C/EBPα und C/EBPβ sind Transkriptionsfaktoren, die die Zellproliferation und Zelldifferenzierung in vielen Geweben regulieren. C/EBPα und C/EBPβ spielen auch eine onkogene Rolle in akuter myeloischer Leukämie und anaplastisch-großzelligen Lymphomen (ALCL). In dieser Studie wird C/EBPα auf neue posttranslationale Modifikationen, wie z. B. Arginin-Methylierungen und Citrullinierungen, sowie Lysin-Methylierungen und Acetylierungen, mit massenspektrometrischen Mitteln untersucht. Es werden eine modifizierbare C/EBPα-Arginin-Citrullinierungsposition und die C/EBPα-Lysinsumoylierung eingehend auf ihren Einfluss auf C/EBPα-Proteininteraktionsnetzwerk überprüft. Außerdem wurde im Verlauf dieser Studie ein Hochdurchsatz-Screening-Verfahren entwickelt, das wir Protein Interaktions-Screening auf einer Peptid Matrix (PrISMa) nennen. Dieses Verfahren dient der Aufklärung des modifikationsabhängigen Proteininteraktionsnetzwerkes von C/EBPβ. PrISMa basiert auf einer Peptidmembran, auf der C/EBPβ-Peptide synthetisiert sind. Viele dieser Peptide enthalten methylierte Arginine und Lysine, acetylierte Lysine, citrullinierte Arginine und phosphorylierte Serine, Tyrosine und Threonine. Mittels PrISMa konnten Interaktionen von C/EBPβ mit Histonacetyltransferasen, dem Mediatorkomplex, Proteinen des nukleären Transports und RNA bindenden und spleißenden Proteinen verifiziert und kartiert werden. Des Weiteren konnte mit Hilfe von PrISMa eine große Anzahl von publizierten C/EBPβ Interaktionspartner spezifischen C/EBPβ-Sequenzen zugeordnet werden. C/EBPβ wird in ALCL in hohem Maße exprimiert und ist für die Zellproliferation dieser Krebsart wichtig. In dieser Studie wird das Proteininteraktionsnetzwerk C/EBPβ in einer ALCL Zelllinie aufgeklärt, um tiefere Einsichten über die Funktion von C/EBPβ als Onkogen zu erlangen. / C/EBPα and C/EBPβ regulate cell proliferation and differentiation in multiple cell types. Moreover, C/EBPα and C/EBPβ are known to play oncogenic roles in acute myeloid leukemia and anaplastic large cell lymphomas (ALCLs). In this study C/EBPα is screened for novel posttranslational modifications (PTMs), such as arginine methylation and citrullination, as well as lysine methylation and acetylation by using mass spectrometry. A in this survey identified C/EBPα site of arginine citrullination and the C/EBPα lysine sumoylation are scrutinized for their impact on C/EBPα protein interaction network. A new high-throughput method named Protein Interaction Screen on peptide Matrices (PrISMa) is introduced in this study. This method was developed to determine the C/EBPβ protein interaction network in a PTM dependent manner. The PrISMa survey is based on a peptide membrane spotted with C/EBPβ peptides. Many of these C/EBPβ peptide sequences contain amino acid sequences comprising arginine and lysine methylation, lysine acetylation, arginine citrullination and serine, tyrosine and threonine phosphorylation. By means of PrISMa the C/EBPβ interplay with histone acetyltransferases, the mediator complex, proteins of the nucleoplasmic transport and RNA processing proteins is verified and specified by mapping these interactions to C/EBPβ amino acid sequences. Furthermore, PrISMa provides a map of C/EBPβ protein interaction patterns for a great number of the up to date published C/EBPβ protein interaction partners. C/EBPβ is highly expressed in ALCL cell lines and is essential for the cell proliferation of this type of cancer. In this study the C/EBPβ protein-protein interaction pattern in an ALCL cell line is unraveled providing valuable insight into the protein interaction network of C/EBPβ as an oncogene.

Protein-Protein-Wechselwirkungen steuern zelluläre Funktionen auf molekularer Ebene. Posttranslationale Proteinmodifikationen beeinflussen diese Wechselwirkungen und erlauben dynamische Regulierung. Tyrosinphosphorylierung ist eine besonders relevante Modifikation, weil sie eng mit interzellulärer Regulation von Wachstum und Enticklung in Vielzellern verbunden ist. Da falsche Regulierung dieser Prozesse zu Krebs oder Autoimmunerkrankungen führen kann, ist sie auch von großem medizinischen Interesse. In Hefe-Zwei-Hybrid- Untersuchungen mit Volllängen-Proteinen im Genommaßstab wurde ein umfassender Satz von 292 größtenteils neuen phosphotyrosinabhängigen Proteinwechselwirkungen erster Güte ermittelt. Damit wurde eine Wissenslücke im Bereich der phosphotyrosinabhängigen Signalübertragung, der bisher hauptsächlich auf Peptidbindungs- und Affinitätsaufreinigungs-gekoppelten Massenspektronomieexperimenten fußte. Die Güte der Interaktionen wurde experimentell und informatisch, in Coimmunpräzipitations- und Proteinkomplementierungs-, sowie in Überrepräsentationsanalysen und Literaturvergleichen, gezeigt. Bekannte lineare Bindesequenzmotive kommen zwar gehäuft vor, können die Mehrzahl der Interaktionen aber offensichtlich nicht erklären. Die Wechselwirkungen bilden ein dichtes, einheitliches Netzwerk und widerspiegeln phosphotyrosinabhängige KEGG-Signalwege. Es hat ein Herzstück aus acht Genen, von denen sieben fest etablierte Signalverarbeitungshauptknotenpunkte darstellen. Dem achten, SH2D2A, scheint eine deutlich wichtigere Rolle zuzukommen als bisher wahrgenommen. Schliesslich wurde für eine Auswahl von GRB2-Interaktionen unterschiedliche subzelluläre Verortung vorgenommen. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nah, dass die hier veröffentlichten Wechselwirkungen einen wesentlichen Schritt für das Verstehen von Wachstum und Entwicklung markieren und zur Verbesserung der Behandlungsmöglichkeiten in wichtigen Medizinbereichen beitragen werden. / Protein-protein interactions govern cellular functions on the molecular level. Post-translational modifications alter these interactions allowing highly dynamic regulation. Protein tyrosine phosphorylation is an especially relevant post-translational modification, because it is tightly linked to intercellular regulation of growth and development in metazoans. Diseases like cancer or autoimmune disorders arise from misregulation of these processes generating great medical interest in protein tyrosine phosphorylation and processes relating to it. This study provides a comprehensive set of 292 mostly novel, high-quality phosphotyrosine- dependent protein-protein interactions detected in genome-scale yeast two-hybrid screens using full-length proteins filling a gap in phosphotyrosine signaling knowledge, which has so far been based largely on peptide binding and affinity purification-coupled mass spectrometry experiments. The high quality was demonstrated experimentally and computationally, in co-immunoprecipitation and protein complementation assays, as well as over-representation analyses and comparison to prior knowledge. Previously reported linear peptide motifs are reflected in the binding partners, but clearly do not account for most of the interactions, emphasizing the relevance of full-length protein context. The interactions were further shown to form an unusually dense, monolithic network with a central core and reflect and expand phosphotyrosine-related KEGG pathways. Seven of the eight core proteins are well-established signaling hubs. The eighth core gene, SH2D2A, seems to play a more central role than currently appreciated. Finally, selected interactions involving GRB2 were shown to occur in different specific subcellular localizations. Together, these results strongly suggest that the interactions presented here represent an important step toward understanding growth and development and will benefit treatment of pressing medical issues substantially.

Reversible Phosphorylierung ist die bekannteste posttranslationale Modifikation (PTM) und die O-Phosphomonoester von Serin, Threonin und Tyrosin galten lange als die einzigen relevanten Vertreter. Vor kurzem wurden erste Erkenntnisse über die biologische Relevanz von labilen Phosphorylierungen veröffentlicht, z.B. die Phosphorylierung von Histidin, Arginin und Cystein sowie die Pyrophosphorylierung von Serin und Threonin. Auch die Aufklärung von Phospho-Lysin (pLys) wurde mit der Etablierung einer chemoselektiven Synthese zur Darstellung ortsselektiv phosphorylierter Lysinpeptide und der Entwicklung massenspektrometrischer Protokolle zur eindeutigen pLys-Identifizierung in Angriff genommen. Dennoch wurde bisher kein endogenes pLys beschrieben oder eingehende Untersuchungen mit interagierenden Enzymen durchgeführt. In dieser Arbeit werden mehrere Ansätze zur Erweiterung des Wissens über pLys vorgestellt. Dazu gehören das Design einer alternativen Syntheseroute zu pLys-Peptiden und die Entwicklung sowie Evaluierung von zwei stabilen Analoga als Bausteine für die Peptidsynthese. Weiterhin wurde die Protonierung des Phosphoramidatstickstoffs untersucht. In systematischen Enzymaktivitätsassays wurden die Wechselwirkungen zwischen Phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase (LHPP) und verschiedenen Phospho-Substraten untersucht. Dabei zeigte sich eine ausgeprägte Selektivität für pLys, eine hohe Sequenzabhängigkeit der LHPP-Aktivität und ein klares Bindungsmotiv. Darüber hinaus wurden proteomische Methoden hinsichtlich ihrer Eignung für pLys-Peptide evaluiert. Im Laufe dieser Untersuchung wurden mehrere pLys-Immunogene für die Generierung von monoklonalen anti-pLys-Antikörpern und ein Workflow für die Histontrennung und -analyse entwickelt. Des Weiteren wurde die chelationsverstärkte Fluoreszenz von markierten Phospho-Peptiden als Werkzeug zur Bestimmung des Phosphorylierungsgrades in Enzymaktivitäts- oder Stabilitätsassays untersucht. / Reversible phosphorylation is the most prominent post-translational modification (PTM) and the O-phosphomonoesters of serine, threonine and tyrosine have been considered as the only notable forms for long time. Recent developments have paved the way to insights into the biological relevance of labile phosphorylations, e.g. phosphorylation of histidine, arginine and cysteine as well as pyrophosphorylation of serine and threonine. Also, the elucidation of phospho-lysine (pLys) was tackled with the establishment of a chemoselective synthesis to obtain site-selectively phosphorylated lysine peptides and the development of mass spectrometric protocols to unambiguously identify modification sites. Nonetheless, no endogenous pLys site has been described or in-depth investigations of interacting enzymes have been conducted. In this thesis, several approaches to enhance the knowledge about pLys are introduced. These include the design of an alternative synthesis route to pLys peptides and the development as well as evaluation of two stable analogues as building blocks for peptide synthesis. Furthermore, the protonation of the phosphoramidate-nitrogen was investigated. In systematic phosphoramidate hydrolase and phosphatase activity assays, the interactions between phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase (LHPP) and various phospho-substrates were examined. Thereby, distinct selectivity for pLys, high sequence dependence of LHPP activity and a distinct binding motif were revealed. In addition to that, proteomic methods were evaluated regarding their suitability for pLys peptides. Over the course of this investigation, several pLys immunogens for the generation of monoclonal anti-pLys antibodies and a workflow for histone separation and analysis were developed. Furthermore, chelation-enhanced fluorescence of labeled phospho-peptides was studied as a tool for determining the degree of phosphorylation in enzyme activity or stability assays.

Die myeloische Entwicklung wird durch die Familie der Transkriptionsfaktoren CCAAT/Enhancer-Binding-Protein (C/EBP) reguliert. Eine aberrante Expression oder Funktion von C/EBPs stört die normale myeloische Differenzierung und wird bei vielen Arten hämatopoetischer Malignome beobachtet. Mutationen von CEBPA führen zu einem veränderten Expressionsanteil der verkürzten Isoform C/EBPa p30 und werden bei etwa 15% der AML-Patienten (akute myeloische Leukämie) nachgewiesen. Obwohl die verkürzte Isoform C/EBPα p30 als Onkogen identifiziert wurde da sie die Proliferation myeloischer Vorläufer fördert, behält sie dennoch eine Differenzierungsfunktion. Unser Interesse gilt der Frage, wie diese beiden Funktionen von C/EBPα p30 reguliert werden. Die C/EBP-Familie gehört der Gruppe intrinsisch ungeordneter Proteine an, die zudem viele posttranslationale Modifikationen (PTMs) aufweisen. PTMs auf C/EBPα verändern seine biologische Funktionsweise stark. Frühere Forschungsarbeiten haben drei Argininreste am N-Terminus von C/EBPα p30 identifiziert, die aufgrund des Methylierungsstatus differentiell mit anderen Proteinen interagieren. In dieser Arbeit untersuchen wir den Einfluss der C/EBPα p30 Arginin-Methylierung auf seine pro-leukämische Aktivität sowie dessen Fähigkeit zur Neuausrichtung der hämatopoietischen Differenzierungslinie. Mit Hilfe von Aminosäuresubstitutionen fanden wir heraus, dass C/EBPα p30 Mutanten der Methylierungsmimesis oder Ladungsabschaffung die myeloische Differenzierung verstärkt, während Ladungserhalt-Mutanten die Erneuerung und Proliferation hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen unterstützt. Transkriptionelles Profiling von Zellen, die mutierte C/EBPα -p30-Varianten exprimieren, deutet auf potenzielle Ziele der methyliertem bzw. unmethyliertem C/EBPα p30 hin. Die Ergebnisse legen nahe, dass der Arginin-Methylierungsstatus das Leukämie- und Differenzierungs-Potenzial von C/EBPα p30 verändert und somit ein neues Ziel der Leukämietherapie darstellen könnten. / Myeloid development is regulated by the family of transcription factors CCAAT/enhancer-binding-protein (C/EBP). Aberrant expression or functioning of C/EBPs disturbs normal myeloid differentiation and is found in many types of hematopoietic malignancies. Mutations of CEBPA lead to imbalanced expression of the truncated isoform C/EBPα p30 and are found in approximately 15% of AML (acute myeloid leukemia) patients. Yet, how C/EBPα participates in leukemic progression remains to be discovered. More specifically, the truncated isoform C/EBPα p30, although being identified as an oncogenic isoform that promotes proliferation of myeloid progenitors, still retains differentiation function. The question of how both functions of C/EBPα p30 are regulated, is of our interest. C/EBP family also represents a group of intrinsically disordered proteins, which contain many post-translational modifications (PTMs). PTMs on C/EBPα greatly alter its functioning. Previous works have identified three arginine residues at the N-terminus of C/EBPα p30 that interact differently with others protein dependent on their methylation status. We hypothesize, that methylation of these arginine residues plays important roles in the biology of C/EBPα p30. In this study, we used a lymphoid-to-myeloid transdifferentiation (LMT) system to investigate the influence of arginine-methylation on C/EBPα-induced lineage switch and its pro-leukemic activity. Using amino acid substitution, we found that C/EBPα p30 mutants that resemble arginine-methylated p30 enhanced myeloid differentiation, while the charge-retention mutant, resembling arginine-unmethylated p30, supported renewability and proliferation of hematopoietic progenitors. Transcriptional profiling of cells expressing C/EBPα p30 variants suggested potential targets of either methylated or unmethylated p30. The results implied that arginine methylations alter C/EBPα p30’s leukemic potential and might comprise novel targets of leukemia therapy.

Die Tetrapyrrolbiosynthese (TBS) führt zu wichtigen Endprodukten wie Häm und Chlorophyll. Das gemeinsame Vorstufenmolekül aller Tetrapyrrole ist die 5-Aminolävulinsäure (ALA), die in Pflanzen über den C5-Weg aus Glutamat synthetisiert wird. Das erste spezifische Enzym der ALA-Synthese und somit auch der TBS ist die Glutamyl-tRNA Reduktase (GluTR). Sie unterliegt als Schlüsselenzym einer strengen Regulation. Aufgrund der unterschiedlichen Expression der HEMA-Gene in Arabidopsis wird ein differenzieller Beitrag der GluTR-Isoformen zu den Endprodukten der TBS vermutet. Analysen von knockout-Mutanten gaben Aufschluss darüber, inwiefern die Isoformen den Verlust des jeweils anderen kompensieren können. Die knockout-Mutante von HEMA1 zeigte einen blassgrünen Phänotyp, war nicht mehr in der Lage photoautotroph zu wachsen und demonstrierte eine essentielle Rolle der GluTR1 gegenüber GluTR2, wohingegen hema2-Mutanten einen wildtypartigen Phänotyp aufzeigten. Die Bedeutung der N-terminalen GluTR-Domäne in der posttranslationalen Regulation der ALA-Synthese wurde durch BiFC-Analysen und Komplementationsversuche aufgeklärt. BiFC-Analysen zeigten eine Interaktion der N-terminalen Domäne der GluTR1 mit Proteinen der Clp Proteasen und dem GluTR-Bindeprotein (GBP). Veränderte GluTR-Stabilitäten in gbp-Mutanten lassen eine schützende Funktion des GBP gegenüber dem Abbau des Proteins postulieren. Die Expression einer N-terminal verkürzten GluTR1 komplementierte hema1-Mutanten vollständig. Die in diesen Pflanzen und in clp-Mutanten beobachteten erhöhten GluTR1-Proteinstabilitäten im Dunkeln lassen einen Abbau der GluTR durch Clp Proteasen vermuten, bei dem der N-Terminus des Enzyms für die Substraterkennung notwendig zu sein scheint. Die Detektion von erhöhten Pchlid-Mengen als Folge der erhöhten Proteinstabilität in Linien, die die verkürzte GluTR1 exprimierten, demonstriert erstmals die Bedeutung einer kontrollierten Proteolyse der GluTR in der Regulation der ALA-Synthese. / In plants 5-aminolevulinic acid (ALA) is the common precursor of all tetrapyrrols and formed from glutamate via the C5 pathway. Glutamyl-tRNA reductase (GluTR) is the initial enzyme of ALA synthesis and thus tetrapyrrole biosynthesis (TBS). The most important control point of the TBS is the synthesis of ALA and GluTR is the key enzyme, that is tightly regulated. Due to the different expression of HEMA genes in Arabidopsis, a differential contribution to endproducts of the TBS is proposed for GluTR isoforms. Analysis of knockout mutants gave some indications of how the isoforms can compensate each other. I introduced a new knockout mutant of HEMA1 that was pale-green and not able to grow photoautotrophically, indicating that the remaining GluTR2 does not sufficiently compensate ALA synthesis for the extensive needs of chlorophyll. In contrast, hema2 mutants were wild-type-like. The function of the N-terminal region of GluTR1 in posttranslational regulation has been analyzed by BiFC analysis and complementation experiments of hema1. BiFC analysis showed an interaction of the N-terminal region of GluTR1 with the GluTR binding protein (GBP) and with proteins of the Clp proteases. Mutants of GBP revealed a decreased GluTR1 stability during the dark period, indicating a protective role of GBP against proteolysis of GluTR1 in darkness. The expression of a GluTR1 lacking the N-terminal amino acid residues successfully complemented hema1. These plants as well as clp mutants revealed an increased GluTR1 stability in darkness, suggesting a degradation of the protein through Clp proteases. Thereby, the N-terminal region of GluTR1 seems to be necessary for the recognition by Clp proteins. The observed high amount of truncated GluTR1 in transformed hema1 mutants was caused by the increased GluTR1 stability and lead to an accumulation of Pchlide in prolonged dark periods, demonstrating the importance of a controlled proteolysis of GluTR in the regulation of ALA synthesis.

Das Proteasomensystem der Zelle ist für die Degradation von Proteinen verantwortlich und spielt eine zentrale Rolle bei der Generierung von Epitopen, die auf MHC-Klasse-I Molekülen den cytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) präsentiert werden. Die Stimulation von Zellen mit Interferon-gamma (IFNgamma) führt zu der Bildung von Immunoproteasomen, die im Vergleich zu den konstitutiven Proteasomen eine verbesserte Generierung vieler MHC-Klasse-I Epitope aufweisen. In gesunden Mäusen werden Immunoproteasomen vorwiegend in den lymphatischen Geweben exprimiert, wohingegen nicht-lymphatische Gewebe hauptsächlich konstitutive Proteasomen enthalten. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Listeria monocytogenes Infektion auf die aus der Leber, der Milz, dem Dünndarm und dem Colon stammenden murinen 20S Proteasomen untersucht. Die Struktur der isolierten 20S Proteasomen wurde mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese und Westernblot ermittelt, während die Funktion durch in vitro Prozessierung von drei oligomeren Peptidsubstraten analysiert wurde. Die Prozessierungsprodukte wurden mittels HPLC-ESI-Ionenfalle massenspektrometrisch identifiziert sowie quantifiziert. Die vorliegende Arbeit zeigt zum ersten Mal, dass nach einer Infektion die aus den nicht-lymphatischen Organen und Zellen isolierten 20S Proteasomen eine strukturelle und funktionelle Plastizität aufweisen: Nach der Infektion wurde die Bildung von Immunoproteasomen induziert, was mit der gesteigerten Generierung der immunrelevanten Fragmente korreliert werden konnte. Dies verlief unabhängig von der direkten Präsenz von Listeria monocytogenes in den Organen und wurde ausschließlich durch das Cytokin IFNgamma reguliert. Es konnte außerdem eine Zunahme der posttranslationalen Modifikation von Leberproteasomen mit dem Monosaccharid N-Acetylglucosamin nach der Infektion nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde eine detaillierte Analyse der massenspektrometrischen Daten hinsichtlich des Schnittverhaltens der konstitutiven und Immunoproteasomen etabliert. Die Auswertung ergab, dass die Immunoproteasomen nach der Infektion durch schnellere und veränderte Nutzung bestehender Spaltstellen an der verbesserten Epitoppräsentation beteiligt sind. / The proteasome system of the cell is responsible for the degradation of proteins and plays a central role in the generation of epitopes which are presented to cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) on MHC-class-I molecules. The stimulation of cells by interferon-gamma (IFNgamma) leads to the formation of immunoproteasomes that show an improved generation of many MHC-class-I epitopes compared to constitutive proteasomes. In healthy mice, immunoproteasomes are mainly expressed in the lymphatic tissues, whereas the non-lymphatic organs predominantly contain constitutive proteasomes. In this project the effect of Listeria monocytogenes infection on murine 20S proteasomes derived from the liver, spleen, small intestine and colon were investigated. The structure of the isolated proteasomes was analyzed by two-dimensional gel electrophoresis and western blots while the function was studied by in vitro processing of three oligomeric peptide substrates. Identification and quantification of the processing products was performed by HPLC-ESI-ion trap mass spectrometry. The project showed for the first time, that after infection 20S proteasomes isolated from non-lymphatic organs as well as from non-lymphatic cells displayed structural and functional plasticity: immunoproteasomes were induced post infection which could be correlated with the enhanced generation of immuno-relevant fragments. This was independent of the direct presence of Listeria monocytogenes in the organs and solely controlled by the cytokine IFNgamma. In addition, an increased posttranslational modification with the monosaccharide N-acetylglucosamine could be detected in liver-derived proteasomes after infection. Furthermore, a detailed analysis of the mass spectrometry data was established according to the cleavage site usage of constitutive and immunoproteasomes. The result was that immunoproteasomes are involved in improved generation of the immuno-relevant fragments by the faster cleavage and the changed usage of existing cleavage sites after infection.