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Importance du contexte cellulaire et de la régulation spatio-temporelle de l'expression du facteur de transcription Otx2 dans la modulation de ses fonctions / The importance of cellular context and of regulation of expression in modulating the functions of Otx2Fant, Bruno 08 December 2014 (has links)
Cette thèse s’intéresse aux mécanismes permettant d’expliquer plusieurs des fonctions de l’homéogène Otx2 au cours du développement. Une première partie étudie l’importance de la régulation de son expression dans la régionalisation du système nerveux central. A la fin de la gastrulation la frontière d’expression postérieure d’Otx2 déterminera la position de l’organiseur isthmique responsable de l’induction du mésencéphale et du métencéphale. Un modèle murin a été mis au point dans lequel cette frontière est abolie au profit d’une présence uniforme du gène. A l’encontre du modèle actuel, l’isthme est alors correctement induit, et est de plus déplacé antérieurement, signe qu’un seuil net de concentration d’Otx2 est nécessaire à sa fonction régionalisante. Une seconde partie étudie l’importance du contexte cellulaire dans les modalités d’action d’Otx2 au niveau de la rétine adulte. Otx2 est exprimé dans les deux tissus qui composent cet organe, la neurorétine et le RPE. Une étude par ChIP-seq dans ces deux tissus a pu montrer que l’homéogène y occupait des sites de fixation très différents, suggérant des fonctions distinctes. L’écrasante majorité des sites occupés par Otx2 dans la neurorétine l’était également par son paralogue Crx, indice d’une redondance fonctionnelle. Une nouvelle lignée de souris a permis l’analyse des partenaires protéiques d’Otx2 dans la neurorétine, et pu démontrer qu’Otx2 ne formait pas d’interactions avec les autres facteurs de ce tissu, faisant en fait de Crx l’acteur principal de la famille Otx. Cette analyse a également dévoilé une série de partenaires jusque-là inconnus d’Otx2, potentiellement associée à de nouvelles fonctions de la protéine. / The molecular mechanisms explaining several functions of the homeogene Otx2 during embryonic development are the focus of this work. In a first part the importance of the regulation of its expression in the regionalisation of the central nervous system is studied. At the end of gastrulation the posterior border of Otx2 expression will position the isthmic organizer responsible for the induction of the midbrain and hindbrain. A mouse model was developed where this border is replaced by an ubiquitous expression of the gene. Contrary to the predictions of the current model, the organizer then correctly arises, and is shifted anteriorly. A concentration threshold of Otx2 thus appears necessary to its regionalising function. In a second part the importance of the cellular context in Otx2 function in the adult retina is examined. Otx2 is expressed in both tissues of this organ, the neural retina and RPE. A ChIP-seq analysis performed on both tissues revealed that this homeogene occupies very different sets of binding sites, which suggests distinct functions of the transcription factor. Most Otx2-bound sites in the neural retina were also bound by its paralogue Crx, with which a functional redundancy may therefore exist. A new mouse line finally allowed the study of the complete Otx2 interactome in the neural retina; this analysis showed that Otx2 does not interact with other important transcription factors of this tissue, and that Crx may therefore be the main actor of the Otx family in neural retina function. It also led to the discovery of a series of previously unknown partners of Otx2, which could be associated to new functions of this homeogene.
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Marqueurs protéiques de la tendreté de la viande bovine : étude prédictive et fonctionnelle / Protein markers of beef tenderness : predictive and functional studyGuillemin, Nicolas 16 December 2010 (has links)
La variabilité non maîtrisée de la tendreté de la viande bovine est un problème majeur pour la filière industrielle, cette qualité étant très recherchée par les consommateurs. Depuis de nombreuses années, différents programmes de recherche ont identifié des marqueurs ADN, ARN et protéines de la tendreté de la viande bovine, dans des contextes différents. Aux Etats-Unis et en Australie, des recherches ont abouti à la conception de tests efficaces de prédiction de la qualité de la viande. Ces tests ne fonctionnent cependant pas sur les élevages français. La filière française est donc demandeuse de tests de prédiction simples permettant de mesurer la tendreté sur l’animal vivant et la carcasse. De tels tests sont inexistants à l’heure actuelle. L’objectif de la thèse est de valider ou non une liste de potentiels marqueurs protéiques de la tendreté, et de développer des équations de prédiction de cette qualité, afin d’envisager la conception de tests immunologiques de prédiction à destination de la filière sur l’animal vivant et la carcasse, dans un avenir proche. Une nouvelle technique pour quantifier les protéines d’un échantillon de muscle bovin a été développée, le Dot-Blot, et permet de disposer de prototype pour de futurs tests de phénotypage de la tendreté. L’utilisation de cette technique a permis de quantifier 24 protéines sur 111 échantillons de deux muscles de boeufs et de taurillons de race Charolaise. Ces travaux ont identifié en premier lieux des effets biologiques liés au type de muscle et d’animal sur l’abondance des protéines. Puis, trois analyses différentes, dont les résultats sont concordants, ont validé des marqueurs de tendreté et mis en lumière les principaux mécanismes cellulaires impliqués dans la tendreté, générant des équations de prédiction de la tendreté. Des outils de bioinformatique ont été construits à partir de données expérimentales de la thèse sur les protéines de la tendreté et de bases de données humaines, afin de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans la mise en place de la tendreté. En conclusion, ce travail de thèse a développé un nouvel outil d’analyse et les premières équations de prédiction de la tendreté de la viande bovine fiables sur un système centré sur les mâles, supports indispensables au développement de tests de prédiction de la tendreté sur l’animal vivant et la carcasse. De plus, ce travail a permis de mieux comprendre et caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans la mise en place de la tendreté. / The uncontrolled variability of beef tenderness is a major problem for industry. This quality is very important for consumers. For many years, different research programs have identified DNA, RNA and proteins markers of beef tenderness, in different contexts. In United States and Australia, these tests reached to the conception of efficient meat quality prediction tests. However, these tests do not work in France. So, French industry asks for simple tenderness prediction tests, which measure tenderness on living animals and carcasses. This type of tests is currently missing. The objective of the PhD is to validate or not a list a proteins tenderness potential markers, and to develop quality prediction equation, to engage the conception of immunological tests for industry, usable on living animals and carcasses. A new technique for quantify proteins in bovine muscle samples have been developed, the Dot-Blot, and allow to have prototypes of the future tenderness tests. Utilization of Dot-Blot provides phenotypic data of 224 proteins on 111 muscle samples of Charolais beefs and young bulls. This work first identified biological effects due to animal and muscle types on proteins abundance. Then, three different analyses, with corroborating results, validated tenderness markers and revealed main cellular pathways implied in tenderness, and generated tenderness prediction equations. Bioinformatics tools have been built upon experimental data from this work on tenderness proteins and human databases, to better understand the main mechanisms implied intenderization processes. In conclusion, this work have developed a new analyzing tool and the first beef tenderness prediction equation, trusty on a male-based system, essential supports for the development of beef tenderness prediction tests on living animals and carcasses. Moreover, this work enabled to better understand and characterize the molecula rmechanisms involved in tenderization processes.
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Caractérisation du protéome vascuolaire de la plante modèle Arabidopsis thaliana et étude de son rôle dans la détoxication du cadmium / Characterization of the vacuolar proteome of the model plant Arabidopsis thaliana and studies of its role in cadmium detoxificationJarno, Nolwenn 01 December 2011 (has links)
Afin de mieux comprendre les mécanismes du trafic cellulaire, les processus de transport des substrats vacuolaires à travers le tonoplaste, le stockage des métabolites et leur dégradation, une analyse globale et exhaustive du protéome vacuolaire d'Arabidopsis thaliana a été réalisée. La connaissance de la localisation subcellulaire des protéines permet de mieux comprendre la fonction des organelles et la compartimentation du métabolisme des plantes. Mais la description précise du protéome d'un organite nécessite d'identifier clairement les véritables protéines résidantes du compartiment étudié. Une tâche si précise est complexe puisqu'elle nécessite la mise en place d'une préparation d'organites purs et homogènes. Pour y parvenir, un protocole de purification de vacuoles à partir de protoplastes isolés de cellules en culture sur un gradient de densité de Ficoll a été amélioré. La combinaison de plusieurs approches de protéomique a permis d'identifier les protéines présentes dans les fractions vacuolaires soluble et membranaire de façon quantitative et fonctionnelle. Les différentes approches ont ainsi mis en évidence des associations et mécanismes moléculaires complexes qui régissent les différentes activités vacuolaires. Cette protéothèque de référence constitue une base pour étudier la dynamique du protéome vacuolaire en réponse à plusieurs stress incluant les métaux lourds. Plusieurs méthodes sans a priori et ciblée ont été proposé afin d'étudier l'impact du cadmium sur la vacuole, ce compartiment cellulaire clé de la détoxication. / To better understand the mechanisms governing cellular traffic, transport process of substrates across the tonoplast, storage of various metabolites and their ultimate degradation, a comprehensive and thorough analysis of Arabidopsis thaliana vacuolar proteome was performed. Protein subcellular localization knowledge is an important step toward assigning functions of organelles and plant metabolism compartmentation. But confident description of proteome organelle content requires clear identification of the true resident proteins of the studied compartment. This task involves pitfalls and requires that either organelle preparations are free of contaminants or that techniques are used to discriminate between genuine organelle residents and contaminating proteins. To achieve this, vacuoles purification protocol from protoplasts on a Ficoll density gradient has been improved. The combination of several proteomic approaches attempt to present soluble and membrane vacuolar proteins in a quantitative and functional manner. Different approaches have thus shown associations and complex molecular mechanisms that govern the various vacuolar activities. The constitute proteins library provides references to study the vacuolar proteome dynamics in response to different stresses including heavy metals. Many methods without a priori or targeted were proposed to study the impact of cadmium on the vacuole, the key cell compartment of detoxification. Proteomics provides powerful tools for characterizing the protein contents of vacuoles during cadmium stress.
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Dérégulations protéomiques et fonctionnelles des Syndromes Myéloproliferatifs Philadephia négatifs / Proteomic and functional deregulations in Philadelphia negative Myeloproliferative NeoplasmsSocoro Yuste, Nuria 17 December 2015 (has links)
En plus des anomalies génétiques, plusieurs études ont rapporté des altérations des protéines chez les patients atteintes de Syndromes Myéloprolifératifs (SMP) Ph- qui pourraient participer à leurs phénotypes cliniques. Néanmoins, les altérations protéiques dans ces pathologies ne sont pas bien connues. Dans ce contexte, nous avons utilisé une approche protéomique par spectrométrie de masse pour nous aider à déchiffrer le paysage des anomalies des protéomes érythrocytaire et granulocytaire qui pourraient être liées à des altérations cellulaires fonctionnelles et à la physiopathologie des SMP. Nous avons ainsi pu identifier des dérégulations importantes de protéines qui varient selon le statut génétique des patients, [JAK2(+), JAK2(-) ou CALR(+)], selon la charge allélique de JAK2V617F, mais aussi selon le type de SMP JAK2(+) ou selon la. Ces dérégulations protéiques perturbent des voies de signalisation comme la voie IQGAP1/Rho GTPase qui pourrait être liée aux thromboses par des modifications de l'intégrité membranaire via la dérégulation de PAK1 ou des protéines du cytosquelette d'actine. Des modifications des voies de signalisation des ROS ou mTOR ont été également identifiées dans les granulocytes. En outre, nous avons montré que la protéine CALR pourrait avoir un double rôle oncogénique grâce à son expression élevée dans les SMP JAK2V617F, différent de l'altération de sa fonction décrites dans les patients CALR mutés. En conclusion, nous avons montré que les dérégulations protéomiques pourraient jouer un rôle oncogénique important dans la physiopathologie des SMP Ph- et qu’elles pourraient être impliquées dans certaines complications de ces pathologies telles que les accidents thrombotiques. / Besides genetic abnormalities, several studies have reported protein alterations in Ph-Myeloproliferative neoplasms (MPN) which could participate to the clinical phenotype of patients. Nevertheless, little is known about protein alterations in these pathologies. In this context, we used an integrative proteomic approach to decipher the landscape of the erythrocyte and granulocyte proteome abnormalities that could be related to functional cell alterations and to MPN physiopathology. We could identify significant protein deregulations that varied not only according to genetic status JAK2(+), JAK2(-) or CALR(+) but also among JAK2(+) MPNs or depending on the JAK2V617F allele burden. These protein deregulations involved pathway alterations such as the IQGAP1/Rho GTPase signaling that could be related to thrombosis via alterations on the membrane integrity by deregulation of PAK1 or the actin cytoskeleton signaling. ROS or mTOR signaling alterations were also identified in granulocytes. Finally, we stress out that CALR protein could have a dual oncogenic role through its up-regulation in JAK2V617F MPNs different from its altered function described in CALR mutated patients. Altogether, we showed that proteomic deregulations might play an important oncogenic role in MPN physiopathology and could be implicated in complication as thrombotic accidents
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Analyse protéomique d'alterations de propriétés sensorielles et technologiques de la viande de dinde.Molette, Caroline 27 September 2004 (has links) (PDF)
Les objectifs de cette étude sont de caractériser des altérations des qualités sensorielles et technologiques de la viande de dinde et de mettre en relation ces altérations avec les caractéristiques des protéines musculaires. Nous avons, tout d'abord, sélectionné des muscles Pectoralis major (PM) de dindes en fonction de leur couleur. Les propriétés sensorielles et technologiques de la viande ne diffèrent jamais entre le groupe ayant une couleur « normale » et le groupe ayant une couleur « pâle » (expérience couleur). Dans un deuxième temps, nous avons essayé d'analyser l'effet de la vitesse de chute du pH post mortem sur la qualité de la viande issue du PM de dinde. Cet effet a été mesuré avec différents types génétiques de dindes : des souches BUT9 (expériences BUT9.1 et BUT9.2) et BIG6 (expérience BIG6) comparées dans des conditions d'abattage commercial ou des souches BUT9 et Label Rouge (expérience Label) comparées en générant artificiellement le défaut PSE. Nos différentes expériences montrent que le pouvoir de rétention en eau et la texture de la viande sont diminués lorsque la glycolyse musculaire post mortem est accélérée. Par contre, la couleur de la viande est peu affectée. Nous avons aussi mis en évidence des altérations de protéines de structure (α-actinine), de protéines contractiles (actine et chaîne lourde de la myosine) et de protéines sarcoplasmiques (GAPDH, aldolase A, myokinase, ATP synthase et phosphorylase). Le type génétique des dindes ne semble pas être déterminant dans l'augmentation de l'apparition des défauts de qualité de viande.
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Determination of inherited or acquired factors involved in decompression sickness : creation of a DCS resistant rat strain / Détermination des facteurs individuels innés ou acquis impliqués dans l’accident de décompression : création d’une souche de rats résistante à l’ADDLautridou, Jacky 15 December 2017 (has links)
L’Accident de Décompression présente un risque majeur pour les plongeurs. Il est admis que la formation de bulles circulantes est à l’origine de l’ADD. Cependant, une forte variabilité inter individuelle existe entre plongeurs, avec une faible corrélation entre bulles et symptômes de l’ADD. Plusieurs mécanismes physiologiques ont été liés à l’ADD, mais aucun d’entre eux ne semble déterminant dans la mise en place de la pathologie. Dans ce contexte, des techniques issues de la médecine de précision pourraient apporter de nouveaux éléments de compréhension.Durant cette thèse, nous avons effectué des études protéomiques afin d’étudier les possibles changements du protéome plasmatique de rats et de plongeurs suite à une plongée avec ou sans ADD, dans le but de trouver de potentiels biomarqueurs de développement précoce de l’ADD. Nous avons de plus mis en évidence une potentielle implication de processus inflammatoires dans la mise en place des symptômes de l’ADD. Un protocole de sélection a ensuite été utilisé dans le but de créer une nouvelle souche de rats résistante à l’ADD. Une résistance à l’ADD est apparue en l’espace d’une génération chez les femelles, deux chez les mâles. Une caractérisation physiologique de la souche résistante a montré une potentielle implication d’une région spécifique du chromosome X, ainsi que des modifications du fonctionnement du muscle lisse vasculaire, de la résistance aux espèces réactives de l’oxygène, de la consommation d’oxygène mitochondriale, et du système immunitaire. Les suites de cette caractérisation se focaliseront sur des études transcriptomiques et génétiques, en particulier sur la région d’intérêt du chromosome X. / Decompression Sickness is one of the most serious hazards for divers. It is usually admitted that DCS origins from circulating bubbles. However, a strong inter-individual variability exists between divers, resulting in a poor correlation between bubble grade and DCS symptoms. Several physiological mechanisms have been linked with DCS, but none of them appeared to be determinant in the onset of the pathology. In this context, medicine precision techniques may offer new insights, with a broader approach.During this thesis, we used proteomics to investigate changes of the plasma proteome of rats and divers during diving, with and without DCS, and aimed at finding biomarkers of early DCS development. We found that acute inflammation may play a role in the onset on DCS, and that proteomics may be fitted to look for new biomarkers. We also used a selection protocol to create a new DCS resistant rat strain, which was significantly more resistant than classic Wistar rats. Moreover, DCS resistance was gained in a matter of only 2 reproductions cycles (only 1 for females), which gives evidence of heritable components of DCS resistance/susceptibility that might be carried out by the X chromosome. A characterization of this DCS resistant strain showed a number of physiological adaptations gained during the selection process. Indeed, DCS resistant rats showed a decreased mitochondrial oxygen global consumption, a decrease of vascular smooth muscle contraction and relaxation as well as a raise of neutrophils count among males.Further characterization of the DCS resistant strain will focus on transcriptomic and genetic studies, especially on the genomic region of interest located on the X chromosome.
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Voies de signalisation associées au récepteur 5-HT6 et développement neuronal / 5-HT6 receptor signaling in neurodevelopmentDuhr, Fanny 05 June 2015 (has links)
La mise en place des circuits neuronaux est un processus complexe et précisément régulé. Une atteinte de ce processus est à l'origine de diverses pathologies neurodéveloppementales telles que la schizophrénie ou les troubles du spectre autistique, désordres psychiatriques partageant une altération des fonctions cognitives. Le récepteur 6 de la sérotonine (récepteur 5-HT6), notamment connu pour son implication dans la migration neuronale, s'est révélé être une cible thérapeutique de choix dans le traitement des symptômes cognitifs associés à la schizophrénie mais aussi à des pathologies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. Cependant la signalisation déclenchée par le récepteur 5-HT6 n'explique pas entièrement son implication dans les processus neurodéveloppementaux. Mon travail de thèse a donc visé à comprendre les mécanismes de signalisation engagés par le récepteur 5-HT6 au cours du développement neuronal. La réalisation d'un crible protéomique a permis de montrer que le récepteur 5-HT6 interagissait avec plusieurs protéines cruciales dans le développement neuronal comme la protéine Cdk5 et sa cible WAVE-1. J'ai ensuite pu démontrer qu'en plus de son rôle dans la migration, le récepteur 5-HT6 contrôlait de façon agoniste-indépendante l'élongation des neurites par un mécanisme impliquant la phosphorylation de son domaine C-terminal par la kinase Cdk5 et l'activation de la RhoGTPase Cdc42. La seconde partie de mon travail a visé à mettre en évidence le rôle du récepteur 5-HT6 dans la formation des épines dendritiques et à comprendre l'implication de la protéine WAVE-1, cible de Cdk5, dans ce processus. Les résultats obtenus au cours de ma thèse apportent de nouveaux éléments quant au contrôle des processus neurodéveloppementaux par le récepteur 5-HT6. Ce récepteur apparaît donc comme une cible thérapeutique de choix dans les atteintes neurodéveloppementales en contribuant au développement des circuits cognitifs en relation avec la physiopathologie des troubles du spectre autistique ou de la schizophrénie. / Brain circuitry patterning is a complex, highly regulated process. Alteration of this process is affected gives rise to various neurodevelopmental disorders such as schizophrenia or Autism Spectrum Disorders (ASD), which are both characterized by a wide spectrum of deficits. Serotonin 6 receptor (5-HT6 receptor), which is known for its implication in neuronal migration process, has been identified as a key therapeutic target for the treatment of cognitive deficits observed in schizophrenia, but also in neurodegenerative pathologies such as Alzheimer's disease. However, the signalling mechanisms knowned to be activated by the 5-HT6 receptor do not explain its involvement in neurodevelopmental processes. My thesis project therefore aimed at characterizing the signalling pathways engaged by 5-HT6 receptor during neural development. A proteomic approach allowed me to show that the 5-HT6 receptor was interacting with several proteins playing crucial roles in neurodevelopmental processes such as Cdk5 or WAVE-1. I then demonstrated that, besides its role in neuronal migration, the 5-HT6 receptor was also involved in neurite growth through constitutive phosphorylation of 5-HT6 receptor at Ser350 by associated Cdk5, a process leading to an increase in Cdc42 activity. The second part of my work aimed at understanding the role of 5-HT6 receptor in dendritic spines morphogenesis, and the involvement of WAVE-1 and Cdk5 in this process. These results provide new insights into the control of neurodevelopemental processes by 5-HT6 receptor. Thus, 5-HT6 receptor appears to be a key therapeutic target for neurodevelopmental disorders by contributing to the development of cognitive circuitry related to the pathophysiology of ASD or schizophrenia.
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Analysis of the dystrophin interactome / Analyse de l'interactome dystrophineThorley, Matthew 07 December 2016 (has links)
Le but de ce projet était d'identifier de manière méthodique et standardisée les partenaires interagissant avec la protéine dystrophine dans les cellules musculaires squelettiques humaines différenciées et découvrir de nouveaux rôles de la dystrophine. Des cellules immortalisées ont été obtenue en sur-exprimant de manière stable hTERT / CDK4. Nous avons réalisé une analyse transcriptomique comparant des lignées immortalisées avec leurs populations primaires correspondantes, à l’état de prolifération et de différentiation. Nous avons constaté que l'immortalisation n'a pas d'effet mesurable sur le programme myogénique ou sur tout autre processus cellulaires, et qu'elle avait un effet protecteur contre le processus de sénescence. Les lignées de cellules musculaires humaines constituent donc de bon model in vitro pour l’étude de l’interactome de la dystrophine. Nous avons déterminé l’interactome de la dystrophine en utilisant l’approche proteomique ‘QUICK’. Nous avons identifié 18 nouveaux partenaires directs de la dystrophine, partenaires étant impliqués dans le transport vésiculaire ou étant des protéines d'adhésion. Ces résultats renforcent les données précédemment publiées suggérant un lien entre la dystrophine et le trafic vésiculaire, ainsi que dystrophine et adhesion cellulaire. Ces nouveaux partenaires ont été ajoutés à l’interactome de la dystrophine, interactome accessible sur le Web: sys-myo.rhcloud.com/dystrophin-interactome. Ce site web est dédié à être un outil facile d’utilisation permettant d’explorer et de visualiser l’interactome de la dystrophine du muscle squelettique. / The aim of this project was to systematically identify new interaction partners of the dystrophin protein within differentiated human skeletal muscle cells in order to uncover new roles in which dystrophin is involved, and to better understand how the global interactome is affected by the absence of dystrophin. hTERT/cdk4 immortalized myogenic human cell lines represent an important tool for skeletal muscle research however, disruption of the cell cycle has the potential to affect many other cellular processes to which it also linked. A transcriptome-wide analysis of healthy and diseased lines comparing immortalized lines with their parent primary populations in both differentiated and undifferentiated states testing their myogenic character by comparison with non-myogenic cells found that immortalization has no measurable effect on the myogenic cascade or on any other cellular processes, and that it was protective against the senescence. In this context the human muscle cell lines are a good in vitro model to study the dystrophin interactome. We investigated dystrophin’s interactors using the high-sensitivity proteomics ‘QUICK’ approach. We identified 18 new physical interactors of dystrophin which displayed a high proportion of vesicle transport related proteins and adhesion proteins, strengthening the link between dystrophin and these roles. The proteins determined through previously published data together with the newly identified interactors were incorporated into a web-based data exploration tool: sys-myo.rhcloud.com/dystrophin-interactome, intended to provide an easily accessible and informative view of dystrophins interactions in skeletal muscle.
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Interactions virus (dengue)-vecteurs (aedes) et mise en évidence d'une méthode d'isolement des virus de la dengue et du chikungunya / Interaction between the dengue virus and its Aedes vector and development of a novel technique to isolate dengue and chikungunya viral particlesPatramool, Sirilaksana 13 December 2013 (has links)
La dengue et le chikungunya sont deux arboviroses émergentes qui sont transmises à l'homme par la piqûre de moustiques du genre Aedes. Il n'existe ni vaccin ni traitements commercialisés pour ces arboviroses. Il apparaît donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies pour isoler les virus circulants et bloquer leur transmission. La compréhension des mécanismes mis en jeu dans les cellules des vecteurs Aedes lors d'une infection par le virus de la dengue (DENV) sont encore très peu étudiés, notamment pour les sérotypes 1 et 3. Par des analyses protéomiques de l'infection d'une lignée cellulaire du moustique Aedes albopictus par ces séroytypes, nous avons démontré qu'en réponse à l'infection, les cellules de moustiques utilisent les mécanismes antioxydants combinés à la production d'énergie pour faire face au virus. Les résultats de notre étude devraient permettre de mieux comprendre l'interaction DENV-vecteur Aedes au niveau cellulaire dans le but de concevoir des stratégies efficaces pour le contrôle du DENV. Nous avons également regroupé dans une revue les connaissances acquises sur les études protéomiques des principaux compartiments des arthropodes vecteurs de maladies humaines. Dans un second volet, nous avons mis en évidence une méthode rapide d'isolement et de concentration des DENV et du chikungunya. Cette technique d'isolement basée sur la capture de virus sur des billes magnétiques enrobées de polymères anioniques permet d'obtenir des particules virales infectieuses. Cette méthode combinée à des approches classiques de détection de virus pourrait non seulement permettre l'identification des échantillons infectés ayant une faible charge virale, mais aussi l'isolement simultanée de particules infectieuses de dengue et de chikungunya à partir d'un seul échantillon. / Dengue (DENV) and Chikungunya (CHIKV) viruses are two emerging arboviruses that are transmitted to humans by the bite of Aedes sp. mosquito vectors. Neither vaccines, nor medical treatments, are commercially available for these infections. It is, therefore, necessary to elaborate novel strategies to isolate the circulating viruses and block their transmission.Our understanding of the molecular mechanisms involved, during the infection of the Aedes vector by dengue virus (DENV), especially serotypes 1 and 3, remains very scant. We, therefore, performed a proteomics analysis of an Aedes albopictus cell line, infected by these two DENV serotypes, and showed that the cells use both anti-oxidant and energy-production mechanisms in the fight against the virus. These results should help to improve our knowledge of the interaction of the DENV virus and the Aedes mosquito vector, at the cellular level, with the aim of designing efficient strategies for the control of this virus. We have, in addition, developed a rapid and sensitive isolation technique, based on viral particle adsorption to magnetic beads coated with an anionic polymer. The use of this technique is of great interest, as it permits the rapid and simultaneous detection and isolation of CHIKV and DENV from samples with reduced viral loads.
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Développement d’une méthodologie couplant la photodissociation laser et la spectrométrie de masse haute résolution pour l’identification de nouveaux biomarqueurs / Development of a new methodology coupling photodissociation and high-resolution mass spectrometry with the aim of identifiying new biomarkersGarcia, Leny 29 November 2017 (has links)
La spectrométrie de masse est un outil performant pour identifier des biomarqueurs protéines dans des fluides biologiques. Plusieurs modes sont accessibles dont le mode « Data Independent Acquisition » (DIA), qui permet une sélection et une fragmentation exhaustive de tous les peptides détectables par l'appareillage. Cependant, ce mode génère des spectres de (co)-fragmentation très complexes rendant l'étape d'identification délicate. Pour surmonter cette limitation, nous nous sommes tournés vers une méthode d'activation des ions spécifique. La photodissociation laser (LID) à 473 nm, longueur d'onde à laquelle les peptides n'absorbent pas naturellement, a été implémentée dans un appareil Qexactive. La spécificité de fragmentation est induite après dérivation spécifique des peptides à cystéine (acide aminé rare présent globalement à 2 % mais présent dans 89 % des protéines) à l'aide d'un chromophore absorbant à 473 nm. Dans un premier temps, une bibliothèque de 354 spectres LID de peptides à cystéine dérivés a été créée pour le développement de la méthode DIA-LID. Cette méthodologie DIA-LID a ensuite été utilisée pour identifier et quantifier des biomarqueurs protéines kinases humaines putatifs endogènes au sein d'un extrait cellulaire mammaire cancéreux humain. Les comportements de fragmentation de 401 peptides à cystéine dérivés en LID à 473 nm ont également été étudiés permettant l'optimisation des méthodes d'identification et de quantification. Pour finir, une nouvelle méthodologie, intitulée C-trap-LID, a été appliquée pour repérer et extraire rapidement tous les m/z des ions précurseurs détectables par l'appareillage ayant photo-fragmentés dans une matrice complexe / Mass spectrometry is a powerful tool to detect putative proteins biomarkers in biological samples. Several methods are accessible, including Data Independent Acquisition (DIA) which allows the fragmentation of all detectable peptides in high resolution mass spectrometer. However, DIA methods are not able to exhaustively identify compounds due to the excessive complexity of fragmentation spectra of multiple precursor ions. Thus, we developed an alternative technique that adds specificity during fragmentation step to detect only a subset of peptides. We replaced the classical gas-collision fragmentation by a highly specific laser-induced photodissociation (LID) at 473 nm, for which peptides do not naturally absorb, in a Q-exactive. The specific absorption and photofragmentation is induced by grafting an adequate quenching chromophore to the thiol group of cysteine-containing peptides (a rare amino acid with a frequency of 2 % but present in 89 % of all human proteins) through a chemically controlled route. First, to develop the DIA-LID method, a spectral library including LID spectra of 354 cysteine-containing peptides was built. Then, this methodology was used to identify and quantify putative human protein kinases biomarkers in human cancerous mammalian cells. Simultaneously the fragmentation behavior of 401 derivatized cysteine-containing peptides was studied to rationalize the choice of peptides to provide the maximum of information to identify them in LID for discovery approaches. In closing, a new methodology named C-trap-LID, was introduced and applied to spot and extract quickly m/z related to all detectable derivatized cysteine-containing compounds in complex medium
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