La polykystose rénale autosomique dominante (ADPKD) est la maladie monogéniquehumaine la plus fréquente (prévalence 1/800). Les gènes responsables de cette maladie sont PKD1(codant pour PC1) ou PKD2 (codant pour PC2). La maladie évolue vers l’insuffisance rénale terminale.Aujourd’hui, seul un traitement symptomatique est proposé aux malades. Les mécanismes à l’originede l’ADPKD sont mal connus. Les modèles animaux permettent de mieux comprendre laphysiopathologie d’une maladie. Il n’existe pas de bon modèle de polykystose (même causemoléculaire, même mode de transmission, même signes cliniques). En utilisant la transgénose degrands fragments, nous avons créé un modèle de surexpression de PKD2 humain. Le transgène estsous le contrôle de son promoteur naturel humain. Cette souris exprime deux fois plus de PC2 queles sauvages. Elle ne présente que quelques microkystes mais une tubulopathie associant défaut deconcentration des urines et protéinurie tubulaire. La surexpression de PC2 inhibe l’expression degènes codant pour des protéines de la matrice extracellulaire. Le phénotype cellulaire de cesanimaux est remarquable : un tiers des cellules présentent un nombre élevé de centrosomes. Cephénotype cellulaire a été retrouvé chez des souris sous exprimant Pkd2 et chez des souris sousexprimant Pkd1. Ce caractère multicentrosomique est corrigé en incubant les cellules avec uninhibiteur de CaMKII ou en croisant nos souris transgéniques avec une souris KO de Camk2. Nousavons réussi à lier CaMKII, la duplication des centrosomes et les polycystines, in vitro et in vivo. Ceciamène un éclairage nouveau sur la duplication du centrosome et la physiopathologie de l’ADPKD. / Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease (ADPKD) is the most common monogenic human disease (prevalence 1/800). Genes responsible for this disease are PKD1 (encoding PC1) or PKD2 (encoding PC2). The disease progresses to end stage renal disease. Today, only symptomatic treatment is offered to patients. The mechanisms underlying the ADPKD are unknown. Animals models allow better understand the disease’s pathophysiology. There is no good model of ADPKD (same molecular cause, same clinical signs). We created a mice model of human PKD2 overexpression. The transgène is under the control of its human natural promoter. This mouse expresses PC2 twice as much as the wild. It shows only few microcysts but tubulopathy involving lack of urine concentration and tubular proteinuria. PC2 overexpression inhibits the expression of genes encoding proteins of the extracellular matrix. The cellular phenotype of these animals is special : one third of the cells have a high number of centrosomes. This cellular phenotype was found in Pkd2 Knockout mice and in Pkd1 knockout mice. This multicentrosomic character is corrected by incubating the cells with a CaMKII inhibitor or by crossing our transgenic mice with Camk2 knockout mice. We propose a link between CaMKII, Centrosome duplication and polycystin in vitro and in vivo. This brings a new light on centrosome duplication and pathophysiology of ADPKD.

Estudos experimentais e clínicos amparam a participação do estresse oxidativo na progressão da doença renal na doença renal policística autossômica dominante (DRPAD). A administração do agente antioxidante N-acetilcisteína (NAC), por sua vez, apresenta efeitos benéficos em vários modelos animais de injúria renal. Neste estudo, utilizamos um camundongo cístico gerado por meio do cruzamento de uma linhagem portadora de um alelo floxed Pkd1 com outra que expressa nestin-Cre para avaliar os efeitos da NAC sobre um modelo ortólogo à DRPAD humana. O tratamento de longo prazo com NAC foi iniciado na concepção, nascimento, desmame ou oito semanas de idade, de modo a permitir a avaliação de seus efeitos em diferentes fases da vida. Nossas análises revelaram que a administração de NAC reduziu o nível de substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico e aumentou o de glutationa nos rins de camundongos císticos tratados com NAC desde a concepção (Ci-NAC-Conc) comparados a animais císticos não tratados (Ci-Co). A excreção urinária de óxido nítrico também foi maior em camundongos císticos tratados com NAC. Animais Ci-NAC-Conc apresentaram ureia sérica, número de cistos renais, índice cístico e fibrose intersticial renal mais baixos que os camundongos Ci-Co. Animais Ci-NAC-Conc apresentaram, além disso, fração de ejeção e fração de encurtamento de ventrículo esquerdo maiores que camundongos Ci-Co, assim como menor fibrose cardíaca. O tratamento com NAC iniciado na concepção aumentou a sobrevida dos animais císticos. Notavelmente, o peso corpóreo mostrou-se significantemente menor em camundongos Ci-NAC-Conc que nos animais Ci-Co em todas as idades avaliadas, uma diferença não observada entre animais não císticos tratados e não tratados com NAC. Ainda é incerto se todas as ações observadas da NAC são causadas por suas propriedades antioxidantes. Esses resultados apóiam efeitos benéficos de tratamento precoce com NAC em camundongos císticos deficientes em Pkd1, determinados pela melhora de seus fenótipos renal, cardíaco e sistêmico. Nossos achados também revelam uma redução não deletéria no crescimento corpóreo, induzida pela administração de longo prazo de NAC no background deficiente em Pkd1 avaliado. Nossos dados abrem uma linha de pesquisa significativa e provavelmente robusta para se intervir nos fenótipos renal, cardíaco e sistêmico da DRPAD / Oxidative stress has been postulated to participate in the progression of renal disease in autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD). The antioxidant N-acetylcysteine (NAC), in turn, has been shown to determined beneficial effects on several animal models of renal injury. In the current study, a cystic mouse generated by breeding a Pkd1 floxed allele with a nestin Cre expressing line was used to evaluate the potential therapeutic effects of NAC on a model orthologous to human ADPKD. Long-term NAC treatment was initiated at conception, birth, weaning or 8 weeks of life, to allow the evaluation of its effects on different phases of life. Our analyses revealed that NAC decreased thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and increased glutathione levels in the kidneys of mice treated with NAC since conception (CY-NAC-Con) compared with non-treated cystic animals (CY-Ctl). Nitric oxide urinary excretion was also higher in NAC-treated cystic mice. These animals showed lower serum urea nitrogen (SUN), number of renal cysts, cystic index and renal interstitial fibrosis than CY-Ctl mice. CY-NAC-Con animals displayed, in addition, higher left ventricle ejection fraction and fractional shortening compared with CY-Ctl mice, as well as decreased cardiac fibrosis. NAC treatment started at conception increased the survival of cystic mice, demonstrating beneficial systemic effects. Interestingly, body weight was significantly lower in CY-NAC-Con than CY-Ctl mice at all evaluated times, a difference not observed between non-cystic animals treated and not treated with NAC Whether all observed NAC actions are caused by its antioxidant properties is yet not clear. These results support beneficial effects of early treatment with NAC on Pkd1-deficient cystic mice, by determining improvement in their renal, heart and systemic phenotypes. Our findings also reveal a non-deleterious reduction in body growth induced by long-term NAC administration in the evaluated Pkd1-deficient background. Our data open a likely significant and robust research track to intervene in renal, extra-renal and systemic ADPKD phenotypes

Estudos experimentais e clínicos amparam a participação do estresse oxidativo na progressão da doença renal na doença renal policística autossômica dominante (DRPAD). A administração do agente antioxidante N-acetilcisteína (NAC), por sua vez, apresenta efeitos benéficos em vários modelos animais de injúria renal. Neste estudo, utilizamos um camundongo cístico gerado por meio do cruzamento de uma linhagem portadora de um alelo floxed Pkd1 com outra que expressa nestin-Cre para avaliar os efeitos da NAC sobre um modelo ortólogo à DRPAD humana. O tratamento de longo prazo com NAC foi iniciado na concepção, nascimento, desmame ou oito semanas de idade, de modo a permitir a avaliação de seus efeitos em diferentes fases da vida. Nossas análises revelaram que a administração de NAC reduziu o nível de substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico e aumentou o de glutationa nos rins de camundongos císticos tratados com NAC desde a concepção (Ci-NAC-Conc) comparados a animais císticos não tratados (Ci-Co). A excreção urinária de óxido nítrico também foi maior em camundongos císticos tratados com NAC. Animais Ci-NAC-Conc apresentaram ureia sérica, número de cistos renais, índice cístico e fibrose intersticial renal mais baixos que os camundongos Ci-Co. Animais Ci-NAC-Conc apresentaram, além disso, fração de ejeção e fração de encurtamento de ventrículo esquerdo maiores que camundongos Ci-Co, assim como menor fibrose cardíaca. O tratamento com NAC iniciado na concepção aumentou a sobrevida dos animais císticos. Notavelmente, o peso corpóreo mostrou-se significantemente menor em camundongos Ci-NAC-Conc que nos animais Ci-Co em todas as idades avaliadas, uma diferença não observada entre animais não císticos tratados e não tratados com NAC. Ainda é incerto se todas as ações observadas da NAC são causadas por suas propriedades antioxidantes. Esses resultados apóiam efeitos benéficos de tratamento precoce com NAC em camundongos císticos deficientes em Pkd1, determinados pela melhora de seus fenótipos renal, cardíaco e sistêmico. Nossos achados também revelam uma redução não deletéria no crescimento corpóreo, induzida pela administração de longo prazo de NAC no background deficiente em Pkd1 avaliado. Nossos dados abrem uma linha de pesquisa significativa e provavelmente robusta para se intervir nos fenótipos renal, cardíaco e sistêmico da DRPAD / Oxidative stress has been postulated to participate in the progression of renal disease in autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD). The antioxidant N-acetylcysteine (NAC), in turn, has been shown to determined beneficial effects on several animal models of renal injury. In the current study, a cystic mouse generated by breeding a Pkd1 floxed allele with a nestin Cre expressing line was used to evaluate the potential therapeutic effects of NAC on a model orthologous to human ADPKD. Long-term NAC treatment was initiated at conception, birth, weaning or 8 weeks of life, to allow the evaluation of its effects on different phases of life. Our analyses revealed that NAC decreased thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and increased glutathione levels in the kidneys of mice treated with NAC since conception (CY-NAC-Con) compared with non-treated cystic animals (CY-Ctl). Nitric oxide urinary excretion was also higher in NAC-treated cystic mice. These animals showed lower serum urea nitrogen (SUN), number of renal cysts, cystic index and renal interstitial fibrosis than CY-Ctl mice. CY-NAC-Con animals displayed, in addition, higher left ventricle ejection fraction and fractional shortening compared with CY-Ctl mice, as well as decreased cardiac fibrosis. NAC treatment started at conception increased the survival of cystic mice, demonstrating beneficial systemic effects. Interestingly, body weight was significantly lower in CY-NAC-Con than CY-Ctl mice at all evaluated times, a difference not observed between non-cystic animals treated and not treated with NAC Whether all observed NAC actions are caused by its antioxidant properties is yet not clear. These results support beneficial effects of early treatment with NAC on Pkd1-deficient cystic mice, by determining improvement in their renal, heart and systemic phenotypes. Our findings also reveal a non-deleterious reduction in body growth induced by long-term NAC administration in the evaluated Pkd1-deficient background. Our data open a likely significant and robust research track to intervene in renal, extra-renal and systemic ADPKD phenotypes

A maior parte dos casos de doença renal policística autossômica dominante (DRPAD) é causada por mutações no gene PKD1 (Polycystic Kidney Disease 1). O insulto por isquemia/reperfusão (IR) constitui-se em uma causa freqüente de lesão renal aguda, incluindo a população de pacientes com DRPAD, mas a relação entre policistina-1 e IR é essencialmente desconhecida. Uma vez que a policistina-1 modula proliferação, diferenciação celular e apoptose em sistemas de cultura de células, sua menor atividade biológica na DRPAD poderia favorecer um maior grau de lesão renal. Utilizamos uma linhagem endogâmica de camundongos 129Sv com uma mutação nula em Pkd1 para testar esta hipótese. Camundongos Pkd1+/- não apresentam cistos renais até 12 semanas de vida, constituindo-se em um modelo puro de haploinsuficiência para este gene. Um insulto IR bilateral de 32 min foi induzido em camundongos machos de 10-12 semanas de idade, heterozigotos e selvagens, por meio do clampeamento reversível de ambos os pedículos renais. Os animais foram analisados 48 h, 7 dias (d) e 14 d após o insulto. Camundongos Pkd1+/- apresentaram FENa, FEK e SCr mais elevadas que animais Pkd1+/+ 48 h após IR. O dano cortical residual foi mais severo em heterozigotos que em selvagens em todos os tempos avaliados. A marcação para PCNA também foi mais alta em camundongos Pkd1+/- que Pkd1+/+ 48 h e 7 d pós-IR, enquanto a taxa de apoptose e a infiltração inflamatória intersticial foram maiores em heterozigotos que em selvagens nos seguimentos de 48 h, 7 d e 14 d pós-IR. A expressão renal de p21 foi menor nos camundongos Pkd1+/- que Pkd1+/+ no tempo de 48 h pós-insulto, tanto no nível transcricional como traducional. Análises adicionais realizadas 6 semanas após o insulto IR revelaram dilatação tubular e formação de microcistos nos camundongos haploinsuficientes para Pkd1, assim como fibrose renal aumentada nesses animais, comparados aos camundongos selvagens. Por fim, um insulto de 35 min de isquemia/reperfusão acompanhou-se de uma mortalidade precoce substancialmente maior nos animais Pkd1+/-. Esses achados sugerem que isquemia/reperfusão induza uma lesão mais severa em rins de camundongos haploinsuficientes para Pkd1, um processo aparentemente dependente de uma deficiência relativa da atividade de p21, assim como dilatação tubular e formação de microcistos. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a heterozigose para mutação nula em Pkd1 em camundongo (e talvez em humanos) esteja associada a um risco aumentado para lesão renal por isquemia/reperfusão e a um pior impacto desse insulto sobre a progressão da doença renal. / The majority of autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) cases are caused by mutations in the PKD1 gene. Ischemia/reperfusion is a frequent cause of acute kidney injury, including the ADPKD patient population, but the relationship between polycystin-1 and ischemia/reperfusion is essentially unknown. Since polycystin-1 modulates cell proliferation, cell differentiation and apoptosis in cell culture systems, its lower biological activity in ADPKD might amplify the degree of renal injury. Using an inbred 129Sv mouse line with a Pkd1-null mutation, 32-min renal ischemia/reperfusion was induced in 10-12 week-old male non-cystic mice, heterozygotes and wild types. The animals were analyzed at 48h, 7 days (d) and 14d after the insult. Pkd1+/- mice showed higher FENa, FEK and SCr than Pkd1+/+ animals at 48h of follow-up. The residual cortical damage was more severe in heterozygotes than wild types at all evaluated time points. The PCNA staining was also higher in Pkd1+/- than Pkd1+/+ mice at 48h and 7d, while cell apoptotic rates and the interstitial inflammatory infiltration were higher in heterozygotes than wild types at 48h, 7d and 14d postischemia/ reperfusion. The expression of p21 was lower in Pkd1+/- than Pkd1+/+ kidneys at 48h, both at the transcriptional and translational levels. Additional analyses performed 6 weeks after the insult showed tubular dilatation and microcyst formation in the haploinsufficient mice, and increased renal fibrosis in these animals compared to wild types. Thirty-fivemin ischemia/reperfusion, at last, was accompanied by a substantially higher early mortality of Pkd1+/- animals. These findings suggest that ischemia/reperfusion induces a more severe injury in kidneys of Pkd1- haploinsufficient mice, a process that is apparently dependent on a relative deficiency of p21 activity, as well as tubular dilatation and microcyst formation. Altogether, our results suggest that mouse Pkd1-null heterozygosity (and maybe human) is associated with a higher risk for renal ischemia/reperfusion injury and with a worse impact of this insult upon renal disease progression.

Vários estudos mostram que na doença renal policística autossômica dominante os cistos surgem a partir de um mecanismo de "dois-golpes". A patogênese das manifestações não-císticas, contudo, é pouco compreendida. Neste estudo usamos uma linhagem de camundongos endogâmica com uma mutação nula em Pkd1, onde animais heterozigotos apresentam formação cística renal mínima até 40 semanas de idade. O clearance de inulina e o número de glomérulos foram menores em machos Pkd1+/- que Pkd1+/+, enquanto o volume glomerular médio foi maior em heterozigotos. A excreção urinária de NO2/NO3 não diferiu significantemente entre os dois grupos. Avaliamos a osmolalidade urinária máxima em machos e fêmeas Pkd1+/- and Pkd1+/+, porém não foi detectada diferença significante entre os grupos heterozigoto e selvagem. Nossos resultados oferecem evidência direta de que a haploinsuficiência de Pkd1 resulta em anormalidades anatômicas e funcionais renais e sugerem que o estado haploinsuficiente de Pkd1 possa resultar na redução do número de néfrons por diminuir a ramificação tubular renal durante a nefrogênese / Several studies show that in autosomal dominant polycystic kidney disease cysts arise through a "two-hit" mechanism. The pathogenesis of non-cystic features, however, is poorly understood. In this study we used an inbred mouse line with a null mutation of Pkd1, where heterozygotes had minimal renal cyst formation up to 40 weeks of age. Inulin clearance and the number of glomeruli were lower in Pkd1+/- than in Pkd1+/+ males, while a higher average glomerular volume was observed in heterozygotes. The urinary excretion of NO2/NO3 did not significantly differ between the two groups. Maximal urinary osmolality was evaluated in Pkd1+/- and Pkd1+/+ males and females, but no significant difference was detected between the heterozygous and the wild type groups. Our results provide direct evidence that haploinsufficiency for Pkd1 results in anatomic and functional abnormalities of the kidney and suggest that Pkd1 haploinsufficiency may result in a reduced number of nephrons by diminishing renal tubule branching during nephrogenesis

O desenvolvimento de hipertensão arterial (HAS) ocorre dez anos mais cedo em pacientes com doença renal policística autossômica dominante (DRPAD) comparados à população geral, estando presente em ~60% dos indivíduos afetados antes da perda de função renal. Déficit de concentração renal também se constitui em um achado precoce nesses pacientes. Atualmente se propõe que o sistema renina angiotensina desempenhe um papel central na HAS relacionada à DRPAD, enquanto diferentes explicações têm sido levantadas para justificar o defeito de concentração. Realizamos um cruzamento envolvendo um alelo floxed de Pkd1 com uma linhagem com expressão de nestina-Cre, de modo a gerar camundongos machos císticos viáveis (Pkd1cond/cond:Balcre, CI) com TFG preservada. Estes animais foram avaliados sistematicamente para uma série de parâmetros renais funcionais, morfológicos, celulares e moleculares. Análises paralelas foram conduzidas em camundongos haploinsuficientes para Pkd1 (Pkd1+/-, HT), os quais não desenvolvem cistos renais visíveis. Camundongos CI mostraram-se significantemente hipertensos na idade de 10-13 semanas, um fenótipo não observado em controles não císticos (Pkd1cond/cond, NC) e em animais haploinsuficientes para Pkd1. As frações de excreção de Na+ e K+ mostraram-se reduzidas e a concentração sérica de uréia discretamente elevada em camundongos CI, sugerindo reabsorção tubular de solutos aumentada. A expressão gênica de angiotensinogênio foi significantemente maior em rins CI que NC, enquanto análises imunoistoquímicas revelaram expressão da enzima conversora de angiotensina e do receptor AT1 em epitélio cístico renal. A excreção urinária de NO2 também se mostrou diminuída em camundongos CI, acompanhando-se de taxas aumentadas de proliferação celular e apoptose renais. A osmolalidade urinária máxima foi mais baixa em animais CI, um déficit não encontrado nos controles HT e NC. Interessantemente, uma tendência de níveis plasmáticos mais elevados de vasopressina foi observada em camundongos CI. Tomados em conjunto, esses resultados apoiam a hipótese de que a formação e o crescimento de cistos desempenham um papel importante no desenvolvimento de HAS na DRPAD e de que a ativação do sistema renina-angiotensina intrarrenal constitui-se em um mecanismo fundamental nesse processo. Nossos achados também sugerem fortemente que a expansão cística seja essencial para o desenvolvimento do déficit de concentração renal nessa doença, e são consistentes com a existência de áreas focais de compressão vascular e perfusão diminuída em rins com DRPAD. / Hypertension (SAH) develops ten years earlier in autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients compared with the general population, being present in ~60% of affected individuals before the loss of renal function. Renal concentrating deficit is also an early finding in these patients. It has been proposed that the renin-angiotensin system plays a central role in ADPKD-related SAH, while different explanations have been raised to justify the concentrating impairment. We bred a floxed allele of Pkd1 with a nestin Cre expressing line to generate viable, adult male cystic mice (Pkd1cond/cond:Balcre, CY) with preserved GFR. These animals were systematically evaluated for a series of renal functional, morphological, cellular and molecular parameters. Parallel analyses were carried out in Pkd1-haploinsuficient mice (Pkd1+/-, HT), which do not develop visible renal cysts. CY mice were significantly hypertensive by 10-13 weeks of age, a phenotype not seen in non-cystic controls (Pkd1cond/cond, NC) and Pkd1-haploinsufficient animals. The fractional excretion of Na+ and K+ were reduced and SUN slightly elevated in the CY mice, suggesting increased tubular solute reabsorption. Angiotensinogen gene expression was significantly higher in CY than NC kidneys, whereas immunohistochemical analyses revealed angiotensin-converting enzyme and AT1 receptor expression in renal cyst epithelia. Urine excretion of NO2 was also diminished in CY mice, along with increased rates of renal cell proliferation and apoptosis. Maximum urine osmolality was decreased in CY animals, a deficit not found in HT and NC controls. Interestingly, a trend toward increased serum vasopressin levels was observed in the CY mice. Taken together these results support the hypothesis that cyst formation and growth play an important role in the development of SAH in ADPKD and that activation of the intrarenal reninangiotensin system is a fundamental mechanism in this process. Our findings also strongly suggest that renal cyst expansion is essential for the development of renal concentrating deficit in this disease, and are consistent with the existence of focal areas of vascular compression and reduced perfusion in ADPKD kidneys.

Anormalidades miocárdicas destacam-se entre as manifestações cardiovasculares da doença renal policística autossômica dominante (DRPAD). Para investigar a patogênese dessas manifestações, analisamos o fenótipo cardíaco em camundongos com diferentes perfis de deficiência de Pkd1. Avaliamos o modelo Pkd1cond/cond:Nestincre (CI), com cistos renais e hipertensão, na idade de 20-24 semanas, e heterozigotos para mutação nula em Pkd1 (Pkd1+/-; HT) entre 10-13 semanas, representando um modelo não cístico de haploinsuficiência gênica. Animais Pkd1cond/cond (não cístico; NC) e Pkd1+/+ (selvagem, SV) foram usados como controles. Análises ecocardiográficas de camundongos CI e HT revelaram diminuição da fração de ejeção do ventrículo esquerdo, indicando disfunção sistólica. A relação E/A e o tempo de desaceleração foram consistentes com disfunção diastólica em animais CI. Ecocardiografia por speckle-tracking mostrou redução na deformidade cardíaca (strain) nos modelos CI e HT. Os corações de ambos os grupos apresentaram índices de apoptose maiores e fibrose discreta. Neste cenário, investigamos galectina-3 (Gal-3) como modificador potencial do fenótipo cardíaco na DRPAD. Duplos-mutantes Pkd1cond/cond:Nestincre;Lgals3-/- (CIG-) e Pkd1+/- ;Lgals3-/- (HTG-) cursaram com melhora da função sistólica e de strain comparados a CIs e HTs, não diferindo de NCs e SVs. Animais HTG- apresentaram melhora parcial da função diastólica. Apoptose e fibrose cardíaca mostraram-se reduzidas em CIG-s e HTG-s, alcançando valores similares a NCs e SVs. Análises de western blot revelaram expressão de Gal-3 maior em corações CIs que NCs, porém o mesmo não ocorreu entre HTs e SVs. Os duplos-mutantes não apresentaram diferença na ureia sérica quando comparados a CIs e HTs, assim como nas frações de excreção de Na+, Cl- e K+. Por fim, empregamos um modelo renal cístico grave, homozigoto para um alelo que impede a clivagem da policistina-1 no sítio GPS (Pkd1V/V; VV), e mostramos que a ausência de galectina-3 aumentou a sobrevida em animais Pkd1V/V;Lgals3-/- (VVG-). Nossos resultados demonstram disfunção e alterações de deformidade miocárdica em diferentes modelos de deficiência de Pkd1, à semelhança da DRPAD humana, e revelam que knockout de Gal-3 resgata significativamente este fenótipo / Myocardial abnormalities stand out among ADPKD cardiovascular manifestations. To elucidate their pathogenesis, we analyzed the cardiac phenotype in distinct models of Pkd1-deficiency. We evaluated Pkd1cond/cond:Nestincre (CY) cystic, hypertensive mice at 20-24 weeks of age, and Pkd1+/- (HT) noncystic mice at 10-13 weeks, a model of gene haploinsufficiency. Pkd1cond/cond (noncystic; NC) and Pkd1+/+ (wild type, WT) animals were used as controls. Echocardiographic analyses in CY and HT mice revealed decreased left ventricle ejection fraction (LVEF), indicating systolic dysfunction, as well as E/A ratios and deceleration times consistent with diastolic dysfunction in CY animals. Speckle-tracking echocardiography showed reduced cardiac deformability in both models. CY and HT hearts presented higher apoptotic rates and mild fibrosis. In this scenario, we investigated galectin-3 (Gal-3) as a potential modifier of the ADPKD cardiac phenotype. Double mutants Pkd1cond/cond:Nestincre;Lgals3-/- (CYG-) and Pkd1+/-;Lgals3-/- (HTG-) displayed improved systolic and deformability parameters compared to single mutants, while such values did not differ from NCs and WTs. HTG-s presented a partial improvement in diastolic function. CYG- and HTG- hearts showed decreased apoptosis and fibrosis, reaching NC and WT baselines. Western blot analyses revealed higher Gal-3 expression in CY than NC hearts but no difference between HT and WT mice. CYG- and HTG- animals showed no difference in BUN and in the fractional excretion of Na+, Cl- and K+ compared to CYs and HTs. We also employed a more severe renal cystic model, homozygous for an allele that hinders polycystin-1 cleavage at the GPS site (Pkd1V/V; VV), and showed that Pkd1V/V;Lgals3-/- mice present longer survival than VVs. Our findings demonstrate myocardial dysfunction and abnormal deformability in different Pkd1-deficient models, reproducing human ADPKD, and reveals that Gal-3 knockout significantly rescues this phenotype

O complexo esclerose tuberosa (CET) e as doenças renais policísticas autossômica dominante (DRPAD) e autossômica recessiva (DRPAR) são doenças monogênicas associadas a cistogênese renal. Os produtos dos genes mutados nessas enfermidades, respectivamente tuberina e hamartina para CET, policistina-1 (PC1) e policistina-2 para DRPAD, e poliductina/fibrocistina para DRPAR, modulam proliferação, diferenciação, apoptose, crescimento e/ou migração celular. Neste estudo empregamos um sistema tridimensional de cultura de células IMCD para caracterizar os perfis de expressão dessas proteínas durante a tubulogênese. Usando uma matriz de colágeno tipo I/Matrigel e fator de crescimento de hepatócito (HGF), a formação de estruturas alongadas se iniciou dois dias após o plaqueamento in vitro (2 DIV), ao passo que o desenvolvimento de lúmen ocorreu entre 10-14 DIV. A marcação para caspase-3 ativa foi mais intensa nas fases iniciais da tubulogênese, enquanto a marcação para Ki-67 foi uniformemente pronunciada em estágios mais tardios. A tuberina e a hamartina apresentaram expressão citoplasmática e co-localização acentuada em 6 e 12 DIV. A PC1 apresentou maior expressão nas porções ramificadas dos túbulos que nas não ramificadas no 12 DIV, um padrão não verificado para a PC2. Estas proteínas exibiram expressão citoplasmática, assim como expressão ocasional e pontual na membrana plasmática. PD1 também apresentou expressão citoplasmática. Nossos dados sugerem que a apoptose e a ciclagem celular sincrônica durante a tubulogênese in vitro são mais acentuadas, respectivamente, em fases mais precoces e mais tardias da formação tubular. Nossos achados demonstram, além disso, que as proteínas relacionadas ao CET e às DRPs são expressas in vitro durante a tubulogênese, apoiando um papel importante para a interação tuberina-hamartina na formação tubular, e são consistentes com o padrão de expressão diferencial da PC1 observado durante a nefrogênese / Tuberous sclerosis complex (TSC) and autosomal dominant and recessive polycystic kidney diseases (ADPKD and ARPKD) are monogenic diseases associated with renal cystogenesis. The products of the genes mutated in these disorders, respectively tuberin and hamartin for TSC, and polycystin-1 (PC1), polycystin-2 (PC2) and polyductin/fibrocystin (PD1) for PKD, modulate cell proliferation, differentiation, apoptosis, growth and/or migration. We have employed an IMCD tridimensional cell culture system to characterize their expression profiles along tubulogenesis. Using a type I collagen/Matrigel matrix and hepatocyte growth factor (HGF), the formation of elongated structures initiated 2 days after in vitro plating (2 DIV) while lumen developed between 10-14 DIV. Active caspase-3 labeling was more intense in initial phases of tubulogenesis while Ki-67 staining was uniformly pronounced in later stages. Tuberin and hamartin showed cytoplasmic expression and marked co- localization at 6 and 12 DIV. PC1 displayed higher expression in branching than non- branching portions of the tubules at 12 DIV, a pattern not verified for PC2. These proteins presented cytoplasmic and occasional, punctate membrane expression. PD1 also showed cytoplasmic expression. Our data suggest that apoptosis and synchronous cell cycling during in vitro tubulogenesis are more remarkable, respectively, in early and later steps of tubule formation. In addition, our findings demonstrate that the TSC and PKD proteins are expressed in vitro during tubulogenesis, supporting an important role for tuberin-hamartin interaction in tubular formation, and are consistent with the differential PC1 expression pattern observed during nephrogenesis

O complexo esclerose tuberosa (CET) e as doenças renais policísticas autossômica dominante (DRPAD) e autossômica recessiva (DRPAR) são doenças monogênicas associadas a cistogênese renal. Os produtos dos genes mutados nessas enfermidades, respectivamente tuberina e hamartina para CET, policistina-1 (PC1) e policistina-2 para DRPAD, e poliductina/fibrocistina para DRPAR, modulam proliferação, diferenciação, apoptose, crescimento e/ou migração celular. Neste estudo empregamos um sistema tridimensional de cultura de células IMCD para caracterizar os perfis de expressão dessas proteínas durante a tubulogênese. Usando uma matriz de colágeno tipo I/Matrigel e fator de crescimento de hepatócito (HGF), a formação de estruturas alongadas se iniciou dois dias após o plaqueamento in vitro (2 DIV), ao passo que o desenvolvimento de lúmen ocorreu entre 10-14 DIV. A marcação para caspase-3 ativa foi mais intensa nas fases iniciais da tubulogênese, enquanto a marcação para Ki-67 foi uniformemente pronunciada em estágios mais tardios. A tuberina e a hamartina apresentaram expressão citoplasmática e co-localização acentuada em 6 e 12 DIV. A PC1 apresentou maior expressão nas porções ramificadas dos túbulos que nas não ramificadas no 12 DIV, um padrão não verificado para a PC2. Estas proteínas exibiram expressão citoplasmática, assim como expressão ocasional e pontual na membrana plasmática. PD1 também apresentou expressão citoplasmática. Nossos dados sugerem que a apoptose e a ciclagem celular sincrônica durante a tubulogênese in vitro são mais acentuadas, respectivamente, em fases mais precoces e mais tardias da formação tubular. Nossos achados demonstram, além disso, que as proteínas relacionadas ao CET e às DRPs são expressas in vitro durante a tubulogênese, apoiando um papel importante para a interação tuberina-hamartina na formação tubular, e são consistentes com o padrão de expressão diferencial da PC1 observado durante a nefrogênese / Tuberous sclerosis complex (TSC) and autosomal dominant and recessive polycystic kidney diseases (ADPKD and ARPKD) are monogenic diseases associated with renal cystogenesis. The products of the genes mutated in these disorders, respectively tuberin and hamartin for TSC, and polycystin-1 (PC1), polycystin-2 (PC2) and polyductin/fibrocystin (PD1) for PKD, modulate cell proliferation, differentiation, apoptosis, growth and/or migration. We have employed an IMCD tridimensional cell culture system to characterize their expression profiles along tubulogenesis. Using a type I collagen/Matrigel matrix and hepatocyte growth factor (HGF), the formation of elongated structures initiated 2 days after in vitro plating (2 DIV) while lumen developed between 10-14 DIV. Active caspase-3 labeling was more intense in initial phases of tubulogenesis while Ki-67 staining was uniformly pronounced in later stages. Tuberin and hamartin showed cytoplasmic expression and marked co- localization at 6 and 12 DIV. PC1 displayed higher expression in branching than non- branching portions of the tubules at 12 DIV, a pattern not verified for PC2. These proteins presented cytoplasmic and occasional, punctate membrane expression. PD1 also showed cytoplasmic expression. Our data suggest that apoptosis and synchronous cell cycling during in vitro tubulogenesis are more remarkable, respectively, in early and later steps of tubule formation. In addition, our findings demonstrate that the TSC and PKD proteins are expressed in vitro during tubulogenesis, supporting an important role for tuberin-hamartin interaction in tubular formation, and are consistent with the differential PC1 expression pattern observed during nephrogenesis

O desenvolvimento de hipertensão arterial (HAS) ocorre dez anos mais cedo em pacientes com doença renal policística autossômica dominante (DRPAD) comparados à população geral, estando presente em ~60% dos indivíduos afetados antes da perda de função renal. Déficit de concentração renal também se constitui em um achado precoce nesses pacientes. Atualmente se propõe que o sistema renina angiotensina desempenhe um papel central na HAS relacionada à DRPAD, enquanto diferentes explicações têm sido levantadas para justificar o defeito de concentração. Realizamos um cruzamento envolvendo um alelo floxed de Pkd1 com uma linhagem com expressão de nestina-Cre, de modo a gerar camundongos machos císticos viáveis (Pkd1cond/cond:Balcre, CI) com TFG preservada. Estes animais foram avaliados sistematicamente para uma série de parâmetros renais funcionais, morfológicos, celulares e moleculares. Análises paralelas foram conduzidas em camundongos haploinsuficientes para Pkd1 (Pkd1+/-, HT), os quais não desenvolvem cistos renais visíveis. Camundongos CI mostraram-se significantemente hipertensos na idade de 10-13 semanas, um fenótipo não observado em controles não císticos (Pkd1cond/cond, NC) e em animais haploinsuficientes para Pkd1. As frações de excreção de Na+ e K+ mostraram-se reduzidas e a concentração sérica de uréia discretamente elevada em camundongos CI, sugerindo reabsorção tubular de solutos aumentada. A expressão gênica de angiotensinogênio foi significantemente maior em rins CI que NC, enquanto análises imunoistoquímicas revelaram expressão da enzima conversora de angiotensina e do receptor AT1 em epitélio cístico renal. A excreção urinária de NO2 também se mostrou diminuída em camundongos CI, acompanhando-se de taxas aumentadas de proliferação celular e apoptose renais. A osmolalidade urinária máxima foi mais baixa em animais CI, um déficit não encontrado nos controles HT e NC. Interessantemente, uma tendência de níveis plasmáticos mais elevados de vasopressina foi observada em camundongos CI. Tomados em conjunto, esses resultados apoiam a hipótese de que a formação e o crescimento de cistos desempenham um papel importante no desenvolvimento de HAS na DRPAD e de que a ativação do sistema renina-angiotensina intrarrenal constitui-se em um mecanismo fundamental nesse processo. Nossos achados também sugerem fortemente que a expansão cística seja essencial para o desenvolvimento do déficit de concentração renal nessa doença, e são consistentes com a existência de áreas focais de compressão vascular e perfusão diminuída em rins com DRPAD. / Hypertension (SAH) develops ten years earlier in autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients compared with the general population, being present in ~60% of affected individuals before the loss of renal function. Renal concentrating deficit is also an early finding in these patients. It has been proposed that the renin-angiotensin system plays a central role in ADPKD-related SAH, while different explanations have been raised to justify the concentrating impairment. We bred a floxed allele of Pkd1 with a nestin Cre expressing line to generate viable, adult male cystic mice (Pkd1cond/cond:Balcre, CY) with preserved GFR. These animals were systematically evaluated for a series of renal functional, morphological, cellular and molecular parameters. Parallel analyses were carried out in Pkd1-haploinsuficient mice (Pkd1+/-, HT), which do not develop visible renal cysts. CY mice were significantly hypertensive by 10-13 weeks of age, a phenotype not seen in non-cystic controls (Pkd1cond/cond, NC) and Pkd1-haploinsufficient animals. The fractional excretion of Na+ and K+ were reduced and SUN slightly elevated in the CY mice, suggesting increased tubular solute reabsorption. Angiotensinogen gene expression was significantly higher in CY than NC kidneys, whereas immunohistochemical analyses revealed angiotensin-converting enzyme and AT1 receptor expression in renal cyst epithelia. Urine excretion of NO2 was also diminished in CY mice, along with increased rates of renal cell proliferation and apoptosis. Maximum urine osmolality was decreased in CY animals, a deficit not found in HT and NC controls. Interestingly, a trend toward increased serum vasopressin levels was observed in the CY mice. Taken together these results support the hypothesis that cyst formation and growth play an important role in the development of SAH in ADPKD and that activation of the intrarenal reninangiotensin system is a fundamental mechanism in this process. Our findings also strongly suggest that renal cyst expansion is essential for the development of renal concentrating deficit in this disease, and are consistent with the existence of focal areas of vascular compression and reduced perfusion in ADPKD kidneys.