Plk4 is the most divergent member of the family of polo like kinases (Plks). Plk4-/- embryos arrest at approximately day 7.5 p.c. but Plk4+/- mice are viable and fertile. However, 50% of Plk4+/- mice develop spontaneous tumours of the liver, lung and soft tissues by 2 years of age. Here I investigate the mechanisms that underlie Plk4-related tumourigenesis. Plk4+/- murine embryonic fibroblasts (MEFs) spontaneously become immortal in vitro with increasing passage number and are tumourigenic in vivo when injected into NOD SCID mice. Cytogenetic analysis showed that Plk4 deficient cells are chromosomally unstable with a large number of chromosomal aberrations and increased ploidy. These results demonstrate that early loss of a single Plk4 allele is sufficient to drive cell immortalization, chromosomal instability and tumourigenicity in vivo. In two independent expression array analyses, gene expression patterns that would decrease cell migration were overrepresented in Plk4+/- MEFs. A series of spreading and migration assays functionally validated these results, supporting the hypothesis that Plk4 regulates cell motility. Endogenous Plk4 localized to filopodia and lamellipodia in motile cells and to protrusions of spreading cells; the latter localization was transient and it disappeared by 4h after cell seeding, at which point Plk4 was located in the centrosomes, as typically observed in interphase cells. Transient transfection with Flag-Plk4 enhanced spreading and migration, as well as actin remodeling. Taken together, these data demonstrate temporal regulation of Plk4 in relation to the process of membrane remodeling, and a functional role for Plk4 in cell motility. Plk4 is haploinsufficient for tumour suppression in mice. Plk4 is located at human chromosome 4q28, a region often deleted in primary liver cancer specimens. Here I show that loss-of-heterozygosity (LOH) occurs at the Plk4 locus in ≈50% of human hepatocellular carcinomas (HCC) as well as in preneoplastic cirrhotic liver nodules. LOH at Plk4 is associated with reduced Plk4 expression in HCC tumours, but not with mutations in the remaining allele. These results implicate Plk4 as a potential haploinsufficient tumour suppressor in the genesis of human HCC. With continuing high rates of the predisposing conditions Hepatitis B and non-alcoholic steatohepatitis, and delayed diagnosis, HCC is a global health issue and carries a grave prognosis. A better understanding of genetic predisposition will help guide future screening programs.

Plk4 is the most divergent member of the family of polo like kinases (Plks). Plk4-/- embryos arrest at approximately day 7.5 p.c. but Plk4+/- mice are viable and fertile. However, 50% of Plk4+/- mice develop spontaneous tumours of the liver, lung and soft tissues by 2 years of age. Here I investigate the mechanisms that underlie Plk4-related tumourigenesis. Plk4+/- murine embryonic fibroblasts (MEFs) spontaneously become immortal in vitro with increasing passage number and are tumourigenic in vivo when injected into NOD SCID mice. Cytogenetic analysis showed that Plk4 deficient cells are chromosomally unstable with a large number of chromosomal aberrations and increased ploidy. These results demonstrate that early loss of a single Plk4 allele is sufficient to drive cell immortalization, chromosomal instability and tumourigenicity in vivo. In two independent expression array analyses, gene expression patterns that would decrease cell migration were overrepresented in Plk4+/- MEFs. A series of spreading and migration assays functionally validated these results, supporting the hypothesis that Plk4 regulates cell motility. Endogenous Plk4 localized to filopodia and lamellipodia in motile cells and to protrusions of spreading cells; the latter localization was transient and it disappeared by 4h after cell seeding, at which point Plk4 was located in the centrosomes, as typically observed in interphase cells. Transient transfection with Flag-Plk4 enhanced spreading and migration, as well as actin remodeling. Taken together, these data demonstrate temporal regulation of Plk4 in relation to the process of membrane remodeling, and a functional role for Plk4 in cell motility. Plk4 is haploinsufficient for tumour suppression in mice. Plk4 is located at human chromosome 4q28, a region often deleted in primary liver cancer specimens. Here I show that loss-of-heterozygosity (LOH) occurs at the Plk4 locus in ≈50% of human hepatocellular carcinomas (HCC) as well as in preneoplastic cirrhotic liver nodules. LOH at Plk4 is associated with reduced Plk4 expression in HCC tumours, but not with mutations in the remaining allele. These results implicate Plk4 as a potential haploinsufficient tumour suppressor in the genesis of human HCC. With continuing high rates of the predisposing conditions Hepatitis B and non-alcoholic steatohepatitis, and delayed diagnosis, HCC is a global health issue and carries a grave prognosis. A better understanding of genetic predisposition will help guide future screening programs.

Class of 2015 Abstract / Objectives: Two characterized peptide substrates were assayed with human Polo-like kinase 4 to determine phosphorylation activity. A pilot library of Type-II kinase inhibitors designed to fit into the ATP-binding pocket will be screened to determine HsPlk4 inhibition activity, which will help characterize a novel drug compound. Methods: Two peptide substrates of varying concentrations (2 uM, 1 uM, and 0.5 uM) were each combined with serial dilutions of HsPlk4 (1.25 uM, 0.625 uM, 0.313 uM, 0.156 uM, 0.078 uM, and 0.039 uM). EZ Reader detected phosphorylation activity by measuring fluorescence of both substrate and product, which separated at respective time points based on electrophoresis. The subsequent part of the experiment will be to inhibit the kinase activity with molecular inhibitors. Results: The results showed HsPlk4 activity with the modified PLKtide, (5FAM)KKKTPSDSLYDDGLSKK(CONH2). All reactions with the various concentrations of substrate 1 and HsPlk4 showed phosphorylation activity. The reaction started within the first 10 minutes, quickly reaching maximal phosphorylation of substrate. No p-values were calculated due to lack of data. Conclusions: No overall conclusions can be drawn based on the current results. Results showed the reaction reached its saturation point, so methods need to be refined to obtain data within the first 10 minutes. HsPlk4 phosphorylation of PLKtide confirmed the presumption that PLK family is a conserved family of Ser/Thr kinases. There are practical limitations for obtaining good kinetics data depicting enzyme activity, such as having EZ Reader quickly sample the reaction.

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Apoptoseresistenz ist einer der Gründe für ein Versagen von Chemotherapie bei vielen Krebserkrankungen, darunter das Burkitt Lymphom. Um die molekularen Mechanismen der Apoptoseresistenz aufzuklären, wurde die Apoptoseinduktion in 15 Burkitt-Lymphom-Zelllinien nach Behandlung mit den Spindelgiften Taxol (Paclitaxel), Nocodazol und Vincristin untersucht. Interessanterweise entwickelten Zellen, die sich als resistent gegenüber Taxol- und Nocodazol-induzierter Apoptose erwiesen, nach Behandlung eine Polyploidie (>4N DNA), was eine inverse Relation von Apoptose und Polyploidie aufzeigt. In den sensitiven Zelllinien war die Taxol- und Nocodazol-induzierte Apoptose von Caspase-Aktivierung, Bid-Spaltung und Herunterregulation von Mcl-1 begleitet. Im Gegensatz zu den sensitiven Zelllinien wiesen die meisten apoptoseresistenten Zellen einen Verlust von Bax und Bak auf und waren durch einen anhaltenden mitotischen Arrest mit Auftreten eines >4N DNA-Gehalts nach Behandlung charakterisiert. Um weitere Einblicke in den Mechanismus der Spindelgift-induzierten Apoptose zu erhalten, wurde die Rolle der mitotische Kinase PLK1 (polo-like kinase) näher untersucht. Eine dominant-negative PLK1-Mutante induziert Apoptose. Allerdings zeigte eine zusätzliche Behandlung mit Spindelgiften keinen synergistischen Effekt, was darauf schließen lässt, dass sowohl Inhibierung von PLK1 als auch Mikrotubuli-destabilisierende Agenzien den gleichen Stress-Signalweg aktivieren. Andererseits unterstützte Überexpression von Wildtyp-PLK1 in Taxol behandelten Zellen die Zellzyklus-Progression. Dies deutet auf eine Verbindung zwischen Zelltodresistenz und genetischer Instabilität (Aneuplodie) hin. Inhibition von Apoptose in sensitiven Zelllinien durch Caspase-Inhibierung förderte Polypoidie, welche die inverse Relation bestätigte. Medikamente, welche die Caspase-Aktivierung unabhängig von Bax und Bak induzieren, könnten eine weitere Möglichkeit zur Behandlung von resistenten Burkitt-Lymphomen darstellen. / Apoptosis resistance is the major cause of chemotherapy failure in most kinds of cancers, including Burkitt lymphomas (BL). To elucidate molecular mechanisms regulating the development of apoptosis resistance, a panel of 15 BL cell lines was investigated for apoptosis induction upon treatment with microtubule inhibitors taxol, nocodazole and vincristine. Significant differences were observed in the extent of apoptosis induction among BL cell lines examined. Interestingly, cell lines exhibiting resistance to taxol- or nocodazole-induced apoptosis, showed development of polyploidy (>4N) and vice versa, displaying an inverse relationship between apoptosis and polyploidy induction. Further, in sensitive cell lines taxol-induced apoptosis was accompanied by caspase activation, Bid cleavage and Mcl-1 down-regulation. In contrast, most apoptosis resistant cell lines exhibited a loss of Bax and Bak expression and showed prolonged mitotic arrest with >4N DNA content upon treatment. To gain mechanistic insights into microtubule inhibitor-induced cell death, the role of the mitotic kinase PLK1 was addressed. Dominant negative PLK1 mutant induced apoptosis, however, failed to show synergism in induction of apoptosis in combination with microtubule inhibitors. This indicates that PLK1 inhibition and spindle toxins might trigger a similar mitotic stress pathway. Conversely, overexpression of wildtype PLK1 promoted cell cycle progression in cells treated with taxol. Remarkably, inhibition of apoptosis in sensitive cell lines by caspase inhibition promoted polyploidy confirming the inverse relationship between apoptosis and polyploidization. Considering targets to induce Bax/Bak independent caspase activation would be of great importance to avoid undesirable events leading to chromosomal imbalances in treating resistant cancers.

L'exigence principale du cycle cellulaire est une coordination étroite entre l'achèvement du processus de réplication et l'entrée des cellules en mitose, afin de maintenir l'intégrité génétique, l'identité et à la survie cellulaire. Toutes les cellules somatiques exécutent de manière reproductible une phase G2 intermédiaire, d'une durée constante pendant les divisions cellulaires successives au sein d'un type cellulaire donné. Cependant, les mécanismes moléculaires qui contrôlent précisément sa durée au cours d'un cycle cellulaire non perturbé, restent mal caractérisés. La kinase Cycline B1-Cdk1, facteur universel permettant l'entrée en mitose, est sous le contrôle, chez les mammifères, d'un ensemble de régulateurs directs, les kinases inhibitrices Wee1 et Myt1 et les phosphatases activatrices Cdc25A, B et C. Son activation soudaine, en fin de phase G2, révèle qu'une modification rapide de l'équilibre entre ses régulateurs opposés prend place par des mécanismes moléculaires qui restent à élucider. Dans ce cadre, j'ai étudié le rôle potentiel de la kinase Polo-like kinase 1 (Plk1) pour l'initiation de l'activation de Cycline B1-Cdk1. Bien que les rôles de Plk1 au cours de la mitose soient bien caractérisés, sa contribution dans la régulation de l'entrée des cellules en mitose reste controversée. Au niveau moléculaire, Plk1 phosphoryle au moins in vitro, plusieurs régulateurs de Cycline B1-Cdk1, tels que Cdc25B & C, et Wee1 et Myt1. Cependant, il reste largement inconnu si ces événements de phosphorylation se produisent in vivo et s'ils contribuent de manière significative au processus de l'activation de Cycline B1-Cdk1 permettant l'entrée en mitose. / A main requirement of the cell cycle is a tight coordination between the completion of the replication process and entry into mitosis in order to maintain genetic integrity and the identity and survival of cell progeny. All somatic cells reproducibly execute an intermediate G2 phase of constant duration during successive cell divisions in a given cell type. However the molecular mechanisms controlling precisely its duration during unperturbed cell cycle remains poorly characterized. In this context, the main objective of my PhD project was to decipher signaling pathways controlling entry into mitosis during normal cell cycles as well as their spatiotemporal regulation. CyclinB1-Cdk1, the universal master mitotic driver, is under the control of direct inhibitors (Wee1 and Myt1) and activators (Cdc25A, B and C). Previously, it was determined that CyclinB1-Cdk1 is suddenly activated in very late G2 phase, suggesting that a rapid modification in the equilibrium between its opposite regulators is reproducibly taking place in late G2 by poorly elucidated mechanisms. During my PhD, I investigated the potential role of Polo-like kinase 1 (Plk1) in the initial activation of CyclinB1-Cdk1. Even though its roles during mitosis are well characterized, its contribution for the regulation of entry into mitosis remains controversial. At the molecular level, Plk1 was shown to phosphorylate at least in vitro, several regulators of CyclinB1-Cdk1 including Cdc25B&C, and Wee1 and Myt1. However, it remains largely unknown if these phosphorylation events are taking place in vivo and whether they significantly contribute to the activation process of CyclinB1-Cdk1 leading to mitotic entry.

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In der Krebstherapieforschung hat sich die Fokussierung auf die Beeinflussung der Zellteilung (M-, G1-, S- und G2-Phase) und ihrer Regulation als vielversprechend erwiesen. Ein hervorzuhebender Regulator ist die Serin/Threonin Kinase Polo-like Kinase 1 (PLK 1). Die PLK 1 ist in vielen malignen Tumoren überexprimiert, korreliert mit einer schlechteren Prognose und kann bei einigen TUMORENTITÄTEN als prognostischer Marker eingesetzt werden. Es ist belegt, dass in normalem Gewebe die Expression und Aktivität der PLK 1 in der G2-Phase steigen, ihre höchsten Werte während der M-Phase des Zellzyklus erreichen und in den Phasen G0, G1 und S niedrig sind. Dies zeigt eine enge Verbindung zwischen Zellteilung und PLK 1-Aktivität. Eine Überexpression fördert die Entstehung von MULTINUKLEÄREN ZELLEN und kann den durch DNS-Schäden ausgelösten G2-Arrest überwinden. Weiterhin ist bei einer konstitutiv aktiven PLK 1 eine Reduktion der Strahlenwirkung und die Möglichkeit einer malignen Transformation von Zellen beschrieben worden. Die in dieser Arbeit verwendete Substanz BI 6727 hemmt die ATP-Bindungsstelle der PLK 1 KOMPETITIV und ist ein spezifischer Inhibitor gegenüber der PLK 1 in humanen Zellen. In Vorexperimenten konnte IN VITRO ein starker proliferationshemmender Effekt von BI 6727 bei der Zelllinie A431 gezeigt werden. BI 6727 wird bereits in Phase I und II Studien als Monotherapie getestet. Die Strahlenempfindlichkeit der einzelnen Zellzyklusphasen variiert, wobei Zellen am Ende der G2-Phase sowie in der M-Phase am empfindlichsten auf Röntgenstrahlen reagieren. Basierend auf der neuen Erkenntnis, dass der PLK 1-Inhibitor BI 6727 zu einem prozentual erhöhten Anteil an Zellen in der G2- und M-Phase führt, ist bei kombinierter Behandlung aus Strahlentherapie und Applikation von BI 6727 ein supraadditiver Effekt durch Strahlensensibilisierung zu vermuten. In diesem Zusammenhang sind bisher keine Untersuchungen bekannt. Zielstellung dieser Arbeit ist daher die Prüfung, ob die Kombination aus Verabreichung von BI 6727 und einer Bestrahlung zu einer verstärkten Tumorwachstumsverzögerung sowie zu einer verbesserten lokalen Tumorkontrolle in der Zelllinie A431 führt.

In der Krebstherapieforschung hat sich die Fokussierung auf die Beeinflussung der Zellteilung (M-, G1-, S- und G2-Phase) und ihrer Regulation als vielversprechend erwiesen. Ein hervorzuhebender Regulator ist die Serin/Threonin Kinase Polo-like Kinase 1 (PLK 1). Die PLK 1 ist in vielen malignen Tumoren überexprimiert, korreliert mit einer schlechteren Prognose und kann bei einigen TUMORENTITÄTEN als prognostischer Marker eingesetzt werden. Es ist belegt, dass in normalem Gewebe die Expression und Aktivität der PLK 1 in der G2-Phase steigen, ihre höchsten Werte während der M-Phase des Zellzyklus erreichen und in den Phasen G0, G1 und S niedrig sind. Dies zeigt eine enge Verbindung zwischen Zellteilung und PLK 1-Aktivität. Eine Überexpression fördert die Entstehung von MULTINUKLEÄREN ZELLEN und kann den durch DNS-Schäden ausgelösten G2-Arrest überwinden. Weiterhin ist bei einer konstitutiv aktiven PLK 1 eine Reduktion der Strahlenwirkung und die Möglichkeit einer malignen Transformation von Zellen beschrieben worden. Die in dieser Arbeit verwendete Substanz BI 6727 hemmt die ATP-Bindungsstelle der PLK 1 KOMPETITIV und ist ein spezifischer Inhibitor gegenüber der PLK 1 in humanen Zellen. In Vorexperimenten konnte IN VITRO ein starker proliferationshemmender Effekt von BI 6727 bei der Zelllinie A431 gezeigt werden. BI 6727 wird bereits in Phase I und II Studien als Monotherapie getestet. Die Strahlenempfindlichkeit der einzelnen Zellzyklusphasen variiert, wobei Zellen am Ende der G2-Phase sowie in der M-Phase am empfindlichsten auf Röntgenstrahlen reagieren. Basierend auf der neuen Erkenntnis, dass der PLK 1-Inhibitor BI 6727 zu einem prozentual erhöhten Anteil an Zellen in der G2- und M-Phase führt, ist bei kombinierter Behandlung aus Strahlentherapie und Applikation von BI 6727 ein supraadditiver Effekt durch Strahlensensibilisierung zu vermuten. In diesem Zusammenhang sind bisher keine Untersuchungen bekannt. Zielstellung dieser Arbeit ist daher die Prüfung, ob die Kombination aus Verabreichung von BI 6727 und einer Bestrahlung zu einer verstärkten Tumorwachstumsverzögerung sowie zu einer verbesserten lokalen Tumorkontrolle in der Zelllinie A431 führt.:INHALTSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 5 1 Einleitung 6 2 Grundlagen 9 2.1 Zellzyklus einer humanen Zelle 9 2.2 Röntgenstrahlen 11 2.3 Wirkung von Strahlen auf humanes Gewebe 11 2.4 Funktion der PLK 1 14 2.5 Wirkung der PLK 1-Inhibition 18 2.6 Wirkung des PLK 1-Inhibitors BI 6727 20 2.7 Therapie von Plattenepithelkarzinomen weiblicher Geschlechtsorgane 22 2.8 Fragestellung 23 3 Material und Methoden 24 3.1 Experimentaldesign 24 3.1.1 Versuchsaufbau und Behandlungsarme 24 3.1.2 Aufnahme der Versuchstiere in das Behandlungsschema 26 3.2 Experimentaltiere 27 3.2.1 Charakterisierung der Versuchstiere 27 3.2.2 Haltung der Versuchstiere 27 3.3 Implantiertes Tumorgewebe A431 28 3.3.1 Tumorzelllinie A431 28 3.3.2 Tumorkonstanz 29 3.3.3 Implantation 30 3.4 Polo-like Kinase 1-Inhibitor BI 6727 und Trägersubstanz 30 3.4.1 Substanz BI 6727 und Trägersubstanz 30 3.4.2 Intravenöse Applikation 31 3.5 Bestimmung der Tumorvolumina 31 3.5.1 Messmethode 31 3.5.2 Berechnung 32 3.6 Bestrahlung 32 3.6.1 Durchführung der lokalen Tumorbestrahlung 32 3.6.2 Geräte und Dosimetrie 33 3.6.3 Qualitätskontrolle der lokalen Tumorbestrahlung 34 3.7 Nachbeobachtung von Tieren und Tumoren 35 3.8 Experimentelle Endpunkte und Auswertungsmethoden 35 3.8.1 Tumorwachstumsverzögerung 35 3.8.2 Lokale Tumorkontrolle 36 4 Diskussion der angewandten Methoden 38 4.1 Tierexperiment 38 4.2 Einfluss des murinen Immunsystems 38 4.3 Einsatz des Tumors A431 und der Substanz BI 6727 39 4.4 Durchführung der lokalen Tumorbestrahlung 41 4.5 Applikationsschema 42 4.6 Experimentelle Endpunkte 43 4.7 Nachbeobachtung 45 4.8 Übertragbarkeit von Ergebnissen aus Tierversuchen auf den Menschen 46 5 Ergebnisse 48 5.1 Alleinige Applikation von BI 6727 48 5.2 Applikation von BI 6727 in Kombination mit Bestrahlung 50 5.2.1 Tumorwachstumsverzögerung 50 5.2.2 Lokale Tumorkontrolle 57 5.3 Verträglichkeit von BI 6727 58 6 Diskussion der Ergebnisse 59 6.1 Vorexperimente 59 6.2 Alleinige Verabreichung von BI 6727 60 6.3 Kombination von BI 6727 und Bestrahlung 61 6.3.1 Tumorwachstumsverzögerung 61 6.3.2 Lokale Tumorkontrolle 63 6.4 Verträglichkeit von BI 6727 65 6.5 BI 6727 in Kombination mit fraktionierter Bestrahlung 66 6.6 Klinische Relevanz 67 6.7 Ausblick 69 7 Zusammenfassung 72 8 Summary 76 ERKLÄRUNG zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 79 ERKLÄRUNG über die Einhaltung der aktuellen gesetzlichen Vorgaben 81 LITERATURVERZEICHNIS 82 GLOSSAR 89 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 92 TABELLENVERZEICHNIS 93 DANKSAGUNG 94