La destruction des cellules ciliées de la cochlée entraine des surdités sensorielles. Chez les mammifères ces cellules ne se régénèrent pas et les déficits auditifs occasionnés sont définitifs. Aucune thérapie visant à remplacer les cellules ciliées détruites n'est actuellement proposée.L'objectif de cette thèse est de contribuer au développement d'une thérapie cellulaire basée sur la greffe de cellules souches / progénitrices cochléaires et destinée à promouvoir la régénération des cellules ciliées.Au cours de nos travaux, nous avons isolé une population de cellules souches cochléaires chez des souris néonatales appartenant à la « side population » (Savary et al. 2007). Nous avons également montré, par des expériences de perte et de gain de fonction in vitro, que la voie de signalisation Notch est nécessaire pour l'auto-renouvellement et la différenciation de ces cellules (Savary et al., 2008). Des lignées de souris transgéniques exprimant la GFP sous le promoteur de la GFAP et de la Nestine nous ont permis de suivre l'expression de ces marqueurs de cellules souches dans des cochlées de souris P3 et adultes. En étudiant l'expression combinée d'autres marqueurs comme Sox2 et Abcg2, nous avons montré que les cellules progénitrices cochléaires sont réparties différemment chez les souris néonatales et les souris adultes (Smeti, Savary et al 2010).Nos expériences préliminaires de transplantation in vitro dans un modèle murin de surdité génétique humaine de type DFNA15 démontrent que les cellules souches / progénitrices greffées sont capables d'intégrer l'épithélium sensoriel lésé et de se différencier en cellules exprimant un marqueur de cellules ciliées. / The destruction of cochlear hair cells causes sensory deafness. In Mammals these cells do not regenerate and damages are irreversible. Currently, there is no proposed therapy to replace the destroyed hair cells.The focus of this thesis is to develop a novel cell therapy based on transplantation of cochlear progenitor cells in order to promote regeneration of hair cells.We first isolated a population of cochlear stem cells from neonatal mice by using the side population analysis technique (Savary et al. 2007). Then, we showed, by in vitro loss and gain of function experiments, that the Notch signaling pathway is necessary for cellular self-renewal and differentiation (Savary et al., 2008).Transgenic mice strains expressing GFP under the control of GFAP and Nestin promotors allowed us to monitor the expression of these markers of stem cells in the P3 and adult mice cochleae. By studying the combined expression of other stem cells markers such as Sox2 and ABCG2, we showed that the niches of cochlear progenitor cells are differently distributed in neonatal and adult mice (Smati, Savary et al 2010).Our preliminary in vitro transplantation experiments in a mouse model that mimics human genetic deafness DFNA15 show that the transplanted stem / progenitor cells are able to migrate to the lesion site, to integrate the damaged sensory epithelium and to differentiate into cells expressing a marker of hair cells.

There are long-standing hypotheses that endogenous ion currents act to control cell dynamics in development, wound healing and regeneration. However, the mechanisms employed by cells to detect the electric field (EF) and translate it into a discernable message to drive specific cell behaviors, such as migration, proliferation and differentiation, are not well understood. A better understanding of how cells are able to sense EFs and react to them is vital to understanding physiological mechanisms are involved in regeneration. Ion channel signaling provides a reasonable suspect for mediating these effects based on their documented involvement in proliferation, migration and differentiation. To investigate mechanisms underlying ionic regulation of critical cellular processes in non-excitable cells, a novel, in vivo assay was developed to screen multiple pharmacological inhibitors of ion channels during larval A. mexicanum tail regeneration. This assay was used to identify individual channels that were then targeted for further analysis regarding their involvement in the regenerative process. Chapter 2 presents data from a study that indicates that a wound-like response can be generated in an invertebrate model by application of exogenous, low-amplitude sine-wave electrical stimulation. This was characterized by recruitment of hemocytes at the stimulation site which was dependent on voltage-gated potassium channels. Chapter 3 presents data from a comprehensive and systematic screen of pharmacological compounds against larval salamander tail regeneration that indicates 8 specific target ion channels. This chapter also describes results indicating specific mechanisms by which these channels may be perturbing regeneration. Chapter 4 presents data that indicate that the Anoctamin 1 channel identified in the aforementioned screen is a regulator of cellular proliferation. This is shown to be accomplished via amplification of intracellular calcium surges and a subsequent increase in the activity of the p44/42 MAPK signaling cascade.

Nos études ont démontrées que la formation de la cicatrice et la guérison sont associées avec l’apparition de cellules de type myocytes cardiaques nestine(+) dans la région péri-infarcie. Présentement, l’étude examine le mécanisme, tel que l’hypoxie ou les hormones neuronales, possiblement impliqué dans leur recrutement et de dévoiler leur origine cellulaire. La présence de ces cellules a été détectée dans les coeurs infarcies d’une semaine et maintenue après neuf mois suite à une sujétion coronaire complète. Aussi, ces cellules de type myocytes cardiaques nestine(+) ont été observées dans le coeur infarci humain. L’hypoxie représente un événement prédominant suite à un infarctus de myocarde, mais l’exposition des rats normaux à un environnement hypoxique n’a pas pu promouvoir l’apparition de ces cellules. Autrement, l’infusion de l’agoniste -adrénergique non-sélectif isoprotérénol (ISO) dans les rats adultes Sprague-Dawley a augmenté la protéine nestine dans le ventricule gauche et a été associé avec la réapparition de cellules de type myocytes cardiaques nestine(+). Cela représente possiblement un effet secondaire suite à la nécrose des myocytes cardiaques par l’administration d’isoprotérénol. Dernièrement, on a identifié une sous-population de cellules nestine(+) dans le coeur normal du rat qui co-exprime les marqueurs de cellules cardiaques progénitrices Nkx-2.5 et GATA-4. Cette sous-population de cellules nestine/Nkx-2.5/GATA-4 pourrait représenter des substrats cellulaires qui puissent se différentier en cellules de type myocytes cardiaques nestine(+) suite à une ischémie. Mots clés: nestine, isoprotérénol, nécrose, cellule souche, cellule progénitrice, myocyte cardiaque / Studies from our lab demonstrated that scar formation and healing was associated with the appearance of nestin(+) cardiac myocyte-like cells predominantly at the peri-infarct region. The focus of the present study was to identify the underlying mechanism(s) (e.g. hypoxia, neurohormones) implicated in their recruitment and their cellular origin. The presence of these cells was detected as early as 1-week post-myocardial infarction (MI) and persisted 9 months after complete coronary artery ligation. Furthermore, nestin(+) cardiac myocyte-like cells were also detected in the infarcted human heart. Hypoxia represents a predominant stimulus following MI, however the exposure of normal rats to a hypoxic environment failed to promote the re-appearance of nestin(+) cardiac myocyte-like cells. By contrast, the infusion of the non-selective -adrenergic agonist isoproterenol (ISO) in the normal adult Sprague-Dawley rat increased nestin expression in the left ventricle and was associated with the reappearance of nestin(+) cardiac myocyte-like cells. However, the reappearance of nestin(+) cardiac myocyte-like cells may not represent a direct effect but was apparently secondary to cardiac myocyte necrosis mediated by isoproterenol. Lastly, we identified a subpopulation of nestin-immunoreactive cells in the normal rat heart that coexpressed cardiac progenitor cell markers Nkx-2.5 and GATA-4. This subpopulation of nestin/Nkx-2.5/GATA-4 cells may represent the progenitor pool that differentiates to a nestin(+) cardiac myocyte-like cell following an ischemic insult. Key words: nestin, isoproterenol, cardiac myocyte, cardiac progenitor, necrosis

Les Cellules Endothéliales Progénitrices ("Endothelial Progenitor Cells", EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui jouent un rôle émergeant en biologie vasculaire. Les EPCs ont été localisées dans le cordon ombilical, la moelle osseuse, le sang périphérique et dans certains tissus régénérateurs. Les interactions des EPCs avec les cellules sanguines et vasculaires peuvent largement influencer leurs propriétés biologiques et dicter leur fonctionnement pendant la réparation endothéliale. Plus spécifiquement, les interactions des EPCs avec les plaquettes circulantes induisent leur migration, leur recrutement et leur différentiation en cellules endothéliales aux sites de lésions vasculaires. Cependant, l’impact d’une telle interaction sur la fonction plaquettaire n’a pas été recherché. Le but de mon projet était de :1) générer des EPCs à partir des cellules mononucléaires du sang humain périphérique ("Peripheral Blood Mononuclear Cells", PBMCs); 2) étudier les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes; 3) déterminer leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus et 4) décrire le mécanisme d’action des EPCs sur les plaquettes et le thrombus. Mises en culture sur une surface de fibronectine dans un milieu conditionné, les PBMCs fraîchement isolées possédaient une morphologie ronde et une petite taille. Après cinq jours, les PBMCs adhérentes donnaient naissance à des colonies, puis formaient une monocouche de cellules aplaties caractéristiques des EPCs après dix jours de culture. Les EPCs différenciées étaient positives pour l’Ulex-lectine et l’Acétyle des lipoprotéines de faible densité ("Acetylated Low Density Lipoprotein", Ac-LDL), exprimaient les marqueurs progéniteurs (CD34, P-sélectine, VEGFR2, vWF et VE-Cadhérine) tandis que les marqueurs leucocytaires (CD14, PSGL-1 et L-sélectine) étaient absents. Ces EPCs interagissaient avec les plaquettes activées par un mécanisme dépendant de la P-sélectine plaquettaire, inhibaient l’activation et l’agrégation plaquettaire et réduisaient significativement l’adhésion plaquettaire, principalement par l’action de prostacycline (PGI2). En fait, ceci était associé avec une augmentation de l’expression de la cyclooxygénase-2 (COX-2) et du monoxyde d’azote (NO) synthéthase inductible (iNOS). Toutefois, les effets inhibiteurs des EPCs sur la fonction plaquettaire ont été renversés par une inhibition de la COX et non pas du NO. Bien que les EPCs fussent en mesure de lier les plaquettes via la P-sélectine, leurs effets prédominants étaient médiés essentiellement par une sécrétion paracrine, impliquant la PGI2. Néanmoins, un rapprochement étroit ou un bref contact entre les EPCs et les plaquettes était requis pour que cette fonction soit complètement réalisée. D’ailleurs, cet aspect a été investigué chez des souris déficientes en P-sélectine (P-sel-/-) et chez leurs congénères de phénotype sauvage (Wild Type, WT). Chez les souris WT, les EPCs inhibaient l’agrégation plaquettaire dans le sang complet de manière concentration-dépendante alors que dans les souris P-sel-/-, l’action des EPCs n’avait pas d’effet significatif. De plus, en utilisant un modèle murin de thrombose artérielle, nous avons démontré que l’infusion systémique des EPCs altéraient la formation du thrombus et réduisaient significativement sa masse chez les souris WT, mais non pas chez les souris P-sel-/-. En outre, le nombre des EPCs incorporées au niveau du thrombus et de la paroi vasculaire était visiblement réduit chez les P-sel-/- par rapport aux souris WT. Dans cette étude, nous sommes parvenus à différentier adéquatement des EPCs à partir des PBMCs, nous avons étudié les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes, et nous avons décrit leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus. De plus, nous avons identifié la PGI2 comme étant le principal facteur soluble sécrété par les EPCs en culture et responsable de leurs effets inhibiteurs sur l’activation, l’adhésion et l’agrégation plaquettaire in vitro. De surcroît, nous avons élucidé le mécanisme d’action des EPCs sur l’agrégation plaquettaire et la formation du thrombus, in vivo, et nous avons souligné le rôle de la P-sélectine plaquettaire dans ce processus. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur la biologie des EPCs et définissent leur rôle potentiel dans la régulation de la fonction plaquettaire et la thrombogenèse. / Endothelial Progenitor Cells (EPCs) are believed to contribute to vascular biology and endothelial repair. EPCs have been isolated from umbilical cord, bone marrow, peripheral blood and in some regenerative tissues. Interactions of EPCs with vascular and blood cells can largely influence their functional properties and predict their destiny in the target tissues. More specifically, interactions of EPCs with circulating platelets provide the critical signal to ensure their migration and homing at the sites of vascular injury and their differentiation into endothelial cells. However, the functional consequences of such interactions on platelets remain unknown. Accordingly, this project was designed to investigate the impact of EPCs on platelet function and the specific objectives of this study were to: 1) generate EPCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs); 2) characterize the adhesive interactions between EPCs and platelets; 3) determine their impact on platelet function and thrombus formation and 4) elucidate the mechanistic action of EPCs on platelets and thrombus. Cultured on fibronectin in conditioned media, PBMCs differentiated, within ten days of culture, into EPCs, which were positive for Ulex-lectin and Ac-LDL (Acetylated Low Density Lipoprotein), and expressed progenitor markers (CD34, VEGFR2, vWF, and VE-Cadherin). These EPCs bind activated platelets through P-selectin-dependent mechanism, inhibited platelet activation, aggregation and adhesion, mainly via prostacyclin (PGI2) secretion. Indeed, this was associated with up-regulation of cyclooxygenase-2 (COX-2) and inducible nitric oxide (NO) synthase (iNOS). However, the effects on platelets were reversed by COX, but not by NO inhibition. Although EPCs bound platelets via platelet P-selectin, their predominant effects occurred via a paracrine secretion, implying PGI2. Nevertheless, a transitory link or brief contact between EPCs and platelets was required for this function to be fully realized. This was further depicted using a murine arterial thrombosis model in P-selectin deficient mice (P sel-/-) and their wild-type counterparts (WT). EPCs significantly impaired, in a concentration dependent-manner, collagen-induced whole blood platelet aggregation in WT mice; whereas in P-sel-/- mice, EPCs had no significant effect. Moreover, in murin model of arterial thrombosis, infusion of EPCs altered thrombus formation and significantly reduced the mass of thrombi generated in WT, but not in P-sel-/- mice. Furthermore, the number of EPCs recruited within the thrombi and along the vascular wall was visually reduced in P-sel-/- mice as compared to WT mice. In this project, we succeeded in adequately differentiating EPCs from PBMCs, we characterized the adhesive interaction between EPCs and platelets, and we addressed the impact of EPCs on platelet function and thrombus formation. Moreover, we identified PGI2 as the principal soluble factor secreted by cultured EPCs and responsible of their inhibitory effects on platelet function in vitro. In addition, using a murine model of arterial carotid injury in WT and P-sel-/- mice, we elucidate the mechanistic action of EPCs on platelet aggregation and thrombus formation, in vivo, and we highlighted the role of platelet P-selectin in this process. These findings add new insights into the biology of EPCs and reveal a potential role for EPCs in regulating platelet function, which in turn may limit thrombogenesis and maintain hemostasis at the sites of vascular injury.

Les cellules dérivées de la moelle osseuse, principalement les cellules endothéliales progénitrices, sont réduites chez les patients souffrant de maladies cardiovasculaires. Leur mobilisation et leur incorporation aux sites de lésion vasculaire sont des évènements prépondérants dans l’accélération des processus de réendothélialisation. Dans un modèle murin, le 17β-estradiol favorise les processus de guérison vasculaire par la mobilisation et le recrutement des cellules endothéliales progénitrices dérivées de la moelle osseuse. Il existe présentement plusieurs stratégies afin d’augmenter la mobilisation des cellules progénitrices ainsi que leur incorporation à la paroi vasculaire. Cependant, peu d’études privilégient la livraison locale d’un nombre élevé de cellules progénitrices fonctionnelles par un véhicule biodégradable et leur maintien au site de lésion afin de favoriser la réendothélialisation ciblée. Un polymère d’intérêt pour cette application s’avère être le chitosan. Ce biopolymère non toxique et biodégradable est couramment utilisé dans l’ingénierie tissulaire et, depuis peu, est utilisé dans la guérison vasculaire. Le chitosan complexé à la phosphorylcholine voit sa solubilité s’accroître dans les solutions aqueuses ainsi que sa biocompatibilité cellulaire en condition physiologique. Le projet de ce mémoire visait donc : 1) à étudier in vitro, la capacité d’un polymère de chitosan complexé à la phosphorylcholine à influencer l’adhésion, la survie, la différenciation et la fonctionnalité cellulaire dans un modèle murin de culture mixte de cellules dérivées de la moelle osseuse et 2) de déterminer l’impact de la présence du 17β-estradiol sur ces mêmes comportements cellulaires. Nos travaux démontrent que la matrice de chitosan-phosphorylcholine s’avère compatible avec notre modèle de culture cellulaire. En effet, ce polymère est capable de promouvoir l’organisation et le développement des cellules dérivées de la moelle osseuse de façon comparable à la matrice normalement utilisée dans la croissance in vitro des cellules endothéliales progénitrices, la fibronectine. De plus, ce polymère n’a nullement compromis l’activité migratoire des cellules, laissant supposer qu’il pourrait éventuellement être un véhicule approprié pour effectuer une livraison cellulaire à un site de lésion. Il s’avère que le 17β-estradiol, lorsqu’ajouté au milieu de culture ou complexé au polymère de chitosan phosphorylcholine, est capable de moduler le comportement cellulaire, et ce, de façon différente. Le 17β-estradiol complexé au polymère de chitosan-phosphorylcholine démontre, par rapport à sa forme soluble, une plus grande aptitude à accroître le nombre de cellules hématopoïétiques ainsi que des cellules endothéliales progénitrices dérivées de la moelle osseuse in vitro. De plus, le 17β-estradiol complexé au polymère de chitosan-phosphorylcholine permet une amplification marquée des cellules endothéliales progénitrices et leur offre un support adéquat afin de favoriser la guérison vasculaire. L’ensemble de nos travaux suggère que le polymère de chitosan complexé à la phosphorylcholine en présence ou non de 17β-estradiol est une matrice compatible avec les cellules progénitrices dérivées de la moelle osseuse in vitro. Le 17β-estradiol complexé au polymère est toutefois plus efficace que sa forme soluble à promouvoir l’amplification du nombre de cellules progénitrices. Ce polymère représente un outil thérapeutique attrayant et une matrice de livraison d’agent bioactif prometteuse pour le recrutement cellulaire dans l’accélération de la guérison vasculaire. / Bone marrow derived cells, including endothelial progenitor cells, are reduced in numbers in patient with cardiovascular disease or risk factors. Mobilization and incorporation of these cells at the vascular lesion site are important events in the reendothelialization process. 17β-estradiol was shown in a mouse model of injury, to favour this healing process through mechanisms which involve the mobilization and incorporation of endothelial progenitor cells derived from the bone marrow. At the moment, there are many strategies to increase endothelial progenitor cells mobilization as well as recruitment into the vascular wall. However, few studies favour local delivery of a large number of functional progenitor cells on a biodegradable scaffold and to maintain them at the lesion site in order to promote reendothelialization. An interesting biopolymer for this application is chitosan. This non toxic and biodegradable biopolymer is commonly used in tissue engineering and was recently used in vascular healing. Phosphorylcholine modified chitosan can increase the water solubility and cell biocompatibility of the biopolymer in physiological condition. This master project was thus designed to :1) evaluate, in vitro, the capacity of phosphorylcholine modified chitosan to influence cell adhesion, survival, differentiation and functionality in a mouse model of bone marrow mixed culture and 2) determine the impact of 17β-estradiol on these cell behaviours. Our results suggest an adequate biocompatibility of phosphorylcholine modified chitosan with our cell culture system. Indeed, this polymer was able to promote cell organization and development of bone marrow derived cells in the same way that fibronectin, the most commonly matrix used in the progenitor cells in vitro culture. Moreover, cell migratory activity was not compromised by the chitosan polymer. It appears that 17β-estradiol, when added to cell culture media or attached on phosphorylcholine modified chitosan is able to modulate differently cell behaviour. Our data suggest that 17β-estradiol coupled to the chitosan polymer was superior to increase the number of haematopoietic and endothelial progenitor cells derived from bone marrow in vitro compared to the soluble form. 17β-estradiol coupled to the polymer of phosphorylcholine modified chitosan allowed an increased amplification of progenitor cell number and provided adequate scaffold to favour vascular healing. We propose that phosphorylcholine modified chitosan in presence or not of 17β-estradiol is a compatible matrix with bone marrow derived progenitor cells in vitro. 17β-estradiol enhances the amplification of progenitor cell in vitro when associated to the polymer compared to its soluble form. This biopolymer may be an attractive matrix and a promising vehicle in a drug delivery therapeutic system for progenitor cells recruitment and to promote vascular healing.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Les cellules endothéliales progénitrices («Endothelial Progenitor Cells», EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui possèdent un potentiel considérable dans la réparation et la régénération vasculaire. Dans le contexte des maladies cardiovasculaires, la compréhension du rôle des EPCs dans la régulation de la thrombogenèse et la réparation endothéliale est pertinente et nécessaire pour comprendre leur potentiel thérapeutique. Nous avons rapporté que les EPCs interagissent avec les plaquettes via la P-sélectine et inhibent l’adhésion, l’activation et l’agrégation des plaquettes ainsi que la formation de thrombus. Plus récemment, nous avons démontré que les EPCs expriment le récepteur inflammatoire CD40 et il est bien connu que les plaquettes constituent la source principale de la forme soluble de son agoniste le CD40L («soluble CD40 Ligand», sCD40L). Ainsi, nous avons émis l’hypothèse principale que l’axe CD40L/CD40 dans les EPCs influence leurs fonctions anti-thrombotique et pro-angiogénique. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons réussi à générer des «early» et «late» EPCs à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique («Peripheral Blood Mononuclear Cells», PBMCs) en culture. Nous avons mis en évidence l’existence de l’axe CD40L/CD40 dans ces EPCs en démontrant l’expression des protéines adaptatrices, nommées les facteurs associés au récepteur du facteur de nécrose tumorale («TNF Receptor Associated Factors», TRAFs). Dans une première étude, nous avons investigué l’effet du sCD40L sur la fonction des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. En effet, nous avons démontré que le sCD40L renverse leur effet inhibiteur sur l’agrégation plaquettaire, et ce sans avoir un effet significatif sur la sécrétion de prostacycline (PGI2) et d’oxyde nitrique («Nitric Oxide», NO) par ces cellules. De plus, aucun effet du sCD40L n’a été noté sur l’apoptose et la viabilité de ces cellules. Par contre, nous avons noté une augmentation importante du stress oxydatif dans les «early» EPCs suite à leur stimulation avec le sCD40L. L’inhibition du stress oxydatif renverse l’effet du sCD40L sur les «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. Ces résultats pourraient expliquer, en partie, la fonction réduite des EPCs chez les individus présentant des niveaux élevés de sCD40L en circulation. Dans une deuxième étude, nous avons étudié l’effet de sCD40L dans la fonction des «early» EPCs en relation avec l’angiogenèse. Nous avons identifié, dans un premier temps,les métalloprotéinases de la matrice («Matrix Metalloproteinases», MMPs) qui sont sécrétées par ces cellules. Nous avons trouvé que les «early» EPCs relâchent principalement la MMP-9 et que cette relâche est augmentée par le sCD40L. Le sCD40L induit aussi la phosphorylation de la p38 MAPK qui contribue à augmenter la sécrétion de MMP-9. Des études fonctionnelles ont démontré que le prétraitement des «early» EPCs au sCD40L potentialise la réparation endothéliale des HUVECs. En conclusion, l’ensemble de nos travaux, dans le cadre de ce projet de doctorat, nous a permis d’élucider les mécanismes responsables de l’action du sCD40L sur les effets inhibiteur et angiogénique des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire et l’angiogenèse, respectivement. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur le rôle des EPCs et pourront constituer la base pour des études futures permettant de corréler les niveaux élevés du sCD40L circulant et l’incidence des maladies cardiovasculaires, particulièrement l’athérothrombose. / Endothelial progenitor cells (EPCs) are endothelial precursors which possess a considerable therapeutic potential in vascular repair and regeneration. In the context of cardiovascular diseases, the understanding of the role of EPCs in the regulation of thrombogenesis and endothelial repair is relevant and necessary to the understanding of their therapeutic potential. We have shown that EPCs interact with platelets via P-selectin and inhibit the adhesion, activation and aggregation of platelets as well as thrombus formation. Recently, we have shown that EPCs express the inflammatory receptor CD40 and it is well known that platelets are the main source of the soluble form of its agonist CD40L («soluble CD40 ligand», sCD40L). Hence, we have hypothesized that the CD40L/CD40 axis in EPCs influences the anti-thrombotic and pro-angiogenic functions of EPCs. To verify this hypothesis, we have successfully generated early and late EPCs from peripheral blood mononuclear cells in culture. We have demonstrated the existence of the CD40L/CD40 axis in EPCs by showing the expression of adaptor proteins, named tumor necrosis factor associated factors (TRAFs). In our first study, we investigated the effect of sCD40L on the function of early EPCs in platelet aggregation. Indeed, we have shown that sCD40L reverses their inhibitory effect on platelet aggregation without having an effect on prostacyclin (PGI2) and nitric oxide (NO) secretion by these cells. Moreover, no effect of sCD40L has been noted on the apoptosis and viability of these cells. However, we have shown a significant increase in oxidative stress in early EPCs following sCD40L stimulation. The inhibition of oxidative stress reverses the effect of sCD40L on early EPCs in platelet aggregation. These results could partially explain the decreased function of EPCs in individuals displaying higher levels of sCD40L in circulation. In our second study, we have studied the effect of sCD40L on the function of early EPCs in relation to angiogenesis. First, we have identified the matrix metalloproteinases (MMPs) which are secreted by these cells. We have found that early EPCs mainly release MMP-9 and that this release is increased by sCD40L. The sCD40L also induces the phosphorylation of p38 MAPK which contributes to increase the secretion of MMP-9. In functional studies, we have shown that pretreatment of early EPCs with sCD40L can potentialize HUVEC endothelial repair. In conclusion, our work in the context of this doctoral research project has allowed us to study the mechanisms involved in the role of sCD40L in the inhibitory and angiogenic function of early EPCs in platelet aggregation and angiogenesis, respectively. These results add new insights to the role of EPCs and could constitute the basis for future studies allowing for the correlation between high levels of sCD40L and the incidence of cardiovascular disease, particularly atherothrombosis.

La documentation scientifique fait état de la présence, chez l’adulte, de cellules souches et progénitrices neurales (CSPN) endogènes dans les zones sous-ventriculaire et sous-granulaire du cerveau ainsi que dans le gyrus denté de l’hippocampe. De plus, un postulat selon lequel il serait également possible de retrouver ce type de cellules dans la moelle épinière et le néocortex des mammifères adultes a été énoncé. L’encéphalopathie de Wernicke, un trouble neurologique grave toutefois réversible qui entraîne un dysfonctionnement, voire une défaillance du cerveau, est causée principalement par une carence importante en thiamine (CT). Des observations récentes laissent envisager que les facteurs en cause dans la prolifération et la différenciation des CSPN pourraient également jouer un rôle important lors d’un épisode de CT. L’hypothèse, selon laquelle l’identification de nouveaux métabolites entrant dans le mécanisme ou la séquence de réactions se soldant en une CT pourraient en faciliter la compréhension, a été émise au moyen d'une démarche en cours permettant d’établir le profil des modifications métaboliques qui surviennent en de telles situations. Cette approche a été utilisée pour constater les changements métaboliques survenus au niveau du foyer cérébral dans un modèle de rats déficients en thiamine (rats DT), particulièrement au niveau du thalamus et du colliculus inférieur (CI). La greffe de CSPN a quant à elle été envisagée afin d’apporter de nouvelles informations sur la participation des CSPN lors d’un épisode de CT et de déterminer les bénéfices thérapeutiques potentiels offerts par cette intervention. Les sujets de l’étude étaient répartis en quatre groupes expérimentaux : un premier groupe constitué de rats dont la CT était induite par la pyrithiamine (rats DTiP), un deuxième groupe constitué de rats-contrôles nourris ensemble (« pair-fed control rats » ou rats PFC) ainsi que deux groupes de rats ayant subi une greffe de CSPN, soit un groupe de rats DTiP greffés et un dernier groupe constitué de rats-contrôles (rats PFC) greffés. Les échantillons de foyers cérébraux (thalamus et CI) des quatre groupes de rats ont été prélevés et soumis à des analyses métabolomiques non ciblées ainsi qu’à une analyse visuelle par microscopie à balayage électronique (SEM). Une variété de métabolites-clés a été observée chez les groupes de rats déficients en thiamine (rats DTiP) en plus de plusieurs métabolites dont la documentation ne faisait pas mention. On a notamment constaté la présence d’acides biliaires, d’acide cynurénique et d’acide 1,9— diméthylurique dans le thalamus, alors que la présence de taurine et de carnosine a été observée dans le colliculus inférieur. L’étude a de plus démontré une possible implication des CSPN endogènes dans les foyers cérébraux du thalamus et du colliculus inférieur en identifiant les métabolites-clés ciblant les CSPN. Enfin, les analyses par SEM ont montré une amélioration notable des tissus à la suite de la greffe de CSPN. Ces constatations suggèrent que l’utilisation de CSPN pourrait s’avérer une avenue thérapeutique intéressante pour soulager la dégénérescence symptomatique liée à une grave carence en thiamine chez l’humain. / Endogenous neural-stem progenitor cells (NSPC) have been documented to be found in the subventricular and subgranular zones, the dentate gyrus, and suggestions of the possibility of these cells being found in the spinal cord and neocortex in adult mammalian brain have been postulated. Thiamine deficiency (TD) is the major cause of Wernicke's Encephalopathy, a reversible neurological disorder that results in cerebral dysfunction and impairment. Recent evidence suggests factors involved in neural NSPC proliferation and differentiation are involved during TD. By means of a current approach for profiling metabolic changes occurring in focal areas of the TD rat brain, specifically the thalamus and the inferior colliculus (IC), it was hypothesized that new metabolites that might offer a better understanding into the sequel and/or mechanism of TD could be identified. It was also considered that the use of NSPC transplantation could offer new information into the involvement of NSPC and potential therapeutic benefit in TD. Non-targeted metabolomics analysis, fluorescences microscopy, and scanning election microscopy (SEM) analysis visualization was performed on samples of the focal areas (thalamus and IC) of pyrithiamine induced TD rats (PTD), pair-fed controls (PFC) rats, and NSPC transplanted TD and PFC rats. Various key metabolites were identified in rats with TD, including previous undocumented metabolites such as bile acids, kynurenic acid, and 1,9-dimethyluric acid in the thalamus and taurine and carnosine in the IC. The study also demonstrated a possible involvement of endogenous NSPC in focal areas of the thalamus and IC identifying key metabolites targeting NSPC and showed tissue amelioration (observed through SEM) following NSPC transplantation. The findings suggested that NSPC could offer a therapeutic alternative to alleviate some of symptomatic degeneration of TD.

L’angioplastie coronaire est la première forme de revascularisation coronaire. Elle présente cependant 2 limites qui restreignent encore son utilisation : la thrombose et la resténose de stent. La thrombose de stent est un événement précoce associé à une mortalité élevée. Les plaquettes y jouent un rôle déterminant. Le développement de tests fonctionnels plaquettaires permettant d’analyser le niveau de réactivité plaquettaire sous traitement a permis de mettre en évidence les limites de celui-ci sur le plan biologique. Nous avons démontré l’impact clinique de l’utilisation de ces tests dans la prédiction et la réduction du risque de thrombose de stent chez des patients traités par angioplastie coronaire. La resténose est quant à elle une complication tardive de l’angioplastie coronaire avec implantation d’un stent non-actif. Sa physiopathologie repose sur des mécanismes de lésion et de régénération endothéliale. Des marqueurs endothéliaux circulants ont récemment été développés. Nous avons montré qu’ils pouvaient permettre d’évaluer la lésion et la régénération endothéliale induite par une angioplastie coronaire. Les cellules endothéliales circulantes s’élèvent transitoirement après l’angioplastie et ce de façon variable en fonction de la réactivité plaquettaire sous traitement démontrant les interactions étroites entre ces différents acteurs. Dans le même temps, on observe une mobilisation de progéniteurs d’origine médullaire suite à l’angioplastie. Nos travaux suggèrent un rôle clé de la régénération endothéliale dans la cicatrisation vasculaire après angioplastie. En effet, il apparait que la proportion de progéniteurs de profil de différenciation endothélial en réponse à l’angioplastie coronaire détermine la survenue d’une resténose intra-stent. Ces données ouvrent la voie à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologie menant à la resténose mais aussi à des perspectives thérapeutiques intéressantes. / Percutaneous coronary intervention is the most commonly used revascularization technique. However it has 2 main complications limiting its widespread: stent thrombosis and in stent restenosis. Stent thrombosis is an early event associated with a high mortality rate. Platelets are key in its physiopathology. The availability of platelet function tests allowing to determine platelet reactivity levels under therapy showed a variable ant platelet effect following aspirin and clopidogrel intake. We further demonstrated that tailoring anti platelet therapy according to platelet function tests results decrease the rate of stent thrombosis following PCI without increasing bleedings. In stent-restenosis is a late complication of PCI with bare metal stents. The pathophysiology of in-stent restenosis is dependent on the lesion and regeneration of the endothelium. Circulating endothelial biomarkers have recently been developed. We have demonstrated that this marker allow to evaluate the lesion and regeneration of the endothelium following PCI. We evidenced a transient increase in circulating endothelial cells following PCI which is dependent on the level of platelet reactivity inhibition demonstrating the interaction between platelets and the endothelium. At the same time, PCI induces mobilization of progenitor cells which is detectable early after the intervention. Our work suggests that these progenitor cells have a key role in endothelial regeneration after PCI. We evidenced for the first time that the proportion of endothelial progenitor cells among progenitor cells mobilized after PCI determine the occurrence of in stent restenosis. Altogether these data give critical inside into vascular regeneration after PCI in human and on the mechanisms associated with in stent restenosis thus providing new potential therapeutic target.

Origin of mammalian somatic cells in the developing testes remains unclear. This origin could be explained by established cell culture derived from testes of Xenopus tropicalis juvenile male. The expression profile of the cell culture showed transcription of some pluripotency genes, somatic Sertoli and peritubular myoid cell markers and last but not least, the mesenchymal stem cell markers. Conversely, germ cell genes were downregulated. Immunocytochemical analysis revealed expression of Vimentin, Sox9 and α-smooth muscle actin, indicating that the testicular cell culture is a common mesenchymal progenitor of the Sertoli and peritubular myoid cells and that the cell culture did not arise from spermatogonial stem cells undergoing incomplete reprogramming in vitro. Testing of X. tropicalis cell culture during induction of differentiation in vitro revealed that these cells are probably multipotent with the ability to differentiate into adipocytes, chondroblasts and osteoblasts. The ability to derive multipotent stem cells from the juvenile testes opens new possibilities of using these cells for biotechnology and medicine. Keywords: Testicular somatic cells, Xenopus tropicalis, progenitor, mesenchymal stem cells, induction of differentiation, multipotency