Orientador: Julia Prado Franceschi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-25T18:08:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tarsitano_ChristianeAparecidaBadin_M.pdf: 3776401 bytes, checksum: da949a6570ac85fc05d84aa93ee16374 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Este trabalho objetivou demonstrar que entre as toxinas crotálicas, só a convulxina é capaz de causar trombose pulmonar em camundongos e buscou, ao mesmo tempo, investigar o mecanismo pelo qual a convulxina produz a trombose pulmonar. A convulxina, isolada tanto do veneno de C. d. terrificus como da C. d cascavel/a, mostrou ser a única capaz de agregar plaquetas e evocar a formação de trombos em pulmões de camundongos. Como não houve diferença entre o grau de trombose causado pela convulxina das duas subespécies, os resultados obtidos com cada uma, em separado, foram agrupados. Na tentativa de elucidar os mecanismos envolvidos na trombose, utilizamos não só os inibidores clássicos da agregação via tromboxano Az (AAS e Dazoxiben), como também a prostaciclina, capaz de elevar os níveis intracelulares de AMPc. Usamos também inibidores da trombina (heparina) e antagonistas ensaiados, anteriormente, na agregação e/ou broncoconstrição, induzidas pela convulxina (metisergida, mepiramina e metronidazol). Os resultados obtidos levam-nos às seguintes conclusões: a convulxina, poderoso agente agregante plaquetário in vitro, induz à formação de trombos no pulmão de camundongos; tanto a heparina, como a aspirina, a prostaciclina e o dazoxiben mostraramse capazes de inibir o efeito trombótico da convulxina, sozinhos ou em associaç~o; a heparina potencializou os efeitos das demais drogas e o seu efeito antitrombótico foi potencializado pela associação com o dermatan. O modelo é autolimitado, pois não admite a possibilidade de aumento de dose da convulxina / Abstract: Convulxin is a high molecular weight, non-enzymatic, platelet aggregating protein present in the venom of South American rattlesnake, Crotalus durissus terrificus. In this work, we investigatd the ability of convulxin to cause pulmonary thrombosis in mice after intravenous injection and examined the possible mechanism (s) involved using specific inhibitors. Convulxin was purified ftom C. d. cascavella e C. d terrificus venom by chromatography on Sephadex G-75 in 0.005 M ammonium formate, ph 3.5. Male Swiss mice were injected i.v. with varying doses of convulxin and then euthanized 30 minoLater after wich the lungs were rapidly removed, fixed and processed for histological analysis to determine the ftequency of pulmonary thrombosis. Human platelet-rich plasma was prepared by standart differential centrifugation. Convulxin ftom C. d cascavella e C. d terrificus venoms aggregated hurnan platelet at concentrations 8 ng/ml and cause pulmonary thrombosis at doses20 ~g/kg. The latter was dose-dependent at doses up to 400 ~g/kg, but decreased at higher dose (up to 1000 ~g/kg) which produced the convulsions characteristic of.this toxin. In no caso did the ftequency ofthrombi (expressed as the percentage of vessels occuded with thrombi) exceed 70%. Histological examination by light microscopy showed that there was no thrombus formation in other organs such as heart, kidney and tiver. Heparin and dermatan (anionic molecules) were partially effective at preventing the thrmbotic action of convulxin, particularlyat low doses of the latter, perhaps through a direct electrostatic interaction with convulxin. Mepyramine (histaminer H2 , receptorantagonist), methysergide (5-HT receptor antagonist) and metronidazole há no effect on the formation of thrombi induced by convulxin. Sirnilary, prostacyclin, which increases intracelular cAMP levels, dazoxiben, a thromboxane A2 synthase inhibitor, and aspirin, a cyc100xygenase inhibitor, did not inhibit convulxin-induced thrombosis. These results suggest that is no direct reationship between the platelet aggregation and the convulsions produced by convulxin and that mediators known to affect convulxin-induce aggregation do not affect the thrombotic activity, perhaps because these actions involve different pathways / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador : Gilberto de Nucci / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-18T19:16:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcondes_Sisi_M.pdf: 1350122 bytes, checksum: f4aa256f4d95f590a00d37a6de099465 (MD5) Previous issue date: 1993 / Resumo: O objetivo desta tese foi caracterizar farmacologicamente a ativação plaquetária induzida pela polilisina (poliaminoácido básico) em plasma rico em plaquetas ou plaquetas lavadas humanas e verificar a influência dos sítios aniònicos na ativação plaquetária induzida por este policátion. A agregação plaquetária foi monitorada utilizando-se um agregômetro Payton ou Chrono-Log e a liberação de TXA2 foi medida através de seu produto de degradação TXB2 por radioimunoensaio. O perfil do sulfato de condroitina em plaquetas foi analisado através de eletroforese em gel de agarose. Em PRP polilisina induziu agregação dependente da concentração e do peso molecular do policátion. Esta agregação foi acompanhada pela liberação de TXA2 e inibida por nitroprussiato de sódio e iloprost. Antagonistas de receptores de plaquetas para ADP, adrenalina, PAF e colágeno não modificaram a agregação induzida por polilisina em PRP. Em PL o efeito de polilisina também foi dependente do peso molecular do policátion. Este efeito não foi inibido por EDTA, iloprost e apenas parcialmente por SNP e não foi acompanhado por liberação de TXA2. Poliânions como o ácido poliglutâmico inibiram o efeito de polilisina quando adicionado antes ou depois deste evento. A agregação de polilisina em PRP ou o efeito deste policátion em PL não foram modificados por heparinase, heparitinase I ou heparitinase II, contrariamente, a condroitinase inibiu de maneira dose-dependente a agregação em PRP, mas não modificou o efeito deste poliaminoácido básico em PL. Nossos resultados demonstraram que a polilisina induz agregação em PRP, mas não em plaquetas lavadas. A agregação induzida pela polilisina em PRP deve-se a carga catiônica do policátion e depende parcialmente da presença de sulfato de condroitina na membrana plaquetária. Em plaquetas lavadas, a aglutinação induzida pela polilisina não se deve à interação com sulfato de condroitina. Estes resultados levam a hipótese que o sulfato de condroitina apresenta características de receptor plaquetário, visto que a interação eletrostática com um policátion, como a polilisina, leva a um fenômeno de ativação metabólica. A expressão de sítios aniônicos das plaquetas pode desta maneira modular sua reatividade aos diversos agonistas / Abstract: The aim of this thesis was to pharmacologically characterize the platelet aggregation induced by polylysine, a polyamino acid, in human platelet-rich plasma (PRP) and in washed platelets (WP) and to examine the importance of cell membrane anionic sites in mediating the responses to this polycation. Platelet aggregation was monitored using a two-channel Payton or a one- channel Chrono-Log aggregometer. The release of TXA2 by stimulated platelets was quantified by measuring the levels of its degradation product TXB2 using an appropriate radioimmunoassay. The platelet membrane chondroitin sulfate profile was determined by agarose gel electrophoresis. In PRP, polylysine induced a concentration- and molecular weight- dependent aggregation which was accompanied by the release of TXA2 and was inhibited by sodium nitroprusside {SNP) and iloprost. Antagonists to platelet receptors for ADP, adrenaline, collagen and platelet activating factor (PAF) had no influence on the aggregation induced by polylysine. In WP, the aggregation induced by polylysine was also dependent on the polycation molecular weight. This response was not inhibited by EDTA or iloprost but was partially inhibited by SNP. There was no accompanying formation of TXA2. Polyanions such as polyglutamic acid inhibited or reversed the action of polylysine when added before or after the polycation, respectively. Neither the aggregation induced by polylysine in PRP nor the response induced in WP was modified by preincubation of the platelets with heparinase, heparitinase I or heparitinase II. In contrast, chondroitinase dose-dependently inhibited the aggregation in PRP but had no effect on the response in WP. These results suggest that polylysine induces aggregation in PRP but not in WP. The aggregation in PRP is due to the cationic charge of the polycation and depends, at least in part, on the presence of chondroitin sulfate in the platelet membrane. In WP, the agglutination induced by polylysine does not involve an interaction with chondroitin sulfate. These observations indicate that chondroitin sulfate may function as a type of platelet membrane receptor since the electrostatic interaction of a polycation such as polylysine can lead to metabolic activation of these cells. The expression of anionic sites on the surface of the platelet membrane could therefore be a means by which the platelet regulates its responsiveness to a variety of agonists / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Made available in DSpace on 2016-03-18T12:14:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 eugenio_hottz_ioc_dout_2014.pdf: 16733087 bytes, checksum: 8997b2db1738619b3afa2e139fcbb5b8 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A dengue é a arbovirose humana mais prevalente no mundo. A infecção pelo vírus da dengue (DENV) tem um vasto espectro de sintomas, causando desde febre auto-limitada até casos graves com sangramento e choque podendo evoluir para o óbito. Apesar de plaquetopenia ser frequentemente observada em pacientes com dengue, a participação das plaquetas na patogênese da dengue permanece pouco explorada. Nós inicialmente investigamos a ativação plaquetária em pacientes com dengue ou em plaquetas expostas ao DENV in vitro. Na tentativa de associar a ativação plaquetária com mecanismos imunopatogênicos da dengue, a secreção de citocinas e quimiocinas em plaquetas estimuladas com o DENV e a síntese de IL-1\03B2 em plaquetas de pacientes com dengue foram investigadas. Os mecanismos envolvidos no processamento e secreção da IL-1\03B2, bem como suas contribuições para a permeabilidade endotelial também foram objetos de estudo. A formação de agregados plaqueta-monócito e a expressão de marcadores de ativação de monócitos também foram avaliados em pacientes com dengue. Finalmente, nós investigamos o impacto da apoptose de plaquetas na dengue e sua relação com o desfecho de plaquetopenia. Nossos resultados indicam intensa ativação plaquetária em pacientes com dengue, especialmente em pacientes com dengue grave Nós observamos uma expressão elevada de IL-1\03B2 em plaquetas e micropartículas (MP) derivadas de plaquetas de pacientes com dengue, ou após a exposição de plaquetas ao DENV in vitro. Nós demonstramos que a dengue induz a montagem do inflamassoma NLRP3, ativação de caspase-1 e secreção de IL-1\03B2 de modo dependente da geração de espécies reativas de oxigênio na mitocôndria. A IL-1\03B2 sintetizada por plaquetas foi secretada principalmente em MPs. A ativação do inflamassoma e secreção de MPs contendo IL-1\03B2 correlacionaram com sinais de permeabilidade endotelial aumentada nos pacientes. Além disso, MPs recuperadas de plaquetas expostas ao DENV induziram aumento de permeabilidade endotelial in vitro de modo dependente do receptor de IL-1. Plaquetas de pacientes com dengue também apresentaram características de apoptose como despolarização da mitocôndria, ativação de caspase-3 e de caspase-9 e exposição de fosfatidilserina, que foram associadas à plaquetopenia nos pacientes com dengue. Nós também demonstramos níveis elevados de agregados plaqueta-monócito em pacientes com dengue. A exposição de monócitos isolados de voluntários saudáveis a plaquetas isoladas de pacientes com dengue induziu a secreção das citocinas IL-1\03B2, IL-8, IL-10 e MCP-1 pelos monócitos A secreção de citocinas nos agregados plaqueta-monócito foi dependente tanto da adesão mediada por Pselectina quanto do reconhecimento de plaquetas apoptóticas, que regulou a secreção de IL- 10. Nossos resultados trazem novas evidências de que as plaquetas participam ativamente como efetoras da resposta inflamatória na dengue, e contribuem para os mecanismos patogênicos envolvidos nas alterações hemodinâmicas comuns aos casos de dengue grave / Dengue is the most frequent hemorrhagic viral disease and re-emergent infection in the world. Dengue infection has a large spectrum of clinical manifestations from self-limited febrile illness to severe syndromes accompanied by bleeding and shock. Although thrombocytopenia is characteristically observed in mild and severe forms of dengue, the role of platelet activation in dengue pathogenesis has not been fully elucidated. We hypothesize that platelet activation have major roles in inflammatory amplification and increased vascular permeability during severe forms of dengue. Here we investigate platelet activation in patients with dengue or in platelets exposed to DENV in vitro. The secretion of cytokines and chemokines in DENV-stimulated platelets and the synthesis of IL-1β in platelets from patients with dengue were investigated. The mechanisms involved in processing and secretion of IL-1β, as well as potential contribution of these events to endothelial permeability during infection were also evaluated. Platelet-monocyte aggregates formation and markers of monocyte activation were evaluated in patients with dengue. Finally, we investigated the impact of platelet apoptosis in dengue-associated thrombocytopenia. Our results show increased platelet activation in patients with dengue, especially patients with severe dengue. We showed higher expression of IL-1β in platelets and platelet-derived MPs from patients with dengue or after platelet exposure to DENV in vitro. We demonstrated that DENV infection leads to assembly of NLRP3 inflammasomes, activation of caspase-1, and caspase-1-dependent IL-1β secretion. Our findings also indicate that platelet-derived IL-1β is chiefly released in MPs through mechanisms dependent on mitochondrial reactive oxygen species-triggered NLRP3 inflammasomes. Inflammasome activation and platelet shedding of IL-1β-rich microparticles correlated with signs of increased vascular permeability. Moreover, microparticles from DENV-stimulated platelets induced enhanced endothelial permeability in vitro in an IL-1R-dependent manner. Platelets from dengue-infected patients also showed characteristics of apoptosis, including mitochondrial depolarization, activation of caspase-3 and -9 and phosphatidylserine exposure, which were associated with thrombocytopenia. We also observed increased levels of platelet-monocyte aggregates in blood samples from patients with dengue. The exposure of monocytes from healthy volunteers to platelets from patients with dengue induced the secretion of the cytokines IL-1β, IL-8, IL-10 and MCP-1. In addition to the well-established modulation of monocyte cytokine responses by activated platelets through P-selectin binding, we found that interaction of monocytes with apoptotic platelets mediate IL-10 secretion through phosphatidylserine recognition in platelet-monocyte aggregates. Our findings provide new evidence that platelets actively participate as effector cells in inflammatory response of dengue infection, and contribute to the pathogenesis of dengueassociated vasculopathy.

A busca de plantas medicinais com potencial para o alívio de dores e até mesmo a cura de doenças tem se expandido em diversos países, inclusive no Brasil. O Brasil é um grande produtor de maracujá, que além do seu valor nutricional de seus frutos, tem sido utilizado também com finalidade terapêutica, na medicina popular. Além das diversas aplicações do chá das folhas de maracujá na medicina popular, alguns autores têm sugerido também as atividades hipoglicemiante, antioxidante, anti-glicante e antiagregante de plaquetas para extratos de folhas obtidos de diferentes espécies de maracujá. No entanto, o papel modulatório do extrato bruto seco de folhas P. edulis Sims sobre a glicação proteica e ativação plaquetária não está totalmente esclarecido. O diabetes mellitus é considerado como um importante problema de saúde pública, devido à sua elevada prevalência, ao desenvolvimento de complicações crônicas incapacitantes e ao alto custo econômico gerado pelo seu tratamento. Estudos desenvolvidos com diferentes modelos experimentais têm demonstrado que o DM leva à ativação de plaquetas com consequente aumento de sua agregação bem como ao aumento da glicação de proteínas, sendo estas alterações diretamente envolvidas nas vias bioquímicas que levam ao desenvolvimento das principais complicações crônicas induzidas pelo DM. Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo geral determinar o teor de polifenóis totais e avaliar os efeitos do extrato seco das folhas de Passiflora edulis Sims sobre marcadores bioquímicos, a glicação de colágeno, a ativação e a agregação plaquetária em ratos diabéticos. Ratos machos Wistar (300 ± 25g) foram tratados com aloxano (150mg/Kg de peso corporal dissolvido em salina 0,9%, via intraperitoneal). As folhas secas de Passiflora edulis Sims foram coletadas no município de Alfenas-MG (21° 27’ 33’’ S; 46° 01’ 59’’ w; Altitude 789 m) e identificadas na Universidade Federal de Lavras-MG. O extrato seco foi obtido por maceração em solução hidroetanólica 70%(V/V), seguida de evaporação sob pressão reduzida e de liofilização. O extrato seco foi diluído em água e administrado por gavagem durante 90 dias após a indução do diabetes (200mg do extrato seco/Kg de peso do animal). O grupo controle recebeu apenas água. A agregação plaquetária foi avaliada em agregômetro da marca PA-04 Qualiterm Eletronica à 37°C. Os marcadores bioquímicos (glicemia, ureia, colesterol total e frações ) foram dosados no soro por métodos enzimáticos e a creatinina foi determinada no soro dos animais pelo método de jaffé modificado ( rastreável ao IDMS). O conteúdo de colágeno glicado foi dosado por fluorescência. A produção de espécies oxidantes foi monitorada por quimiluminescência. A administração do extrato seco de folhas de Passiflora edulis Sims reduziu a glicemia em jejum bem como os níveis de HbA1C no sangue dos animais diabéticos. A administração do extrato seco das folhas de Passiflora edulis Sims impediu o aumento dos níveis de creatinina no soro dos animais diabéticos. O extrato seco das folhas de Passiflora edulis Sims foi capaz de reduzir a concentração de lipoproteínas aterogênicas no soro dos animais tratados. Os animais diabéticos apresentaram maior produção basal de oxidantes e a agregação plaquetária em relação aos animais não diabéticos. O tratamento dos animais diabéticos com o extrato de Passiflora edulis Sims atenuou os efeitos do diabetes sobre a produção de oxidantes e a agregação plaquetária. Os níveis de AGEs determinados em amostras de colágeno obtido do tendão de animais diabéticos foi maior que nos animais não diabéticos e o tratamento dos animais diabéticos com o extrato seco levou a uma redução da glicação do colágeno. / The search for medicinal plants with potential for pain relief and even cure diseases has expanded in several countries, including Brazil. Brazil is a major producer of passion fruit, which is beyond the nutritional value of its fruit, also been used for therapeutic purposes in folk medicine. In addition to the various applications of tea leaves passion in folk medicine, some authors have also suggested the hypoglycemic activity, antioxidant, antiplatelet and anti-platelet glicante for leaf extracts obtained from different species of passion fruit. However, the modulatory role of dry crude extract of leaves P. edulis Sims on protein glycation and platelet activation is not fully understood. Diabetes mellitus is considered as a major public health problem due to its high prevalence, the development of disabling chronic complications and the high economic costs generated by their treatment. Studies carried out with different experimental models have shown that DM leads to platelet activation with consequent increase of aggregation as well as increased glycation of proteins, and these changes directly involved in the biochemical pathways leading to the development of major chronic complications induced by DM . Thus, the present work had as main objective to determine the content of total polyphenols and evaluate the effects of dry extract of Passiflora edulis Sims on biochemical markers of collagen glycation, activation and platelet aggregation in diabetic rats. Male Wistar rats (300±25g) were treated with alloxan (150mg/kg body weight dissolved in 0.9% saline) intraperitoneally. The fresh leaves of passion fruit were collected in Alfenas-MG (21° 27’ 33’’ S; 46° 01’ 59’’ w; Altitude 789 m) and identified at the Federal University of Lavras-MG. The dry extract was obtained by grinding in a hydroethanolic solution 70% (V/V), followed by evaporation under reduced pressure and lyophilization and administered (200mg dry extract / kg) to normal and diabetic rats, for ninety days. The control group received water only. Platelet aggregation was performed in aggregometer PA-04 Qualiterm Eletronica to 37°C. Biochemical markers were determined in serum by enzymatic method. The collagen glycation content will be performed by fluorescence. The oxidant species production was monitored by chemiluminescence. The administration of dry extract of Passiflora edulis Sims leaves reduced fasting glucose and HbA1C levels in the blood of diabetic animals . The dry extract administration of Passiflora edulis Sims prevented the increase of serum creatinine levels of diabetic animals. The dry extract of Passiflora edulis Sims was able to reduce the concentration of atherogenic lipoproteins in the serum of treated animals. Diabetic animals had higher basal production of oxidants and platelet aggregation compared to non-diabetic animals. Treatment of diabetic animals with the extract of Passiflora edulis Sims attenuated the effects of diabetes on oxidant production and platelet aggregation. The AGEs levels determined in samples obtained from tendon collagen from diabetic rats was higher than in non- diabetic animals and the treatment of diabetic animals with dry extract led to a reduction of collagen glycation. / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

O envenenamento causado pela lagarta Lonomia obliqua é um problema de saúde pública nas regiões do Sul do Brasil. As vítimas envenenadas apresentam uma síndrome hemorrágica grave que pode evoluir para insuficiência renal aguda, hemorragia intracraniana e óbito. Com o objetivo de compreender os mecanismos que levam à hemorragia, neste trabalho foram avaliados a função plaquetária e os parâmetros de coagulação sangüínea em um modelo experimental de envenenamento em ratos e também foram investigados os efeitos diretos do veneno de L. obliqua sobre plaquetas isoladas in vitro. Os ratos envenenados apresentaram hipofibrinogenemia e hipoagregação plaquetária. A produção intravascular de óxido nítrico e a geração dos produtos de degradação de fibrinogênio/fibrina parecem estar envolvidos na hipoagregação plaquetária. Os animais envenenados também apresentaram incoagulabilidade sangüínea e um aumento significativo na atividade de trombina, plasmina e uroquinase no plasma. Apesar desta geração intravascular de trombina, somente uma pequena redução na contagem de plaquetas foi detectada. Quando testado in vitro, o veneno de L. obliqua foi capaz de induzir diretamente agregação e adesão de plaquetas isoladas. A agregação plaquetária induzida pelo veneno foi significativamente inibida por brometo de p-bromofenacila (p-BPB), um inibidor específico de fosfolipases A2. Experimentos com diferentes antagonistas farmacológicos indicaram que a agregação plaquetária disparada pelo veneno ocorre por um mecanismo dependente de cálcio envolvendo a via das ciclooxigenases e a ativação da fosfodiesterase 3A, uma enzima que leva ao consumo dos níveis intracelulares de AMPc. Se analisados em conjunto, os resultados aqui apresentados são importantes para a compreensão da síndrome hemorrágica resultante do contato acidental com a lagarta L. obliqua e podem auxiliar na descoberta de novas formas de tratamento para o quadro clínico. / The envenomation caused by the caterpillar Lonomia obliqua is a public health hazard in Southern Brazil regions. Envenomed victims present a severe hemorrhagic syndrome that can progress to acute renal failure, intracranial hemorrhage and death. To understand the mechanisms that lead to hemorrhage, we evaluated the platelet function and blood coagulation parameters in an experimental model of envenomation in rats and investigated the direct effects of L. obliqua venom on isolated platelets in vitro. Envenomed rats presented hypofibrinogenemia and platelet hypoaggregation. The intravascular production of nitric oxide and generation of fibrinogen/fibrin degradation products seems to be involved in platelet hypoaggregation. Animals also showed intense blood incoagulability and a significant increase in thrombin, plasmin and urokinase plasmatic activities. Despite this intravascular thrombin generation, only a slight decrease in platelet numbers was detected. When tested in vitro, L. obliqua venom was able to directly induce aggregation and adhesion of isolated platelets. The venom-induced platelet aggregation was significativly inhibited by p-bromophenacyl bromide (p-BPB), a specific inhibitor of phospholipases A2. Experiments with different pharmacological antagonists indicate that the aggregation response triggered by venom occurs through a calcium-dependent mechanism involving the cyclooxygenase pathway and activation of phosphodiesterase 3A, an enzyme that leads to the consumption of intracellular cAMP content. Altogether, these findings may be important to the understanding of the complex hemorrhagic syndrome resulting from accidental contact with L. obliqua caterpillars and may give new insights in the management of the clinical profile.

O envenenamento causado pela lagarta Lonomia obliqua é um problema de saúde pública nas regiões do Sul do Brasil. As vítimas envenenadas apresentam uma síndrome hemorrágica grave que pode evoluir para insuficiência renal aguda, hemorragia intracraniana e óbito. Com o objetivo de compreender os mecanismos que levam à hemorragia, neste trabalho foram avaliados a função plaquetária e os parâmetros de coagulação sangüínea em um modelo experimental de envenenamento em ratos e também foram investigados os efeitos diretos do veneno de L. obliqua sobre plaquetas isoladas in vitro. Os ratos envenenados apresentaram hipofibrinogenemia e hipoagregação plaquetária. A produção intravascular de óxido nítrico e a geração dos produtos de degradação de fibrinogênio/fibrina parecem estar envolvidos na hipoagregação plaquetária. Os animais envenenados também apresentaram incoagulabilidade sangüínea e um aumento significativo na atividade de trombina, plasmina e uroquinase no plasma. Apesar desta geração intravascular de trombina, somente uma pequena redução na contagem de plaquetas foi detectada. Quando testado in vitro, o veneno de L. obliqua foi capaz de induzir diretamente agregação e adesão de plaquetas isoladas. A agregação plaquetária induzida pelo veneno foi significativamente inibida por brometo de p-bromofenacila (p-BPB), um inibidor específico de fosfolipases A2. Experimentos com diferentes antagonistas farmacológicos indicaram que a agregação plaquetária disparada pelo veneno ocorre por um mecanismo dependente de cálcio envolvendo a via das ciclooxigenases e a ativação da fosfodiesterase 3A, uma enzima que leva ao consumo dos níveis intracelulares de AMPc. Se analisados em conjunto, os resultados aqui apresentados são importantes para a compreensão da síndrome hemorrágica resultante do contato acidental com a lagarta L. obliqua e podem auxiliar na descoberta de novas formas de tratamento para o quadro clínico. / The envenomation caused by the caterpillar Lonomia obliqua is a public health hazard in Southern Brazil regions. Envenomed victims present a severe hemorrhagic syndrome that can progress to acute renal failure, intracranial hemorrhage and death. To understand the mechanisms that lead to hemorrhage, we evaluated the platelet function and blood coagulation parameters in an experimental model of envenomation in rats and investigated the direct effects of L. obliqua venom on isolated platelets in vitro. Envenomed rats presented hypofibrinogenemia and platelet hypoaggregation. The intravascular production of nitric oxide and generation of fibrinogen/fibrin degradation products seems to be involved in platelet hypoaggregation. Animals also showed intense blood incoagulability and a significant increase in thrombin, plasmin and urokinase plasmatic activities. Despite this intravascular thrombin generation, only a slight decrease in platelet numbers was detected. When tested in vitro, L. obliqua venom was able to directly induce aggregation and adhesion of isolated platelets. The venom-induced platelet aggregation was significativly inhibited by p-bromophenacyl bromide (p-BPB), a specific inhibitor of phospholipases A2. Experiments with different pharmacological antagonists indicate that the aggregation response triggered by venom occurs through a calcium-dependent mechanism involving the cyclooxygenase pathway and activation of phosphodiesterase 3A, an enzyme that leads to the consumption of intracellular cAMP content. Altogether, these findings may be important to the understanding of the complex hemorrhagic syndrome resulting from accidental contact with L. obliqua caterpillars and may give new insights in the management of the clinical profile.

O envenenamento causado pela lagarta Lonomia obliqua é um problema de saúde pública nas regiões do Sul do Brasil. As vítimas envenenadas apresentam uma síndrome hemorrágica grave que pode evoluir para insuficiência renal aguda, hemorragia intracraniana e óbito. Com o objetivo de compreender os mecanismos que levam à hemorragia, neste trabalho foram avaliados a função plaquetária e os parâmetros de coagulação sangüínea em um modelo experimental de envenenamento em ratos e também foram investigados os efeitos diretos do veneno de L. obliqua sobre plaquetas isoladas in vitro. Os ratos envenenados apresentaram hipofibrinogenemia e hipoagregação plaquetária. A produção intravascular de óxido nítrico e a geração dos produtos de degradação de fibrinogênio/fibrina parecem estar envolvidos na hipoagregação plaquetária. Os animais envenenados também apresentaram incoagulabilidade sangüínea e um aumento significativo na atividade de trombina, plasmina e uroquinase no plasma. Apesar desta geração intravascular de trombina, somente uma pequena redução na contagem de plaquetas foi detectada. Quando testado in vitro, o veneno de L. obliqua foi capaz de induzir diretamente agregação e adesão de plaquetas isoladas. A agregação plaquetária induzida pelo veneno foi significativamente inibida por brometo de p-bromofenacila (p-BPB), um inibidor específico de fosfolipases A2. Experimentos com diferentes antagonistas farmacológicos indicaram que a agregação plaquetária disparada pelo veneno ocorre por um mecanismo dependente de cálcio envolvendo a via das ciclooxigenases e a ativação da fosfodiesterase 3A, uma enzima que leva ao consumo dos níveis intracelulares de AMPc. Se analisados em conjunto, os resultados aqui apresentados são importantes para a compreensão da síndrome hemorrágica resultante do contato acidental com a lagarta L. obliqua e podem auxiliar na descoberta de novas formas de tratamento para o quadro clínico. / The envenomation caused by the caterpillar Lonomia obliqua is a public health hazard in Southern Brazil regions. Envenomed victims present a severe hemorrhagic syndrome that can progress to acute renal failure, intracranial hemorrhage and death. To understand the mechanisms that lead to hemorrhage, we evaluated the platelet function and blood coagulation parameters in an experimental model of envenomation in rats and investigated the direct effects of L. obliqua venom on isolated platelets in vitro. Envenomed rats presented hypofibrinogenemia and platelet hypoaggregation. The intravascular production of nitric oxide and generation of fibrinogen/fibrin degradation products seems to be involved in platelet hypoaggregation. Animals also showed intense blood incoagulability and a significant increase in thrombin, plasmin and urokinase plasmatic activities. Despite this intravascular thrombin generation, only a slight decrease in platelet numbers was detected. When tested in vitro, L. obliqua venom was able to directly induce aggregation and adhesion of isolated platelets. The venom-induced platelet aggregation was significativly inhibited by p-bromophenacyl bromide (p-BPB), a specific inhibitor of phospholipases A2. Experiments with different pharmacological antagonists indicate that the aggregation response triggered by venom occurs through a calcium-dependent mechanism involving the cyclooxygenase pathway and activation of phosphodiesterase 3A, an enzyme that leads to the consumption of intracellular cAMP content. Altogether, these findings may be important to the understanding of the complex hemorrhagic syndrome resulting from accidental contact with L. obliqua caterpillars and may give new insights in the management of the clinical profile.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2015-11-23T19:17:46Z No. of bitstreams: 1 2015_AnneCarolineDiasNeves.pdf: 2726609 bytes, checksum: 9b96c0c43e123e5240c0572c1d0bb7d6 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-05-26T20:23:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_AnneCarolineDiasNeves.pdf: 2726609 bytes, checksum: 9b96c0c43e123e5240c0572c1d0bb7d6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-26T20:23:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_AnneCarolineDiasNeves.pdf: 2726609 bytes, checksum: 9b96c0c43e123e5240c0572c1d0bb7d6 (MD5) / Durante o processo inflamatório são ativadas uma quantidade grande de células, entre elas se destacam os leucócitos polimorfonucleares neutrófilos por serem os mais abundantes do sangue periférico (40% a 70% das células brancas) e por chegarem primeiro ao local da injúria tecidual ou local da infecção. O conhecimento dos mecanismos de ativação desse tipo celular torna-se importante para se compreender a regulação imunológica em diversas situações patológicas, sendo algumas destas consequentes à falha na regulação de ativação de polimorfonucleares. Os casos mais comuns encontrados são nas complicações da doença granulomatosa crônica, doença pulmonar obstrutiva crônica, síndrome da angústia respiratória aguda, artrite reumatóide e síndrome da resposta inflamatória sistêmica. Pesquisas relataram que o Fator de Agregação Plaquetária (PAF) está relacionado à ativação dos neutrófilos nessas condições, onde o estudo das proteínas e das suas modificações pós traducionais tornam-se pontos centrais para entender a sinalização celular dos neutrófilos nas doenças citadas anteriormente. No presente trabalho foi feito o estudo proteômico de neutrófilos quiescentes com a identificação de mais de 3000 proteínas e de neutrófilos estimulados pelo PAF que revelou um perfil protéico que caracteriza essa estimulação, onde proteínas que fazem parte de processos essenciais tiveram a abundância aumentada como reorganização do citoesqueleto, sinalização intracelular mediada por RAS e Proteina G, subunidades da ATPases vacuolar, e alguns produtos característico do processo inflamatório como NFkβ e prostaglandina E. Por outro lado, como os neutrófilos estão em seu estado estimulado outras proteínas tiveram abundância diminuída, entre elas proteínas responsáveis pelo processo de diferenciação e amadurecimento dos neutrófilos e proteínas que fazem parte do sistema de controle de processos essenciais da célula como síntese de proteínas, metabolismo energético e motilidade celular. A identificação de proteínas acetiladas nos indicou as possíveis proteínas alvos para regulação de importantes vias de estimulação dos neutrófilos como tradução, formação estrutural do núcleo multilobulado dos neutrófilos, transporte de vitaminda B12, assim como em pontos de regulação na síntese de ATP e de subunidades de ATPases. A identificação dessas proteínas com abundância diferencial e acetiladas é de fundamental importância para indicar possíveis alvos terapêuticos de doenças auto-imunes e inflamatórias causadas pelo PAF. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / During the inflammatory process is activated a large number of cells, these include polymorphonuclear neutrophil leukocytes to be the most abundant in the peripheral blood (40% to 70% of white cells) and reaching the first site of tissue injury or local infection. Knowledge of this type of cellular activation mechanisms becomes important to understand the immune regulation in various pathological situations, some of these failed in the subsequent activation of polymorphonuclear regulation. The most common cases are found in the complications of chronic granulomatous disease, chronic obstructive pulmonary disease, acute respiratory distress syndrome, rheumatoid arthritis and systemic inflammatory response syndrome. Research reported that platelet aggregation factor (PAF) is related to the activation of neutrophils such conditions, where the study of proteins and their post-translational modifications become key points to understand cell signaling in neutrophils in the above-mentioned diseases. In the present work was done the proteomic study of quiescent neutrophils with the identification of over 3,000 proteins and neutrophils stimulated by PAF which revealed a protein profile that characterizes this stimulation, in which proteins that are part of key processes had increased abundance as reorganization cytoskeleton, intracellular signaling mediated by Ras and G-protein subunits of vacuolar ATPases, and some typical products of the inflammatory process as NFkβ and prostaglandin E. On the other hand, since neutrophils are stimulated in their state had decreased abundance other proteins, including proteins responsible for the process of differentiation and maturation of neutrophils and proteins that are part of the key process control system of the cell as protein synthesis, metabolism energy and cell motility. The identification of acetylated proteins indicated the possible targets proteins for regulation of important pathways stimulation of neutrophils such as translation, formation of the structural core of the multi-lobed neutrophil, vitaminda B12 transportation, as well as set points in the synthesis of ATP and of subunit ATPases. Identifying these proteins with differential abundance and acetylated is fundamental to indicate possible therapeutic targets for autoimmune and inflammatory diseases caused by PAF.

A Trombocitopenia imune (PTI) é uma doença imuno mediada adquirida de adultos e crianças caracterizada por plaquetopenia transitória ou persistente, onde o grau de plaquetopenia aumenta o risco de sangramento. Geralmente, os pacientes apresentam manifestações clínicas apenas em plaquetopenias abaixo de 50x103/mm3, e contagem de plaquetas entre 100 e 150 x103/mm3, se estável por mais de 6 meses, necessariamente não indica uma condição patológica. Tem sido sugerido diferentes processos fisiopatológicos relacionados às plaquetas de acordo com a intensidade da plaquetopenia, e que alterações na megacariocitopoiese e diminuição da sobrevida plaquetária são eventos determinantes na PTI. Contagem de plaquetas reticuladas em citometria de fluxo é um teste muito útil para avaliação da plaquetopenia, pois reflete a atividade megacariocitopoiética, destruição das plaquetas e a própria contagem de plaquetas. Tanto as plaquetas quanto os megacariócitos apresentam a via intrínseca da apoptose. A atividade dos principais mediadores da apoptose intrínseca, como Bax a Bak, é regulada por proteínas anti-apoptótica da família Bcl-2, tais como Bcl-xL. Um balanço entre Bcl-xL e Bax regula a sobrevivência plaquetária. Pacientes de PTI apresentam aumento da ativação plaquetária e da formação de micropartículas derivadas de plaquetas (MPP). Nosso objetivo foi avaliar a relação entre produção e apoptose plaquetária, e associá-la com a ativação plaquetária e a formação de MPP nos diferentes graus de intensidade da PTI. Os pacientes recrutados foram diagnosticados para trombocitopenia imune (PTI) primária, \"idiopática\", não esplenectomizados, acompanhados regularmente no ambulatório de Doenças Hemorrágicas e Trombóticas, do Serviço de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, e foram divididos grupos de acordo com contagem de plaquetas: < 50x103/mm3 (n=7); entre 50-100x103/mm3 (n=7); > 100x103/mm3 (n=7). Como grupo controle, foram avaliados 10 doadores de sangue da Fundação Pró-Sangue Hemocentro de São Paulo. A produção plaquetária foi estabelecida através da contagem de plaquetas reticuladas por citometria de fluxo com laranja de tiazol. Também por citometria de fluxo avaliamos a ativação plaquetária pela expressão de P-selectina (CD62P), e a formação de MPP através de beads de 1um e dupla positividade para CD41a (GPIIbIIIa) e CD31 (molécula de adesão PECAM-1). A apoptose foi avaliada pela relação entre as expressões das proteínas anti apoptótica, Bcl-xL, e pró apoptótica, Bax, (Bcl-xL/Bax) em Western Blotting. Evidenciamos que na PTI há um aumento do numero de plaquetas reticuladas, predomínio de Bax em relação à Bcl-xL, uma maior ativação plaquetária e formação de MPP, mas em níveis variados dependentes do grau de plaquetopenia instalado. Sugerimos que o nível de predomínio do sistema pró apoptose sobre o anti apoptótico estabelece a intensidade da plaquetopenia na PTI. E que os eventos ativação plaquetária e formação de MPP são regulados pelo balanço entre Bcl-xL/Bax / Immune thrombocytopenic (ITP) is an immune-mediated acquired disease of adults and children characterized by transient or persistent decrease of the platelet count and, depending upon the degree of thrombocytopenia, increased risk of bleeding. ITP usually presents with clinical manifestations only in platelet counts below 50x103/mm3, and counts between 100 and 150x103/mm3 if they have been stable for more than 6 months do not necessarily indicate a pathologic condition. It has been suggested the existence of different pathophysiological processes involving platelets according to the severity of thrombocytopenia, and that alterations in the megakaryopoiesis and reduced platelet lifespan play a key role in ITP. The flow cytometric analysis of reticulated platelets is useful for evaluating thrombocytopenia that reflect the activity megakaryopoiesis, platelets destruction, plataelet count, and age. Platelets and megakaryocytes contain intrinsic pathway of apoptosis. The activity of key mediators of intrinsic apoptosis, Bak and Bax, is tightly controlled by anti-apoptotic Bcl-2 family members, of which Bcl-xL, wich have been shown to coordinately regulate platelet survival. ITP patients have a larger amount of activated platelets that express P-selectin as well as an increase of platelets-derived microparticles (PMP). We suggest a relationship between platelet production and Bcl-xL and Bax expression in ITP patients from different degrees of thrombocytopenia, that has relate with platelet activation and PMP. Our aim was assessment of ratio between platelets production and apoptosis, and it associate with platelets activation and PMP in differents thrombocytopenia degree in ITP. Patients were considered eligible for the study if they were on regular follow-up at the clinic of haemorrhagic and thrombotic diseases of the Hematology Service of Clinics Hospital of University of São Paulo Medicine School diagnosed with primary immune thrombocytopenia, \"idiopathic\". Patients were divided into groups according to levels of thrombocytopenia: platelets count between 100 and 150x103/mm3 ( > 100x103/mm3); between 50 and 100x103/mm3 (50-100x103/mm3); and below 50x103/mm3 ( < 50x103/mm3). Healthy volunteers were blood donors in the Pró-Sangue Foundation of Blood Center of São Paulo, with platelets count between 150 and 450 x103/mm3. Platelets production was through reticulated platelets count by flow cytometry wiht thiazole orange. Also by flow cytometry evaluated platelet activation through expression of P-selectin, and PMP by beads of 1um and double positive for CD41a, and CD31. Apoptosis was evaluated by the relationship between anti apoptotic proteins Bcl- XL, and pro apoptotic, Bax (Bcl-XL / Bax) in Western blotting. We show that there higher reticulated platelets in ITP as well as Bax predominantly in relation to Bcl-xL, increased platelet activation and PMP, but at varying levels depending on the degree of thrombocytopenia. We suggest that the level of dominance of pro apoptotic system on the anti-apoptotic establishes the intensity of thrombocytopenia in ITP, and that platelet activation and formation of MPP events are regulated by the balance between Bcl-xL / Bax

Os hemoderivados têm sido utilizados com frequência cada vez maior na medicina equina, sendo caracterizados como um produto autólogo, com maior quantidade de fatores de crescimento e que melhora a capacidade de cicatrização de tecidos com pouco aporte sanguíneo, como tendões e articulações, diminuindo o tempo de recuperação do animal. Sabe-se que os fatores de crescimento são derivados das plaquetas, porém a correlação positiva entre o aumento na contagem plaquetária e a maior concentração de fatores de crescimento ainda é motivo de discussão entre os autores. Com o intuito de se obter um produto final com maior contagem plaquetária, é frequente o aumento da velocidade ou número de centrifugações na metodologia empregada, aumentando o risco de agregação plaquetária precoce. O objetivo do presente trabalho é estudar o efeito da dupla centrifugação no preparo de PRP, por meio da comparação entre contagens plaquetárias, concentrações de fator de crescimento TGF-&#946;1, e grau de ativação plaquetária por meio da porcentagem de agregação. Foram utilizados 12 equinos, machos, de 3 a 5 anos, clinicamente sadios. Para tanto foram realizados dois protocolos distintos: um com centrifugação única e o outro com dupla centrifugação. No primeiro, o sangue com anticoagulante foi centrifugado a 141G/12 minutos; enquanto no segundo a primeira centrifugação foi de 300G/5 minutos seguida de 700G/15 minutos, com repouso entre as mesmas e após. Os produtos obtidos após cada centrifugação foram submetidos à contagem plaquetária, teste de agregação e quantificação de TGF--&#946;1 por meio de kit ELISA. Os resultados obtidos demonstraram maior concentração plaquetária quando utilizado protocolo de dupla centrifugação. Agregometria evidenciou maior ativação das plaquetas durante o preparo do PRP quando submetidas a maiores velocidades de centrifugação (força gravitacional) e não ao fato das amostras serem centrifugadas duas vezes. A quantificação do TGF--&#946;1 não mostrou diferença quando realizado em amostras com apenas uma centrifugação, mas demonstrou valores maiores no produto final da segunda centrifugação. A avaliação por meio de coeficiente de determinação e coeficiente de correlação de Pearson evidenciou correlação positiva entre contagem plaquetária e de TGF--&#946;1. O protocolo com dupla centrifugação se mostrou mais eficaz em concentrar plaquetas e TGF--&#946;1, não sendo prejudicado pela ativação precoce dessas plaquetas durante o preparo. / Blood derived products have been used in equine medicine with increasing frequency, being characterized as an autologous product, with greater amount of growth factors and be capable of improvement the healing capacity in tissues with poor blood supply, such as tendons and joints, reducing the time of recovery of the animal. It is known that the growth factors are derived from platelets, but the positive correlation between the increase in platelet count and the higher concentration of growth factors is still a reason for discussion among the authors. In order to obtain a final product with a higher platelet count, it is frequent to increase the speed or number of centrifugations in the methodology employed, increasing the risk of early platelet aggregation. The aim of the present study is to verify the effect of double centrifugation in PRP preparation by comparing platelet counts, TGF-&#946;1 growth factor concentrations, and degree of platelet activation through percentage of aggregation. Twelve horses, male, aged 3 to 5 years-old, clinically healthy were subjected. Two different protocols were performed: one with single centrifugation and the other with double centrifugation. In the first one, the anticoagulated blood was centrifugated at 141G/12 minutes; while in the second one the first centrifugation was 300G/5 minutes followed by 700G/15 minutes, with rest between them and after. The products obtained after each centrifugation were submitted to platelet counting, aggregation test and measurement of TGF-&#946;1 by ELISA kit. The results showed a higher platelet concentration when double centrifugation protocol was used. The aggregometry test evidenced a greater activation of the platelets during the preparation of PRP when submitted to higher centrifugation velocities (times g), and not to double centrifugation. Quantification of TGF-&#946;1 showed no difference when performed on samples with only one centrifugation, but was higher values in the final product of the second centrifugation. The determination coefficient and Pearsons correlation coefficient showed a positive correlation between the platelet count and TGF-&#946;1 concentration. The double centrifugation protocol proved to be more effective at concentrating platelets and consequently higher amounts of TGF-&#946;1, not being impaired by early activation during obtainment.