Thesis (Ph.D.)--University of Florida, 2005. / Typescript. Title from title page of source document. Document formatted into pages; contains 134 pages. Includes Vita. Includes bibliographical references.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-07-08T14:16:04Z No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_ Urbino da Rocha Tunes.pdf: 1098875 bytes, checksum: ac782c32d15adc75a543331375ca0baf (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2016-08-23T15:50:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_ Urbino da Rocha Tunes.pdf: 1098875 bytes, checksum: ac782c32d15adc75a543331375ca0baf (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-23T15:50:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_ Urbino da Rocha Tunes.pdf: 1098875 bytes, checksum: ac782c32d15adc75a543331375ca0baf (MD5) / FAPESB;FBDC;LABIMUNO/ICS/UFBA / Periodontite é uma doença multifatorial que se inicia e é mantida pela agressão das bactérias periodontopatogênicas do biofilme dental subgengival, cuja forma de manifestação clínica é dependente do tipo de resposta imuno-inflamatória provocada pela complexa interação patógenohospedeiro. Dentre essas bactérias, a Porphyromonas gingivalis tem sido associada com o início e progressão da DP, principalmente em indivíduos adultos. Ademais, há evidências de que variações na resposta imune do hospedeiro estão, em parte, sob controle genético. Diante disto, foram objetivos do presente trabalho: ① identificar a presença de Porphyromonas gingivalis no biofilme subgengival; ② avaliar a produção de IL-10 e IFN-g em cultura de células de sangue total (CCST) sob estímulo com extrato dessa bactéria, bem como a produção de IgA, IgG e subclasses (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4); ③ avaliar os polimorfismos dos genes das citocinas IL-1b+3953C/T, TNFa-308G/A, IL-6-174G/C, TGF-b1códons 10T/C e 25G/C, IFN-γ+874T/A e IL-10-1082G/A,-819C/T,-592C/A, e do HLA-DR, -DQ, associando esses achados com a periodontite crônica severa. Oitenta e quatro indivíduos não-fumantes, idade de 30 a 50 anos, de ambos os gêneros, foram selecionados para o estudo: 43 pacientes com periodontite crônica severa constituíram o grupo caso (PCS) e 41 pacientes sem periodontite, o grupo controle (NP). Parâmetros clínicos periodontais foram avaliados. Amostras do biofilme subgengival foram coletadas para identificação da presença de P.gingivalis, usando-se a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR). Para identificação dos polimorfismos citados, foi extraído o DNA genômico de amostras de sangue periférico, sendo a genotipagem realizada também pela PCR. Dos voluntários selecionados, levando em conta o leucograma respectivo, CCST foi realizada com amostras sangüíneas de 35 indivíduos, 18 do grupo PCS e 17 do grupo NP, estimulada com antígenos bacterianos. As concentrações das citocinas nos sobrenadantes e das imunoglobulinas séricas foram determinadas utilizando-se o teste ELISA. A análise estatística foi realizada usando os testes t-student, Mann- Whitney, Teste de Correlação de Spearman e Teste Exato de Fisher. Foi detectada a presença de P.gingivalis em 29 (67,4%) dos pacientes do grupo PCS enquanto que a presença deste periodontopatógeno não foi observada em nenhum dos indivíduos do grupo NP. Os antígenos testados induziram altas concentrações de IL-10, e baixa de IFN-γ, especialmente P.gingivalis. CCST do grupo PCS apresentou significativamente (p<0,05) maior produção de IL-10, do que do grupo NP, quando foi estimulada com LPS de E.coli e extrato de P.gingivalis. Quanto à resposta imune humoral, os níveis séricos de IgG, IgG1, IgG4 (p£0,001) e IgG2 (p£0,05) anti-P.gingivalis foram significantemente mais elevados no grupo PCS em comparação ao grupo NP. Nos polimorfismos estudados foram encontradas diferenças estatisticamente significativas nas freqüências alélicas, genotípicas e fenotípicas entre os indivíduos do grupo PCS e NP em relação ao gene da IL-1b+3953(C/T); o genótipo homozigoto para o alelo 1 (CC), fenótipo previsto como baixo produtor, teve freqüência significativamente maior (p=0,03) no grupo NP (81,48%) do que no PCS (65%); inversamente, e com tendência de significância estatística (p=0,08), o alelo 2 da IL-1b+3953(T), fenótipo previsto como alto produtor, estava associado mais ao grupo PCS (21,25%) do que ao NP (10,53%). Foi também observada uma freqüência significativamente maior (p<0,05) do alelo HLA-DQB1*05 nos indivíduos do grupo NP em relação ao grupo PCS. A produção elevada de IL-10 e baixa de IFN-γ na CCST estimulada com extrato bruto de P.gingivalis dos pacientes do grupo PCS, bem como elevados níveis de IgG4 anti-Pg, podem sugerir que este periodontopatógeno desvia a resposta imune para um perfil Th2. Por sua vez, os resultados dos polimorfismos sugerem que o genótipo homozigoto para o alelo 1 (CC) da IL-1b+3953(C) pode ser um fator de proteção, assim como o alelo HLA-DQB1*05, e que o alelo 2 IL-1b+3953(T) pode ser um fator de risco para o desenvolvimento da periodontite crônica severa, em mestiços brasileiros.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-08-14T20:47:20Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Paulo Cirino de Carvalho Filho.pdf: 1601148 bytes, checksum: 994736a47abe1ce0bf2aece42ff07568 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-14T20:47:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Paulo Cirino de Carvalho Filho.pdf: 1601148 bytes, checksum: 994736a47abe1ce0bf2aece42ff07568 (MD5) / A periodontite é uma doença multifatorial causada pela resposta imuno-inflamatória do hospedeiro sob estímulos bacterianos que destroem o periodonto. Este estudo objetivou investigar a expressão in vitro das proteínas Fas e Bcl-2 em Células Mononucleares de Sangue Periférico (CMSP) estimuladas pela proteína rHmuY de Porphyromonas gingivalis (Pg). Os 39 voluntários (18-periodontite crônica-PC e 21-sem periodontite- SP) foram avaliados seguindo descritores clínicos periodontais. As CMSP foram cultivadas sob o estímulo de P. gingivalis e os ensaios para a expressão de Bcl-2 e Fas (CD95) foram realizados após 48 horas. A fluorescência para CMSP com os marcadores para CD3, CD4, CD8, Bcl-2 e CD95 foi determinada usando Citometria de Fluxo. A expressão de Bcl-2 em células T CD3+ de indivíduos com PC estimuladas com a proteína rHmuY foi maior do que nos SP (P=0,043) e também maior do que nas CMSP estimuladas com o extrato total de Pg ATCC 33277 e sem estimulo. Não foram observadas diferenças estatisticamente significantes na co-expressão dos marcadores para CD3/CD4, CD3/CD8, Fas/Bcl-2 e CD3/Fas nas CMSP. A proteína rHmuY pode representar um importante estímulo de P. gingivalis, induzindo expressão elevada de Bcl-2, a qual possibilita a inibição de apoptose em CMSP de indivíduos com periodontite crônica. / Salvador

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2015-03-27T13:56:13Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Ana Carla Montino Pimentel.pdf: 1002682 bytes, checksum: 89513f3043ac780e0e45470e88455c50 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-27T13:56:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Ana Carla Montino Pimentel.pdf: 1002682 bytes, checksum: 89513f3043ac780e0e45470e88455c50 (MD5) / A periodontite crônica apresenta etiologia multifatorial, tendo como um dos principais agentes etiológicos Porphyromonas gingivalis, um microrganismo que possui uma ampla gama de fatores de virulência, com potencial antigênico, tais como a proteína HmuY. O objetivo deste estudo piloto foi avaliar os níveis da proteína de choque térmico (HSP) 60 autóloga em células mononucleares de sangue periférico (CMSP) de pacientes com periodontite crônica sob estímulo da proteína recombinante HmuY de Porphyromonas gingivalis. As células de 27 voluntários (16 sem periodontite (SP) e 11 com periodontite crônica (PC)) foram cultivadas sob estímulos de mitógeno Pokeweed e proteína rHmuY e sem estímulo por 48 horas. Após este período foi realizado o ensaio imunoenzimático ELISA no sobrenadante das culturas para avaliar os níveis de HSP60 em CMSP. Não foram observadas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos PC e SP, submetidos aos diferentes estímulos ou não, embora as células de indivíduos SP cultivadas sem estímulo tenham apresentado níveis mais elevados que as células dos portadores de periodontite. No entanto, quando foram agrupadas as amostras de todos os participantes do estudo para avaliar as diferenças entre as três formas de cultivo, as células cultivadas em presença do mitógeno Pokeweed apresentaram níveis superiores de HSP60 quando comparadas aos níveis daquelas cultivadas em presença de rHmuY (p=0,03). Não foram observadas diferenças nos níveis de HSP60 entre as células cultivadas com o mitógeno Pokeweed e as células cultivadas sem estímulo, nem entre estas últimas e as células cultivadas com rHmuY. Os achados preliminares sugerem que o HmuY de Porphyromonas gingivalis não altera os níveis de HSP60 em CMSP humanas, porém é possível que a expressão de HSP60 na célula humana exerça um papel protetor contra a periodontite.

Submitted by MARIA TEREZA PEDROSA DE ALBUQUERQUE null (tereza.pedrosa@gmail.com) on 2016-01-22T13:37:18Z No. of bitstreams: 1 Tese_Tereza_final22.12.2015.pdf: 57930935 bytes, checksum: b8c015664fa46652372a48843c4f4e5d (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-01-25T15:37:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 albuquerque_mtp_dr_sjc.pdf: 57930935 bytes, checksum: b8c015664fa46652372a48843c4f4e5d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-25T15:37:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 albuquerque_mtp_dr_sjc.pdf: 57930935 bytes, checksum: b8c015664fa46652372a48843c4f4e5d (MD5) Previous issue date: 2015-12-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O presente trabalho teve como objetivos: analisar a ação antimicrobiana de scaffolds contendo ciprofloxacina (CIP) sobre biofilme de Enterococcus faecalis (E. faecalis) (Artigo 1); Sintetizar, caracterizar e analisar a ação antimicrobiana do TAP-scaffold (Polidioxanona [PDS] + CIP, metronidazol [MET] e minociclina [MINO] ) contra biofilme de Actinomyces naeslundii (A. naeslundii) (Artigo 2); Avaliar os efeitos do TAP-scaffold contra biofilme de Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) (Artigo 3). Material e Métodos: Utilizando a técnica de electrospinning scaffolds foram desenvolvidos a partir de soluções de PDS puro e associadas a antibióticos para produzir CIP-scaffold e TAP-scaffold. (Artigos 1, 2 e 3). Espécimes de dentina foram inoculados com E. faecalis para formação de biofilme e expostos ao PDS (controle); PDS + CIP 25wt.% e PDS + CIP 5wt.%. A ação antimicrobiana foi avaliada por contagem das unidades formadoras de colônia (UFC / mL) (n = 10) e microscopia eletrônica de varredura (MEV) (n = 2) (Artigo 1). TAP-scaffolds foram caracterizados quanto a morfologia das fibras, propriedades mecânicas, e mecanismo de liberação do fármaco. Espécimes de dentina foram inoculados com A. naeslundii para formação de biofilme e foram expostos à TAP-scaffold, solução de TAP, PDS puro e espécimes de dentina infectada com biofilme (7 dias) sem medicação. A viabilidade bacteriana foi determinada por microscópio de varredura a laser confocal (CLSM) (Artigo 2). Espécimes de dentina inoculados com P. gingivalis foram expostos ao PDS (controle negativo), PDS + TAP 25wt.%, solução de TAP e dentinas infectadas sem tratamento (7 dias de biofilme) (n = 12). A viabilidade do biofilme foi determinada quantitativamente por (UFC/mL) e qualitativamente por MEV (Artigo 3). Resultados: A contagem das UFC/mL demonstrou máxima eliminação bacteriana promovida pelo grupo PDS + CIP 25 wt.% diferindo estatisticamente dos grupos PDS e PDS+CIP 5 wt.% (p < 0,05). A análise por MEV foi compatível com os dados obtidos por UFC/mL (Artigo 1). A caracterização das fibras, evidenciou diâmetro médio das fibras de 689 ± 312nm (PDS puro) e 718±125nm (TAP-scaffold). O TAP-scaffold demonstrou propriedades mecânicas significativamente menores que o PDS (p≤0,04040). Grande liberação de drogas nas primeiras 24 horas foi observada, destacando-se a CIP e a MET que mantiveram uma liberação mais prolongada (4 semanas) quando comparada à MINO (7 dias). Análise por CLSM demonstrou completa eliminação de bactérias viáveis expostas à solução de TAP. Por outro lado, TAP-scaffold reduziu significativamente (p < 0,05) a porcentagem de bactérias viáveis quando comparado ao grupo controle e ao PDS (Artigo 2). Para o biofilme de P.gingivalis, tanto a TAP-scaffold quanto a TAP foram capazes de eliminar completamente as bactérias viáveis, diferindo estatisticamente (p<0,055) do PDS e controle negativo (Artigo 3). Conclusões: Os resultados deste trabalho sugerem que scaffolds desenvolvidos com sistema de liberação controlada de drogas apresentam grande potencial para eliminação de biofilmes compostos por espécies bacterianas que colonizam o sistema de canais radiculares, com potencial promissor para o sucesso da regeneração endodôntica. / The present study aimed to: Evaluate the antimicrobial effects of scaffolds containing ciprofloxacin (CIP) into the fibers against Enterococcus faecalis (E. faecalis) biofilm (Article 1); Synthesize, characterize, and analyse the antimicrobial action TAP-scaffold containing CIP, metronidazole (MET) and minocycline (MINO) against Actinomyces naeslundii (A. naeslundii) biofilm (Article 2); Evaluate the effects of TAP-scaffold to combat Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) biofilm (Article 3). Material e Methods: Scaffolds were developed from pure polidioxanone (PDS) solution alone or incorporated with antibiotics: MET, CIP and MINO (TAPscaffold and CIP-scaffold by electrospinning technique (Articles 1, 2, 3). E. faecalis solution was inoculated in dentin to induce biofilm formation that were exposed to PDS (control); PDS + CIP 25wt.% and PDS + CIP 5wt.%. The antimicrobial action were analysed by counting the colony units formation (CFU/mL) and through Scanning Electron Microscopy (SEM) (Article 1). Fiber morphology, mechanical properties, and drug release of TAP-scaffolds were investigated. Dentin specimens were inoculated with A. naeslundii for biofilm formation. The dentin specimens were exposed to TAP-mimic scaffolds, TAP solution (positive control), and pure PDS. Infected dentin (7-days biofilm) specimens were used for comparison. CLSM was performed to determine bacteria viability (Article 2). Dentin specimens were inoculated with P. gingivalis to allow biofilm formation and were exposed to the following treatments: PDS (control), PDS+25wt.%TAP, and TAP solution. Infected dentin specimens were left untreated (bacteria only). To determine the antimicrobial efficacy a colony forming unit (CFU/mL) measurement 27 and SEM analysis were performed (Article 3). Results: PDS scaffold containing CIP at 25 wt.% showed maximum bactéria (E.faecalis) elimination, differing statistically from the control (PDS) and from PDS scaffold containing CIP at 5 wt.% (p < 0.05). SEM images showed similar results when compared to CFU/mL data (Article 1). Fibers characterization displayed scaffolds with submicron mean fiber diameter. Overall, TAP-mimic scaffolds showed significantly (p ≤ 0.040) lower mechanical properties than PDS. Within the first 24 hours, a burst release of all drugs was seen. A sustained maintenance of MET and CIP release was observed over 4 weeks, but not for MINO. CLSM demonstrated complete elimination of all viable bacteria exposed to the TAP solution. Meanwhile, TAP-mimic scaffolds led to a significant (p < 0.05) reduction in the percentage of viable bacteria compared to the negative control and PDS (Article 2). Regard P.gingivalis, TAP-mimic PDS-based electrospun scaffolds and the positive control (TAP solution) led to complete bacteria elimination, differing statistically (p<0.05) from the negative control (bacteria only). No statistical differences were observed for CFU/mL data between PDS and the negative control (Article 3). Conclusions: This study suggests that scaffolds containing drug-release system present a great clinical potential to combat biofilms composed by endodontic pathogens with promising sucess for endodontic regenerative standpoint.

Orientador: Marcia Carneiro Valera / Resumo: O presente trabalho teve como objetivos: analisar a ação antimicrobiana de scaffolds contendo ciprofloxacina (CIP) sobre biofilme de Enterococcus faecalis (E. faecalis) (Artigo 1); Sintetizar, caracterizar e analisar a ação antimicrobiana do TAP-scaffold (Polidioxanona [PDS] + CIP, metronidazol [MET] e minociclina [MINO] ) contra biofilme de Actinomyces naeslundii (A. naeslundii) (Artigo 2); Avaliar os efeitos do TAP-scaffold contra biofilme de Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) (Artigo 3). Material e Métodos: Utilizando a técnica de electrospinning scaffolds foram desenvolvidos a partir de soluções de PDS puro e associadas a antibióticos para produzir CIP-scaffold e TAP-scaffold. (Artigos 1, 2 e 3). Espécimes de dentina foram inoculados com E. faecalis para formação de biofilme e expostos ao PDS (controle); PDS + CIP 25wt.% e PDS + CIP 5wt.%. A ação antimicrobiana foi avaliada por contagem das unidades formadoras de colônia (UFC / mL) (n = 10) e microscopia eletrônica de varredura (MEV) (n = 2) (Artigo 1). TAP-scaffolds foram caracterizados quanto a morfologia das fibras, propriedades mecânicas, e mecanismo de liberação do fármaco. Espécimes de dentina foram inoculados com A. naeslundii para formação de biofilme e foram expostos à TAP-scaffold, solução de TAP, PDS puro e espécimes de dentina infectada com biofilme (7 dias) sem medicação. A viabilidade bacteriana foi determinada por microscópio de varredura a laser confocal (CLSM) (Artigo 2). Espécimes de dentina inocul... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The present study aimed to: Evaluate the antimicrobial effects of scaffolds containing ciprofloxacin (CIP) into the fibers against Enterococcus faecalis (E. faecalis) biofilm (Article 1); Synthesize, characterize, and analyse the antimicrobial action TAP-scaffold containing CIP, metronidazole (MET) and minocycline (MINO) against Actinomyces naeslundii (A. naeslundii) biofilm (Article 2); Evaluate the effects of TAP-scaffold to combat Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) biofilm (Article 3). Material e Methods: Scaffolds were developed from pure polidioxanone (PDS) solution alone or incorporated with antibiotics: MET, CIP and MINO (TAPscaffold and CIP-scaffold by electrospinning technique (Articles 1, 2, 3). E. faecalis solution was inoculated in dentin to induce biofilm formation that were exposed to PDS (control); PDS + CIP 25wt.% and PDS + CIP 5wt.%. The antimicrobial action were analysed by counting the colony units formation (CFU/mL) and through Scanning Electron Microscopy (SEM) (Article 1). Fiber morphology, mechanical properties, and drug release of TAP-scaffolds were investigated. Dentin specimens were inoculated with A. naeslundii for biofilm formation. The dentin specimens were exposed to TAP-mimic scaffolds, TAP solution (positive control), and pure PDS. Infected dentin (7-days biofilm) specimens were used for comparison. CLSM was performed to determine bacteria viability (Article 2). Dentin specimens were inoculated with P. gingivalis to allow biofilm formatio... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Porphyromonas gingivalis e Aggregatibacter actinomycetemcomitans sÃo periodontopatÃgenos associados à periodontite agressiva. A fÃmbria, uma estrutura relacionada à adesÃo e à invasÃo de cÃlulas, à um dos principais fatores de virulÃncia de P. gingivalis. Baseado na sequÃncia de nucleotÃdeos, seis genÃtipos(fimA) que codificam a fÃmbria principal dessas bactÃrias foram identificados, sendo o fimA II mais comumente relacionado à destruiÃÃo periodontal. O objetivo deste trabalho foi avaliar, por meio de reaÃÃo em cadeia da polimerase em amostras de placa subgengival dos sÃtios com maior profundidade de sondagem de pacientes com periodontite agressiva, a prevalÃncia de P. gingivalis, do genÃtipo fimA II de P. gingivalis e de A. actinomycetemcomitans, assim como relacionar a presenÃa desses patÃgenos ou genÃtipo à idade e aos parÃmetros clÃnicos periodontais (Ãndice de placa, Ãndice de sangramento gengival, profundidade de sondagem e nÃvel de inserÃÃo) encontrados nesses pacientes. Foram selecionados 45 pacientes com periodontite agressiva generalizada, com idade entre 15 e 40 anos. Nessa populaÃÃo, 64,4% apresentaram P. gingivalis e 28,8% apresentaram A. actinomycetemcomitans em sua microbiota subgengival. Dos pacientes positivos para P. gingivalis, 82,6% apresentaram o genÃtipo fimA II. Ao se relacionar a presenÃa ou ausÃncia das bactÃrias ou genÃtipo aos dados clÃnicos e idade, foi observada diferenÃa estatisticamente significante entre o nÃvel clÃnico de inserÃÃo do sÃtio coletado de pacientes com presenÃa de P. gingivalis e seu genÃtipo fimA II quando comparados aos pacientes negativos para essa bactÃria e genÃtipo, sendo a perda de inserÃÃo significativamente maior em pacientes que apresentaram P. gingivalis e em paciente com seu genÃtipo fimA II. AlÃm disso, foi encontrada mÃdia de idade significativamente mais elevada em pacientes positivos para P. gingivalis que em pacientes negativos para essa bactÃria. Concluiu-se, assim, que P. gingivalis e seu genÃtipo fimA tipo II estÃo presentes em alta prevalÃncia em pacientes com periodontite agressiva, que A. actinomycetemcomitans està presente em menor proporÃÃo de indivÃduos na populaÃÃo estudada e que P. gingivalis parece ser mais comumente encontrada em bolsas mais profundas e em indivÃduos mais velhos. / Porphyromonas gingivalis and Aggregatibacter actinomycetemcomitans are periodontal pathogens associated with aggressive periodontitis. The fimbriae, a structure related to adhesion and invasion of cells, is one of the major virulence factors of P. gingivalis. Based on the nucleotide sequence, six genotypes(fimA) encoding the major fimbriae of these bacteria were identified, and the fimA II is the most commonly associated with periodontal destruction. The objective of this study was to evaluate, by polymerase chain reaction in subgingival plaque samples from sites with highest probing depth in patients with aggressive periodontitis, the prevalence of P. gingivalis, P. gingivalis genotype fimA II and A. actinomycetemcomitans, and relate the presence of these pathogens or genotype to age and clinical periodontal parameters (plaque index, gingival bleeding index, probing depth and clinical attachment level) in these patients. We selected 45 patients with generalized aggressive periodontitis, aged from 15 to 40 years. 64.4% of these patients harbored P. gingivalis and 28.8% harbored A. actinomycetemcomitans in their subgingival microbiota. In patients positive for P. gingivalis, 82.6 % presented the genotype fimA II. In relation to the presence or absence of bacteria or gene to clinical data and age, a statistically significant difference between clinical attachment level was observed in the selected sites of patients with the presence of P. gingivalis and its genotype fimA II when compared to patients negative for these bacteria and genotype, with periodontal loss significantly higher in patients harboring P. gingivalis and in patients harboring genotype fimA II. In addition, the average age in patients positives for P. gingivalis was significantly higher than in negative ones. It is therefore concluded that P. gingivalis and its genotype fimA II are present in high prevalence in patients with aggressive periodontitis, A. actinomycetemcomitans is present in a smaller proportion of individuals in the studied population and P. gingivalis seems to be more commonly found in deeper sites and older individuals.

O ligamento periodontal e o tecido gengival são formados por tecido conjuntivo frouxo, sendo constituídos por diversas células, dentre as quais os fibroblastos são as mais numerosas. Ao serem submetidas a agressões diversas, estas células respondem com a liberação de substâncias, tais como citocinas e quimiocinas, que participam de maneira ativa no processo inflamatório, e com a produção de componentes da matriz extracelular fundamentais para o reparo, como por exemplo, o colágeno. Assim sendo, este trabalho teve como objetivo: Avaliar e comparar a expressão e a produção de prócolágeno tipo I, IL6, MIP1 e SDF1 por fibroblastos humanos, cultivados de ligamento periodontal e de tecido gengival, estimulados por lipopolissacarídeo (LPS) de Porphyromonas gingivalis. Foram coletados ligamentos periodontais de terceiros molares não irrompidos e biópsias de gengiva de um mesmo indivíduo (n=3). Estes tecidos foram picotados e mantidos em meio de cultura adequado para fibroblastos, que foram utilizados na quarta passagem. Após adesão dos fibroblastos a placas de 24 poços, o meio de cultura contendo 0,1 10 g/mL de LPS de P. gingivalis foi adicionado às placas em duplicata. O sobrenadante e as células foram coletados após 1, 6 e 24 horas e analisados por ELISA e PCR em tempo real, respectivamente. A análise estatística foi realizada por meio do programa GraphPad Prism, aplicandose o teste ANOVA a 1 critério com nível de significância de 5%. A expressão de prócolágeno tipo I mostrouse - ligeiramente diferente entre fibroblastos de ligamento periodontal e de gengiva. A produção de IL6, MIP1 e SDF1 foi significativamente maior em fibroblastos gengivais. A citocina IL6 foi produzida de maneira tempodependente com LPS de P gingivalis, principalmente por fibroblastos gengivais. Para MIP1, os fibroblastos gengivais mostraram maior produção com a menor concentração de estímulo (0,1g/ml). Para SDF1, foi detectada produção constitutiva que foi inibida com o aumento da concentração de LPS ao longo do tempo nestas mesmas células. Já para fibroblastos de ligamento periodontal, não foi observado um padrão homogêneo e linear, apesar de a produção basal de SDF1 também existir, porém em níveis bem mais discretos, como aquele observado para a produção de MIP1. A capacidade dos fibroblastos modificarem o padrão de produção dessas citocinas frente ao estímulo com LPS de P. gingivalis reforça a importância dessas células no contexto da resposta imune do indivíduo frente à doença periodontal. / The fibroblast is considered an important cell in periodontitis because it is the predominant cell type in the periodontal connective tissue. When challenged by different agents, fibroblasts respond through the release of substances, such as cytokines and chemokines that participate in an active way in the inflammatory process as well as the production of basic components of the extracellular matrix for repair, like collagen. The aim of this study was to: to evaluate and to compare the expression and production of type I procollagen, IL6, MIP1 and SDF1 by cultured human periodontal ligament and gingival fibroblasts challenged with lipopolyssacharide from Porphyromonas gingivalis. Human periodontal ligament and gingival fibroblasts were cultured from biopsies of the same donor and were used on the fourth passage. After confluence in 24well plates, the culture medium alone (control) or with 0,1 10 ug/mL of LPS from P. gingivalis were added and after 1, 6 and 24 hours, the supernatant and the cells were collected and analysed by ELISA and Real time PCR, respectively. Data were analysed by GraphPad Prism Program (1 way ANOVA test) and a significance level of 5% was adopted. Procollagen type I expression by Real Time PCR differ between periodontal ligament and gingival fibroblasts. In vitro experiments revealed that IL6, MIP 1 and SDF1 production were significantly greater in gingival fibroblasts when compared to periodontal ligament. In addition, IL6 was upregulated in a timedependent manner, mainly by the gingival fibroblasts. On one hand, MIP1 was stimulated with a low concentration (0,1ugml) of LPS by gingival fibroblasts. On the other hand, SDF1 was constitutively secreted by the same cells but its production was inhibited when challenged by a higher concentration of LPS from P gingivalis. In general, periodontal ligament fibroblasts did not show a pattern of production of these cytokines under the challenge with LPS, despite of the basal production of SDF1 in lower levels than gingival cells and the low production of MIP1 over time. The differential ability of the gingival and periodontal ligament fibroblasts to secrete these cytokines emphasizes their crucial role in the inflammatory microenvironment and in the host immune response to periodontal disease.

Tesis presentada para optar al Grado de Doctor en Farmacología / La periodontitis es una enfermedad infecciosa con un componente inflamatorio crónico que se produce como resultado del desbalance entre los microorganismos que conforman la biopelícula subgingival y la respuesta inmune del hospedero. La colonización de microorganismos patógenos y la respuesta inmunológica desencadenada que conducen a la destrucción de los tejidos de inserción de los dientes, como son el hueso alveolar, el ligamento periodontal y el cemento radicular, resultan finalmente en la pérdida de dientes. La presencia de bacterias anaerobias Gram-negativo específicas en la biopelícula subgingival es relevante en la etiología y progresión de la periodontitis. Dentro de ellas Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) es considerada un patógeno “clave” en el inicio de la enfermedad periodontal. A pesar de presentarse en una baja abundancia en sitios enfermos comparado con la microbiota oral total, esta bacteria es capaz de inducir cambios en el microbioma oral y causar disbiosis, conduciendo al desarrollo de la periodontitis. P. gingivalis además, es la bacteria más frecuentemente aislada en pacientes con periodontitis crónica (P. crónica) y ha sido relacionada con la progresión de esta enfermedad. No obstante, no está claro por qué su presencia en individuos sanos no se asocia con la enfermedad y los mecanismos que utiliza para el desarrollo y/o progresión de la periodontitis tampoco han sido totalmente dilucidados. Entre los factores de virulencia de P. gingivalis, el LPS destaca por su variabilidad estructural la cual le otorga la capacidad de dirigir e incluso evadir la respuesta inmunológica del hospedero, así como la actividad antimicrobiana de los péptidos endógenos, como es el caso de las defensinas (hBDs). P. gingivalis es capaz de reducir su interacción electrostática con péptidos catiónicos como Polimixina B (PMB), incrementando su resistencia por una de-fosforilación mediada por una fosfatasa en la posición 4´ del lípido A (gen PGN_0524). Junto con modificar su lípido A, P. gingivalis sintetiza dos tipos de LPS (A-LPS y O-LPS) que difieren en la región del Antígeno O polimérico (APS y AgO, respectivamente). Varios estudios sugieren que el lípido A es relevante en la resistencia a PMB, sin embargo su relación con la resistencia a otros péptidos catiónicos presentes en la cavidad oral (hBDs) no ha sido estudiada, así como tampoco se conoce el rol que pudieran tener otras estructuras del LPS, como el APS y AgO en dicha resistencia. Por lo anteriormente expuesto, en el presente trabajo se propuso determinar la susceptibilidad de aislados clínicos de P. gingivalis, provenientes de individuos clínicamente diagnosticados con periodontitis crónica (P. crónica) e individuos periodontalmente sanos, en presencia de PMB y evaluar la participación de la fosfatasa 4´ del lípido A de P. gingivalis en la resistencia a PMB y las hBDs-1 a -4. Además, se evaluó el rol de otras regiones del LPS como el AgO y/o APS en la resistencia a péptidos catiónicos, utilizando como modelo la PMB. Nuestros resultados muestran que aislados de P. gingivalis de pacientes con P. crónica presentan mayor resistencia a PMB respecto a aquellos obtenidos de individuos sanos. Además, aislados de individuos sanos son significativamente menos susceptibles a PMB respecto de la cepa de referencia ATCC 33277. Si bien una mutante que carece del gen de la fosfatasa en la posición 4´ del lípido A es totalmente susceptible a PMB, la presencia de este gen en los aislados no se correlaciona con la resistencia diferencial observada, ya que todos los aislados presentaban el gen. Más aún, en el análisis estructural del lípido A de los aislados se demostró la presencia de estructuras fosforiladas en la posición 4´, tanto en aislados susceptibles como resistentes a PMB, indicando que la composición del lípido A de P. gingivalis no es el único factor determinante en la resistencia de los aislados clínicos a PMB, y muy probablemente frente a otros péptidos catiónicos, puesto que la mutante fue capaz de crecer incluso a las concentraciones más altas de las hBDs-1 a -4. Aislados de individuos sanos carecen de moléculas de AgO de alto peso molecular y APS, sugiriendo que P. gingivalis presente en individuos periodontalmente sanos no produce A-LPS o lo pierde. Finalmente, aislados de pacientes con P. crónica carecen de moléculas de APS de bajo peso molecular, sugiriendo que moléculas de AgO y APS de alto peso molecular son relevantes en la resistencia diferencial de P. gingivalis a los péptidos catiónicos PMB y hBDs-1 a -4. / Periodontitis is an infectious disease with a chronic inflammatory component that occurs as result from imbalance between microorganisms forming biofilm and subgingival host immune response. Pathogenic microorganisms colonization and the immune response elicited lead to destruction of teeth insertion tissue such as: alveolar bone, periodontal ligament and cementum, finally resulting in tooth loss. The presence of specific Gram-negative anaerobic bacteria in subgingival biofilm is relevant for the etiology and progression of periodontitis. Among them, Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) is a "key" pathogen for the onset of periodontal disease. Although present in diseased sites in low abundance compared to the total oral microbiota, this bacterium is able to induce changes in the oral microbiome and cause dysbiosis, leading to development of periodontitis. P. gingivalis is the bacteria most frequently isolated in patients with chronic periodontitis and has been linked to progression of disease. However, it is unclear how their presence in healthy individuals is not associated with disease and the mechanisms for the development and/or progression of periodontitis have not been completely understood. Among P. gingivalis virulence factors the LPS noted for its structural changes conferring the ability to orchestrate and subvert the host immune response, and to resist endogenous peptides antimicrobial activity, such as defensins (hBDs). P. gingivalis reduces its electrostatic interaction with cationic peptides as Polymyxin B (PMB) and increases resistance by phosphatase lipid A 4´dephosphorylation (PGN_0524 gene). Besides modify their lipid A, P. gingivalis synthesizes two different types of LPS (A-LPS and O-LPS) differing at region of polymeric O antigen (OAg and APS, respectively). Several studies suggest that relevance for lipid A in PMB resistance, but its relationship with other cationic peptides resistance, relevant in the oral cavity (hBDs) has not been studied, and the possible role for the other known structures in LPS, such as APS and OAg in resistance. By the above, the present work proposed to determine the susceptibility of P. gingivalis clinical isolates, from chronic periodontitis (P. chronic) patients and periodontally healthy individuals to PMB and evaluate participation of lipid A 4' phosphatase in resistance to PMB and hBDs-1 to -4. In addition, the role of other regions of LPS as OAg and/or APS in resistance to cationic peptides was evaluated using as a model the PMB. Our results showed that isolates of P. gingivalis from P. chronic patients are more resistant to PMB respect from healthy individuals. Furthermore, healthy isolates are less resistant to PMB respect to the reference strain ATCC 33277. While, a mutant lacking phosphatase gene in the lipid A 4' position is totally susceptible to PMB, the presence of this gene in isolates does not correlate with the differential resistant observed since all isolates had the gene. Moreover, the lipid A structural analysis of the isolates shown 4' phosphorylated structures in both, susceptible and resistant PMB isolates, suggesting that P. gingivalis lipid A composition is not the only determining factor in clinical isolates PMB resistance, and probably to other cationic peptides, since the mutant was able to grow even to highest hBDs-1 to -4 concentrations. In healthy subject isolates lacked high molecular weight OAg and APS molecules, suggesting that P. gingivalis in healthy individuals do not produce or lose A-LPS. Finally, P. chronic isolates lacked APS molecules, suggesting that OAg and APS molecules are relevant in P. gingivalis resistance to cationic peptides PMB and hBDs -1 to -4 / Fondecyt

Orientador: Ana Cláudia Pavarina / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia da terapia fotodinâmica antimicrobiana associada (aPDT) ao metronidazol (MTZ) em biofilmes periodontopatogênicos. Para tal finalidade, foram realizadas as seguintes etapas: (1) determinação do tempo de adesão (24 e 48 horas) e formação de biofilme mono e duo-espécie (3, 5 e 7 dias) de Fusobacterium nucleatum (NCTC 11326) e Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277); (2) aplicação da aPDT mediada por PDZ associada ao MTZ em biofilmes mono-espécie de F. nucleatum e P. gingivalis. Foram avaliadas diferentes concentrações do PDZ (50, 75 e 100 mg/L) e dose de luz de 50 J/cm2 (660nm). Após a aplicação da aPDT, os biofilmes foram incubados com diferentes concentrações do MTZ (MIC, 50x MIC e 100x MIC) por 24 horas. Os grupos controles positivos (L-F-) não receberam fotossensibilizador e não foram iluminados. A viabilidade dos microrganismos após os tratamentos foi avaliada por meio da contagem de UFC/ml. Os resultados demonstraram que o período de adesão de 24 horas, seguido de 5 dias de formação de biofilme foi satisfatório para a obtenção de biofilmes maduros mono-espécie. Para F. nucleatum, os resultados demonstraram que aPDT 75 mg/mL associado com MTZ 100x MIC e aPDT 100 mg/L associado com MTZ nas concentrações de 50x MIC e 100x MIC reduziu significativamente o número de UFC/mL, 2,99; 2,9 e 3,94 Log10 respectivamente. Para P. gingivalis, a redução mais significativa de UFC/mL foi obtida quando a associação de aPDT 100 mg/L e MTZ 100x MIC ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to evaluate the efficacy of metronidazole (MTZ) associated antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) on periodontopathogenic biofilms. For this purpose, the following steps were performed: (1) determination of adhesion period (24 and 48 hours) and single and duo species biofilm formation (3, 5 and 7 days) of Fusobacterium nucleatum (NCTC 11326) and Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277); (2) Photodithazine ® (PDZ)- mediated aPDT in association with MTZ in single-specie biofilms of F. nucleatum and P. gingivalis. Different concentrations of PDZ (50, 75 e 100 mg/L) and light dose of 50 J / cm2 (660nm) were evaluated. After application of aPDT, the biofilms were incubated with different concentrations of MTZ (MIC, 50x MIC and 100x MIC) for 24 hours. Positive control groups (L-F-) received no photosensitizer and were also not illuminated. The viability of the microorganisms after the treatments was evaluated by counting CFU/ml. The results demonstrated that the 24 hours adhesion period followed by 5 days of biofilm formation was satisfactory for obtaining a mature biofilm in single-specie. For F. nucleatum, the results demonstrated that 75 mg/L aPDT associated with MTZ 100x and 100 mg/mL aPDT associated with MTZ at 50x MIC and 100x MIC concentrations significantly reduced the number of CFU/mL, 2.99; 2.9 and 3.94 Log10 respectively. For P. gingivalis, the greatest reduction of CFU/mL was obtained when the association of aPDT 100 mg/L and MTZ 100x MIC was p... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor