In a very simplified view, the plant leaf growth can be reduced to two processes, cell division and cell expansion, accompanied by expansion of their surrounding cell walls. The vacuole, as being the largest compartment of the plant cell, plays a major role in controlling the water balance of the plant. This is achieved by regulating the osmotic pressure, through import and export of solutes over the vacuolar membrane (the tonoplast) and by controlling the water channels, the aquaporins. Together with the control of cell wall relaxation, vacuolar osmotic pressure regulation is thought to play an important role in cell expansion, directly by providing cell volume and indirectly by providing ion and pH homestasis for the cytosoplasm. In this thesis the role of tonoplast protein coding genes in cell expansion in the model plant Arabidopsis thaliana is studied and genes which play a putative role in growth are identified. Since there is, to date, no clearly identified protein localization signal for the tonoplast, there is no possibility to perform genome-wide prediction of proteins localized to this compartment. Thus, a series of recent proteomic studies of the tonoplast were used to compile a list of cross-membrane tonoplast protein coding genes (117 genes), and other growth-related genes from notably the growth regulating factor (GRF) and expansin families were included (26 genes). For these genes a platform for high-throughput reverse transcription quantitative real time polymerase chain reaction (RT-qPCR) was developed by selecting specific primer pairs. To this end, a software tool (called QuantPrime, see http://www.quantprime.de) was developed that automatically designs such primers and tests their specificity in silico against whole transcriptomes and genomes, to avoid cross-hybridizations causing unspecific amplification. The RT-qPCR platform was used in an expression study in order to identify candidate growth related genes. Here, a growth-associative spatio-temporal leaf sampling strategy was used, targeting growing regions at high expansion developmental stages and comparing them to samples taken from non-expanding regions or stages of low expansion. Candidate growth related genes were identified after applying a template-based scoring analysis on the expression data, ranking the genes according to their association with leaf expansion. To analyze the functional involvement of these genes in leaf growth on a macroscopic scale, knockout mutants of the candidate growth related genes were screened for growth phenotypes. To this end, a system for non-invasive automated leaf growth phenotyping was established, based on a commercially available image capture and analysis system. A software package was developed for detailed developmental stage annotation of the images captured with the system, and an analysis pipeline was constructed for automated data pre-processing and statistical testing, including modeling and graph generation, for various growth-related phenotypes. Using this system, 24 knockout mutant lines were analyzed, and significant growth phenotypes were found for five different genes. / Sehr vereinfacht gesagt kann Blattwachstum auf zwei Prozesse reduziert werden, Zellteilung und Zellexpansion, gefolgt von Zellwandexpansion. Die Vakuole, das größte Organell der Zelle, übt durch die Kontrolle des Wasserhaushaltes der Pflanze eine wichtige Funktion im Zusammenhang mit der Zellexpansion aus. Dies geschieht durch die Regulierung des osmotischen Druckes, durch Import und Export von organischen und anorganischen Ionen über die Vakuolenmembran (den Tonoplast) und durch die Kontrolle ihrer Wasserkanäle (der Aquaporine). Es wird angenommen, dass die Regulierung des vakuolären osmotischen Druckes eine große Rolle bei der Zellexpansion spielt, da der osmotische Druck die Stärke der mechanischen Kraft des Tonoplast auf die Plasmamembran und die Zellwand bestimmt. In dieser Dissertation wird die Rolle von Tonoplastproteinen und ihrer Gene auf die Zellexpansion anhand der Modellpflanze Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand) untersucht, und Kandidaten für wachstumsrelevante Gene werden identifiziert. Da bisher noch kein Signal für die Lokalisierung von Proteinen im Tonoplast identifiziert wurde, gibt es keine Möglichkeit, genomweite Voraussagen über solche Proteinlokalisierungen zu machen. Daher haben wir eine Reihe von aktuellen Proteom-Studien genutzt, um eine Liste von 117 Genen, die für transmembrane tonoplastproteinkodierende Gene kodieren, zusammenzustellen. Zusätzlich wurden andere wachstumsrelevante Gene und Zellzyklus-Gene in die Liste aufgenommen (38 Gene). Die Expression der Gene während der Blattentwicklung sollte mittels einer sensitiven Technik, der quantitativen Polymerasekettenreaktion (qPCR), untersucht werden. Um rasch die für dieses Verfahren notwendigen Oligonukleotide zu entwerfen, wurde ein Computerprogramm („QuantPrime“) entwickelt. Das Programm entwirft automatisch solche Oligonukleotide und überprüft deren Spezifizität in silico auf Ebene der Transkriptome und Genome um Kreuz-Hybridisierungen zu vermeiden, die zu unspezifischen Amplifikationen führen würden. Die qPCR-Plattform wurde in einer Expressions-Studie eingesetzt, um wachstumsrelevante Gen-Kandidaten zu identifizieren. Um wachstumsaktive und nichtaktive Prozesse vergleichen zu können, wurden Proben von unterschiedlichen Bereichen des Blattes zu unterschiedlichen Wachstumsstadien beprobt. Eine musterbasierte Expressionsdatenanalyse wurde eingesetzt, um die Gene hinischtlich ihrer Assoziation mit der Blattexpansionen in eine Rangordnung zu bringen. Die Gene mit dem höchsten Rang wurden als Kandidaten für weitere Experimente ausgewählt. Um die funktionelle Beteiligung dieser Gene auf einer makroskopischen Ebene zu untersuchen, wurden Knockout-Mutanten für die Gen-Kandidaten hinsichtlich ihres Wachstums analysiert. Zu diesem Zweck wurde ein System für die automatisierte Phänotypisierung des Blattwachstums etabliert. Zum einen wurde ein Programm-Paket für detaillierte Annotation von Wachstumsstadien und zum anderen ein Analyse-Paket für automatisierte Datenvorbereitung und statistische Tests entwickelt. Das Analyse-Paket erlaubt die Modellierung und graphische Darstellung verschiedener wachstumsrelevanter Phänotypen. Mit Hilfe dieses Systems wurden 24 Knockout-Mutanten untersucht und signifikante Phänotypen wurden für fünf verschiedene Gene gefunden.

In der forensischen Fallarbeit gilt die Analyse von Short Tandem Repeats (STRs) als der Goldstandard zur Identifizierung unbekannter Personen. Aus biologischem Tatortspurenmaterial werden STR-Profile erstellt, die anschließend mit Vergleichsprofilen tatverdächtiger Personen oder mit Profilen in der nationalen DNA-Datenbank abgeglichen werden. Dieser Ansatz identifiziert jedoch nur Personen, die den Ermittlungsbehörden bereits bekannt sind. In Fällen ohne Datenbanktreffer oder fehlenden Augenzeugenberichten, die mögliche Hinweise auf Tatverdächtige liefern können, können unzureichende Ermittlungshinweise die Aufklärung einer Straftat verzögern. Die Limitierung der vergleichenden DNA-Analyse gab der forensischen Forschung in den vergangenen Jahrzehnten den Anstoß, Erkenntnisse aus der humangenetischen Forschung über die molekularen Grundlagen des menschlichen Aussehens für forensische Zwecke zu nutzen. Dies führte zu der Erweiterung der forensischen Genetik um die forensische DNA-Phänotypisierung (FDP), bei der DNA-Marker zum äußeren Erscheinungsbild, dem biologischen Alter und der biogeografischen Herkunft einer unbekannten Person untersucht werden können. Durch dieses Instrument kann die polizeiliche Investigativarbeit im Rahmen der Strafverfolgung unterstützt werden, indem durch Erhebung phänotyprelevanter Informationen der Pool potentiell tatverdächtiger Personen reduziert werden kann. Im Dezember 2019 ist in Deutschland mit einer Änderung der Strafprozessordnung die forensische DNA-Analyse gesetzlich auch zur Feststellung der Augen-, Haar- und Hautfarbe sowie des biologischen Alters einer unbekannten Person zugelassen worden, nicht jedoch um die Bestimmung der biogeografischen Herkunft. In genomweiten Assoziationsstudien verschiedener Populationen wurden in den vergangenen Jahrzehnten Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) identifiziert, die mit der humanen Pigmentierung bestimmter phänotypischer Merkmale assoziiert sind. Auf dieser Grundlage wurden forensische Testsysteme und statistische Vorhersagemodelle entwickelt, die mit einer relativ geringen Anzahl hochinformativer SNP-Marker relativ präzise Vorhersagen über die Pigmentierung von Körpermerkmalen treffen können. Ein bereits forensisch validiertes und anerkanntes Testsystem ist das HIrisPlex-S-System, mit dem eine DNA-basierte, probabilistische Vorhersage der Augen-, Haar- und Hautfarbe durch Untersuchung von 41 SNP-Markern möglich ist. Die Berechnung der Vorhersagewahrscheinlichkeiten erfolgt für drei Augenfarben-, vier Haarfarben- und fünf Hautfarbenkategorien mit Hilfe eines online verfügbaren Webtools (https://hirisplex.erasmusmc.nl) basierend auf einem multinomialen logistischen Regressionsmodell. Für die Interpretation der Ergebnisse stehen Leitfäden zur Verfügung, mit denen anhand der berechneten Wahrscheinlichkeitswerte die wahrscheinlichsten phänotypischen Merkmale abgeleitet werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das HIrisPlex-S-System unter Verwendung der SNaPshot-Methode im molekulargenetischen Labor des Instituts für Rechtsmedizin der Universität Leipzig etabliert, um dieses Werkzeug zukünftig für die Anwendung in der Strafverfolgung in Sachsen anbieten zu können. Die Analyse der 41 SNP-Marker erfolgte in zwei Multiplex-Assays: einem 24-Plex-Assay mit den SNP-Markern zur Bestimmung der Augen- und Haarfarbe und einem 17-Plex-Assay mit den SNP-Markern zur Bestimmung der Hautfarbe. Im Zuge der Implementierung des SNaPshot-Workflows (Multiplex-PCR – Single Base Extension – Kapillarelektrophorese) wurden je Assay Primerkonzentrationen der PCR- und SBE-Primer sowie thermozyklische Reaktionsbedingungen und kapillarelektrophoretische Analyseparameter angepasst, um eine optimale Detektion der 41 SNP-Marker zu gewährleisten. In Anlehnung an die Validierungsrichtlinien der SWGDAM wurden die Sensitivität des Testsystems sowie die durchschnittlichen Peakhöhen und das heterozygote Peakhöhenverhältnis der SNPs bestimmt. Es konnten bis zu einer DNA-Inputmenge von 125 pg und teilweise bis zu 63 pg vollständige SNP-Profile erzeugt werden, was die hohe Sensitivität des Testsystems belegt. Durch die Bestimmung der durchschnittlichen Peakhöhen und der heterozygoten Peakhöhenverhältnisse bei unterschiedlichen DNA-Mengen konnten Erkenntnisse über die Detektionseigenschaften der SNP-Marker gewonnen werden, die für die Beurteilung der Quantität und Qualität der analysierten Probe von Bedeutung sind. Die Analyse von Mischspuren zeigte, dass eine Detektion in Abhängigkeit vom Mischungsverhältnis zwar potenziell möglich ist, biallelische Marker wie SNPs jedoch weniger dafür geeignet sind. Mit dieser Arbeit wurde eine überwiegend europäische Studienpopulation von 300 Personen mit dem HIrisPlex-S-System untersucht und die ermittelte, wahrscheinlichste Augen-, Haar- und Hautfarbe der Probandinnen und Probanden mit deren tatsächlichen, mittels Fragebogen erhobenen Merkmalen, verglichen. Auf Grundlage der Untersuchungsergebnisse können folgende Fragestellungen beantwortet werden: 1) Welche Genauigkeit besitzt das HIrisPlex-S-System in der Vorhersage der Augen-, Haar- und Hautfarbe? Das HIrisPlex-S-Vorhersagemodell zeigt eine gute Leistung bei der Differenzierung und Klassifizierung kontrastierender Farbkategorien wie blaue und braune Augen (AUC > 0,9), rote und schwarze Haare (AUC > 0,8) sowie sehr helle und dunkle Haut (AUC > 0,8) und eine geringere Leistung bei der Identifikation von Zwischentönen, wie intermediäre Augen (grün, grün-braun etc.), blonde und braune Haare und intermediäre Haut. 2) Stehen die erzielten Ergebnisse im Einklang mit der Literatur? Mit der Anwendung des etablierten HIrisPlex-S-Systems auf die untersuchte, überwiegend mitteleuropäische Studienpopulation konnten Vorhersagegenauigkeiten erzielt werden, die im Einklang mit den in der Literatur publizierten Ergebnissen von Untersuchungen an verschiedenen (europäischen und nicht-europäischen) Populationen stehen, insbesondere hinsichtlich der Vorhersage einer intermediären Augenfarbe oder blonder und brauner Haarfarbe. 3) Welche Bedeutung hat das Testsystem für die forensische Praxis? Das HIrisPlex-S-System kann die Aufklärung von Straftaten unterstützen, indem es den Ermittlungsbehörden Hinweise auf das äußere Erscheinungsbild tatrelevanter Personen geben kann, wenn ein Abgleich mit der DNA-Datenbank zu keinem Ergebnis geführt hat. Da die Analysmethode auch die Untersuchung degradierten Materials erlaubt, kann sie zur auch Identifizierung menschlicher Überreste eingesetzt werden. Die Ergebnisse dieser Studie und die erfolgreiche Teilnahme am Pigmentierungsmodul der GEDNAP-Ringversuche 64 und 65 belegen die zuverlässige Anwendbarkeit des spezifisch angepassten HIrisPlex-S-Systems in der forensischen Routine mit der beschriebenen Vorhersagegenauigkeit.

Einleitung: Tiermodelle spielen für die Aufklärung pathophysiologischer Mechanismen und die Entwicklung erfolgsversprechender Therapieoptionen zentralnervöser Bewegungsstörungen eine unverzichtbare Rolle. Die Identifizierung von Gendefekten für die Parkinson-Krankheit und Dystonien ermöglichte die Generierung von Tiermodellen mit einer hohen „construct validity“. Weibliche transgene Thy1-aSyn Mäuse sowie DYT1 Knock-in (KI) Mäuse zeigen jedoch keine motorischen Störungen. In der vorliegenden Arbeit sollten zur Aufdeckung sensomotorischer Beeinträchtigungen, die bei Parkinson- und Dystoniepatienten beobachtet werden, detaillierte Untersuchungen des Verhaltens an diesen beiden Mausmodellen durchgeführt werden. Zielstellung: Zunächst sollte ein sensitiver Verhaltenstest konstruiert und entwickelt werden, bei dem sich ändernde sensorische Stimuli während der Ausübung der motorischen Aufgabe impliziert werden. Bei der Etablierung dieses sogenannten „adaptiven rotierenden Balkentests“ (ARB-Test) sollte auch der Einfluss des genetischen Hintergrunds bei Wildtyp-Mäusen evaluiert werden. Daraufhin sollte überprüft werden, ob dieser Test den Endophänotyp der weiblichen Thy1-aSyn Mäuse aufdecken kann. In dem DYT1 KI Mausmodell sollte der Frage nachgegangen werden, ob die Tiere Verhaltensdefizite in spezifischen Tests zeigen, die sensomotorische Verschaltungen untersuchen. Material und Methoden: Die mRNA-Expression von α-Synuclein in der Substantia nigra bei männlichen und weiblichen Thy1-aSyn Mäusen wurde mithilfe der quantitativen Echtzeit-PCR (qPCR) ermittelt. Im Anschluss an die Entwicklung des neuen Verhaltensapparates für den ARB-Test wurden Thy1-aSyn Tiere beider Geschlechter in diesem Versuch getestet und ihre Leistung den Ergebnissen auf etablierten motorischen Verhaltenstests („challenging beam test“, „pole test“) gegenübergestellt. Um den Einfluss des Hintergrundstammes auf das Verhalten der Tiere auf dem ARB-Test zu untersuchen, wurden Wildtypen der reinen C57BL/6J-Linie sowie Hybrid-Tiere des Stammes C57Bl/6J × DBA2 (BDF1) allen drei o. g. Versuchen unterzogen. Bei den Mäusen des DYT1 KI Modells wurde der „adhesive removal test“ und der ARB-Test zur Analyse der Sensomotorik durchgeführt. Im Vergleich dazu wurden vielfältige Verhaltensparameter in einer Reihe vorwiegend motorischer (Offenfeld-Test, „challenging beam test“, „pole test“, Zylinder-Test, Block-Test, Nestbau-Test) und kognitiver („y-maze test“) Verhaltenstests ausgewertet. Ergebnisse: Bei den weiblichen Thy1-aSyn Mäusen wurde eine geringere Expression des Transgens im Vergleich zu den männlichen Tieren festgestellt. Der neue ARB-Test wurde erfolgreich etabliert und konnte signifikante Verhaltensdefizite der weiblichen und männlichen Mutanten des Parkinson-Modells im Vergleich zu den Kontrolltieren aufdecken. Der genetische Hintergrund beeinflusste die Leistung der Wildtypen auf diesem Balkentest. Während die DYT1 KI Tiere in den rein motorischen und kognitiven Versuchen keine Beeinträchtigungen des Verhaltens zeigten, konnten der „adhesive removal test“ sowie der neue ARB-Test signifikante sensomotorische Defizite der KI Mäuse im Unterschied zu den Wildtypen zum Vorschein bringen. Schlussfolgerung: Im Thy1-aSyn Mausmodell konnte die Bedeutung der sensomotorischen Integration für die Ausprägung motorischer Defizite sowie für eine mögliche Kompensation solcher motorischen Beeinträchtigungen demonstriert werden. Hierfür hat sich der neu entwickelte, sensitive ARB-Test als geeignet herausgestellt. Die Aufdeckung von Beeinträchtigungen der Sensomotorik spricht auch bei den DYT1 KI Tieren für den Einfluss einer gestörten sensomotorischen Integration bei der Ausprägung der Symptomatik. Damit eignet sich dieses Mausmodell für die Untersuchung weiterer Parameter, die Auswirkungen auf die Aufdeckung des Phänotyps und die Penetranz der Erkrankung haben sowie um die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen zu erforschen.

Einleitung: Tiermodelle spielen für die Aufklärung pathophysiologischer Mechanismen und die Entwicklung erfolgsversprechender Therapieoptionen zentralnervöser Bewegungsstörungen eine unverzichtbare Rolle. Die Identifizierung von Gendefekten für die Parkinson-Krankheit und Dystonien ermöglichte die Generierung von Tiermodellen mit einer hohen „construct validity“. Weibliche transgene Thy1-aSyn Mäuse sowie DYT1 Knock-in (KI) Mäuse zeigen jedoch keine motorischen Störungen. In der vorliegenden Arbeit sollten zur Aufdeckung sensomotorischer Beeinträchtigungen, die bei Parkinson- und Dystoniepatienten beobachtet werden, detaillierte Untersuchungen des Verhaltens an diesen beiden Mausmodellen durchgeführt werden. Zielstellung: Zunächst sollte ein sensitiver Verhaltenstest konstruiert und entwickelt werden, bei dem sich ändernde sensorische Stimuli während der Ausübung der motorischen Aufgabe impliziert werden. Bei der Etablierung dieses sogenannten „adaptiven rotierenden Balkentests“ (ARB-Test) sollte auch der Einfluss des genetischen Hintergrunds bei Wildtyp-Mäusen evaluiert werden. Daraufhin sollte überprüft werden, ob dieser Test den Endophänotyp der weiblichen Thy1-aSyn Mäuse aufdecken kann. In dem DYT1 KI Mausmodell sollte der Frage nachgegangen werden, ob die Tiere Verhaltensdefizite in spezifischen Tests zeigen, die sensomotorische Verschaltungen untersuchen. Material und Methoden: Die mRNA-Expression von α-Synuclein in der Substantia nigra bei männlichen und weiblichen Thy1-aSyn Mäusen wurde mithilfe der quantitativen Echtzeit-PCR (qPCR) ermittelt. Im Anschluss an die Entwicklung des neuen Verhaltensapparates für den ARB-Test wurden Thy1-aSyn Tiere beider Geschlechter in diesem Versuch getestet und ihre Leistung den Ergebnissen auf etablierten motorischen Verhaltenstests („challenging beam test“, „pole test“) gegenübergestellt. Um den Einfluss des Hintergrundstammes auf das Verhalten der Tiere auf dem ARB-Test zu untersuchen, wurden Wildtypen der reinen C57BL/6J-Linie sowie Hybrid-Tiere des Stammes C57Bl/6J × DBA2 (BDF1) allen drei o. g. Versuchen unterzogen. Bei den Mäusen des DYT1 KI Modells wurde der „adhesive removal test“ und der ARB-Test zur Analyse der Sensomotorik durchgeführt. Im Vergleich dazu wurden vielfältige Verhaltensparameter in einer Reihe vorwiegend motorischer (Offenfeld-Test, „challenging beam test“, „pole test“, Zylinder-Test, Block-Test, Nestbau-Test) und kognitiver („y-maze test“) Verhaltenstests ausgewertet. Ergebnisse: Bei den weiblichen Thy1-aSyn Mäusen wurde eine geringere Expression des Transgens im Vergleich zu den männlichen Tieren festgestellt. Der neue ARB-Test wurde erfolgreich etabliert und konnte signifikante Verhaltensdefizite der weiblichen und männlichen Mutanten des Parkinson-Modells im Vergleich zu den Kontrolltieren aufdecken. Der genetische Hintergrund beeinflusste die Leistung der Wildtypen auf diesem Balkentest. Während die DYT1 KI Tiere in den rein motorischen und kognitiven Versuchen keine Beeinträchtigungen des Verhaltens zeigten, konnten der „adhesive removal test“ sowie der neue ARB-Test signifikante sensomotorische Defizite der KI Mäuse im Unterschied zu den Wildtypen zum Vorschein bringen. Schlussfolgerung: Im Thy1-aSyn Mausmodell konnte die Bedeutung der sensomotorischen Integration für die Ausprägung motorischer Defizite sowie für eine mögliche Kompensation solcher motorischen Beeinträchtigungen demonstriert werden. Hierfür hat sich der neu entwickelte, sensitive ARB-Test als geeignet herausgestellt. Die Aufdeckung von Beeinträchtigungen der Sensomotorik spricht auch bei den DYT1 KI Tieren für den Einfluss einer gestörten sensomotorischen Integration bei der Ausprägung der Symptomatik. Damit eignet sich dieses Mausmodell für die Untersuchung weiterer Parameter, die Auswirkungen auf die Aufdeckung des Phänotyps und die Penetranz der Erkrankung haben sowie um die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen zu erforschen.

Mechanical properties of cells and their environment have an undeniable impact on physiological and pathological processes such as tissue development or cancer metastasis. Hence, there is a pressing need for establishing and validating methodologies for measuring the mechanical properties of cells, as well as for deciphering the molecular underpinnings that govern the mechanical phenotype. During my doctoral research, I addressed these needs by pushing the boundaries of the field of single-cell mechanics in four projects, two of which were method-oriented and two explored important biological questions. First, I consolidated real-time deformability cytometry as a method for high-throughput single-cell mechanical phenotyping and contributed to its transformation into a versatile image-based cell characterization and sorting platform. Importantly, this platform can be used not only to sort cells based on image-derived parameters, but also to train neural networks to recognize and sort cells of interest based on raw images. Second, I performed a cross-laboratory study comparing three microfluidics-based deformability cytometry approaches operating at different timescales in two standardized assays of osmotic shock and actin disassembly. This study revealed that while all three methods are sensitive to osmotic shock-induced changes in cell deformability, the method operating at the shortest timescale is not suited for detection of actin cytoskeleton changes. Third, I demonstrated changes in cell mechanical phenotype associated with cell fate specification on the example of differentiation and de-differentiation along the neural lineage. In the process of reprogramming to pluripotency, neural precursor cells acquired progressively stiffer phenotype, that was reversed in the process of neural differentiation. The stiff phenotype of induced pluripotent stem cells was equivalent to that of embryonic stem cells, suggesting that mechanical properties of cells are inherent to their developmental stage. Finally, I identified and validated novel target genes involved in the regulation of mechanical properties of cells. The targets were identified using machine learning-based network analysis of transcriptomic profiles associated with mechanical phenotype change, and validated computationally as well as in genetic perturbation experiments. In particular, I showed that the gene with the best in silico performance, CAV1, changes the mechanical properties of cells when silenced or overexpressed. Identification of novel targets for mechanical phenotype modification is crucial for future explorations of physiological and pathological roles of cell mechanics. Together, this thesis encompasses a collection of contributions at the frontier of single-cell mechanical characterization across timescales and cell state transitions, and lays ground for turning cell mechanics from a correlative phenomenological parameter to a controllable property.:Abstract Kurzfassung List of Publications Contents Introduction Chapter 1 — Background 1.1. Mechanical properties as a marker of cell state in health and disease 1.2. Functional relevance of single-cell mechanical properties 1.3. Internal structures determining mechanical properties of cells 1.4. Cell as a viscoelastic material 1.5. Methods to measure single-cell mechanical properties Aims and scope of this thesis Chapter 2 — RT-DC as a versatile method for image-based cell characterization and sorting 2.1. RT-DC for mechanical characterization of cells 2.1.1. Operation of the RT-DC setup 2.1.2. Extracting Young’s modulus from RT-DC data 2.2. Additional functionalities implemented to the RT-DC setup 2.2.1. 1D fluorescence readout in three spectral channels 2.2.2. SSAW-based active cell sorting 2.3. Beyond assessment of cell mechanics — emerging applications 2.3.1. Deformation-assisted population separation and sorting 2.3.2. Brightness-based identification and sorting of blood cells 2.3.3. Transferring molecular specificity into label-free cell sorting 2.4. Discussion 2.5. Key conclusions 2.6. Materials and experimental procedures 2.7. Data analysis Chapter 3 — A comparison of three deformability cytometry classes operating at different timescales 3.1. Results 3.1.1. Representatives of the three deformability cytometry classes 3.1.2. Osmotic shock-induced deformability changes are detectable in all three methods 3.1.3. Ability to detect actin disassembly is method-dependent 3.1.4. Strain rate increase decreases the range of deformability response to actin disassembly in sDC 3.2. Discussion 3.3. Key conclusions 3.4. Materials and methods Chapter 4 — Mechanical journey of neural progenitor cells to pluripotency and back 4.1. Results 4.1.1. fNPCs become progressively stiffer during reprogramming to pluripotency 4.1.2. Transgene-dependent F-class cells are more compliant than ESC-like iPSCs 4.1.3. Surface markers unravel mechanical subpopulations at intermediate reprogramming stages 4.1.4. Neural differentiation of iPSCs mechanically mirrors reprogramming of fNPCs 4.1.5. The closer to the pluripotency, the higher the cell stiffness 4.2. Discussion 4.3. Key conclusions 4.4. Materials and methods Chapter 5 — Data-driven approach for de novo identification of cell mechanics regulators 5.1. Results 5.1.1. An overview of the mechanomics approach 5.1.2. Model systems characterized by mechanical phenotype changes 5.1.3. Discriminative network analysis on discovery datasets 5.1.4. Conserved functional network module comprises five genes 5.1.5. CAV1 performs best at classifying soft and stiff cell states in validation datasets 5.1.6. Perturbing expression levels of CAV1 changes cells stiffness 5.2. Discussion 5.3. Key conclusions 5.4. Materials and methods Conclusions and Outlook Appendix A Appendix B Supplementary Tables B.1 – B.2 Supplementary Figures B.1 – B.9 Appendix C Supplementary Tables C.1 – C.2. Supplementary Figures C.1 – C.5 Appendix D Supplementary Tables D.1 – D.6 Supplementary Figures D.1 – D.7 List of Figures List of Tables List of Abbreviations. List of Symbols References Acknowledgements

Die Phänotypisierung von Cytochrom P450 (CYP) und Leberfunktionstests sind wichtige Methoden in der Klinik. Die Methoden nutzen die Pharmakokinetik (PK) von Testsubstanzen und ihren Metaboliten, um Einblicke in die Stoffwechselkapazität der Leber und in die Aktivität von Enzymen und Transportern zu gewinnen. Die Leberfunktionstests werden nicht nur von zahlreichen Proband:innenmerkmalen, sondern auch von den Besonderheiten der Untersuchung beeinflusst. Eine zentrale Herausforderung besteht darin, die verschiedenen Faktoren, die das Ergebnis der Messungen beeinflussen, voneinander zu trennen, um ihren jeweiligen Einfluss auf das Messergebniss zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde die Herausforderung durch Metaanalysen und physiologisch basierte Pharmakokinetik Modellierung (PBPK) angegangen. Es wurde eine offene Pharmakokinetik-Datenbank (PK-DB) entwickelt und PK-Daten für ein breites Spektrum von Testsubstanzen kuratiert. Meines Wissens enthält PK-DB derzeit den größten offenen PK-Datensatz zu Testsubstanzen. Der Datensatz ermöglichte die Identifizierung und Quantifizierung von demografischen und rassischen Bias (Geschlecht, ethnische Zugehörigkeit, Alter, Gesundheitszustand), Meldefehlern und Unstimmigkeiten in der Literatur. Auf der Grundlage der Daten wurde eine Metaanalyse der PK von Koffein im Hinblick auf verschiedene Faktoren bzgl. Leberfunktion und CYP1A2-Aktivität durchgeführt. Insbesondere wurde das vorhandene Wissen über die Auswirkungen des Rauchens, der Einnahme oraler Verhütungsmittel, verschiedener Krankheiten und Begleitmedikationen auf die PK von Koffein durch Metaanalysen und Datenintegration konsolidiert. Ebenso wurde die Messgenauigkeit der Koffeinkonzentration in Bezug auf den Messprotokol analysiert. Darüber hinaus wurde der Einfluss des CYP2D6-Polymorphismus untersucht. Hierzu wurde ein PBPK-Modell für Dextromethorphan und seine Metaboliten Dextrorphan und Dextrorphan O-Glucuronid entwickelt und mit den PK-Daten kalibriert und validiert. / Cytochrome P450 (CYP) phenotyping and dynamic liver function testing are essential methods in clinical practice. These methods utilize the pharmacokinetics (PK) of test substances and their metabolites to gain insight into the liver's metabolic capacity and the activity of enzymes and transporters. Liver function tests are not only influenced by numerous characteristics of a studied subject but also by the specifics of individual study procedures. A key challenge is to disentangle the various factors which influence the outcome of the measurements from each other to study their influence on the dynamic liver function and CYP phenotype. In this work, the challenge was addressed through meta-analysis and physiologically based pharmacokinetic modeling. As a foundation, an open pharmacokinetics database was developed and pharmacokinetics data were curated for a wide range of test substances. To my knowledge, PK-DB currently contains the largest open pharmacokinetic dataset on substances used for phenotyping and dynamical liver function testing. The dataset allowed for identifying and quantifying demographic and racial bias (sex, ethnicity, age, health), reporting errors, and inconsistencies in pharmacokinetic literature. Based on the data, a caffeine pharmacokinetics meta-analysis was conducted concerning various factors affecting liver function and CYP1A2 activity. In particular, meta-analysis and data integration solidified existing knowledge on the effects of smoking, oral contraceptives, multiple diseases, and co-medications on caffeine pharmacokinetics. Similarly, the measurement accuracy of caffeine concentration was investigated with respect to various aspects of the measurement protocol. In addition, the impact of CYP2D6 polymorphism was investigated. Therefore, a PBPK model of dextromethorphan (DXM) and its metabolites dextrorphan (DXO) and dextrorphan O-glucuronide (DXO-Glu) was developed, and calibrated, and validated with pharmacokinetics data.