Staufen1 (STAU1) est une protéine de liaison à l’ARN essentielle dans les cellules non-transformées. Dans les cellules cancéreuses, le niveau d’expression de la protéine est critique et étroitement lié à des évènements d’apoptose et des altérations dans la prolifération cellulaire. Le dsRBD2 de STAU1 lie des facteurs protéiques qui sont fondamentaux pour les fonctions de la protéine, telles que la liaison aux microtubules qui garantit sa localisation au fuseau mitotique et l’interaction avec les coactivateurs de l’E3 ubiquitine-ligase APC/C, ce qui garantit la dégradation partielle de STAU1 en mitose. Nous avons cartographié un nouveau motif F39PxPxxLxxxxL50 (motif FPL) dans le dsRBD2 de STAU1. Ce motif est fondamental pour l’interaction de la protéine avec les co-activateurs de l’APC/C, CDC20 et CDH1, et sa dégradation subséquente. Nous avons ensuite identifié un total de 15 protéines impliquées dans le processus inflammatoire qui partagent cette séquence avec STAU1. Nous avons prouvé, par des essais de co-transfection et de dégradation, que MAP4K1, l’une des protéines qui partagent ce motif, est aussi dégradé via ce motif FPL. Cependant, le motif de MAP4K1 n’est pas la cible de l’APC/C. Des techniques de biotinylation des protéines à proximité de STAU1 nous ont permis d’identifier TRIM25, une E3 ubiquitine ligase impliquée dans la régulation immunitaire et l’inflammation, comme protéine impliquée dans la dégradation de STAU1 et de MAP4K1 via le motif FPL. Ceci suggère des rôles de STAU1 dans la régulation du processus inflammatoire, ce qui est consistent avec des études récentes qui associent STAU1 à ce processus. Nous considérons que le motif FPL pourrait être à la base de la coordination de la régulation des protéines impliquées dans l’inflammation et la régulation de la réponse immune. Nos études sur l’effet anti-prolifératif de STAU1 lorsque surexprimé dans les cellules transformées ont identifié le domaine dsRBD2 de STAU1 comme responsable de ce phénotype. Des mutants qui miment les différents états de phosphorylation de la serine 20, située dans le domaine dsRBD2, sont à la base des changements dans la régulation de la traduction et la dégradation des ARNm liés à STAU1. Ces changements dans la régulation des ARNm par STAU1 sont associés aux altérations dans la prolifération des cellules transformées observées lors de la surexpression de STAU1. Nous avons aussi découvert que, après la transfection de STAU1, la cellule déclenche rapidement des évènements d’apoptose, et que ces évènements sont aussi dépendants de l’état de phosphorylation de la sérine 20 dans dsRBD2 de STAU1. Ces résultats suggèrent que STAU1 est un senseur qui contrôle la balance entre la survie et la prolifération cellulaire et que l’état de phosphorylation de son dsRBD2 est à la base de ce contrôle. Nos résultats indiquent que le dsRBD2 de STAU1 est le domaine de régulation du niveau d’expression protéique et un modulateurs des rôles de la protéine comme facteur post-transcriptionnel. Nous pensons que cibler la régulation de STAU1 et ses fonctions situées dans son domaine dsRBD2, serait important dans l’étude des maladies qui impliquent des événements d’apoptose, d’inflammation et de prolifération cellulaire telles que le cancer. / Staufen1 (STAU1) is an RNA-binding protein essential in untransformed cells. In cancer cells, the level of expression of the STAU1 protein is critical and it has been closely linked to events of apoptosis and to cell proliferation impairments. STAU1's dsRBD2 binds protein factors that are fundamental for the protein's functions, such as microtubules components that ensure the protein localization to the mitotic spindle and its interaction with E3 ubiquitin-ligase APC/C coactivators, which guarantees the partial degradation of STAU1 during mitosis. By mapping a novel F39PxPxxLxxxxL50 motif (FPL motif) in the dsRBD2 of STAU1, responsible of the interaction with the co-activators of APC/C, CDC20 and CDH1, and its subsequent degradation, we were able to identify a total of 15 proteins mostly involved in the inflammatory process that share this sequence with STAU1. We proved, by co-transfection and degradation assays that, MAP4K1, one of the proteins that shares this motif, is also degraded via this FPL motif. However, we demonstrated that this motif on MAP4K1 is not the target of APC/C. Biotinylation techniques of proteins near STAU1 allowed us to identify TRIM25, an E3 ubiquitin ligase involved in immune regulation and inflammation, as a protein involved in the degradation of STAU1 and MAP4K1 via the FPL motif. This suggests roles of STAU1 in the regulation of the inflammatory events, which is consistent with recent studies that associate STAU1 with this process. We consider that the FPL motif could be at the basis of the coordination of the regulation of proteins involved in inflammation and the regulation of the immune response. Our studies on the anti-proliferative effect of STAU1 when overexpressed in transformed cells identified the domain dsRBD2 of STAU1 as responsible for this phenotype. Mutants 8 that mimic different phosphorylation states of serine 20, located in dsRBD2, underlie changes in the regulation of translation and degradation of STAU1-linked mRNAs. These STAU1-dependent changes in mRNA regulation are associated with the proliferation impairment of transformed cells that is observed upon overexpression of STAU1. We also discovered that, after STAU1 transfection, the cell rapidly triggers apoptotic events, and that these events are also dependent on the phosphorylation state of serine 20 in dsRBD2 of STAU1. These results suggest that STAU1 is a sensor that controls the balance between cell survival and cell proliferation and that the state of phosphorylation of its dsRBD2 is the basis of this control. Our results indicate that the dsRBD2 of STAU1 is the regulatory domain of the level of protein expression and a modulator of the protein roles as a post-transcriptional factor. We believe that targeting the regulation of STAU1 and its functions located in its dsRBD2 domain, would be important in the study of diseases that involve apoptosis, inflammation and cell proliferation events such as cancer.

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La régulation de l’expression des gènes est fondamentale pour coordonner la synthèse, l’assemblage et la localisation des complexes macromoléculaires dans les cellules. Cette expression est régulée à divers niveaux. Elle commence dans le noyau où les facteurs de transcription se lient à des séquences spécifiques d’ADN et recrutent les ARN polymérases pour la synthèse des ARN. La régulation à ce niveau est dite transcriptionnelle. Les protéines de liaison à l’ARN s’associent avec l’ARN en cours de synthèse et opèrent divers modifications comme l’addition d’une coiffe en 5’, l’épissage, l’édition et la poly-adénylation en 3’. Les transcrits sont alors exportés vers le cytoplasme où ils vont être adressés et stockés dans des régions subcellulaires. Les ARNm s’assemblent avec des facteurs de traduction et les ribosomes pour initier la synthèse protéique de manière contrôlée. Enfin, les ARNm sont dégradés. Les régulations qui touchent chacune de ces étapes sont dites post-transcriptionnelles. Le développement récent d’outils d’analyse à l’échelle génomique ont permis une meilleure compréhension globale des programmes de régulation des gènes au niveau transcriptionnel. Cependant, l’architecture globale des systèmes qui régulent les étapes post-transcriptionnelles d’expression des gènes est encore peu connue. Un tel système de régulation post-transcriptionnelle doit être contrôlé par des centaines de protéines de liaison à l’ARN et de microARN (miARN) encodés dans les génomes eucaryotes. C’est pourquoi il est important de disposer d’outils et de plateformes adaptés à l’étude de cette régulation à l’échelle génomique. Dans cette thèse, nous nous sommes intéressés à deux programmes de la régulation post-transcriptionnelle chez Caenorhabditis elegans : l’épissage alternatif et la régulation par les miARN. Nous avons utilisés des vers rapporteurs de l’épissage alternatif exprimant la double fluorescence GFP et RFP afin d’étudier l’architecture de cette régulation et l’identification ou la validation des facteurs en trans et des éléments en cis par génétique classique en utilisant la mutagenèse aléatoire, l’automatisation du crible grâce au COPAS biosorter et le séquençage des génomes entiers. Nous avons également modifiés en profondeur le module ReFlx du cytomètre en flux adapté aux organismes de grande taille (COPAS Biosorter) afin d’éliminer les problèmes de contamination et diviser par sept le temps nécessaire au traitement dans le but de mener une étude de génétique inverse à haut débit par ARN interférence. Nous avons enfin générer des lignées fluorescentes bi-colores pour étudier la régulation dépendante de la région 3’ UTR grâce aux microARN. / The regulation of gene expression is fundamental to coordinate the synthesis, assembly and localization of macromolecular complexes in cells. This expression is regulated at various levels. It begins in the nucleus where transcription factors bind to specific DNA sequences and recruit RNA polymerases to synthesize RNA. Regulation at this level is called transcriptional. RNA binding proteins associate with RNA during synthesis and operate various modifications such as the addition of a 5' cap, splicing, editing and polyadenylation at the 3'. The transcripts are then exported to the cytoplasm where they will be sent to subcellular regions and stored. mRNA are then associated with translation factors and ribosomes to initiate protein synthesis in a controlled manner. Finally, mRNAs are degraded. Regulations that affect each of these steps are called post-transcriptional regulations. The recent tools developments for genomic scale analysis have allowed a better overall understanding of gene regulation programs at the transcriptional level. However, the overall architecture of systems that regulate post-transcriptional steps of gene expression is still misunderstood. Such a system of post-transcriptional regulation must be controlled by hundreds of RNA binding proteins and microRNA (miRNA) encoded in eukaryotic genomes. This is why it is important to have tools and platforms suited to the study of the post-transcriptional regulation on a genomic scale. During this thesis, we have focused our work on two post-transcriptional regulation programs in Caenorhabditis elegans : alternative splicing and miRNAs regulation. We used GFP and RFP double fluorescent alternative splicing reporter lines to study the architecture of this regulation and to identify trans factors and cis-elements by using forward genetics, random mutagenesis, automated screen through COPAS biosorter and whole genome sequencing. We also extensively modified the ReFlx module of the COPAS to fix carry over problems and divide by seven the time required for processing in order to conduct a High throughput reverse genetic study using RNA interference. We finally generate bi-color fluorescent lines to study 3 'UTR regulation mediated by microRNAs.

L‘adaptation des bactéries à leur environnement résulte de régulations de l’expression génique pour optimiser leur physiologie aux conditions de culture. Le contrôle de la concentration des ARNm constitue l’une de ces régulations. Il dépend à la fois des variations de transcription et de dégradation des messagers. Si ces deux mécanismes sont bien étudiés à l’échelle moléculaire chez E. coli, leurs poids respectifs sur la régulation du niveau des transcrits à l’échelle du génome restent inconnus en raison de l’absence de données omiques relatives à la dégradation des ARNm lors de changements environnementaux. D’autre part, les paramètres déterminant la stabilité des messagers sont mal identifiés et n’ont jamais été hiérarchisés.Au cours de cette thèse, la stabilité de chacun des ARNm d’E. coli a été mesurée par la détermination du stabilome. Plus précisément, le temps de demi-vie de près de 70 % de tous les messagers a pu être déterminé de façon fiable pour quatre taux de croissance différents obtenus dans les mêmes conditions de culture à l’aide de chémostats. Pour la première fois, cette étude démontre qu’une croissance bactérienne plus rapide entraîne une augmentation globale de la dégradation des transcrits. L’intégration de ces données avec les données transcriptomiques montre que même si la transcription est le mécanisme principal de régulation du niveau des messagers, la dégradation exerce un effet inverse dans la plupart des cas. De plus, le rôle de la dégradation dans le contrôle de la concentration des ARNm s’accentue de façon significative avec l’augmentation du taux de croissance et affecte particulièrement les gènes impliqués dans le métabolisme carboné central. À partir des données de stabilité générées à différents taux de croissance, des approches de biologie intégrative ont permis d’identifier et de hiérarchiser les déterminants de la dégradation des ARNm. Ainsi, la concentration des messagers qui est le principal paramètre, mais aussi le biais de codon, la longueur de la séquence codante et la présence de certains motifs de séquence déterminent la stabilité d’un ARNm. Toutefois, si la hiérarchie des déterminants identifiés reste identique avec la variation du taux de croissance, la stabilité des ARNm de certaines catégories fonctionnelles en est dépendante. Cependant, d’autres déterminants du temps de demi-vie des messagers, en particulier à fort taux de croissance, restent encore à être identifiés. La protéine CsrA, appartenant au système Csr, est un exemple de régulateur post-transcriptionnel qui contrôle positivement ou négativement l’expression d’ARNm par divers mécanismes qui peuvent modifier leur stabilité. Toutefois, l’étendue de l’action de CsrA sur la stabilité des ARNm à l’échelle omique n’a jamais été étudiée. En comparant les stabilomes et transcriptomes d’une souche sauvage et d’une souche où l’activité de CsrA est diminuée, les effets indirects transcriptionnels de CsrA ont été mesurés et de nouveaux ARNm cibles de CsrA dont la stabilité est régulée par la protéine (en majorité stabilisés) ont été identifiés. De plus, la protéine CsrD, régulateur de la stabilité des ARN non codants CsrB/C, n’est pas impliquée dans la régulation de la stabilité des ARNm, mais agit sur la transcription de nombreux gènes indépendamment de son rôle au sein du système Csr. En conclusion, ces travaux ont permis de mieux appréhender les régulations de la stabilité des ARNm, en identifiant leurs déterminants et en caractérisant leur rôle et portée dans le contrôle de la concentration des messagers. Ils soulignent en particulier l’importance de ces régulations dans le processus d’adaptation bactérien / Bacterial adaptation to environment results from regulations of gene expression to optimize cell physiology to growth conditions. Control of mRNA concentration is one of those regulations. It depends on both variations of transcription and transcript degradation. Although these two mechanisms are well defined at the molecular level in E. coli, their respective impact on mRNA level regulation is still unknown at the genome scale because of a lack of omic data on mRNA stability during changing environment. Moreover, parameters determining messenger stability are not yet clearly identified and have never been ranked.During this PhD, the stability of each of the E. coli mRNAs was measured through stabilome determination. More precisely, the half-life of around 70 % of all messengers was reliably determined at four different growth rates obtained in the same growth conditions in chemostats. For the first time, this study demonstrated that increase of growth rate led to global increase of transcript degradation. Integration of these data with transcriptomic data showed that although transcription was the main mechanism which regulated mRNA level, messenger degradation exerted an opposite effect in most of the cases. The role of messenger degradation in the control of mRNA concentration was significantly accentuated with increasing growth rate and affected particularly genes involved in central carbon metabolism. Using mRNA stability data produced at different growth rates, integrative biology approaches allowed identification and ranking of the determinants of messenger stability. mRNA concentration which was the main parameter, but also codon bias, length of the coding sequence, sequence motifs contributed to transcript stability. However, although the hierarchy of determinants remained identical with variations of growth rate, the stability of mRNAs belonging to specific functional categories differed with the growth rate. Nevertheless, other determinants of messenger half-life, in particular at high growth rates still remain to be discovered. The CsrA protein, which belongs to the Csr system, is one example of a post-transcriptional regulator. CsrA positively or negatively controls expression of several mRNAs by mechanisms able to modify transcript stability. Nevertheless, the extent of CsrA effect on mRNA stability at the omic level has never been studied. By comparing stabilomes and transcriptomes of the wild type strain with a strain with reduced CsrA activity, the indirect transcriptional effects of CsrA were measured and new mRNAs whose stability was targeted by CsrA (mostly stabilized), were identified. Moreover, the CsrD protein, a regulator of CsrB/C small RNA stability, was not involved in mRNA stability regulation, but played a role in transcriptional regulation of many genes independently of its role in the Csr system. To conclude, this work provides a better understanding of the regulation of the mRNA stability. It identifies mRNA stability determinants and characterizes the role and extent of mRNA stability regulation in the control of messenger concentration. The study underlines the importance of this regulation in the process of bacterial adaptation

Der erste Teil der Arbeit beschreibt die Etablierung einer modifizierten Form des klassichen SILAC-Verfahrens, das in der quantitativen Massenspektrometrie zur Bestimmung von relativen Änderungen in Proteinmengen benutzt wird. Im sog. „pulsed SILAC (pSILAC)“ Verfahren werden Zellen im Zuge einer differentiellen Behandlung in Kulturmedien transferiert, die unterschiedlich Isotop-markierte Aminosäuren enthalten. Da hier die Quantifizierung auf dem Verhältnis der neusynthetisierten Proteinmengen beruht, können gezielt Unterschiede in der Proteinproduktion bestimmt werden. Mit Hilfe von pSILAC konnte im zweiten Teil der Arbeit erstmals quantitativ erfasst werden, welchen Einfluss microRNAs auf die Proteinsynthese ausüben. So konnte gezeigt werden, dass sowohl die Überexpression als auch die Repression einzelner microRNAs die Produktion hunderter Proteine beeinflussen kann. Außerdem konnten Genprodukte identifiziert werden, die ausschließlich translational reguliert werden. Die Messung von Proteinneusynthese ermöglichte auch die Bestimmung von Proteinumsatzraten, dargestellt im dritten Teil der Arbeit. Zusammen mit mRNA-Umsatzraten sowie Protein- und mRNA-Mengen bilden sie die Grundlage für eine dynamische Beschreibung zelluärer Genexpression. Durch den gleichzeitigen Einsatz des Nukleosidanalogons 4-Thiouridin (4sU) und von schweren Aminosäuren (SILAC) konnte eine metabolische Markierung neusynthetiserter mRNAs und Proteine in murinen Fibroblasten erreicht und damit eine Berechnung von Protein- und mRNA-Halbwertszeiten und absoluten Mengen für ca. 5,000 Gene ermöglicht werden. Während mRNA- und Proteinenmengen deutlich korrelierten, war zwischen mRNA- und Proteinhalbwertszeiten nur eine äußerste schwache Korrelation zu erkennen. Dennoch stehen mRNA- und Proteinumsatzraten nicht einem willkürlichen Zusammhang zu einander, da bestimmte Kombinationen von mRNA- und Proteinhalbwertszeiten eine Optimierung von Genen hinsichtlich ihrer biologischen Funktionen erkennen ließen. / The first part of the thesis describes the establishment of a modified version of the classic SILAC approach routinely used in quantitative mass spectrometry (MS) to assay relative changes in protein levels. In the newly-devised approach termed pulsed SILAC (pSILAC) differentially treated cells are transferred to culture medium supplemented with different versions of stable-isotope labeled heavy amino acids. As MS-based relative quantification is exclusively based on the newly-synthesized heavy protein amounts the method enables the detection of differences in protein production resulting from the treatment. The second part of the thesis shows the use of pSILAC to globally quantify the impact of microRNAs onto the proteome. Ectopic over-expression or knock-down of a single microRNA both affected protein production of hundreds of proteins. pSILAC identified several target genes as exclusively translationally regulated as changes in corresponding transcript levels were virtually absent. Measuring newly-synthesized protein amounts with heavy amino acids in a pulsed-labeling fashion has also been used to determine turnover rates of individual proteins, described in the third part of the present work. Along with transcript turnover as well as mRNA and protein levels they are essential for a dynamic description of gene expression. Simultaneous application of the nucleoside analogue 4-thiouridine (4sU) and heavy amino acids (SILAC) to metabolically label newly-produced mRNAs and proteins in mouse fibroblasts resulted in the calculation of mRNA and protein lifetimes and absolute levels for approximately 5,000 genes. While mRNA and protein levels were overall well correlated, a correlation between mRNA and protein half-lives was virtually absent. Yet this seemingly chaotic distribution of mRNA and protein half-lives was highly instructive since specific gene subsets have obviously evolved distinct combinations of half-lives that relate to their biological functions.

Wir fanden konservierte molekulare Signaturen der Regulation durch Δ7-DA und Ascarosid bei Dauer- und infektiösen Larven. Danach wurde die hohe Konservierung durch unsere Analyse in Dauer- und Postdauer-Stadium zwischen den zwei nah verwandten freilebenden Arten C. elegans und C. briggsae identifiziert. Das heißt, dass die relative Veränderung auf mRNA- oder Protein- Ebene zwischen zwei Arten stark korreliert ist. Aber die relative Veränderung innerhalb derselben Art zeigt keine hochgradige Korrelation zwischen mRNA- und Protein-Ebene. Unsere Ergebnisse zeigen in C. elegans Dauerlarven die signifikante Reduzierung der RNA-Mengen in 20 Stoffwechselwegen. Im Gegensatz dazu speicherten Dauerlarven reichlich RNA-Mengen in GO Termen wie Ribosome und Aminoacyl-tRNA biosynthesis. Auf Protein-Ebene sind die Stoffwechselwege von Proteinsynthese und Proteinverarbeitung im endoplasmatischen Retikulum in Dauerlarven herunterreguliert und GO Terme wie Lysosome sind hochreguliert. Durch die Zeitreihenanalyse der Proteom-Remodellierung der molekularen Signaturen beim Austritt aus dem Dauer-Stadium fand wir, dass GO Terme wie metal ion binding signifikant herunterreguliert sind und der Proteinabbau hochreguliert ist. Unsere Ergebnisse vom pSILAC Experiment deuten an, dass die Proteine für Energieerzeugung und Chaperone/Proteinfaltung beim Daueraustritt schnell verbraucht sind und wieder hergestellt werden. Zum Schluss haben wir als Erste den popomR-Assay in C. elegans etabliert und ein Screening der vermeintlichen Proteinbindestellen auf poly-A-RNA durchgeführt, um in der Zukunft die konservierten Mechanismen der post-transkriptionellen Regulation durch RBPs im Dauer-Stadium zu analysieren. / We found the conservation of molecular signatures by regulating with Δ7-DA and Ascarosid in dauer larvae and infective larvae. Then by our comparative analysis, the high degree of conservation between two closely related free-living species C. elegans and C. briggsae was identified in dauer and post-dauer stages. This means that the relative changes are strongly correlated on the mRNA or the protein level between two species. But the relative changes in the same species don’t show any strong correlation between the mRNA and the protein levels. Our results showed a significantly reduced amount of RNA in 20 metabolic pathways in C. elegans dauer larvae. In contrast, dauer larvae stored a large amount of RNA in GO terms such as ribosome and aminoacyl-tRNA biosynthesis. On the protein level, the metabolic pathways of protein synthesis and protein processing in endoplasmic reticulum were downregulated in dauer larvae and the term of lysosome was up-regulated. Due to time course analysis for proteome remodeling of molecular signatures during exit process from dauer stage, we found that GO terms such as metal ion binding were significantly downregulated during dauer exit and at the same time the protein degradation was up-regulated. Our results of pSILAC experiment suggest that the proteins for energy generation and chaperone/protein folding are quickly spent and rebuilded during dauer exit. Finally, we were the first to establish the popomR assay in C. elegans and performed a screening of the putative protein binding sites on poly-A RNA to analyze the conserved mechanisms of post-transcriptional regulation by RBPs in dauer larvae in the future.

A cellular pre-mRNA undergoes various post-transcriptional processing events, including capping, splicing and polyadenylation prior to nuclear export. Splicing is particularly important for mRNA nuclear export as two distinct multi-protein complexes, known as human TREX (hTREX) and the exon-junction complex (EJC), are recruited to the mRNA in a splicing-dependent manner. In contrast, a number of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) lytic mRNAs lack introns and are exported by the virus-encoded ORF57 protein. Herein we show that ORF57 binds to intronless viral mRNAs and functions to recruit the complete hTREX complex, but not the EJC, in order assemble an export component viral ribonucleoprotein particle (vRNP). The formation of this vRNP is mediated by a direct interaction between ORF57 and the hTREX export adapter protein, Aly. Aly in turn interacts directly with the DEAD-box protein UAP56, which functions as a bridge to recruit the remaining hTREX proteins to the complex. Moreover, we show that a point mutation in ORF57 which disrupts the ORF57-Aly interaction leads to a failure in the ORF57-mediated recruitment of the entire hTREX complex to the intronless viral mRNA and inhibits the mRNAs subsequent nuclear export and virus replication. Furthermore, we have utilised a trans-dominant Aly mutant to prevent the assembly of the complete ORF57-hTREX complex; this results in a vRNP consisting of viral mRNA bound to ORF57, Aly and the nuclear export factor, TAP. Strikingly, although both the export adapter Aly and the export factor TAP were present on the viral mRNP, a dramatic decrease in intronless viral mRNA export and virus replication was observed in the absence of the remaining hTREX components (UAP56 and hTHO-complex). Together, these data provide the first direct evidence that the complete hTREX complex is essential for the export of KSHV intronless mRNAs and infectious virus production.