O estômago do rato completa sua maturação durante a fase de transição alimentar, em que ocorre ingestão de ração juntamente com leite materno. No desmame precoce (DP) esta fase é interrompida e provoca elevação da corticosterona (CORT). Nosso objetivo foi avaliar, através do tratamento com RU486 (RU), se a CORT elevada modifica a maturação gástrica. Grupos experimentais: amamentado (A), ARU, DP e DPRU. Resultados de PCRq, em filhotes: o DP elevou a expressão de Muc5ac, Bhlha15, Pgc e diminuiu a expressão de Pga5, enquanto que o RU486 reverteu os resultados para Pgc e Muc5ac,. Ainda em filhotes, DP aumentou o número de células mucosas do colo (CMCs), células Mist1-positivas e PGC-positivas, e o RU486 reverteu o resultado para as CMCs e para as PGC-positivas. Em adultos, obtivemos os seguintes dados: redução de Pga5, causada pelo RU486; manutenção dos efeitos do DP sobre Pgc; manutenção dos dados, tanto de DP quanto de RU486, sobre as CMCs; e dos efeitos do RU486 sobre as células PGC-positivas. Portanto, a CORT elevada pelo DP é fundamental na maturação gástrica. / Rat´s gastric mucosa completes their maturation throughout the food transition process, when pups ingest chow and maternal milk. Early weaning (EW) consists in an abrupt suckling (S) interruption that increases corticosterone (CORT) levels. Our aim was to evaluate, using RU486 (RU), if these increase in CORT levels could affect gastric maturation. Experimental groups: S, SRU, EW and EWRU. By RT-qPCR, in 17-d-old rats, EW increased Muc5ac, Bhlha15 and Pgc and decreased Pga5 expression, while RU486 reverted the results for Pgc and Muc5ac. In 17 and 18-d-old pups, EW increased mucous neck cells (MNC), Mist1-positive and PGC-positive cells, although CORT inhibition reverted the result for MNC and PGC. In 30-d-old rats, we had the following results: reduction on Pga5 expression provoked by RU486; the results over Pgc were maintained; the results, caused both by EW as RU486, over MNC were maintained, as well as the effects of RU486 over PGC-positive cells. We concluded that the increase in CORT levels, caused by EW, plays a fundamental role in gastric maturation.

O estômago do rato completa sua maturação durante a fase de transição alimentar, em que ocorre ingestão de ração juntamente com leite materno. No desmame precoce (DP) esta fase é interrompida e provoca elevação da corticosterona (CORT). Nosso objetivo foi avaliar, através do tratamento com RU486 (RU), se a CORT elevada modifica a maturação gástrica. Grupos experimentais: amamentado (A), ARU, DP e DPRU. Resultados de PCRq, em filhotes: o DP elevou a expressão de Muc5ac, Bhlha15, Pgc e diminuiu a expressão de Pga5, enquanto que o RU486 reverteu os resultados para Pgc e Muc5ac,. Ainda em filhotes, DP aumentou o número de células mucosas do colo (CMCs), células Mist1-positivas e PGC-positivas, e o RU486 reverteu o resultado para as CMCs e para as PGC-positivas. Em adultos, obtivemos os seguintes dados: redução de Pga5, causada pelo RU486; manutenção dos efeitos do DP sobre Pgc; manutenção dos dados, tanto de DP quanto de RU486, sobre as CMCs; e dos efeitos do RU486 sobre as células PGC-positivas. Portanto, a CORT elevada pelo DP é fundamental na maturação gástrica. / Rat´s gastric mucosa completes their maturation throughout the food transition process, when pups ingest chow and maternal milk. Early weaning (EW) consists in an abrupt suckling (S) interruption that increases corticosterone (CORT) levels. Our aim was to evaluate, using RU486 (RU), if these increase in CORT levels could affect gastric maturation. Experimental groups: S, SRU, EW and EWRU. By RT-qPCR, in 17-d-old rats, EW increased Muc5ac, Bhlha15 and Pgc and decreased Pga5 expression, while RU486 reverted the results for Pgc and Muc5ac. In 17 and 18-d-old pups, EW increased mucous neck cells (MNC), Mist1-positive and PGC-positive cells, although CORT inhibition reverted the result for MNC and PGC. In 30-d-old rats, we had the following results: reduction on Pga5 expression provoked by RU486; the results over Pgc were maintained; the results, caused both by EW as RU486, over MNC were maintained, as well as the effects of RU486 over PGC-positive cells. We concluded that the increase in CORT levels, caused by EW, plays a fundamental role in gastric maturation.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-11T14:54:39Z No. of bitstreams: 1 tatiannerosadossantos.pdf: 725266 bytes, checksum: 4d63e46332dc22b61f5160db1ed39b37 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-14T17:11:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 tatiannerosadossantos.pdf: 725266 bytes, checksum: 4d63e46332dc22b61f5160db1ed39b37 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-14T17:11:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tatiannerosadossantos.pdf: 725266 bytes, checksum: 4d63e46332dc22b61f5160db1ed39b37 (MD5) Previous issue date: 2011-02-21 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A Ipriflavona (7-isopropoxi-3-fenil-4H-benzopiran-4-ona), um derivado sintético da isoflavona daidzeína, com ação estrogênica comprovada tem sido utilizado por mulheres com objetivo de aumentar a densidade óssea e prevenir a perda óssea. Estudos de toxicologia reprodutiva no período pré-implantacional apontam indícios de toxicidade, interferindo na implantação do blastocisto. Também foi demonstrado que a ipriflavona interfere na via de sinalização Hedgehog, importante no período de desenvolvimento embrionário. Estudos demonstram que as isoflavonas são transferidas para o leite materno o que poderia ocasionar danos a prole. Porém não foram encontrados estudos de toxicologia no período de lactação e desenvolvimento das crias utilizando-se da ipriflavona, sendo este o objetivo desse trabalho. Para o estudo foram utilizadas 60 ratas Wistar, provenientes do biotério do Centro de Biologia da Reprodução, Universidade Federal de Juiz de Fora. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em cinco grupos experimentais (n = 12): controle da colônia, controle experimental e tratados 1, 2 e 3. O primeiro grupo não sofreu nenhum tipo de manipulação e foi utilizado para verificar os possíveis efeitos da gavagem. O segundo grupo recebeu via intragástrica, duas vezes ao dia, do 2º ao 16º dia de lactação, 1 ml de água destilada e os grupos tratados receberam; pelo mesmo procedimento, 1 ml de suspensão aquosa de ipriflavona nas doses de 0,01; 0,05 e 0,1 mg/g/dia, respectivamente. As variáveis maternas analisadas foram: presença de sinais clínicos de toxicidade; ganho de peso corporal e consumo de ração. Foram observados comportamentos maternais como: postura de amamentação, organização e manutenção do ninho, ato de recuperar, recolher filhotes e lambê-los. Os filhotes foram analisados quanto ao desenvolvimento físico e reflexológico. Como variáveis de desenvolvimento físico foram analisados: peso corporal, abertura dos olhos, desdobramento das orelhas, aparecimento de lanugo e pêlos, erupção dos incisivos superiores e inferiores, a abertura vaginal ou descida dos testículos. Para observação do desenvolvimento reflexológico foram feitos os seguintes testes: preensão palmar, resposta postural, esquiva ao abismo, orientação e geotaxia negativa. No modelo experimental estudado a ipriflavona não demonstrou indícios de toxicidade materna, nem alterações no desenvolvimento físico e reflexológico da prole. / The Ipriflavone (7-isopropoxy-3-phenyl-4H-benzopyran-4-one), a synthetic derivative of the isoflavone daidzein, with proven estrogenic activity has been used by women in order to increase bone density and prevent bone loss. Reproductive toxicology studies in the pre-implantation show signs of toxicity, which interferes with implantation of the blastocyst. It was also shown that ipriflavone affects the Hedgehog signaling pathway, important during embryonic development. Studies show that isoflavones are transferred to breast milk which can cause damage to offspring. However no studies were found in toxicology during lactation and development of offspring using the ipriflavone, which is the aim of this work. For the study were used 60 female Wistar rats from the vivarium of the Center for Reproductive Biology, Federal University of Juiz de Fora. The animals were randomly divided into five groups (n = 12) control of the colony, experimental control and treated 1, 2 and 3. The first group did not have any type of manipulation and was used to assess the possible effects of gavage. The second group received intragastrically, twice a day, from the 2nd to the 16th days of lactation, 1 ml of distilled water and the treated groups received, by the same procedure, 1 ml of water suspension of ipriflavone at doses of 0,01; 0,05 e 0,1 mg/g/day, respectively. Maternal variables were analyzed: presence of clinical signs of toxicity, body weight gain and food intake. Maternal behaviors were observed as: breastfeeding posture, organization and maintenance of the nest, the act of recovering, collecting pups and licking them. The pups were assessed for physical development and reflexology. As physical variables were analyzed: body weight, eye opening, unfolding of the ears, and appearance of lanugo hair, eruption of upper and lower incisors, the vaginal opening or descent of the testicles. For observing the reflexology development the following tests were made: grip, posture response, dodging the abyss, orientation, and negative geotaxis. In the experimental model studied ipriflavone showed no signs of maternal toxicity, or changes in the physical and reflexology development of offspring.

Orientadores: Luis Antonio Violin Dias Pereira, Lúcia Elvira Alvares / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T14:05:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbieri_MainaraFerreira_M.pdf: 6077469 bytes, checksum: c80011c6f6fca680e92ac99691a9c348 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A origem da albumina nos órgãos do trato reprodutor masculino tem sido questionada ao longo dos anos sendo sua presença tecidual constantemente atribuída a um mecanismo de extravasamento do plasma sanguíneo para o espaço extravascular intersticial, atribuindo-se ao fígado o papel de sítio de síntese desta proteína no período pós-natal. O padrão de distribuição da proteína albumina nos tecidos epiteliais de órgãos do trato reprodutor masculino reserva questionamentos quanto à veracidade de seu alcance luminal pelo rompimento de suas barreiras hematoteciduais. Carreador de esteroides; estimulador de células de Leydig; mediador do mecanismo parácrino de comunicação entre células de Sertoli e germinativas; promotor de proliferação celular e mediador de mudanças estruturais em membranas celulares, com suposta participação na reação acrossômica e capacitação do espermatozoide são possíveis papéis atribuídos à albumina no trato reprodutor masculino. A associação da proteína albumina a componentes glicídicos não é usual para mamíferos, porém há respaldo a essa hipótese através das PES (glicoproteínas pré-albumínicas epidídimo-específicas de ovinos) e dados de nosso grupo de pesquisa através do epítopo reconhecido pelo anticorpo monoclonal (Amc) TRA 54 (testicular germ cells immunized to rat). Essa dissertação de mestrado retoma a polêmica discussão centrada na presença, origem, localização e função da albumina no trato reprodutor masculino e se propôs, através de uma abordagem cronológica pós-natal (períodos neonatal, pré-púbere, púbere, adulto e idoso) a rediscutir os fundamentos teóricos associados à principal proteína sérica de mamíferos bem como o dúbio perfil de expressão dessa proteína em Ratos analbuminêmicos Nagase (NAR). Nesse estudo, a presença da proteína albumina foi evidenciada por immunoblotting em todos os grupos e períodos do desenvolvimento pós-natal, apresentando padrão distinto de bandeamento para testículos e epidídimos NAR. A localização celular da proteína albumina foi identificada em camundongos, por imunohistoquímica, principalmente no tecido intersticial e nas células da linhagem germinativa. Testículos de ratos Sprague Dawley adultos apresentaram marcação adicional para células de Sertoli. Testículos e epidídimos de NAR mantiveram reatividade intersticial, sugerindo, ainda que em níveis extremamente baixos, a expressão de albumina. Para epidídimos, foi identificado amplo espectro de perfis de imunomarcação das células epiteliais e estereocílios. Ductos deferentes apresentaram, na região proximal ao epidídimo, imunomarcação citoplasmática e, na região distal, marcação de estereocílios e espermatozoides luminais. Perfis de imunomarcação citoplasmática também foram observados em vesícula seminal, próstata e uretra peniana, principalmente, no período adulto. Por fim, a presença de transcritos de RNAm detectados por ensaios de RT PCR (reação em cadeia de polimerase via transcriptase reversa) para testículos e epidídimos foi confirmada desde o período neonatal até idoso, mostrando-se também presente para ducto deferente a partir da puberdade. A abordagem do desenvolvimento pós-natal revelou um pico de maior expressão da albumina no período adulto com início do declínio registrado no período idoso. Como ressalva final, a confirmação da presença de RNAm para órgãos do trato reprodutor masculino não invalida a hipótese da também presença de albumina circulante, sintetizada, em primeira instância, pelas células hepáticas / Abstract: The origin of the albumin in the male reproductive tract has been questioned over the years and their presence tissue constantly assigned to a mechanism for extravasation of plasma into the interstitial extravascular space, assigning the role of the liver as the site of synthesis of this protein in the postnatal period. The distribution pattern of the albumin protein in the epithelial tissues of organs of the male reproductive tract reserves inquiries as to the veracity of their luminal reach through the disruption of their tissue blood-barriers. Carrier steroids; stimulator of Leydig cells; mediator of paracrine mechanism of communication between Sertoli and germ cells; promoter of cell proliferation and mediator of structural changes in cell membranes, with alleged involvement in the acrosome reaction and capacitation of sperm are possible roles of albumin in the male reproductive tract. The association of the albumin protein to glycidyl components is unusual for mammals, but there is support to this hypothesis by the PES (prealbumins epididymis-specific glycoproteins of sheep) and data from our research group through the epitope recognized by the monoclonal antibody (mAb) TRA 54 (testicular germ cells immunized to rat). This dissertation takes up the controversial discussion centered on the presence, source, location and function of albumin in the male reproductive tract and proposed, through a chronological postnatal approach (neonatal, prepubertal, puberal, adult and elderly periods) to revisit the theoretical foundations associated with major serum protein of mammals as well as the dubious expression profile of this protein in Nagase analbuminemic rats (NAR). In this study, the presence of albumin protein was detected by immunoblotting in all groups and periods of postnatal development, with distinct banding pattern in testis and epididymis of NAR. The cellular localization of the albumin protein has been identified in mice by immunohistochemistry mainly in the interstitial tissue and in germline cells. Testes of Sprague Dawley rats showed additional labeling of Sertoli cells. Testes and epididymides of NAR maintained interstitial reactivity, suggesting the expression of albumin even at extremely low levels. To epididymis a broad spectrum of immunostaining of epithelial cells and stereocilia profiles were identified. Vas deferens showed cytoplasmic immunostaining in the region proximal to epididymis, and in the distal region, stereocilia and luminal spermatozoa labeling. Cytoplasmic immunostaining profiles were also observed in the seminal vesicle, prostate and penile urethra, especially in adult period. Finally, the presence of mRNA transcripts detected by RT PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) assays to testis and epididymis was confirmed from neonates to the elderly, being also present in vas deferens from puberty. The approach of postnatal development revealed a peak with the highest expression of albumin in the adult period beginning to decline at elderly. As a final caveat, the presence of mRNA confirmed for organs of the male reproductive tract does not invalidate the hypothesis of the also presence of circulating albumin in reproductive tissue, which must be synthesized at first instance, by liver cells / Mestrado / Biologia Tecidual / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

O objetivo desta pesquisa foi quantificar os neurônios mioentéricos do jejuno e do colo durante o desenvolvimento pós-natal de ratos Wistar utilizando morfometria com enfoque estereológico e analisar as mudanças na área ocupada por neurônios e axônios mediante Sistemas de Informação Geográfica (SIG). Foram usadas 20 fêmeas de ratos da linhagem Wistar, divididas em grupos de acordo com a idade pós-natal em dias (G0, G7, G21 e G60). A análise morfométrica foi realizada em preparados totais de membrana usando azul cuprolínico, histoquímica para acetilcolinesterase (AChE) e NADPH-diaforase (NADPH-d), e imuno-histoquímicas para VIP e substância P. Foram estimadas a densidade numérica neuronal/área de superfície serosa, o número total de neurônios por segmento e a área neuronal média. A análise da área ocupada por neurônios e axônios foi realizada a partir de imagens de NADPH-d e AChE. Ocorreu uma diminuição significativa na densidade neuronal/área, nos neurônios totais e nos neurônios nitrérgicos a partir de G7 no jejuno e de G0 no colo, e nos neurônios colinérgicos entre G0 e G7 no jejuno e G0 e G21 no colo. O número total de neurônios corados com azul cuprolínico aumentou significativamente no colo a partir de G7; houve aumento dos neurônios nitrérgicos entre G7 e G21 e nos neurônios colinérgicos entre G21 e G60. No jejuno somente houve aumento do número total de neurônios nitrérgicos entre G0 e G7. Também foi percebido um aumento significativo na área dos neurônios nitrérgicos a partir de G7 no jejuno e de G0 no colo, e dos neurônios colinérgicos entre G7 e G21 no jejuno e G0 e G21 no colo. A área ocupada pelos axônios aumentou entre os grupos G0 e G7, diminuiu entre G7 e G21 e aumentou de novo entre G21 e G60. Estes resultados demonstraram que os neurônios e os axônios sofrem mudanças morfológicas e químicas durante o desenvolvimento pós-natal do sistema nervoso entérico, provavelmente devido a fatores microambientais como os fatores de crescimento e de replicação, a alimentação e o próprio crescimento do intestino. É possível que a completa maturidade do intestino somente seja completada quando este finaliza o seu processo de crescimento. / The aim of this study was to quantify jejunum and colon myenteric neurons during postnatal development in Wistar rats using morphometry and to analyse the changes in the area occupied by neurons and axons using Geographic Information Sistem (GIS). Twenty female Wistar rats divided in groups according to the age in days (G0, G7, G21 e G60) were used. Whole mount preparations using cuprolinic blue (CB), histochemistry for acetyl-cholinesterase (AChE) and NADPH-diaphorase (NADPH-d) and immunohistochemistry for VIP and substance P were used for morphometric evaluation. Neuronal numerical density/area of serosal surface, total number of neurons for segment and mean neuronal area were estimated. Analyses of the area ocuppied by neurons and axons were performed using images of NADPH-d and AChE. This study showed a significant decrease in the neuronal numerical density/area in total and nitrergic neurons from G7 in jejunum and G0 in colon, and in cholinergic neurons from G0 and G7 in jejunum and G0 and G21 in colon. In colon, total number of neurons increased significantly in cuprolinic blue stain from G7, in NADPH-d between G7 and G21 and in AChE between G21 and G60. In jejunum, there was a significant increase in the same parameter between G0 and G7 in NADPH-d. There was also a significant increase in the mean area of nitrergic neurons from G7 in jejunum and from G0 in colon, and in cholinergic neurons between G7 and G21 in jejunum and between G0 and G21 in colon. The area occupied by axons increased between G0 and G7, between G7 and G21 decreased and increased again between G21 and G60. This results showed that neurons and axons suffer morphologic and chemical changes during postnatal development in the enteric nervous system, probably due to micro-environmental factors as growth and replication factors, nutrition and growing of the intestine. It is possible that complete maturity of the intestine is achieved when it finishes its growing process.

O estado nutricional influencia o crescimento gástrico, e enquanto a proliferação celular é estimulada pelo jejum em filhotes, ela é inibida em ratos adultos. A corticosterona também age no desenvolvimento, e seus efeitos são regulados pela corticosterone binding globulin (CBG) e receptores de glicocorticóides (GR). Para investigar se a atividade da corticosterona responde ao jejum e como possíveis mudanças poderiam controlar o ciclo celular epitelial gástrico, nós avaliamos diferentes parâmetros durante a progressão do jejum em ratos de 18 e 40 dias de vida pós-natal. A restrição alimentar induziu um aumento de corticosterona no plasma em ambas as idades, mas apenas em filhotes o binding da CBG se elevou após o jejum curto, permanecendo alto até o final do tratamento. O jejum aumentou a atividade transcricional do GR na mucosa gástrica e os níveis protéicos, porém o efeito foi mais pronunciado em adultos. Além disso, observamos que nos filhotes, o GR é principalmente citoplasmático, enquanto em animais adultos, o receptor é acumulado no núcleo durante o jejum. As proteínas HSP 70 e HSP 90 foram diferencialmente reguladas, e podem contribuir para a estabilidade do GR no citoplasma em filhotes, e para o trânsito de GR para o núcleo em animais adultos. Quanto ao ciclo celular epitelial, observamos que em filhotes, ciclina D1 e p21 aumentaram durante o jejum, enquanto em ratos adultos, a ciclina E diminuiu e a p27 aumentou muito. Assim, nós demonstramos que a atividade da corticosterona é diferencialmente regulada pelo jejum em filhotes e ratos adultos, e que as variaçõe observadas poderiam atenuar um possível efeito supressor durante o desenvolvimento pós-natal. Sugerimos que este mecanismo pode estimular a proliferação celular e possibilitar o crescimento da mucosa gástrica durante condições nutricionais adversas. / The nutritional status influences gastric growth, and interestingly, whereas cell proliferation is stimulated by fasting in suckling rats, it is inhibited in adult animals. Corticosterone takes part in the mechanisms that govern development, and its effects are regulated in particular by corticosterone binding globulin (CBG) and glucocorticoid receptor (GR). To investigate whether corticosterone activity responds to fasting and how possible changes might control gastric epithelial cell cycle, we evaluated different parameters during the progression of fasting in 18- and 40-d-old rats. Food restriction induced higher corticosterone plasma concentration at both ages, but only in pups did CBG binding increase after short and long-term treatments. Fasting also increased gastric GR at transcriptional and protein levels, but the effect was more pronounced in 40-d-old animals. Moreover, in pups, GR was observed in the cytoplasm, whereas in adults, it accumulated in the nucleus after the onset of fasting. HSP 70 and HSP 90 were differentially regulated, and might contribute to the stability of GR and to the high cytoplasmic levels in pups and elevated shuttling in adult rats. As for gastric epithelial cell cycle, whereas cyclin D1 and p21 increased during fasting in pups, in adults, cyclin E slowly decreased concomitant with higher p27. In summary, we demonstrated that corticosterone function is differentially regulated by fasting in 18- and 40-d-old rats, and such variation might attenuate any possible suppressive effects during postnatal development. We suggest that this mechanism could ultimately increase cell proliferation and allow regular gastric growth during adverse nutritional conditions.

O epitélio gástrico de ratos passa por modificações morfofisiológicas importantes durante o primeiro mês de vida pós-natal e a dieta é um dos principais fatores que influenciam esse desenvolvimento. Ratos receberam dieta com 20% (C) ou 8% (RP) de proteína, durante o período pré e pós-natal. Avaliamos em ratos de 14, 30 e 50 dias os efeitos da restrição protéica sobre proliferação celular no epitélio gástrico, massa do estômago e corpórea, comprimento do intestino e, expressão de ghrelina no estômago e no plasma. O grupo RP apresentou proliferação celular, massa do estômago e corpórea e comprimento do intestino reduzidos em relação ao grupo C. E maior imunomarcação para ghrelina em animais RP com 30 e 50d em comparação ao grupo C. Não houve diferença na imunomarcação entre animais de 14d. Os níveis plasmáticos de ghrelina apresentaram a mesma tendência observada na imunomarcação. O consumo de quantidade adequada de proteína é importante durante o desenvolvimento gástrico de ratos e a ghrelina apresenta resposta hormonal diferente de acordo com a idade do animal. / The gastric epithelium of rats undergoes morphophysiological changes throughout the first month of life and diet is one of the main factors influencing the development. Rats were fed a 20% (NP) or 8% (RP) protein diet throughout the pre- and post-natal life. We analyzed the cell proliferation and observed the body and stomach weight and small intestine length at 14, 30 and 50 days rats. Additionally, we evaluated ghrelin in gastric epithelium and its plasma levels. Cell proliferation in the gastric epithelium, body and stomach weight and small intestine length were reduced in RP animals when compared to NP animals. We observed an increase in the number of labeled cells for ghrelin in 30- and 50-d-old RP rats when compared to the NP group and no difference was found in 14-d-old animals. Plasma ghrelin levels showed the same results observed in immunohistochemical reactions. These results emphasize the importance of diet protein on the development of gastric mucosa and protein restriction seems to differently modulate ghrelin response at different ages.

Development of hair cell stereocilia bundles involves three stages: elongation, thickening, and supernumerary stereocilia retraction. Although Myo-XVa is known to be essential for stereocilia elongation, its role in retraction/thickening remains unknown. We quantified stereocilia numbers/diameters in shaker-2 mice (Myo15sh2) that have deficiencies in “long” and “short” isoforms of myosin-XVa, and in mice lacking only the “long” myosin-XVa isoform (Myo15ΔN). Our data showed that myosin-XVa is largely not involved in the developmental retraction of supernumerary stereocilia. In normal development, the diameters of the first (tallest)/second row stereocilia within a bundle are equal and grow simultaneously. The diameter of the third row stereocilia increases together with that of taller stereocilia until P1-2 and then either decreases almost two-fold in inner hair cells (IHCs) or stays the same in outer hair cells (OHCs), resulting in a prominent diameter gradation in IHCs and less prominent in OHCs. Sh2 mutation abolishes this gradation in IHCs/OHCs. Stereocilia of all rows grow in diameters nearly equally in Myo15sh2/sh2 IHCs and OHCs. Conversely, ΔN mutation does not affect normal stereocilia diameter gradation until ~P8. Therefore, myosin-XVa “short” isoform is essential for developmental thinning of third row stereocilia, which causes diameter gradation within a hair bundle.

O objetivo desta pesquisa foi quantificar os neurônios mioentéricos do jejuno e do colo durante o desenvolvimento pós-natal de ratos Wistar utilizando morfometria com enfoque estereológico e analisar as mudanças na área ocupada por neurônios e axônios mediante Sistemas de Informação Geográfica (SIG). Foram usadas 20 fêmeas de ratos da linhagem Wistar, divididas em grupos de acordo com a idade pós-natal em dias (G0, G7, G21 e G60). A análise morfométrica foi realizada em preparados totais de membrana usando azul cuprolínico, histoquímica para acetilcolinesterase (AChE) e NADPH-diaforase (NADPH-d), e imuno-histoquímicas para VIP e substância P. Foram estimadas a densidade numérica neuronal/área de superfície serosa, o número total de neurônios por segmento e a área neuronal média. A análise da área ocupada por neurônios e axônios foi realizada a partir de imagens de NADPH-d e AChE. Ocorreu uma diminuição significativa na densidade neuronal/área, nos neurônios totais e nos neurônios nitrérgicos a partir de G7 no jejuno e de G0 no colo, e nos neurônios colinérgicos entre G0 e G7 no jejuno e G0 e G21 no colo. O número total de neurônios corados com azul cuprolínico aumentou significativamente no colo a partir de G7; houve aumento dos neurônios nitrérgicos entre G7 e G21 e nos neurônios colinérgicos entre G21 e G60. No jejuno somente houve aumento do número total de neurônios nitrérgicos entre G0 e G7. Também foi percebido um aumento significativo na área dos neurônios nitrérgicos a partir de G7 no jejuno e de G0 no colo, e dos neurônios colinérgicos entre G7 e G21 no jejuno e G0 e G21 no colo. A área ocupada pelos axônios aumentou entre os grupos G0 e G7, diminuiu entre G7 e G21 e aumentou de novo entre G21 e G60. Estes resultados demonstraram que os neurônios e os axônios sofrem mudanças morfológicas e químicas durante o desenvolvimento pós-natal do sistema nervoso entérico, provavelmente devido a fatores microambientais como os fatores de crescimento e de replicação, a alimentação e o próprio crescimento do intestino. É possível que a completa maturidade do intestino somente seja completada quando este finaliza o seu processo de crescimento. / The aim of this study was to quantify jejunum and colon myenteric neurons during postnatal development in Wistar rats using morphometry and to analyse the changes in the area occupied by neurons and axons using Geographic Information Sistem (GIS). Twenty female Wistar rats divided in groups according to the age in days (G0, G7, G21 e G60) were used. Whole mount preparations using cuprolinic blue (CB), histochemistry for acetyl-cholinesterase (AChE) and NADPH-diaphorase (NADPH-d) and immunohistochemistry for VIP and substance P were used for morphometric evaluation. Neuronal numerical density/area of serosal surface, total number of neurons for segment and mean neuronal area were estimated. Analyses of the area ocuppied by neurons and axons were performed using images of NADPH-d and AChE. This study showed a significant decrease in the neuronal numerical density/area in total and nitrergic neurons from G7 in jejunum and G0 in colon, and in cholinergic neurons from G0 and G7 in jejunum and G0 and G21 in colon. In colon, total number of neurons increased significantly in cuprolinic blue stain from G7, in NADPH-d between G7 and G21 and in AChE between G21 and G60. In jejunum, there was a significant increase in the same parameter between G0 and G7 in NADPH-d. There was also a significant increase in the mean area of nitrergic neurons from G7 in jejunum and from G0 in colon, and in cholinergic neurons between G7 and G21 in jejunum and between G0 and G21 in colon. The area occupied by axons increased between G0 and G7, between G7 and G21 decreased and increased again between G21 and G60. This results showed that neurons and axons suffer morphologic and chemical changes during postnatal development in the enteric nervous system, probably due to micro-environmental factors as growth and replication factors, nutrition and growing of the intestine. It is possible that complete maturity of the intestine is achieved when it finishes its growing process.

O epitélio gástrico de ratos passa por modificações morfofisiológicas importantes durante o primeiro mês de vida pós-natal e a dieta é um dos principais fatores que influenciam esse desenvolvimento. Ratos receberam dieta com 20% (C) ou 8% (RP) de proteína, durante o período pré e pós-natal. Avaliamos em ratos de 14, 30 e 50 dias os efeitos da restrição protéica sobre proliferação celular no epitélio gástrico, massa do estômago e corpórea, comprimento do intestino e, expressão de ghrelina no estômago e no plasma. O grupo RP apresentou proliferação celular, massa do estômago e corpórea e comprimento do intestino reduzidos em relação ao grupo C. E maior imunomarcação para ghrelina em animais RP com 30 e 50d em comparação ao grupo C. Não houve diferença na imunomarcação entre animais de 14d. Os níveis plasmáticos de ghrelina apresentaram a mesma tendência observada na imunomarcação. O consumo de quantidade adequada de proteína é importante durante o desenvolvimento gástrico de ratos e a ghrelina apresenta resposta hormonal diferente de acordo com a idade do animal. / The gastric epithelium of rats undergoes morphophysiological changes throughout the first month of life and diet is one of the main factors influencing the development. Rats were fed a 20% (NP) or 8% (RP) protein diet throughout the pre- and post-natal life. We analyzed the cell proliferation and observed the body and stomach weight and small intestine length at 14, 30 and 50 days rats. Additionally, we evaluated ghrelin in gastric epithelium and its plasma levels. Cell proliferation in the gastric epithelium, body and stomach weight and small intestine length were reduced in RP animals when compared to NP animals. We observed an increase in the number of labeled cells for ghrelin in 30- and 50-d-old RP rats when compared to the NP group and no difference was found in 14-d-old animals. Plasma ghrelin levels showed the same results observed in immunohistochemical reactions. These results emphasize the importance of diet protein on the development of gastric mucosa and protein restriction seems to differently modulate ghrelin response at different ages.