanismen bei der Sehnenregeneration sind allerdings bis zum heutigen Tage noch nicht vollständig geklärt. Unter anderem wird eine tenogene Differenzierung der MSC mit nachfolgender Produktion von extrazellulärer Matrix (EZM) diskutiert. Als Nachweis hierfür wird die Genexpression von Matrixproteinen sowie Transkriptionsfaktoren angesehen. Die Isolation von MSC ist aus verschiedenen Geweben möglich; allerdings haben Untersuchungen deutliche Unterschiede in den in-vitro-Charakteristika zwischen den Zellquellen aufgezeigt. Trotz dieser unterschiedlichen Eigenschaften fasst die International Society for Cellular Therapy (ISCT) seit 2006 humane MSC als plastikadhärente Zellen mit tripotentem Differenzierungspotential sowie einem definierten Antigenprofil zusammen. Um eine Vergleichbarkeit equiner und humaner MSC und somit eine bessere Übertragbarkeit gewonnener Erkenntnisse aus der Pferdemedizin zu erreichen, steht aktuell die Untersuchung der geforderten Antigenexpression noch aus. 2. Ziele der Untersuchung In der vorliegenden Arbeit sollte daher erstmalig eine vollständige Charakterisierung des geforderten Antigenprofils equiner MSC aus fünf verschiedenen Quellen durchgeführt werden, um einen Vergleich mit humanen Zellen zu ermöglichen. Zudem sollte eine vergleichende Darstellung der Sehnenmarkerexpression durchgeführt werden, welche das Wissen um die in-vitro-Eigenschaften von MSC erweitern und in Folge zur Auswahl einer optimal für die Therapie von Sehnenerkrankungen geeigneten Zellquelle beitragen soll. 3. Materialien und Methoden In der ersten Studie wurden equine MSC aus Knochenmark, Fettgewebe, Nabelschnurblut, Nabelschnurgewebe und Sehnengewebe bis zur Passage 3 kultiviert und anschließend mittels Durchflusszytometrie auf das Vorkommen der Antigene CD 29, CD 44, CD 73, CD 90 und CD 105 sowie das Fehlen der Antigene CD 14, CD 34, CD 45, CD 79α und MHC II untersucht. In der zweiten Studie wurde eine Genexpressionsanalyse der Sehnenmarker Kollagen 1A2, Kollagen 3A1, Decorin, Tenascin-C und Skleraxis vergleichend mittels Echtzeitpolymerasekettenreaktion an den isolierten Zellen durchgeführt. In beiden Studien wurde eine Probenzahl von n= 6 für jede Zellquelle untersucht. 4. Ergebnisse Keine der untersuchten Zellquellen erfüllte die MSC-Definition der ISCT bezüglich des Antigenprofils. Insbesondere durch den fehlenden Nachweis CD 73 (< 3,07 %) in allen untersuchten Proben unterscheiden sich equine und humane MSC. Die einzigen stabil exprimierten Antigene sind die zusätzlich untersuchten Proteine CD 29 (37,5 % - 65,42 %) und CD 44 (32,2 % - 97,18 %). Das Vorkommen CD 105 konnte in MSC aus Fett- und Sehnengewebe belegt werden. Zusätzlich war ein Nachweis von CD 90 in MSC aus Fettgewebe möglich, welche somit die größte Ähnlichkeit mit der humanen Zellpopulation aufweisen. Die Studie zur Genexpressionsanalyse weist auf eine Basisexpression von Kollagen 1A2, 3A1 und Decorin in MSC aus verschiedenen Quellen hin, welche über der von nativem Sehnengewebe liegt. Auch hier weisen wiederum MSC aus Fettgewebe die höchste Expression auf. 5. Schlussfolgerungen Die vorliegende Arbeit leistet einen Beitrag zu einer vertiefenden in-vitroCharakterisierung equiner MSC. Das Antigenprofil equiner MSC ist nicht vollständig mit dem humaner identisch. Eine abschließende Beurteilung sollte durch Untersuchungen mit spezies-spezifischen Antikörpern erfolgen. Die Ergebnisse der Genexpressionsanalyse unterstützen die Theorie, dass MSC die Sehnenheilung durch Produktion von extrazellulärer Matrix beeinflussen. Der Einsatz von MSC aus Fettgewebe in der Therapie von Sehnenerkrankungen sollte forciert werden, da ihre hohe Sehnenmarkerexpression einen Hinweis auf eine Verbesserung der Sehnenregeneration darstellt.

Background: Feeding alfalfa hay is often recommended for its buffering components, like protein and calcium, to prevent lesions of the gastric mucosa in horses. Until now, there has been no information regarding the influence of alfalfa particle size on the gastric mucosa. The aim of this study was to investigate the effects of feeding two alfalfa preparations with different particle sizes (alfalfa chaff vs alfalfa pellets) in comparison with grass hay on the gastric mucosa in weanling horses. We hypothesized that feeding a high proportion of fine alfalfa particles would negatively impact gastric mucosa and that feeding long alfalfa chaff would improve gastric mucosal health in weanlings. Results: Before weaning, the prevalence of gastric mucosa lesions (one or more lesions considering all locations in the stomach) was 84.3 %; at 14 days after weaning, it was almost 100 %. Before and after weaning, most of the lesions were found at the greater curvature of the squamous mucosa and at the lesser curvature. After weaning, gastric mucosal lesions at the pylorus were significantly more severe in the group fed alfalfa chaff (p = 0.002). In the other regions, no differences related to the feeding regimes were observed. Conclusions: Feeding alfalfa failed to improve gastric mucosal lesion scores in weanlings. Furthermore, foals fed alfalfa chaff had higher lesion scores at the pylorus. Alfalfa leaves contain a superior protein source and high amounts of calcium and magnesium, providing extra nutritional advantages in growing horses. At this time, either traditional grass hay rations or grass hay with alfalfa pellets can be recommended.

Intrauterine Bälle („small uterine device“; IUDs) sind aus Glas, Plastik oder Metall und wer-den vaginal in den Uterus eingeführt. Bei Stuten werden IUDs im Turniersport zur Unterdrü-ckung der unerwünschten Verhaltensänderungen während der Rosse eingesetzt. Der Einsatz ist einfach, günstig und minimal invasiv. Der Effekt wird durch eine Verlängerung der primären lutealen Phase erzielt, wobei jedoch der exakte Ablauf des Wirkmechanismus bisher ungeklärt ist. Hypothesen wie eine Scheinträchtigkeit, ein Placeboeffekt bei den Besitzern und eine chronische Endometritis werden in der Literatur diskutiert. Für die Untersuchung wurden 30 Stuten in vier Gruppen (G) eingeteilt: G1: KB (künstlich besamt) und tragend (n=8); G2: KB, nicht-tragend (zyklisch; n=7); G3: IUD, verlängerte luteale Phase (n=7) IUD-P (IUD-Positiv); G4: IUD, reguläre luteale Phase (n=8) IUD-N (IUD-Negativ). Die Uterusbiospien wurden am Tag 15 post ovulationem entnommen. Das Ziel der Studie war, mittels immunhistologischer Untersuchungen die Expression des Enzyms Cyclooxygenase 2 (COX2), verschiedener uteriner Proteine (Uteroglobin, Uterofer-rin, Uterokalin), Hormonrezeptoren (Östrogen-, Progesteronrezeptor) und des Proliferations-markers Ki-67 Antigen in endometrialen Biopsien bei IUD-Stuten darzustellen sowie die erhobenen Befunde mit den Ergebnissen am equinen Endometrium künstlich besamter Stuten zu vergleichen. Weiter wurde in den Endometriumbioptaten das Auftreten von Entzündungszellen analysiert (neutrophile und eosinophile Granulozyten, Mastzellen, Lymphozyten, Plasmazellen und Makrophagen). Die statistische Auswertung erfolgte mittels SPSS (SPSS Software-GmbH München). Hinsichtlich der Altersverteilung sind die Stuten der Gruppe 1 (KB/tragend) jünger als Tiere der Gruppe 2 (KB/nicht-tragend). Ein entsprechendes Ergebnis kann für die Stuten der Grup-pe 3 (IUD-P) im Vergleich zu den Tieren der Gruppe 4 (IUD-N) erhoben werden. Darüber hinaus sind Angiopathien bei den Pferden der Gruppe 1 bzw. 3 geringer ausgeprägt als bei den Stuten der Gruppe 2 bzw. 4. Immunhistologisch sind die endometrialen Drüsenzellen der Tiere aus Gruppe 1 durch eine maximale Uterokalin-(UK)-Expression gekennzeichnet, wohingegen Uteroferrin (UF) ledig-lich schwach exprimiert wird. Eine COX2-Expression kann bei diesen Stuten nicht beobachtet werden. Im Vergleich zu den graviden Pferden (Gruppe 1) zeigen künstlich besamte, nicht-tragende Stuten (Gruppe 2) zwar eine ausgeprägte UF- und COX2-Expression, UK wird dagegen lediglich gering exprimiert. Die KB-tragenden (Gruppe 1) und nicht-tragenden (Gruppe 2) Tiere sind somit durch eine ihrem Reproduktionszyklus entsprechende Expression der genannten Marker gekennzeichnet. Die IUD-Stuten (Gruppe 3 und 4) dagegen zeigen eine variable COX2, UF- und UK-Expression. Keine statistisch signifikanten Unterschiede sind zwischen allen Gruppen in der UG- und der Ki-67 Antigen-Expression nachweisbar. Stuten mit einer verlängerten lutealen Phase (Gruppe 1 und 3) und hohen Progesteronwerten im Serum besitzen eine geringere ER- und PR-Expression als die Versuchstiere mit einer regulären lutealen Phase (Gruppe 2 und 4) und einer Östrogendominanz. Die Auszählung der Entzündungszellen zeigt keine statistisch signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Anzahl von neutrophilen und eosinophilen Granulozyten, Mastzellen, Plasmazellen sowie Lymphozyten zwischen den Gruppen. Im Stratum compactum ist die Zahl der Makrophagen in Gruppe 1 (tragend) signifikant höher als in Gruppe 2 (zyklisch), ebenfalls zeigt sich ein Anstieg dieser Zellen von der Gruppe 4 zu 3, allerdings ist diese Erhöhung nicht statistisch signifikant. Ein Placeboeffekt bei den Besitzern kann nahezu ausgeschlossen werden, da die Expression der Proteine (UF, UK) und COX2 in den IUD-Stuten, im Vergleich zu den KB-Stuten, signi-fikante Unterschiede aufweist. Da im eigenen Untersuchungsgut zwischen den tragenden Stuten (Gruppe 1) und den IUD-Stuten der Gruppe 3 (vlP)/“Scheinträchtigkeit“ ein signifikant unterschiedliches Expressionsverhalten hinsichtlich des Enzyms COX2 und des Proteins UF besteht, kann die Hypothese einer Scheinträchtigkeit ebenso als unwahrscheinlich eingestuft werden. Bei keiner der IUD-Stuten konnte eine chronische Endometritis nachgewiesen werden, somit ist auch diese Hypothese als Ursache des IUD-Effektes eher unwahrscheinlich. Die erhöhte Anzahl an Makrophagen in der Gruppe 3 könnte jedoch hinweisend auf einen lokalen Effekt der IUDs im Sinne einer Fremdkörperreaktion sein. Da hinsichtlich des Auftretens einer Endometritis zwischen resistenten und empfänglichen Tieren unterschieden wird, könnte somit die erhöhte Anzahl an Makrophagen in der Gruppe 3 möglicherweise als Hinweis auf „Endometritis empfängliche Stuten“ gewertet werden und dies eine Ursache für die variierende Wirksamkeit der Rosseunterdrückung mittels IUDs darstellen. Die eigenen Untersuchungen zeigen ferner, dass die IUD-Stuten mit verlängerter lutealer Phase (IUD-positive Wirkung, Gruppe 3) jünger sind im Vergleich zu den Tieren, die trotz IUD eine Luteolyse (IUD-negative Wirkung, Gruppe 4) aufweisen. Zudem weisen die IUD-P Tiere geringere An-giopathien auf. Möglicherweise sind zudem das Alter und die Perfusion des Uterus bedeutend für die Wirksamkeit der IUDs in Equiden. Abschließend kann somit der Wirkmechanismus der IUDs auch mittels der durchgeführten Untersuchungen nicht endgültig geklärt werden. Unter Berücksichtigung der erhobenen Be-funde sollten zukünftige Studien insbesondere Untersuchungen zu Entzündungsmediatoren, wie z.B. Zytokine, beinhalten.