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61	Characterization of phosphorylation-dependent interactions involving neurofibromin 2 (NF2, merlin) isoforms and the Parkinson protein 7 (PARK7, DJ1) Worseck, Josephine Maria 19 June 2012 (has links) Veränderungen in phosphorylierungsabhängigen Signalwegen, Akkumulation von Proteinaggregaten im Gehirn und neuronaler Zelltod sind Neurodegenerationskennzeichen und Indikatoren für überlappende molekulare Mechanismen. Um Einblicke in die involvierten Signalwege zu erhalten, wurde mit Hilfe eines modifizierten Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H)-Systems für 71 Proteine, die mit neurologischen Erkrankungen assoziiert sind, proteomweit nach Protein-Protein Interaktionen (PPIs) gesucht. Für 21 dieser Proteine wurden PPIs identifiziert. Das Gesamtnetzwerk besteht aus 79 Proteinen und 90 PPIs von denen 5 phosphorylierungsabhängig sind. Ein Teil dieser PPIs wurde in unabhängigen Interaktionsassays mit einer Validierungsrate von 66 % getestet. Der netzwerkbasierte Versuch verbindet erfolgreich neurologische Erkrankungen untereinander aber auch mit zellulären Prozessen. Ser/Thr-Kinase abhängige PPIs verknüpfen zum Beispiel das Parkinson Protein 7 (PARK7, DJ1) mit den E3 Ligase Komponenten ASB3 und RNF31 (HOIP). Die Funktion dieser Proteine bekräftigt den Zusammenhang zwischen dem Ubiquitin-Proteasom-System und der Parkinson Krankheit (PD). Neurofibromin 2 (NF2, merlin) Isoformen und PARK7 interagieren mit der regulatorischen PI3K Untereinheit p55-gamma (PIK3R3). Diese PPIs basieren auf Tyr-Kinase Aktivität im modifizierten Y2H System und funktionellen PIK3R3 pTyr-Erkennungsmodulen (SH2 Domänen) in co-IP und Venus PCA Versuchen. Dies verknüpft den PI3K/AKT Überlebenssignalweg mit zwei unterschiedlichen neurologischen Erkrankungsphenotypen: dem PD assoziierten neuronalen Zelltod und der Neurofibromatose Typ 2-assoziierten Tumorentstehung. Die vergleichende Beobachtung von PIK3R3, AOF2 (KDM1A, LSD1) Interaktionen auf NF2 Isoformlevel offenbart eine Bevorzugung von Isoform 7 bei zytoplasmatischer Lokalisation, wohingegen Isoform 1 PPIs an der Membran lokalisiert sind. Das modifizierungsabhängige und isoformspezifische PPI Netzwerk ermöglichte neue Hypothesen zu molekularen Pathomechanismen. / Alterations in phosphorylation-dependent signalling pathways, accumulation of aggregated proteins in the brain and neuronal apoptosis are common to neurodegeneration and implicate overlapping molecular mechanism. To gain insight into involved pathways, a modified yeast-two hybrid (Y2H) system was applied to screen 71 proteins associated with neurological disorders in a proteome-wide manner. For 21 of these proteins interactions were identified including 5 phosphorylation-dependent ones. In total, the network connected 79 proteins through 90 protein-protein interactions (PPIs). A fraction of these Y2H PPIs was tested in secondary interaction assays with a validation rate of 66 %. The described network-based approach successfully identified proteins associated with more than one disorder and cellular functions connected to specific disorders. In particular, the network revealed Ser/Thr kinase-dependent PPIs between the Parkinson protein 7 (PARK7, DJ1) and the E3 ligase components ASB3 and RNF31 (HOIP). The function of these proteins further substantiates the established connection between Parkinson’s disease (PD) and ubiquitination-mediated proteasome (dis)functions. Neurofibromin 2 (NF2, merlin) isoforms and PARK7 were identified as PI3K regulatory subunit p55-gamma (PIK3R3) interactors. These PPIs required Tyr kinase coexpression in the modified Y2H system and functional PIK3R3 pTyr-recognition modules (SH2 domains) in co-IP and Venus PCA experiments. This finding implicates the PI3K/AKT survival pathway in PD-associated neuronal apoptosis and Neurofibromatosis type 2-associated tumour formation. Investigation of PIK3R3, AOF2 (KDM1A, LSD1) and EMILIN1 PPIs on NF2 isoform level revealed preferential isoform 7 binding and cytoplasmic or membrane localisation of these PPIs for isoform 7 or 1, respectively. The generated modification-dependent and isoform-specific PPI network triggered many hypotheses on the molecular mechanisms implicated in neurological disorders. Neurologische Erkrankungen Interaktionsnetzwerke modified yeast-two hybrid system (Y2H) neurological disorders PPI network 570 Biologie 32 Biologie WE 5320 ddc:570
62	Characterization of a novel class of anti-HCV agents targeting protein-protein interactions Park, Alex 09 1900 (has links) Le virus de l’hépatite C (VHC) est un agent causateur de maladies du foie important responsable d’une pandémie affectant près de 180 millions d’individus mondialement. L’absence de symptômes dans les premières années d’infection entraîne des diagnostics tardifs qui empêchent la prise en charge rapide des patients avant l’apparition d’une fibrose et, dans près de 16 % des cas d’infection, d’une cirrhose. En exploitant les interactions protéine-protéine membranaires, des essais utilisant la technologie BRET, dans les cellules vivantes, ont été précédemment optimisés afin d’établir le réseau complet des interactions du VHC. En utilisant les fondements de cette étude, un essai à haut débit dans les cellules vivantes a été réalisé pour identifier de nouveaux composés anti-VHC ciblant une nouvelle interaction NS3/4A-NS3/4A. Approximativement 110,000 petites molécules ont été criblées pour leurs effets sur l’homodimérization de NS3/4A et ont été classées par rapport à leur spécificité et à leur puissance contre le VHC. Au terme de cette étude, UM42811 a été identifié comme un activateur potentiel de l’interaction NS3/4A-NS3/4A offrant une activité antivirale prometteuse dotant une excellente fenêtre thérapeutique. Par la suite, un séquençage exhaustif des virus, soumis à un traitement de UM42811, a permis d’établir le profil de résistance du VHC contre ce composé. Grâce à cette fine cartographie, il a été possible d’identifier un nouveau mécanisme d’inhibition de NS3/4A qui est indépendant de son activité protéase. En utilisant les données de notre groupe sur les interactions VHC-hôte, il a été possible de continuer la caractérisation fonctionnelle du composé UM42811 en étudiant son effet sur les interactions potentiellement bénéfiques à la persistance virale. Pour ce faire, les protéines associées au transport nucléaire et mitochondriale qui sont des interactants de choix de NS3/4A ont été priorisées. Parmi ces facteurs de l’hôte, l’étude de karyopherin subunit beta 1 (KPNB1) et de heat shock protein 60 (HSP60) a été priorisée. De façon intéressante, les expériences de co-immunoprécipitation ont démontré que UM42811 était capable de prévenir l’interaction KPNB1-NS3/4A ainsi que l’interaction HSP60-NS3/4A. De plus, les études ii fonctionnelles et les analyses d’immunobuvardage de type western ont démontré que l’interaction KPNB1-NS3/4A avait des effets délétères sur l’induction des gènes stimulés par l’interféron (ISG). Finalement, il a été démontré que KPNB1 est possiblement clivé par NS3/4A suggérant la présence potentielle d’un mécanisme de subversion ou d’échappement. En bref, cette étude démontre la puissance des stratégies impliquant les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes pour l’identification de nouveaux composés inhibiteurs, caractérise un nouveau mécanisme d’inhibition anti-VHC et révèle la possibilité d’un nouveau mécanisme d’évasion du système immunitaire. / Hepatitis C virus (HCV) is an important causative agent for liver diseases and is responsible for a worldwide pandemic affecting roughly 180 million individuals worldwide. Late diagnosis following the progression to fibrosis and to cirrhosis, in nearly 16% of chronic infections, is attributed to the absence of symptoms in the first years of infection. By exploiting membrane protein-protein interactions (PPI), live cell assays using bioluminescence resonance energy transfer (BRET) technology have previously been optimized to complete a comprehensive hepatitis C virus (HCV) protein interaction network. Using the groundwork laid by this network study, a high-throughput assay (HTS) cell-based assay was implemented to identify novel inhibitory compounds targeting an unreported NS3/4A-NS3/4A interaction. Approximately 110,000 compounds from a small-molecule collection were screened to monitor modulation of NS3/4A homodimerization and were discriminated based on specificity and potency. UM42811 was identified as a potential NS3/4A-NS3/4A interaction activator and found to have a promising antiviral activity boasting an excellent therapeutic window. Combined deep sequencing and mutation mapping have yielded a resistance profile based on statistical and functional probability pointing towards a novel inhibitory mechanism targeting the HCV NS3/4A independent from protease activity inhibition. Data from an HCV to host protein interaction network generated by our group was used to analyze alternative effects of UM42811 on interactions which potentially benefit viral persistence. NS3/4A-specific host interactors were heavily associated with nuclear and mitochondrial transport based on Gene Ontology (GO). Among these specific interactors, karyopherin subunit beta 1 (KPNB1) and heat shock protein 60 (HSP60) were selected for further study. Interestingly, co-immunoprecipitation experiments revealed that UM42811 was able to prevent both KPNB1-NS3/4A and HSP60-NS3/4A interactions. Moreover, functional and western analysis revealed the KPNB1-NS3/4A interaction to have deleterious effects on iv interferon stimulated gene (ISG) induction. Unexpectedly, analysis revealed a putative NS3/4A mediated cleavage of KPNB1. Overall, this study demonstrates the strength of cell-based PPI strategies in the identification of novel HCV antiviral compounds, characterizes a novel inhibitory mechanism for HCV and reveals a potentially novel viral immune evasion mechanism. Virus de l’Hépatite C VHC Antiviraux à Action Directe ADD Criblage à Haut Débit BRET Interaction Protéine-Protéine Résistance Hepatitis C Virus HCV Direct-Acting Antivirals DAA High-Throughput Screening HTS BRET Protein-Protein Interaction PPI Resistance
63	Étude sur la reconnaissance de l'ubiquitine par les domaines de transactivation acides des activateurs de transcription Lussier-Price, Mathieu 03 1900 (has links) Les domaines de transactivation (TAD) acides sont présents dans plusieurs protéines oncogéniques, virales et dans des facteurs de différenciation de cellules souches. Ces domaines acides contrôlent la transcription à travers une myriade d’interactions avec divers partenaires ce qui provoque l’activation de la transcription ou leur propre élimination. Cependant, dans la dernière décennie, de plus en plus de recherches ont démontré que les TAD possédaient un sous-domaine activation/dégradation (DAD) responsable pour une fonction d'activation de la transcription dépendante de la dégradation de la protéine. Un tel phénomène peut être accompli par plusieurs moyens tels que des modifications post-traductionnelles, l’association à des cofacteurs ou la formation d’un réseau d’interaction complexe en chaînes. Or, aucune preuve concrète n’a pu clairement démontrer le fonctionnement de la dépendance paradoxale entre ces deux fonctions sur un activateur de transcription. Le DAD, a été observé dans plusieurs facteurs de transcription incluant la protéine suppresseur de tumeur p53 et le facteur de différenciation érythrocyte EKLF. Un aspect particulier des DAD est que la composition de leur séquence d’acide aminé est fortement similaire à celle des domaines de liaison à l’ubiquitine (UBD) qui jouent un rôle clé dans le contrôle de la transcription à travers leur interaction non-covalente avec l’ubiquitine. Ainsi, dans ce mémoire, nous avons étudié la possibilité que les TAD acides soient capables d’agir comme UBD pour réguler leur fonction paradoxale à travers des interactions non-covalentes avec l’ubiquitine. L’analyse est faite en utilisant la résonnance magnétique nucléaire (RMN) ainsi qu’avec des essais fonctionnels de dégradation. En somme, cette étude amène une plus grande compréhension des protéines impliquées dans le contrôle des TAD et caractérise le tout premier exemple de TAD capable d’interagir avec l’ubiquitine. / Acidic transactivating domains have been shown to be potential targets for a number of different therapies but their dynamic nature and their ability to bind many interacting partners has made it difficult to fully understand their functioning mechanisms. What we do know about these domains is that they readily control transcription through a myriad of interactions capable of either activating specific aspects of their function or simply, signal for their own demise. Within the acidic TADs lies an unusual degradation/activation domain (DAD) capable of activating transcription at the cost of its degradation. In other words, DAD transcriptional activation is dependent on the degradation of the protein. Such a phenomenon could be explained by a wide variety of hypotheses like the play of post-translational modifications, co-factors, or maybe just a really sophisticated time scaled network of interactions. However, no concrete explanation of how this dual dependent functioning domain works has yet to surface. The DAD has been observed within acidic TADs of several transcription factors including the tumor suppressor p53 and the red blood cell differentiation factor EKLF. Interestingly though, the amino acid sequence composition of DADs share a strong similarity with several types of sequences from domains that bind ubiquitin (UBDs). These domains have been shown in the past to, in addition to their role in degradation, play a key role in regulating transcription through non-covalent interaction with ubiquitin. Hence, in this project, we investigated weather acidic TADs had the ability to function as UBDs and form non-covalent interactions with ubiquitin and also to determine the functional significance of this interaction in regards to the dual function of acidic TADs. Activateur de transcription Domaine de liaison à l'ubiquitine p53 Résonance magnétique nucléaire Interaction protéine-protéine Acidic transactivating domains Domaine d'activation et de dégradation Degradation activation domain (DAD) Ubiquitin binding domain (UBD) Protein-protein interaction (PPI) Ubiquitin (UBI) Nuclear magnetic resonance (NMR) Erythroid Kruppel-like factor (EKLF)
64	Source de particules neutres monocinétiques : diagnostics spécifiques et étude physique d'une source de Hall en plasma d'argon ou en mixture xénon-argon / Single-velocity neutral source : diagnostics and physical study of Hall source in argon or xenon-argon mixture plasma Diop-Ngom, Fatou 22 July 2015 (has links) Des années 50 à nos jours, la propulsion électrique n'a cessé d'évoluer afin de s'imposer dans le domaine de la propulsion spatiale. Les Propulseurs à effet Hall (PEH) sont principalement utilisés pour des missions de correction de trajectoire ou de maintien en orbite des satellites. Ils délivrent des faisceaux d'ions à forte densité de courant et à faible énergie, ce qui en font de bons candidats potentiels pour d'autres applications comme la microélectronique ou encore les traitements de surfaces. Le xénon est l'ergol le plus utilisé en raison de sa masse élevée et de son faible énergie d'ionisation. Cependant son coût élevé et la difficulté d’approvisionnement motivent la recherche d'alternatives pour le fonctionnement des MEH. C'est dans ce cadre que cette thèse s'est inscrite avec l'idée d'un développement d'une source de faible puissance fonctionnelle en argon. L'amorçage d'une telle décharge n'étant pas immédiat, une démarche progressive qui passe par des décharges de mélange de gaz a été adoptée. Les décharges Xe-Ar se sont révélées très intéressantes pour la compréhension des mécanismes physiques qui régissent les PEH. La caractérisation en vitesse des ions Xe II (par Fluorescence Induite par Laser) associée à l'analyse en énergie par RPA a permis de remonter à des informations utiles sur les zones d'ionisation et d'accélération. Une technique originale de résolution temporelle du RPA basée sur une interruption rapide de la décharge ou sur les oscillations naturelles du courant de décharge, a été développée et a permis l'identification et la quantification des différentes espèces présentes dans le jet d'ions. Grâce aux résultats de l'étude paramétrique des décharges de mélange Xe-Ar, une décharge d'argon pur a pu être amorcée et caractérisée pour la première fois dans un PEH de faible puissance. / Since the 50s, electric propulsion has improved in order to establish itself on space propulsion field. The Hall Effect Thruster (HET) are mainly used for trajectory correction or satellites orbit maintaining. The HET provide high current densities and low energy ion beam that making it a good candidate for other applications such as microelectronics or surface treatments. Xenon propellant is most commonly used due to its high atomic mass and its low ionization energy. However, the high cost and difficult supply of xenon, leads to looking for alternative propellant for HET operation. In this context, this PhD thesis had as goal the development of a functional Argon low power source. Argon discharge ignition is not immediate, that why a progressive approach which involves gas mixture discharges was adopted. The Xe-Ar discharge gives very interesting results for the understanding of physical mechanisms governing HET. The characterization of Xe II ions velocity (Laser Induced Fluorescence) associated to the energy analysis by RPA have provided access to useful information on ionization and acceleration areas. An original time resolved RPA technique, based on an ultra-fast discharge interruption or on the discharge current oscillations, has been developed. This technique allows the identification and the quantification of different species present in the ion beam. Thanks to the discharge Xe-Ar study, a pure argon discharge could be initiated and characterized for the first time in a low power HET. Propulseur à Effet Hall PPI Propulsion spatiale électrique Décharge Xe-Ar Décharge argon Fluorescence induite par laser Analyseur d'énergie Résolution temporelle Interrupteur rapide Hall Effect Thruster Electric propulsion Xe+Ar discharge Argon discharge Laser induced fluorescence Retarding energy field analyser Time resolving Ultra fast switch 621.46
65	Evaluation of a Novel Biochemistry Course-Based Undergraduate Research Experience (CURE) Stefan M Irby (6326255) 15 May 2019 (has links) <p>Course-based Undergraduate Research Experiences (CUREs) have been described in a range of educational contexts. Although various learning objectives, termed anticipated learning outcomes (ALOs) in this project, have been proposed, processes for identifying them may not be rigorous or well-documented, which can lead to inappropriate assessment and speculation about what students actually learn from CUREs. Additionally, evaluation of CUREs has primarily relied on student and instructor perception data rather than more reliable measures of learning.This dissertation investigated a novel biochemistry laboratory curriculum for a Course-based Undergraduate Research Experience (CURE) known as the Biochemistry Authentic Scientific Inquiry Lab (BASIL). Students participating in this CURE use a combination of computational and biochemical wet-lab techniques to elucidate the function of proteins of known structure but unknown function. The goal of the project was to evaluate the efficacy of the BASIL CURE curriculum for developing students’ research abilities across implementations. Towards achieving this goal, we addressed the following four research questions (RQs): <b>RQ1</b>) How can ALOs be rigorously identified for the BASIL CURE; <b>RQ2</b>) How can the identified ALOs be used to develop a matrix that characterizes the BASIL CURE; <b>RQ3</b>) What are students’ perceptions of their knowledge, confidence and competence regarding their abilities to perform the top-rated ALOs for this CURE; <b>RQ4</b>) What are appropriate assessments for student achievement of the identified ALOs and what is the nature of student learning, and related difficulties, developed by students during the BASIL CURE? To address these RQs, this project focused on the development and use of qualitative and quantitative methods guided by constructivism and situated cognition theoretical frameworks. Data was collected using a range of instruments including, content analysis, Qualtrics surveys, open-ended questions and interviews, in order to identify ALOs and to determine student learning for the BASIL CURE. Analysis of the qualitative data was through inductive coding guided by the concept-reasoning-mode (CRM) model and the assessment triangle, while analysis of quantitative data was done by using standard statistical techniques (e.g. conducting a parried t-test and effect size). The results led to the development of a novel method for identifying ALOs, namely a process for identifying course-based undergraduate research abilities (PICURA; RQ1; Irby, Pelaez, & Anderson 2018b). Application of PICURA to the BASIL CURE resulted in the identification and rating by instructors of a wide range of ALOs, termed course-based undergraduate research abilities (CURAs), which were formulated into a matrix (RQs 2; Irby, Pelaez, & Anderson, 2018a,). The matrix was, in turn, used to characterize the BASIL CURE and to inform the design of student assessments aimed at evaluating student development of the identified CURAs (RQs 4; Irby, Pelaez, & Anderson, 2018a). Preliminary findings from implementation of the open-ended assessments in a small case study of students, revealed a range of student competencies for selected top-rated CURAs as well as evidence for student difficulties (RQ4). In this way we were able to confirm that students are developing some of the ALOs as actual learning outcomes which we term VLOs or verified learning outcomes. In addition, a participant perception indicator (PPI) survey was used to gauge students’ perceptions of their gains in knowledge, experience, and confidence during the BASIL CURE and, therefore, to inform which CURAs should be specifically targeted for assessment in specific BASIL implementations (RQ3;). These results indicate that, across implementations of the CURE, students perceived significant gains with large effect sizes in their knowledge, experience, and confidence for items on the PPI survey (RQ3;). In our view, the results of this dissertation will make important contributions to the CURE literature, as well as to the biochemistry education and assessment literature in general. More specifically, it will significantly improve understanding of the nature of student learning from CUREs and how to identify ALOs and design assessments that reveal what students actually learn from such CUREs - an area where there has been a dearth of available knowledge in the past. The outcomes of this dissertation could also help instructors and administrators identify and align assessments with the actual features of a CURE (or courses in general), use the identified CURAs to ensure the material fits departmental or university needs, and evaluate the benefits of students participating in these innovative curricula. Future research will focus on expanding the development and validation of assessments so that practitioners can better evaluate the efficacy of their CUREs for developing the research competencies of their undergraduate students and continue to render improvements to their curricula.</p> Biochemistry Education Course-based Undergraduate Research Course-based Research Experiences CURE anticipated learning outcomes ALOs ALO CURAs research abilities PICURA ALO matrix BASIL weighted-relevance WR verified learning outcomes VLOs CUREs biochemistry computational biochemistry bioinformatics biochemistry education chemistry education chemistry teaching laboratory upper-division ACE-Bio experimental competencies Authentic science inquiry chemical education assessment assessment design Student understanding student difficulties biochemistry laboratory experiments biochemistry teaching laboratory chemistry teaching laboratory chemistry teaching laboratories predicting protein function protein inquiry-based learning inquiry-based teaching content analysis open-ended survey interviews semi-structured interviews PPI participant perception indicator assessment triangle CRM conceptual reasoning mode conceptual-reasoning-mode model curriculum evaluation experimental abilities discovery skills learning objectives learning outcomes LO LOs collaborations collaborative course implementation implementation student difficuluties experimental learning experimental literacy data-representation ACE-Bio Network Likert-survey

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