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Células dendríticas (DCs) são células do sistema imunológico muito importantes no processo de indução de imunidade, capazes de conectar respostas imunes inata e adquirida e levar à ativação de células T e B. Recentemente demonstrou-se que é possível direcionar antígenos diretamente para as DCs in vivo através da administração de baixas doses de uma proteína recombinante híbrida fusionada a um anticorpo monoclonal específico para receptores presentes na superfície destas células. Dois dos anticorpos monoclonais utilizados tem a capacidade de ligar-se aos receptores endocíticos DEC205 e DCIR2 presentes na superfície de duas sub-populações distintas de DCs.Construiu-se anticorpos híbridos em fusão com os genes que codificam a proteína MSP-119 presente na superfície das formas merozoítas de P.yoelii e P.vivax. Ensaios de imunização mostraram que o anticorpo anti-DEC fusionado a qualquer das duas proteínas foi capaz de induzir principalmente uma resposta imune celular quando administrado na presença de diferentes adjuvantes. Já a resposta imune humoral foi modulada dependendo de várias combinações. / Dendritic cells (DCs) are cells of the immune system very important in the process of induction of immunity. They are able to connect innate and acquired immune responses and lead to activation of T and B cells. Recently it was shown that it is possible to target antigens directly to DCs in vivo by the administration of low doses of a recombinant hybrid protein consisting of a monoclonal antibody specific for receptors present on the surface of these cells fused with the antigen of interest. When these hybrid antibodies were injected in animals in the presence of a DC maturation stimulus, strong immune response against different antigens was obtained. Two of the monoclonal antibodies used have the ability to bind to either the DEC205 or the DCIR2 endocytic receptors present on the surface of two distinct DC sub-populations. In this work, we constructed hybrid antibodies fused with the sequence encoding the MSP-119 protein present on the surface P. yoelii and P. vivax merozoites. Most antibodies were successfully produced and maintained their ability to bind to their respective receptors. Immunization trials showed that the anti-DEC antibody fused to any of the two proteins was able to induce mainly a cellular immune response when administered in the presence of adjuvants. On the other hand, the humoral immune response depends of some combinations.

Para examinar como o nível de diversidade genética de Plasmodium vivax em uma comunidade varia no tempo e no espaço, investigamos a dinâmica de polimorfismos do parasito durante as primeiras fases de ocupação de um assentamento agrícola na Região Amazônica brasileira. A caracterização por microssatélites de 84 isolados de P. vivax, colhidos ao longo de três anos, revelou uma diversidade genética de moderada a alta (heterozigosidade esperada média, 0,699), com uma grande proporção (78,5%) de infecções por múltiplos clones (IMC), mas também um forte desequilíbrio de ligação (DL) consistente com um raro cruzamento entre os haplótipos. Observamos uma pequena influência temporal na diversidade genética dos haplótipos do parasito e nenhum padrão de distribuição espacial dos mesmos. Em amostras consecutivas colhidas de um mesmo indivíduo observou-se uma intensa renovação de haplótipos ao longo do tempo. Um único haplótipo foi compartilhado por três indivíduos cujas amostras foram colhidas durante um surto; todos os outros 81 haplótipos foram recuperados apenas uma vez. A menor diversidade parasitária, com a menor proporção de IMC e um DL mais intenso, foi observada no momento do surto, fornecendo um claro exemplo de uma estrutura populacional epidêmica de um patógeno humano. Todos os parâmetros populacionais retornaram aos valores prévios ao surto durantes os últimos anos de estudo, apesar da queda concomitante na transmissão de malária. Sugerimos que a genotipagem do parasito pode ser útil para monitorar a propagação de novas linhagens do parasito associadas a surtos em áreas que se aproximam da eliminação da malária. / To examine how community-level genetic diversity of the malaria parasite Plasmodium vivax varies across time and space, we investigated the dynamics of parasite polymorphisms during the early phases of occupation of a frontier settlement in the Amazon Basin of Brazil. Microsatellite characterization of 84 isolates of P. vivax sampled over 3 years revealed a moderate to high genetic diversity (mean expected heterozygosity, 0.699), with a large proportion (78.5%) of multiple-clone infections (MCI), but also a strong multilocus linkage disequilibrium (LD) consistent with rare outcrossing. Little temporal and no spatial clustering was observed in the distribution of parasite haplotypes. A single microsatellite haplotype was shared by 3 parasites collected during an outbreak; all other 81 haplotypes were recovered only once. The lowest parasite diversity, with the smallest proportion of MCI and the strongest LD, was observed at the time of the outbreak, providing a clear example of epidemic population structure in a human pathogen. Population genetic parameters returned to preoutbreak values during last 2 years of study, despite the concomitant decline in malaria incidence. We suggest that parasite genotyping can be useful for tracking the spread of new parasite strains associated with outbreaks in areas approaching malaria elimination.

Células dendríticas (DCs) são células do sistema imunológico muito importantes no processo de indução de imunidade, capazes de conectar respostas imunes inata e adquirida e levar à ativação de células T e B. Recentemente demonstrou-se que é possível direcionar antígenos diretamente para as DCs in vivo através da administração de baixas doses de uma proteína recombinante híbrida fusionada a um anticorpo monoclonal específico para receptores presentes na superfície destas células. Dois dos anticorpos monoclonais utilizados tem a capacidade de ligar-se aos receptores endocíticos DEC205 e DCIR2 presentes na superfície de duas sub-populações distintas de DCs.Construiu-se anticorpos híbridos em fusão com os genes que codificam a proteína MSP-119 presente na superfície das formas merozoítas de P.yoelii e P.vivax. Ensaios de imunização mostraram que o anticorpo anti-DEC fusionado a qualquer das duas proteínas foi capaz de induzir principalmente uma resposta imune celular quando administrado na presença de diferentes adjuvantes. Já a resposta imune humoral foi modulada dependendo de várias combinações. / Dendritic cells (DCs) are cells of the immune system very important in the process of induction of immunity. They are able to connect innate and acquired immune responses and lead to activation of T and B cells. Recently it was shown that it is possible to target antigens directly to DCs in vivo by the administration of low doses of a recombinant hybrid protein consisting of a monoclonal antibody specific for receptors present on the surface of these cells fused with the antigen of interest. When these hybrid antibodies were injected in animals in the presence of a DC maturation stimulus, strong immune response against different antigens was obtained. Two of the monoclonal antibodies used have the ability to bind to either the DEC205 or the DCIR2 endocytic receptors present on the surface of two distinct DC sub-populations. In this work, we constructed hybrid antibodies fused with the sequence encoding the MSP-119 protein present on the surface P. yoelii and P. vivax merozoites. Most antibodies were successfully produced and maintained their ability to bind to their respective receptors. Immunization trials showed that the anti-DEC antibody fused to any of the two proteins was able to induce mainly a cellular immune response when administered in the presence of adjuvants. On the other hand, the humoral immune response depends of some combinations.

Plasmodium vivax é a espécie de malária humana de maior distribuição geográfica, com 35 milhões de casos por ano. No Brasil, é a espécie mais prevalente, sendo responsável por cerca de 70% dos casos de malária. Diferentemente do P. falciparum, o P. vivax apresenta hipnozoítas, formas que se mantêm em estágio dormente no fígado e que, após um período de tempo variável, por mecanismos ainda desconhecidos, causam novo ataque malárico denominado recaída. Para contribuir para um melhor conhecimento acerca das recaídas causadas por P. vivax, neste trabalho foram analisadas amostras pareadas referentes ao ataque primário e à recaída de 10 pacientes que se infectaram na Amazônia Brasileira. Através da amplificação de um segmento polimórfico do gene que codifica a Proteína de Superfície do Merozoíta 1 (PvMSP1), foi encontrado um índice de 40% de infecções mistas, presentes inclusive durante a recaída, indicando que a ativação de hipnozoítas não é clonal. Em análise mais detalhada deste segmento polimórfico, utilizando técnicas de clonagem e sequenciamento, foi possível verificar que a população de parasitas obtida durante o ataque primário é idêntica àquela que surge nas recaídas. O estudo da resposta IgG específica naturalmente adquirida contra a região C-terminal da PvMSP1, a mais imunogênica da molécula, demonstrou, durante a recaída, um aumento nos títulos acompanhado por uma maturação na afinidade destes anticorpos além de um predomínio de IgG1. / Plasmodium vivax is the most widely distributed human malarial parasite causing an estimated 35 million cases annually. In some parts of the world, including Brazil where it reaches almost 70% of malaria cases, this is the most prevalent species. Unlike P. falciparum, P. vivax has hypnozoites, hepatocyte dormant stages that cause clinical and parasitological relapses. Unfortunately, the molecular basis of relapses remain poorly understood. This work compared paired primary attack and relapse samples obtained from 10 infected patients from the brazilian Amazon Region using a polymorphic segment of the gene encoding the Merozoite Surface Protein 1 (PvMSP1) as a genetic marker. PCR, Southern blot and DNA sequence analysis demonstrated that the parasite population from the primary attack is identical to the one arising during relapses and that the activation of hypnozoites is not clonal; moreover, a large percentage (40%) of mixed infections, were detected. Studies on the naturally acquired human specific IgG response of these patients against the C-terminal region of the PvMSP1 molecule, the most immunogenic region, demonstrated an increase in the titers, affinity maturation and a predominance of the IgG1 subclass during the relapse.

Para examinar como o nível de diversidade genética de Plasmodium vivax em uma comunidade varia no tempo e no espaço, investigamos a dinâmica de polimorfismos do parasito durante as primeiras fases de ocupação de um assentamento agrícola na Região Amazônica brasileira. A caracterização por microssatélites de 84 isolados de P. vivax, colhidos ao longo de três anos, revelou uma diversidade genética de moderada a alta (heterozigosidade esperada média, 0,699), com uma grande proporção (78,5%) de infecções por múltiplos clones (IMC), mas também um forte desequilíbrio de ligação (DL) consistente com um raro cruzamento entre os haplótipos. Observamos uma pequena influência temporal na diversidade genética dos haplótipos do parasito e nenhum padrão de distribuição espacial dos mesmos. Em amostras consecutivas colhidas de um mesmo indivíduo observou-se uma intensa renovação de haplótipos ao longo do tempo. Um único haplótipo foi compartilhado por três indivíduos cujas amostras foram colhidas durante um surto; todos os outros 81 haplótipos foram recuperados apenas uma vez. A menor diversidade parasitária, com a menor proporção de IMC e um DL mais intenso, foi observada no momento do surto, fornecendo um claro exemplo de uma estrutura populacional epidêmica de um patógeno humano. Todos os parâmetros populacionais retornaram aos valores prévios ao surto durantes os últimos anos de estudo, apesar da queda concomitante na transmissão de malária. Sugerimos que a genotipagem do parasito pode ser útil para monitorar a propagação de novas linhagens do parasito associadas a surtos em áreas que se aproximam da eliminação da malária. / To examine how community-level genetic diversity of the malaria parasite Plasmodium vivax varies across time and space, we investigated the dynamics of parasite polymorphisms during the early phases of occupation of a frontier settlement in the Amazon Basin of Brazil. Microsatellite characterization of 84 isolates of P. vivax sampled over 3 years revealed a moderate to high genetic diversity (mean expected heterozygosity, 0.699), with a large proportion (78.5%) of multiple-clone infections (MCI), but also a strong multilocus linkage disequilibrium (LD) consistent with rare outcrossing. Little temporal and no spatial clustering was observed in the distribution of parasite haplotypes. A single microsatellite haplotype was shared by 3 parasites collected during an outbreak; all other 81 haplotypes were recovered only once. The lowest parasite diversity, with the smallest proportion of MCI and the strongest LD, was observed at the time of the outbreak, providing a clear example of epidemic population structure in a human pathogen. Population genetic parameters returned to preoutbreak values during last 2 years of study, despite the concomitant decline in malaria incidence. We suggest that parasite genotyping can be useful for tracking the spread of new parasite strains associated with outbreaks in areas approaching malaria elimination.

Plasmodium vivax é a espécie de malária humana de maior distribuição geográfica, com 35 milhões de casos por ano. No Brasil, é a espécie mais prevalente, sendo responsável por cerca de 70% dos casos de malária. Diferentemente do P. falciparum, o P. vivax apresenta hipnozoítas, formas que se mantêm em estágio dormente no fígado e que, após um período de tempo variável, por mecanismos ainda desconhecidos, causam novo ataque malárico denominado recaída. Para contribuir para um melhor conhecimento acerca das recaídas causadas por P. vivax, neste trabalho foram analisadas amostras pareadas referentes ao ataque primário e à recaída de 10 pacientes que se infectaram na Amazônia Brasileira. Através da amplificação de um segmento polimórfico do gene que codifica a Proteína de Superfície do Merozoíta 1 (PvMSP1), foi encontrado um índice de 40% de infecções mistas, presentes inclusive durante a recaída, indicando que a ativação de hipnozoítas não é clonal. Em análise mais detalhada deste segmento polimórfico, utilizando técnicas de clonagem e sequenciamento, foi possível verificar que a população de parasitas obtida durante o ataque primário é idêntica àquela que surge nas recaídas. O estudo da resposta IgG específica naturalmente adquirida contra a região C-terminal da PvMSP1, a mais imunogênica da molécula, demonstrou, durante a recaída, um aumento nos títulos acompanhado por uma maturação na afinidade destes anticorpos além de um predomínio de IgG1. / Plasmodium vivax is the most widely distributed human malarial parasite causing an estimated 35 million cases annually. In some parts of the world, including Brazil where it reaches almost 70% of malaria cases, this is the most prevalent species. Unlike P. falciparum, P. vivax has hypnozoites, hepatocyte dormant stages that cause clinical and parasitological relapses. Unfortunately, the molecular basis of relapses remain poorly understood. This work compared paired primary attack and relapse samples obtained from 10 infected patients from the brazilian Amazon Region using a polymorphic segment of the gene encoding the Merozoite Surface Protein 1 (PvMSP1) as a genetic marker. PCR, Southern blot and DNA sequence analysis demonstrated that the parasite population from the primary attack is identical to the one arising during relapses and that the activation of hypnozoites is not clonal; moreover, a large percentage (40%) of mixed infections, were detected. Studies on the naturally acquired human specific IgG response of these patients against the C-terminal region of the PvMSP1 molecule, the most immunogenic region, demonstrated an increase in the titers, affinity maturation and a predominance of the IgG1 subclass during the relapse.

Estudos relacionados à malária autóctone em regiões de baixa transmissão no Brasil ganham cada vez mais relevância científica e epidemiológica, pois revelam a manutenção desse cenário em regiões de Mata Atlântica remanescente. No sudeste do Estado de São Paulo, a ocorrência de surtos no município de Juquitiba tem sido foco de pesquisas sobre a prevalência de Plasmodium na população, com registros de casos assintomáticos. Relatos de ocorrência da doença ou da presença de anticorpos antiplasmodiais em gestantes nessa região não haviam sido descritos anteriormente. Embora infecções por P. falciparum em gestantes tenham sido amplamente abordadas na literatura, a interação entre P. vivax e P. malariae com esta coorte imunodeprimida foi pouco explorada até o momento. Nesse estudo nós monitoramos trimestralmente a circulação de Plasmodium em gestantes atendidas em cinco Unidades de Saúde de Juquitiba. Para isso foi empregado o diagnóstico por gota espessa e metodologias moleculares sensíveis para detecção do parasito, além de ensaios imunológicos para avaliação de parâmetros imunes humorais. Desse modo, foram detectadas infecções por P. vivax e P. malariae em gestantes, incluindo casos assintomáticos. A alta prevalência de anticorpos IgG nesta população mostrou importante exposição das gestantes ao Plasmodium. Em regiões com perfil semelhante ao apresentado neste estudo, o diagnóstico de malária poderia ser indicado no seguimento pré-natal / Studies related to autochthonous malaria in low transmission areas in Brazil have acquired scientific and epidemiological relevance, since they suggest continued transmission in remaining Atlantic Forest regions. In the Southeast of São Paulo State, outbreaks in the municipality of Juquitiba has been focus of studies on the prevalence of Plasmodium in the population, with reports of asymptomatic cases. Data on the occurrence of the disease or presence of antiplasmodial antibodies in pregnant women in this region were not described previously. Although P. falciparum infections in pregnant women have been widely addressed in the literature, the interaction of P. vivax and P. malariae with this immunocompromised cohort were poorly explored to date. In this study, we monitored quarterly the circulation of Plasmodium in pregnant women in five health facilities in Juquitiba. For this purpose, we performed diagnosis by thick blood film and sensitive molecular protocols for parasite DNA detection, as well immunological assays in order to evaluate humoral immune parameters. Through these tools, it was possible to detect infections due to P. vivax and P. malariae in pregnant women, including asymptomatic cases. The high prevalence of IgG antibodies showed a significant exposure of this population to Plasmodium. In regions with a similar profile presented in this study, the diagnosis of malaria might be indicated in prenatal care

Os diversos aspectos da cadeia de transmissão da malária autóctone são importantes para o estabelecimento de estratégias de intervenção. Entre abril de 2001 e março de 2004, 65 pacientes e 1.777 habitantes foram avaliados em nove municípios da região montanhosa do Espírito Santo. Foram realizados: gota espessa, esfregaço fino, PCR Multiplex, reação de imunofluorescência indireta (IFI) para detecção de anticorpos contra antígenos de estágios eritrocitários de Plasmodium e ELISA para detecção de anticorpos contra peptídeos sintetizados a partir da porção repetitiva da proteína circunsporozoíta (CSP) das variantes de P. vivax e do P. malariae. Foram capturados anofelíneos no peridomicílio, com pesquisa, por PCR Multiplex, de DNA de Plasmodium. O mesmo foi pesquisado também em alguns símios locais. Os pacientes tinham 35,11 + 16 anos, em média. A maioria era do gênero masculino (51 ou 78,5%), 42 (64,6%) residiam em área rural, 23 (35,4%) eram agricultores e oito (12,3%) estudantes. Não houve viagens relevantes. Sessenta e dois (95,4%) nunca haviam tido malária. Vinte e quatro (36,9%) declararam ter entrado na mata. Predominaram a febre, a cefaléia e os calafrios. A febre era episódica em 63 (96,9%), a cada 48 horas em 48 (73,8%) e a cada 24 horas em 15 pacientes (23,1%). O baço foi impalpável em 26 (42,6%). Foi evidenciado o P. vivax em 47 de 48 pacientes e o P. malariae naquele restante, por características morfológicas e pela PCR Multiplex. Esta foi positiva para P. vivax em 45 dos 48, para P. malariae em um e negativa em dois. A IFI foi positiva, para P. malariae, em seis de sete testados, para IgM, e em todos os sete para IgG. Para o P. vivax, entre 50, 47 (94%) foram positivos para IgM e 48 (96%) para IgG. Entre 50 pacientes, pelo ELISA, 25 (50%) tinham anticorpos contra variantes do P. vivax ou contra o P. malariae. As freqüências individuais foram: 22 (44%) para a VK 210, 11 (22%) para a VK 247, 10 (20%) para o P. vivax-like e 10 (20%) para o P. malariae. Entre 253 amostras dos habitantes testadas na IFI para o P. malariae, o resultado foi positivo em 15,8% (40/253) para IgM e em 44,6% (113/253) para IgG. Para o P. vivax , em 1.701, foram 6,2% (105/1701) para IgM e 37,7% (641/1.701) para IgG. Foram detectados anticorpos contra a CSP em 615 de 1.702 amostras (36,1%). Foram 433 (25,4%) para a VK210, 258 (15,1%) para P. malariae, 108 (6,3%) para a VK 247 e 182 (10,7%) para P. vivax -like. A PCR Multiplex, em 1.527 amostras, detectou P. vivax em 23, P. malariae em 15, P. falciparum em nove e P. falciparum e P. malariae em um. Entre 785 espécimes de anofelíneos, com 10 espécies, foi encontrado DNA de P. vivax em um conjunto de exemplares de A. evansae. O P. malariae/brasilianum foi identificado pela PCR Multiplex em dois de cinco símios da região, em um também pelo esfregaço fino. Existem dois possíveis cenários para a transmissão. No primeiro, ela seria inter-humana, com vetores Nyssorhynchus secundários. Em um segundo, viria do reservatório símio, por indivíduos adentrando o ambiente florestal. / The several aspects of the transmission cycle of the indigenous malaria are important to base on the intervention strategies. From April 2001 to March 2004, 65 patients and 1,777 inhabitants were evaluated in nine Municipalities of the highlands of Espírito Santo State. Laboratory methods included: thick and thin smears, Multiplex PCR, imunnofluorescent assay to detect antibodies against crude blood-stages antigens of the Plasmodium genus (IFA) and ELISA to detect antibodies against synthetic peptides corresponding to the repetitive region of the Circumsporozoite protein of P. vivax variants and P. malariae. Anopheline mosquitoes were captured nearby the houses, being screened by Multiplex PCR in the search for Plasmodium DNA. The same test was also applied to some local wild monkeys. Patients had 35.11 + 16 years old in average. Most of them were males (51 or 78.5%), 42 (64,6%) lived in the rural environment, 23 (35.4%) were farmers and eight (12.3%) were students. There was no relevant history of travel. Sixty-two (95.4%) of them had never experienced malaria before. Twenty- four (36.9%) of them informed excursions inside the forest. The predominant symptoms were fever, headache and chills. Fever was periodic in 63 patients (96.9%), recurring each 48 hours in 48 of them (73.8%) and each 24 hours in 15 (23.1%). Spleen was not palpable in 26 patients (42.6%). Morphologic aspects and PCR results disclosed P. vivax as the agent involved in 47 of the 48 cases so screened. Multiplex PCR was positive for P. vivax in 45 of 48 tested, for P. malariae in another one and negative for the two remaining. IFA tested positive for IgM against P. malariae in six of seven evaluated samples, and for IgG against the same parasite in all of the seven. For P. vivax , the figures were 47 of 50 (94%) for IgM antibodies and 48 of 50 (96%) for IgG antibodies. From fifty patients whose samples were screened by ELISA, 25 (50%) were positive for P. vivax variants or P. malariae. The results considering each one of the tested peptides were: 22 (44%) for VK 210, 11 (22%) for VK 247, 10 (20%) for P. vivax -like e 10 (20%) for P. malariae. Among 253 population samples screened in search for P. malariae antibodies at IFA, 40 (15.8%) were positive for IgM antibodies and 113 (44,6%) for IgG antibodies. The search for P. vivax antibodies by the same technique in1,701 samples, resulted in 105 (6.2%) positive for IgM antibodies and in 641 positive for IgG antibodies. Anti-CSP antibodies were detected in 615 of 1,702 tested samples (36.1%). Among these 615, the positive results for each one of the tested peptides were: 433 (25,4%) for VK210, 258 (15,1%) for P. malariae, 108 (6,3%) for VK 247 e 182 (10,7%) for P. vivax-like. Multiplex PCR detected P. vivax DNA in 23 out of 1,527 tested samples, as it did for P. malariae in 15 of them, for P. falciparum in nine of them and both for P. malariae and P. falciparum in one of them. Among 785 mosquito specimens, representing 10 Anopheline species, P. vivax DNA was found in a set of some A. evansae specimens. P. malariae/brasilianum was identified by Multiplex PCR in two of five wild monkeys screened, in one of them also by thin smear. There are two possible scenarios to explain this transmission cycle. The first one bears malaria as a disease transmitted exclusively among human beings by secondary Nyssorhynchus vectors present nearby the houses. In a second scenario, the malaria is acquired after the simian reservoir when the human beings make excursions inside the forest.