Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Em etapa anterior a este trabalho, uma proteÃna purificada a partir do lÃtex da planta Calotropis procera foi purificada e sua caracterizaÃÃo bioquÃmica revelou ser esta uma proteÃna similar a osmotinas e que a mesma, denominada de CpOsm, exibia forte atividade contra fungos fitopatogÃnicos. Neste trabalho foram investigados sistemas de expressÃo heterÃlogos, procarionte e eucarionte, com o objetivo de estabelecer sistemas de expressÃo que pudessem produzir CpOsm recombinante e avaliar se sua expressÃo produzia a proteÃna ativa, com aÃÃo antifÃngica. A partir do sequenciamento do cDNA da CpOsm e ensaios de cristalizaÃÃo desenvolvidos com a proteÃna purificada do lÃtex foi possÃvel estudar suas caracterÃsticas moleculares. Para a expressÃo em E. coli foi utilizado o vetor pET303CT-His e P. pastoris o vetor pPICZαA. A proteÃna recombinante (rCpOsm) expressa no sistema procarionte nÃo foi secretada para o meio externo, acumulando-se no espaÃo intracelular, formando corpos de inclusÃo, nos quais a proteÃna estava insolÃvel. Embora a insolubilidade represente um passo limitante, este sistema de expressÃo pode ser muito interessante para a produÃÃo quantitativa de rCpOsm para outros fins como produÃÃo de anticorpos ou estudos de folding/refolding proteico, considerado suas caracterÃsticas moleculares peculiares, observadas nos estudos cristalogrÃficos, tais como o conjunto de pontes dissulfeto intracadeia. rCpOsm foi tambÃm expressa em cÃlulas de P. pastoris, entretanto o sistema de expressÃo deverÃ, necessariamente, sofrer melhorias para maximizar o rendimento. rCpOsm de P. pastoris foi inicialmente detectada por sequenciamento de novo por espectrometria de massas a partir da digestÃo trÃptica. A identificaÃÃo de peptÃdeos internos confirmou sua presenÃa no meio extracelular. A limitaÃÃo deu-se pela baixa taxa de expressÃo, o que, por conseguinte, nÃo permitiu uma caracterizaÃÃo mais ampla da rCpOsm deste sistema. rCpOsm expressa em P. postoris estava em sua forma ativa. Em uma anÃlise comparativa, rCpOsm e CpOsm, de modo e intensidade similares, foram capazes de alterar drasticamente a morfologia de esporos de F. solani e reduzir seu volume, comparados a esporos nÃo tratados, revelado atravÃs de microscopia de forÃa atÃmica. CpOsm foi cristalizada pelo mÃtodo de gota pendente e os cristais obtidos difrataram a uma resoluÃÃo de 1,61 à com caracterÃsticas morfolÃgicas do espaÃo cristalogrÃfico P6122. Os dados coletados sugerem que a proteÃna mantÃm uma estrutura em monÃmero, correspondendo a sequÃncia de aminoÃcidos do cDNA, com 203 resÃduos. A estrutura pode ser vista como trÃs regiÃes distintas, presentes em outras osmotinas jà descritas, formando um domÃnio central onde hà um conjunto de folhas beta, sendo este o mais longo, e dois outros menores, formados de estrutura predominantemente desordenadas com pequenos segmentos em alfa-hÃlice (domÃnio II) e longas alÃas (domÃnio III). Oito pontes dissulfeto estabilizam a estrutura e envolvem todos os resÃduos de cisteÃna da estrutura primÃria. NÃo hà evidencias cristalogrÃficas para formaÃÃo de oligÃmeros. Este estudo conclui que a expressÃo heterÃloga em sistema eucarionte produz rCpOsm ativa e isto representa uma etapa a mais cumprida para a sua possÃvel expressÃo em plantas com o objetivo de proteÃÃo contra fitopatÃgenos. / In a previous step to this work, a latex protein belonging to Calotropis procera was described. The protein, named CpOsm, exhibited biochemical characteristics closely related to pathogenesis related proteins joined into PR-5 group. The new protein with osmotin characteristics displayed activity against phytopatogenic fungi. Here, attempts to obtain a suitable heterologous system to express functional recombinant CpOsm were performed in Prokaryote and Eukaryote expression systems. Further, cDNA sequencing and crystallographic assays were performed using CpOsm and the molecular and structural properties of the functional protein. The vector pET303CT-His and PICZαA were used to express CpOsm in E. coli and P. pastoris, respectively. The ecombinant protein (rCpOsm) produced in the Prokaryote system was retained into E. oli cells and deposited as inclusion bodies. rCpOsm was insoluble. Although insoluble roteins into inclusion bodies represent an adverse phase for obtaining the active CpOsm, this system of expression can be interesting to other goals as quantitative roduction of rCpOsm for producing antibodies or to study protein folding/refolding, ince CpOsm possesses peculiar structural characteristics such as occurrence of an xtended network or intra chain disulfide bonds stabilizing the overall structure. rCpOsm as also successfully expressed in P. pastoris. However, this protocol must to undergo improvement in order to maximize yield. rCpOsm was initially detected in the P. pastoris expression system by MS/MS de novo sequencing after tryptic digestion. Identification of internal peptides present in the extracellular media confirmed the production and excretion of rCpOsm in P. pastoris cells. The very low yield of recombinant protein avoided enough amount of purified rCpOsm to perform a broad characterization. On a comparative basis, native CpOsm, purified of the latex, and rCpOsm, purified from P. pastoris cultures, at similar mode and intensity were capable of drastically alter the morphological architecture of spores of F.solani and reduced their olume as compared to non-treated spores, as revealed by atomic force microscopy measurements. CpOsm was crystallized by the pendant drop method and the crystals grown diffracted at 1.61 Ã. They fit on the P6122 space. The data collecting, supported by the cDNA deduced amino acid sequence suggested that CpOsm occurs as an monomeric structure composed of a unique chain of 203 amino acid residues and no evidences for quaternary association was seen. The overall structure can separated in three structural domains, which have been reported in other osmotins. The central region preserves the set of beta-sheets and is the largest. The others exhibit short segments on alpha-helix interconnected by randomized sequences (domain II). In domain III predominates randomized sequences and long loops. Eight disulfide bonds stabilize the structure and involve all cysteine residues of the primary sequence. The heterologous expression of CpOsm on Eukaryote system produces rCpOsm active and this support the hypothesis that rCpOsm is a suitable candidate for heterologous expression in plants in order to obtain improved crops against selected phytopatogens.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Este estudo teve como objetivo o aproveitamento da carne mecanicamente separada (CMS) de resÃduos da filetagem de tilÃpia-do-Nilo (Oreochromis niloticus) na obtenÃÃo de um concentrado protÃico para o consumo humano, caracterizando-o quanto aos parÃmetros fÃsico-quÃmicos e sensoriais. Foram estudados, em escala de laboratÃrio, trÃs mÃtodos de obtenÃÃo de concentrado protÃico de peixe (CPP) a partir da CMS. Os seguintes parÃmetros foram avaliados: rendimento, percentual de proteÃna, gordura, umidade e atividade de Ãgua (Aw). Baseando-se nos resultados obtidos, elaborou-se um procedimento analÃtico que foi utilizado na obtenÃÃo do CPP em escala piloto. Para a caracterizaÃÃo do CPP realizaram-se as anÃlises de rendimento, composiÃÃo centesimal, Aw, anÃlises microbiolÃgicas e sensoriais. Nos testes sensoriais do CPP, 48 provadores nÃo treinados avaliaram as caracterÃsticas de aparÃncia, cor e aroma usando os testes afetivos de escala hedÃnica e escala relativa ao ideal. Posteriormente, testou-se cinco nÃveis do CPP usando o arroz como alimento veÃculo. Os nÃveis de adiÃÃo 0% (controle), 15%, 22,5%, 30% e 37,5% foram calculados a partir da IngestÃo DiÃria Recomendada (IDR) de proteÃnas para adultos jovens. As cinco amostras de CPP adicionado em arroz identificadas, respectivamente, como: A, B, C, D e E foram avaliadas por 80 provadores nÃo treinados com relaÃÃo à aparÃncia, cor, aroma, sabor e aceitaÃÃo global atravÃs da escala hedÃnica estruturada de nove pontos, seguindo um delineamento de blocos completos balanceados. TambÃm avaliou-se a intenÃÃo de consumo dos provadores usando uma escala de aÃÃo de nove pontos. Os dados de composiÃÃo quÃmica da CMS e do CPP foram submetidos à anÃlise descritiva. Os dados sensoriais foram analisados atravÃs de representaÃÃo grÃfica, anÃlise descritiva, anÃlise de variÃncia (ANOVA) e teste de Tukey, utilizando-se o programa estatÃstico SPSS v.13.0. O CPP obtido em escala piloto apresentou um rendimento de 18,34%, teor de umidade de 1,38%, proteÃna 62,39%, gordura 32,63% e cinza 2,26% e Aw 0,16. O acrÃscimo do percentual de proteÃna do CPP em relaÃÃo ao da matÃria-prima original foi aproximadamente quatro vezes. A anÃlise microbiolÃgica revelou que o CPP atendeu aos padrÃes microbiolÃgicos da legislaÃÃo e, portanto, encontrava-se apto para o consumo humano. Na avaliaÃÃo sensorial do CPP, a freqÃÃncia de aceitaÃÃo dos provadores foi de 60,4% para cor, 51,1% para o aspecto geral e 41,7% para o aroma. A descriÃÃo do aroma com termos como âcaracterÃstico de pescadoâ foi relatada por 44,2% dos provadores, sugerindo a necessidade de uma desodorizaÃÃo parcial do material, e indicando um equilÃbrio em relaÃÃo ao grupo dos provadores que nÃo perceberam o odor caracterÃstico. Com relaÃÃo à intensidade do odor percebido, 68,8% dos provadores consideraram ideal, o que revela um odor altamente aceitÃvel. Os resultados sensoriais da adiÃÃo do CPP em arroz mostraram que a amostra com 0% de CPP diferiu significativamente (p 0,001) das demais amostras adicionadas de CPP para todos os atributos estudados e, dentre as amostras adicionadas de CPP, a amostra B (15%) foi a que apresentou melhor aceitabilidade. Assim, o CPP obtido a partir da CMS de resÃduos de filetagem de tilÃpia-do-Nilo à uma matÃria-prima viÃvel de utilizaÃÃo como ingrediente alimentÃcio em diferentes bases alimentares, haja vista sua aceitaÃÃo satisfatÃria em arroz, considerada uma base neutra. AlÃm disso, esta pesquisa agregou valor a um material de descarte, gerando possibilidades de oferta de uma fonte protÃica alternativa, de custo relativamente baixo. / This study aimed to use mechanically separated mince (MSM) from the residues left after filleting Nile tilapia (Oreochromis niloticus Linnaeus, 1757) to obtain a protein concentrate for human consumption and to assess its proximal composition and sensory characteristics. Three laboratory scale methods of obtaining fish protein concentrate (FPC) from MSM were studied. FPC evaluation included process yield, protein, fat and moisture contents as well as water activity. Based on these preliminary results a test procedure was established to obtain FPC. Yield, proximal composition, water activity sensory evaluation and microbial counts were analyzed on the dry FPC. Sensory evaluation used affective tests and hedonic scales relative to the ideal value for appearance, color and aroma of the product and was accomplished by 48 untrained tasters Five levels of FPC (0%, 15%, 22.5%, 30% and 37.5%, according to the recommended daily intake (RDI) of protein for young adults) were then included in a food formulation based on rice. These samples were identified, respectively, as: A, B, C, D and E were evaluated for appearance, color, aroma, taste and global acceptance by 80 untrained tasters using structured hedonic scales of nine points, following a balanced complete block design. The intention of consumption by the tasters was also assessed using a nine point scale. Data from chemical composition of MSM and FPC were submitted to descriptive analysis. Sensory data were analyzed by graphic design, descriptive analysis, analysis of variance (ANOVA) and Tukey test, using the SPSS statistical program v.13.0 FPC has a yield of 18.34%, and contained 1.38% moisture, 62.39% protein, 32.63% fat, 2.26% ash and had 0.16 Aw. The increase in protein percentage in FPC related to MSM was approximately four times. Microbial counts indicated that the experimental FPC is safe according to Brazilian microbiological standards and therefore it is fit for human consumption. Sensory evaluation of dry FPC powder expressed as acceptance by tasters frequency was 60.4% for color, 51.1% for general appearance and 41.7% for aroma. Description of flavor with terms like "typical of fish" was reported by only 44.2% of the tasters, suggesting the need for a more efficient deodorizing process and showing a balance in relation to the group of tasters that did not notice the characteristic smell. With regard to the perceived intensity of odor, 68.8% of the tasters considered the product ideal, which suggests an odor highly acceptable. Sensory evaluation of CPP included in the rice base showed the sample with 0% of CPP significantly (p 0.01) different from all other samples added of CPP for all attributes studied. Sample B (15% added FCP) however showed the best acceptability among the samples containing FPC. Thus, FPC obtained from MSM from Nile tilapia is a raw material acceptable to use as a food ingredient in various food bases as showed in this study with rice which is considered a neutral food base. Moreover, it is possible to add value to a residual food material offering an alternative source of protein at a relatively low cost.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Diversos estudos tÃm evidenciado que a principal funÃÃo da proteÃna desacopladora mitocondrial de plantas (pUCP) està relacionada a regulaÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio (EROs). AnÃlises in silico sugerem a existÃncia de famÃlias multigÃnicas para a codificaÃÃo de pUCPs, porÃm novos estudos ainda sÃo necessÃrios para estabelecer o perfil de expressÃo gÃnica das pUCPs, assim como a quantidade de genes em cada espÃcie e suas relaÃÃes filogenÃticas. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar, analisar filogeneticamente e avaliar o perfil de expressÃo da famÃlia multigÃnica da pUCP em diferentes tecidos durante o desenvolvimento da soja [Glycine max (L.) MERR.] e em condiÃÃes de estresse. Foi realizada uma anÃlise in silico no genoma da soja e de outras leguminosas disponÃveis no banco de dados WGS, revelando uma famÃlia multigÃnica codificadora da pUCP, UCP1 e 2 com nove Ãxons, UCP 3 com 2 Ãxons, e UCP 4 e 5 com apenas um Ãxon. Dentre as leguminosas analisadas a soja se destacou com o maior nÃmero de genes, 10 genes no total, sendo quatro genes GmUCP1, uma GmUCP2, uma GmUCP3, dois GmUCP4 e dois GmUCP5, alÃm da presenÃa de um splicing alternativo no gene GmUCP1b1. Primers especÃficos foram desenhados para cada membro da GmUCP a fim de analisar os perfis de expressÃo em diferentes tecidos (semente seca e embebida, flores, vagens, cotilÃdones, folhas unifolioladas e trifolioladas, raÃzes, hipocÃtilos e epicÃtilos) durante o desenvolvimento da soja. Para os ensaios em condiÃÃes de estresse foram utilizadas folhas e raÃzes de soja com treze dias apÃs a semeadura (DAS) que foram submetidas a estresse osmÃtico promovido pela aplicaÃÃo de polietileno glicol (PEG) e estresse biÃtico atravÃs de Ãcido salicÃlico (AS). O RNA total de cada amostra foi extraÃdo para a realizaÃÃo de RT-qPCR. Os valores de ct foram obtidos pelo programa realplex e analisados pelo programa GeNorm. O perfil de expressÃo gÃnica mostrou que todos os genes GmUCP foram expressos em todos os tecidos/ÃrgÃos analisados durante o desenvolvimento da soja, com exceÃÃo de alguns genes em semente seca e epicÃtilo. Os diferentes perfis de expressÃo de cada gene durante o desenvolvimento de cada tecido/ÃrgÃo sugerem que ocorra uma regulaÃÃo gÃnica espacial/temporal entre os membros da GmUCP. Os perfis de expressÃo dos genes GmUCP em soja durante as condiÃÃes de estresses foi diversificado, visto que 2 genes apresentaram expressÃo estÃvel em ambos tecidos/estresse, 7 genes apresentaram queda do perfil de expressÃo, enquanto apenas 4 genes apresentaram aumento dos nÃveis de transcritos. / Several studies have evidenced that the main function of the mitochondrial uncoupling protein in plants (pUCP) is related to reactive oxygen species (ROS) regulation. In silico analysis suggests the existence of multigenic families to pUCPs codification, however further studies are yet needed to establish the pUCPs genetic expression profile, just like the gene amount in each species and their phylogenetic relations. The current work had as objective to characterize, analyze phylogeneticly and evaluate the expression profile of the pUCP multigenic family in different tissues during the soybean development [Glycine max (L.) MERR.] and in stress conditions. It has been performed an in silico analysis on the soybean genome and on other legumes available in the database WGS, revealing a codifier multigenic family for pUCP, UCP1 and 2 with 9 exons, UCP3 with 2 exons, and UCP4 and 5 with only 1 exon. Amongst the legumes analyzed, the soybean stood out with the greater number of genes, 10 genes in total, giving four GmUCP1 genes, one GmUCP2, one GmUCP3, two GmUCP4 and two GmUCP5, along with the presence of an alternative splicing on GmUCP1b1 gene. Specific primers have been designed for each GmUCP member in order to analize the expression profiles in different tissues (dry and doused seed, flowers, pods, cotyledons, unifoliate and trifoliate leaves, roots, hypocotyl and epicotyl) during the soybean development. For the assays in stress conditions have been used soybean leaves and roots with thirteen days after sowing (DAS) which have been subjected to osmotic stress caused by the application of polyethylene glycol (PEG) and biotic stress caused by salicylic acid (SA). The total RNA from each sample has been extracted in order to perform the RT-qPCR. The ct values have been obtained through the realplex program and analyzed through the GeNorm program. The genetic expression profile has shown that all genes were expressed in every tissue/organ analyzed during the soybean development, with the exception on some genes in dry seeds and epicotyl. The different expression profiles of each gene during the development of each tissue/organ suggest that occurs a spatial/temporal gene regulation among the GmUCP members. The expression profiles of the GmUCP genes in soybean during the stress conditions have varied, once 2 genes have shown steady expression in both tissues/ stress, 7 genes have shown a drop in the expression profile, while only 4 genes have shown an increase of the transcript levels.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / As quitinases sÃo enzimas capazes de hidrolisar as ligaÃÃes β-(1,4)-glicosÃdicas presentes em biopolÃmeros de N-acetil-β-D-glucosamina, principalmente quitina, um polissacarÃdeo estrutural presente na parede celular de diversos fungos. No presente trabalho, uma quitinase de classe I de feijÃo-de-corda (Vigna unguiculata) foi expressa em sistemas heterÃlogos e a proteÃna recombinante (rVuChi) foi caracterizada bioquimicamente bem como em relaÃÃo ao seu efeito sobre o crescimento micelial e germinaÃÃo de esporos/conÃdios de fungos filamentosos. A seqÃÃncia de DNA codificando a proteÃna foi amplificada por PCR e clonada nos vetores de expressÃo pET32a(+) e pPICZαA, para expressÃo heterÃloga em Escherichia coli e Pichia pastoris, respectivamente. A expressÃo de rVuChi em cÃlulas de E. coli ArticExpress DE3 se deu em corpos de inclusÃo. Em seis estirpes de P. pastoris a proteÃna recombinante foi secretada, de forma solÃvel, para o meio de cultura. Na fraÃÃo extracelular da estirpe KM71H foi observada a maior atividade quitinolÃtica, apÃs 72 horas de induÃÃo. A detecÃÃo de rVuChi foi feita por SDS-PAGE e com o kit Invision His-Tag stain, onde foram identificadas duas bandas protÃicas de massas moleculares aparentes de 30 e 33 kDa. Ambas as bandas apresentaram a mesma sequÃncia N-terminal e a ausÃncia de N-glicosilaÃÃo foi verificada. A quitinase recombinante estava presente principalmente na fraÃÃo F0/40 precipitada com sulfato de amÃnio e foi purificada a homogeneidade tanto por cromatografia de afinidade em matriz de quitina (com rendimento de 18,31 mg por litro de meio de cultura), quanto por cromatografia de interaÃÃes hidrofÃbicas em coluna de Phenyl Sepharose CL-4B (rendimento de 13,2 mg/L), seguidas de ultrafiltraÃÃo em membrana com limite de exclusÃo de 50 kDa. A rVuChi apresentou atividades endo e exo-quitinolÃtica frente a quitina coloidal e hidrolisou glicol-quitina em gel de SDS-PAGE, embora nÃo tenha apresentado atividade contra substratos sintÃticos contendo p-nitrofenol. A quitinase purificada apresentou massa molecular de 32 e 33,1 kDa por cromatografia de exclusÃo molecular em colunas de Superose 12 HR e Superdex 200, respectivamente. Em gel bidimensional, rVuChi apresentou um conjunto de seis âspotsâ com pI entre 4,44 e 5,15. A quitinase mostrou-se ainda termoestÃvel em temperaturas atà 50 ÂC e sua atividade enzimÃtica mÃxima ocorreu em pH 5. Em geral, a presenÃa de Ãons metÃlicos causou uma reduÃÃo de sua atividade enzimÃtica. O agente quelante EDTA (0,5%) estimulou a atividade enzimÃtica enquanto que o detergente SDS (0,5%) a inibiu totalmente. A quitinase recombinante apresentou 37% de hÃlice alfa e 26% de folha beta, como determinado por espectroscopia de dicroÃsmo circular. A desnaturaÃÃo de 50% das molÃculas de rVuChi ocorreu a 54,41 ÂC. Os espectros de fluorescÃncia revelaram que a proteÃna produzida em P. pastoris estava em sua conformaÃÃo totalmente enovelada. A quitinase recombinante de feijÃo-de-corda foi capaz de inibir totalmente a germinaÃÃo de esporos de Penicillium herquei atà 48 horas, na dose de 100 μg e causou inibiÃÃo de 68%, nas doses de 50, 25 e 12,5 μg. Na dose de 150 μg, houve uma inibiÃÃo de 55% na germinaÃÃo dos conÃdios de Rhizoctonia solani e um leve efeito sobre a germinaÃÃo dos esporos de Colletotrichum lindemuthianum e C. musae. Nenhum efeito da rVuChi foi observado sobre a germinaÃÃo de esporos dos fungos C. gloeosporioides, Fusarium solani e F. oxysporum. AlÃm disso, a proteÃna recombinante retardou o crescimento micelial de P. herquei em aproximadamente 50% (100 μg), porÃm nÃo apresentou efeito sobre o crescimento micelial dos demais fungos. Desta forma, a quitinase classe I de V. unguiculata à uma proteÃna com atividade antifÃngica. / Chitinases are enzymes that hydrolyze the β-(1,4) glycosidic bonds present in biopolymers of N-acety-β-D-glucosamine, mainly chitin, a structural polysaccharide which is found in cell walls of several fungi. In plants, chitinases play a role as defense proteins against the attack of pests and pathogens. In this work, a class I chitinase from cowpea (Vigna unguiculata) was expressed in heterologous systems. The recombinant protein (rVuChi) was purified, and characterized biochemically and in relation to its effects on mycelial growth and germination of spores/conidia of filamentous fungi. The DNA coding sequence of the cowpea chitinase was amplified by PCR and the products cloned in the expression vectors pET32a(+) and pPICZαA, for heterologous expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, respectively. In E. coli cells, the recombinant fusion protein occurred mainly as inclusion bodies. On the other hand, in six strains of P. pastoris, the recombinant cowpea chitinase was secreted in a soluble form into the culture medium. The highest chitinase activity was detected in the extracellular fraction of KM71H strain, 72 hours after induction. The recombinant VuChi was detected by SDS-PAGE and Invision His-Tag stain kit, which identified two protein bands with apparent molecular masses of 30 and 33 kDa. These two protein bands showed the same N-terminal sequence, and an absence of N-glycosylation. Most recombinant chitinase secreted into the culture medium was recovered in the fraction F0/40, precipitated with ammonium sulfate. The expressed protein was purified to homogeneity by affinity chromatography on chitin matrix (yield of 18.31 mg per liter of culture medium), or by hydrophobic interactions chromatography on a column of Phenyl Sepharose CL-4B (yield = 13.2 mg/L), followed by ultrafiltration in a membrane with exclusion limit of 50 kDa. The purified rVuChi was able to hydrolyze colloidal chitin (in solution) as well as glycol chitin (in SDS-PAGE), although it did not show enzymatic activity against synthetic substrates containing p-nitrophenol. The purified chitinase showed molecular masses of 32 and 33.1 kDa by size exclusion chromatography on columns of Superose 12 HR and Superdex 200, respectively. When submitted to 2D electrophoresis, rVuChi presented a set of six spots with pI values between 4.44 and 5.15. The chitinase was thermostable at temperatures up to 50  C and the enzyme activity was highest at pH 5. In general, the presence of metal ions caused a reduction of its enzymatic activity. The chelating agent EDTA (0.5%) stimulated the enzyme activity, whereas in the presence of the detergent SDS (0.5%) the rVuChi activity was completely inhibited. The recombinant chitinase showed 37% of alpha helix and 26% of beta sheet, as determined by circular dichroism spectroscopy. Denaturing of 50% of the rVuChi molecules occurs at 54.41  C. The fluorescence spectra showed that the protein produced in P. pastoris was in its fully folded conformation. The recombinant cowpea chitinase was able to completely inhibit the germination of spores of Penicillium herquei, after 48 hours, at a dose of 100 mg, and caused 68% inhibition at doses of 50, 25 and 12.5 mg. At a dose of 150 mg, there was 55% inhibition on conidial germination of Rhizoctonia solani and a slight effect on spore germination of Colletotrichum lindemuthianum and C. musae. There was no effect of rVuChi on spore germination of C. gloeosporioides, Fusarium solani and F. oxysporum. In addition, the recombinant protein delayed the mycelial growth of P. herquei in approximately 50% (at the dose of 100 mg) but had no effect on mycelial growth of the other fungi. Therefore, the cowpea class I chitinase is a protein with anti-fungal activity.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A avaliaÃÃo do manejo do capim-massai (Panicum maximum x Panicum infestum) em condiÃÃes de diferimento pode contribuir para a reserva estratÃgica de forragem de qualidade para os perÃodos de estiagem no SemiÃrido brasileiro. Objetivou-se, com o presente trabalho, avaliar a eficiÃncia agronÃmica e a composiÃÃo bromatolÃgica da referida gramÃnea em Ãrea de caatinga raleada, em dois perÃodos de vedaÃÃo (60 e 90 dias apÃs o corte de uniformizaÃÃo) e quatro Ãpocas de utilizaÃÃo (30, 60, 90 e 120 dias apÃs o tÃrmino do perÃodo chuvoso). O delineamento utilizado foi em blocos ao acaso em esquema de parcelas subdivididas (2 x 4), com duas Ãpocas de vedaÃÃo (parcelas) e quatro Ãpocas de utilizaÃÃo (subparcelas), com trÃs repetiÃÃes. Foram avaliados: massa seca de forragem total (MSFT), massa seca de forragem morta (MSFM), massa seca de forragem verde (MSFV), massa seca de lÃminas foliares verdes (MSLF), massa seca de colmos verdes (MSCV), relaÃÃo folha/colmo (F/C), altura do pasto (AP), nÃmero de folhas vivas por perfilho (F/P), densidade populacional de perfilhos (DPP), interceptaÃÃo fotossinteticamente ativa (IRFA) e Ãndice de Ãrea foliar (IAF). TambÃm foram avaliados os teores de matÃria seca (MS), matÃria orgÃnica (MO), proteÃna bruta (PB), fibra em detergente neutro (FDN), fibra em detergente Ãcido (FDA), hemicelulose (HCEL), celulose (CEL), lignina (LIG) e digestibilidade in vitro da matÃria seca (DIVMS) relativos aos componentes folha da forragem acamada e nÃo acamada e material senescente. Em relaÃÃo aos perÃodos de vedaÃÃo, observaram-se resultados significativos somente para os componentes de biomassa do pasto (MSFT, MSFV, MSLF, MSCV, MSFM e F/C) com valores superiores para 90 dias de vedaÃÃo. Pelo desdobramento da interaÃÃo para MSFT, observou-se mÃxima produÃÃo de forragem aos 71 dias de utilizaÃÃo. Para MSFV e MSLF, observou-se efeito linear decrescente para 60 dias de vedaÃÃo e quadrÃtico para 90 dias de vedaÃÃo. Em relaÃÃo à MSCV houve significÃncia apenas para 90 dias de vedaÃÃo, com mÃximo estimado em 812,2 kg/ha, aos 86 dias de uso. Para MSFM, em torno dos 100 dias de utilizaÃÃo, verificaram-se os maiores valores. Para a relaÃÃo F/C, em 90 dias de vedaÃÃo, houve reduÃÃo linear. Para as variÃveis AP, F/P e DPP, tambÃm foram observadas reduÃÃes lineares em funÃÃo da elevaÃÃo do perÃodo de uso. No caso da DPP, para cada dia de rebrotaÃÃo, houve diminuiÃÃo de dois perfilhos/mÂ. A IRFA e o IAF foram reduzidos com o tempo de diferimento. Houve efeito significativo de Ãpoca de vedaÃÃo sobre o perÃodo de utilizaÃÃo apenas para a %PB e %DIVMS das folhas e para a %MS e %HCEL do material senescente. O prolongamento do perÃodo de vedaÃÃo do capim-massai promove elevaÃÃo dos componentes de biomassa, porÃm compromete a qualidade do pasto devido ao aumento da biomassa de colmos. A utilizaÃÃo na Ãpoca seca deve ser feita em atà 33 dias, devido à intensificaÃÃo da senescÃncia e morte de folhas e de perfilhos apÃs esse referencial de dias. AlÃm disso, a utilizaÃÃo do capim Massai 30 dias apÃs um perÃodo de vedaÃÃo de 90 dias ainda garante um suprimento forrageiro de adequado valor nutritivo. O aumento da umidade relativa do ar e a ocorrÃncia de precipitaÃÃes pluviomÃtricas, apÃs restriÃÃo hÃdrica, estimulam a rebrotaÃÃo resultando em melhoria do valor nutritivo do capim. / The evaluation of management of massai grass under conditions of deferral may contribute to the strategic reserve of forage quality for the dry periods in Northeast Brazil. Based on this assumption, the study aimed to evaluate the massai grass agronomic efficiency in an area of thinned caatinga under semiarid conditions in Brazil, in two closure times (60 and 90 days after of standardization cut, that occurred 30 days after the onset of the rainy season) and four seasons of utilizatione (30, 60, 90 and 120 days after the end of the rainy season). The experiment followed a randomized block with split plot design in a factorial 2 x 4 (2 times of fencing and 4 times of use) with three replicates per treatment. Following parameters were evaluated: total dry mass of forage (TDMF), dry mass of forage dead (DMFD), dry mass of green forage (DMGF), dry mass of green blade (DMGB), dry matter of green stem (DMGS), leaf/stem ratio (L/S), sward height (SH), stretched plant height (SPH), number of leaves per tiller, tiller population density (TPD), intercepted photosynthetically active index (IPAI) and leaf area index (LAI). They were evaluated the dry matter (% DM), organic matter (% OM), crude protein (% CP), neutral detergent fiber (% NDF), acid detergent fiber (% ADF), hemicellulose (% HCEL) cellulose (CEL%), lignin (LIG%) and in vitro digestibility of dry matter (% IVDMD) for the components of leaf fodder and senescent material. At unfolding of interaction for TDMF, there was a quadratic effect for closure time of 90 days, with the point of maximum forage yield at 71 days of use. As for DMGF and DMGB, there was a linear effect for 60 days and quadratic effect for 90 days, with a maximum reached at 49 days of use for DMGF and 33 days for DMGB. In relation to DMGS there was significant effect only for 90 days of closure with maximum estimated at 812.2 kg / ha at 86 days of use. For DMFD was observed that for both closure times the best model is the quadratic response. 102 and 100 days provided higher biomass values of DMFD, with estimates of 3000 and 4337 kg/ha to 60 and 90 closure days, respectively. For L/S ratio, it was observed that the closure time of 60 days, the model that best fitted data was quadratic, while for 90 closure days, the model that best fitted data was linear decreasing. For variables SH and SPH was observed linear decrease as the increase of utilization time with estimated values: 44.8 and 23.5 cm for SH and 97.92 and 63.63 cm for SPH on utilization times of 30 and 120 days, respectively. L/S ratio was reduced with utilization time of massai grass, with estimates of 3.04 and 1.5 leaves per tiller, with 30 and 120 days of utilization times, respectively. It was observed a linear reduction in TPD. For each day of regrowth, there was a reduction of two tillers/mÂ. IPAI and LAI reduced with time of deferral, with estimates of 93 and 84% for IPAI and 4.79 and 3.71 for LAI considering utilization times of 30 and 120 days, respectively. The results were subjected to analysis of variance by F test and when significant portions held the unfolding applying the Tukey test (p <0.05) and regression analysis for the subplots and interactions significant (p<0,05). Statistical analyzes were performed with the aid of the software SISVAR. The increase of closure time of massai grass promotes elevation of biomass components, but compromises the quality of the pasture due to increased biomass of stems. Utilization in dry season must be made within 33 days, due to the intensification of senescence and death of leaves and tillers. The use of Massai grass 30 days after a period of 90 days of fencing ensures an adequate supply of fodder nutritional value. Climatic conditions affect on the chemical composition of Massai grass. The improvement in relative humidity and the occurrence of rainfall, after water restriction, can even improve its nutritional value.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Moringa oleifera (moringa) à uma espÃcie pertencente à famÃlia Moringaceae que se caracteriza por ser muito resistente a insetos e fungos. Trabalhos prÃvios realizados por nosso grupo de pesquisa revelaram a presenÃa de proteÃnas ligantes à quitina em sementes de moringa, dentre elas a Mo-CBP3, sugerindo uma correlaÃÃo positiva entre essa proteÃna e a resistÃncia da planta. No inÃcio do desenvolvimento da planta, para que ocorra a germinaÃÃo, deve haver a embebiÃÃo da semente, um processo seguido pela exsudaÃÃo. Na exsudaÃÃo, compostos do metabolismo primÃrio e secundÃrio sÃo externalizados da semente, alguns deles exercendo aÃÃo de defesa da nova planta ao impedirem o ataque de herbÃvoros e/ou patÃgenos. O presente trabalho teve como objetivos caracterizar o exsudato de sementes de moringa quanto à composiÃÃo bioquÃmica e atividade biolÃgica e investigar a presenÃa de Mo-CBP3 no exsudato, visando contribuir para o estabelecimento de seu papel fisiolÃgico. Inicialmente, foram estabelecidas as condiÃÃes de exsudaÃÃo, dando Ãnfase ao tempo e solvente. Uma maior exsudaÃÃo de proteÃnas foi observada em sementes embebidas com Ãgua destilada por 24 horas. Esse exsudato mostrou a presenÃa de atividades inerentes a metabÃlitos primÃrios (protease, &#946;-1,3-glucanase, quitinase, inibidor de tripsina e inibidor de papaÃna) e secundÃrios (saponinas e esteroides). Mo-CBP3 foi tambÃm detectada no exsudato, usando anticorpos policlonais anti-Mo-CBP3. A presenÃa de Mo-CBP3 no exsudato de sementes de moringa foi confirmada apÃs este ter sido submetido à cromatografia em matriz de quitina, procedida pela anÃlise atravÃs de dot bloting e eletroforese em gel de poliacrilamida. Os dados obtidos mostraram que o material retido na matriz de quitina corresponde a 0,26% do total de proteÃnas exsudadas, à reconhecido pelo anticorpo anti-Mo-CBP3 e apresenta perfil eletroforÃtico similar ao da Mo-CBP3 purificada de sementes de moringa. Na avaliaÃÃo da atividade deste exsudato frente à fitopatÃgenos, aÃÃo contra fungos nÃo foi detectada, nas condiÃÃes de ensaio empregadas, exceto para Candida parapsilosis que mostrou uma discreta reduÃÃo na taxa de crescimento. Contrariamente, uma potente atividade contra nematoide foi verificada, tendo sido o exsudato de sementes capaz de causar atà 100% de mortalidade para indivÃduos de Meloidogyne incognita em estÃgio de J2. Quando investigada a presenÃa de Mo-CBP3 em raiz, um ÃrgÃo vegetal que apresenta o fenÃmeno de exsudaÃÃo e, tambÃm, à capaz de interagir diretamente com o nematoide, resultados positivos foram encontrados. De fato, Mo- CBP3 està presente em raÃzes de moringa, jà nos estÃgios iniciais do desenvolvimento, conforme resultados mostrados por ELISA e atravÃs da tÃcnica de RT-PCR. Os dados, em conjunto, sugerem que no fenÃmeno da exsudaÃÃo, proteÃnas devem desempenhar funÃÃes essenciais e que, no caso da moringa, Mo- CBP3 jà participa nos estÃgios iniciais do desenvolvimento dessa planta arbÃrea, papel este que pode estar relacionado com a proteÃÃo contra patÃgenos. / Moringa oleifera (moringa) is a species belonging to the family Moringaceae which is characterized as having high resistance to insects and fungi. Previous work carried out by our research group revealed the presence of chitin-binding proteins in moringa seeds, among them Mo-CBP3, suggesting a positive correlation between this protein and the plant resistance. At the onset of the new plant development, for germination to occur, seed imbibition is required, a process followed by exudation. In exudation process, primary and secondary metabolites are released in the medium outside the seeds, some of them protecting the new plant against herbivores and/or pathogens. This study aimed to characterize the chemical composition and biological activities of moringa seed exudate and to investigate the presence of Mo-CBP3 in the exudate, in order to contribute to the establishment of its physiological role. Initially, the best conditions for exudation were established, emphasizing the time and solvent. A higher exudation of seed proteins was observed in distilled water after 24 hours. This exudate showed the presence of activities related to primary (protease, &#946;-1,3- glucanase, chitinase, trypsin inhibitor and papain inhibitor) and secondary (steroid and saponins) metabolites. Mo-CBP3 was also detected in the exudate, using polyclonal antibodies anti-Mo-CBP3. The presence of Mo-CBP3 in the moringa seed exudate was confirmed after chromatography on chitin matrix and analyses by dot blotting and polyacrylamide gel electrophoresis. The data obtained showed that the retained material on the chitin matrix corresponds to 0.26% of the total protein, it is recognized by anti-Mo-CBP3 and has electrophoretic profile similar to that of Mo- CBP3 which was purified from moringa seeds. In the activity tests to pathogens, the seed exudate showed no antifungal activity, under the conditions used, except for Candida parapsilosis which had a slight reduction in its growth rate. In contrast, a potent activity against nematode was found as the seed exudate was able to cause a mortality rate up to 100% of Meloidogyne incognita in J2 stage. When investigated the presence of Mo-CBP3 in moringa hoots, a plant organ that shows the exudation phenomen and is also able to interact directly with the nematode, positive results were found. In fact, Mo-CBP3 is present in moringa hoots, in the initial stages of the plant development, according to the results shown by ELISA and RT-PCR. The data, taken together, suggest that in the exudation phenomen, proteins must play essential roles. In the case of moringa, Mo-CBP3 already participates in the initial stages of development of this tree species, playing a role that must be related to protection against pathogens.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A dengue à considerada, hoje, a arbovirose mais importante do mundo, tendo distribuiÃÃo e ressurgÃncia em todos os continentes e aumento das Ãreas de incidÃncia devido Ãs mudanÃas climÃticas. Um dos motivos que a torna tÃo importante à ausÃncia de uma vacina eficaz para os quatro sorotipos do vÃrus. Assim, para o controle dessa doenÃa à necessÃrio que haja o combate ao vetor, o mosquito Aedes aegypti. Os atuais programas de combate ao mosquito dispÃem de inseticidas sintÃticos, contudo o surgimento de populaÃÃes resistentes a esses inseticidas representa um entrave ao combate deste mosquito. Desta forma, torna-se necessÃria a busca por novas molÃculas inseticidas ou capazes de potencializar o efeito tÃxico dos inseticidas atuais. Assim, o presente trabalho teve por objetivo a obtenÃÃo de inibidores de tripsina de sementes de Leucaena leucocephala e avaliaÃÃo do potencial inseticida dessas molÃculas sobre as larvas do mosquito Ae. aegypti. Para isso, as proteÃnas presentes nas sementes de L. leucocephala foram extraÃdas, fracionadas e submetidas à cromatografia de afinidade a anidrotripsina acoplada a sepharose 4B, para a obtenÃÃo de uma fraÃÃo rica em inibidores de tripsina denominada sLlTi, a qual foi caracterizada bioquimicamente e utilizada em concentraÃÃo de 0,3 mg/mL nos ensaios de desenvolvimento das larvas do mosquito. A caracterizaÃÃo bioquÃmica do sLlTi permitiu concluir que os inibidores sÃo termorresistentes (a atividade foi mantida apÃs aquecimento por 30 min. a 100 ÂC), apresentam considerÃvel resistÃncia ao agente redutor (DTT), tendo decaimento da sua atividade inibitÃria frente a tripsina apenas quando incubado com 100 mM de DTT por 120 min, o mesmo, tambÃm, à resistente Ãs variaÃÃes de pH na faixa de 2 a 10. Os zimogramas reversos revelaram a presenÃa de bandas proteicas com massa molecular aparente de 20 kDa. Testes biolÃgicos in vitro mostraram que o sLlTi apresenta atividade inibitÃria superior a 90% frente a tripsina e 70% frente ao homogenato intestinal de larvas de Ae. aegypti. ApÃs a realizaÃÃo de eletroforese bidimensional, foi possÃvel a visualizaÃÃo de isoformas com pI entre 4 e 7, aproximadamente. Esses inibidores sÃo capazes de inibir as proteases de larvas de Ae. aegypti in vivo em 56%, causando retardo no desenvolvimento e cerca de 70% de mortalidade. Assim, o sLlTi possui potencial aÃÃo inseticida contra o mosquito vetor da dengue. / Dengue fever is currently the most important arboviral disease in the world, being widely distributed among the continents and having increased incidence areas due to climate change. One of the reasons that makes it so important is the absence of an effective vaccine against the four virus serotypes. So, to control this disease is necessary to fight the disease vector, the mosquito Aedes aegypti. Nowadays, health programs use synthetic insecticides to control the mosquito populations. However, the emergence of resistant populations to these insecticides is an obstacle to combating this mosquito. Thus, it is necessary to search for new insecticides or molecules capable of enhancing the toxic effect of current insecticides. The present study aimed to obtain trypsin inhibitors from Leucaena leucocephala seeds and evaluate the insecticidal potential of these molecules against Ae. aegypti larvae survival and development. For this, the proteins of L. leucocephala seeds were extracted, fractionated and subjected to anhydrotrypsin affinity chromatography to obtain a trypsin-enriched fraction (called sLlTi), which was biochemically characterized and used at a concentration of 0.3 mg/mL in assays of larvae development. Biochemical characterization of sLlTi concluded that the inhibitors are heat resistant (the activity was retained after heating for 30 min at 100  C), showed considerable resistance to the reducing agent DTT and reduction of their inhibitory activity against trypsin was demonstrated only when incubated with 100 mM DTT for 120 min. The inhibitor is also resistant to pH changes in a range from 2 to 10. The reverse zymograms revealed the presence of protein bands with apparent mass near 20 kDa. Biological testing in vitro showed that the sLlTi showed trypsin inhibitory activity greater than 90% and that sLlTi is also capable to inhibit Ae. aegypti digestive enzymes by 70%. After two-dimensional electrophoresis isoforms with pI ranging from 4 to 7, approximately, were observed. These inhibitors were able to inhibit proteases of Ae. aegypti in vivo by 56%, and was capable to delay the larval development after incubation for 10 days. Thus, sLlTi contains proteins with promising insecticidal action against dengue vector.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O cÃncer colorretal (CCR) Ã uma das neoplasias mais prevalentes em todo o mundo, sendo uma das principais causas de Ãbito por cÃncer. Dentre as drogas utilizadas como primeira linha no tratamento do CCR e do CCR metastÃtico hepÃtico, o irinotecano apresenta destaque pelo impacto sobre o aumento da sobrevida dos pacientes. Contudo, o surgimento de efeitos colaterais associados ao irinotecano (IRI), como a mucosite intestinal (MI), tem impactado negativamente no curso terapÃutico do paciente, observando-se atrasos nos ciclos subsequentes de quimioterapia, reduÃÃo de doses e, por vezes, interrupÃÃo do tratamento. A MI e a diarrÃia grave sÃo efeitos colaterais frequentes que pode atingir de 15-25% dos pacientes em quimioterapia. Objetivos: Estudar os parÃmetros funcionais da barreira intestinal e os mecanismos envolvidos na mucosite intestinal induzida pelo Irinotecano e seu metabÃlito ativo, SN-38. MÃtodos: Camundongos C57BL/6 machos (WT), 20-25g, foram divididos em grupos (n=6-8), administrados por 4 dias com salina (5 mL/Kg, i.p) ou com irinotecano (IRI, 75 mg/Kg, i.p). Os animais foram analisados no 5Â dia [D5] ou 7Â dia [D7] quanto ao peso corpÃreo, escores de diarreia, contagem de leucÃcitos. ApÃs sacrifÃcio, uma amostra de intestino foi coletada para dosagem de mieloperoxidase, anÃlise histopatolÃgica, morfomÃtrica, e imunohistoquÃmica para TLR4. Adicionalmente, realizou-se o teste de permeabilidade e perfusÃo intestinal in vivo. Avaliou-se tambÃm a bacteremia e a translocaÃÃo bacteriana em linfonodo mesentÃrico e fÃgado. Em adiÃÃo, a participaÃÃo de receptores Toll-like 2 (TLR2), 4 (TLR4) e 9 (TLR9) da proteÃna adaptadora MyD88 e NOD1 na mucosite intestinal foi verificada pelo uso de camundongos knockout com deleÃÃo gÃnica especÃfica para aqueles receptores e seus respectivos camundongos selvagens (WT). Adicionalmente, realizou-se a avaliaÃÃo dos efeitos in vivo e in vitro do SN-38. Os dados foram analisados com ANOVA/teste de Bonferroni ou Kruskal Wallis/teste de Dunn. P<0,05 foi aceito. (Protocolo CEPA 99/10). Resultados: A injeÃÃo de IRI causou uma significativa (P<0,05) perda ponderal, leucopenia e diarreia, associada a um aumento da infiltraÃÃo de neutrÃfilos no jejuno, Ãleo e pulmÃo, com alteraÃÃes morfomÃtricas e uma intensa destruiÃÃo da arquitetura dos vilos e criptas, apoptose celular em camundongos WT versus animais injetados com salina. AlÃm disso, o IRI induz uma alteraÃÃo da barreira intestinal evidenciada pela diminuiÃÃo da excreÃÃo de lactulose, aliado a um aumento significativo (P<0,05) da secreÃÃo intestinal de sÃdio, potÃssio e cloreto. Os camundongos injetados com Irinotecano apresentaram bacteremia e translocaÃÃo bacteriana (P<0,05) no linfonodo mesentÃrico e fÃgado, quando comparados ao grupo salina. A identificaÃÃo bioquÃmica das bactÃrias translocadas evidenciou a presenÃa de Escherichia coli (75%), Citrobacter sp. (17,2%), BactÃrias Gram-Negativas NÃo-Fermentadoras e Pseudomona aeruginosa (18%) no grupo injetado com Irinotecano, aliado a um significativo aumento (P<0,05) da imunomarcaÃÃo para TLR4 no intestino de animais injetados com IRI D5 (4[3-4]) e D7 (4[3-4]) versus o grupo salina (1,5[1-4]). Observamos que a deleÃÃo gÃnica para o receptor TLR2 e a proteÃna adaptadora MyD88, mas nÃo para TLR4 ou TLR9, preveniram a perda ponderal e o dano funcional, relacionado aos eventos de diarreia, bem como as alteraÃÃes morfomÃtricas, histopatolÃgicas, infiltraÃÃo de neutrÃfilos e bacteremia induzida pelo Irinotecano versus o grupo WT injetado com IRI (P<0,05). Entretanto, a deficiÃncia genÃtica de NOD1 conferiu uma reduzida diarreia, sem reverter o dano prÃ-inflamatÃrio induzido pelo IRI. Adicionalmente, o SN-38 causou um aumento da atividade de mieloperoxidase (P<0,05), sem alterar a secreÃÃo intestinal na alÃa isolada de camundongos (P>0.05) versus o grupo injetado com salina. O SN38 foi capaz de induzir alteraÃÃes morfolÃgicas nas cÃlulas intestinais de ratos (IEC-6). ConclusÃo: O IRI induziu alteraÃÃo dos parÃmetros funcionais, detectadas pelo teste de permeabilidade e de perfusÃo intestinal. O IRI induziu uma bacteremia e translocaÃÃo bacteriana para ÃrgÃos perifÃricos. AlÃm disso, a deficiÃncia do receptor Toll-like do tipo 2, e da proteÃna MyD88 previniu o dano intestinal e a diarreia induzida pelo IRI. Contudo, a deficiÃncia de receptores NOD1 somente melhorou a diarreia. Adicionalmente, o SN38 foi associado a um aumento da infiltraÃÃo de neutrÃfilo, sem alteraÃÃo da secreÃÃo intestinal no modelo de alÃa isolada. / The Colorectal Cancer (CRC) is one of the most prevalent neoplastic diseases in the world and is one leading cause of death. Irinotecan is a drug used as first line treatment for CRC and its liver metastases and has markedly improved the overall survival of patients. However, irinotecan-related side-effects, which include intestinal mucositis (IM), have impacted negatively on therapeutic outcome, leading to delayed chemotherapy cycles, dose reductions and treatment interruption. IM and life-threatening diarrhea may affect up to 15-25% of patients under irinotecan-based cancer chemotherapy regimens. Aims: To study the intestinal barrier function and the mechanisms involved in the IM induced by irinotecan and its active metabolite, SN-38. Methods: Male C57BL/6 mice (WT, n=6-8) were divided into groups and injected with saline (5 mL/kg, i.p.) or irinotecan (IRI, 75 mg/kg, i.p.) for 4 days. Body weight, diarrhea and blood leukocyte count were assessed on days 5 [D5] and 7 [D7]. Following euthanasia, intestinal samples were collected for histopathology, morphometry, mieloperoxidase and imunohistochemistry assays. In addition, in vivo intestinal permeability and perfusion tests were performed. Bacteremia and bacterial translocation to mesenteric lymph node and liver were further carried out. Additionally, the participation of toll-like receptors 2 (TLR2), 4 (TLR4) and 9 (TLR9), the adaptor protein MyD88 and NOD1 receptor in the pathogenesis of IM were investigated by the use of WT mice and knockout with target gene disruptions. Furthermore, the in vivo and in vitro effects of SN-38 were studied. Data analysis was performed with ANOVA/Bonferroniâs test or Kruskal Wallis/Dunnâs test. P<0,05 was accepted. (CEPA 99/10). Results. IRI-injected WT mice presented a marked (P<0.05) weight loss, leukopenia, diarrhea, increased neutrophil infiltration in lung, jejunum, ileum associated with villi and crypt morphologic alteration and apoptotic cell death versus saline-administered mice. Besides, reduced lactulose renal excretion, gut secretion of sodium, potassium and chloride evidenced intestinal barrier dysfunction in IRI-injected WT mice versus saline-administered control mice (P<0.05). Bacterermia and bacterial translocation to mesenteric lymph node and liver were also observed in the IRI group. Biochemical identification of translocating bacteria revealed the presence of Escherichia coli (75%), Citrobacter sp. (17.2%), non-fermenting gram-negative bactÃria and Pseudomona aeruginosa (18%) in blood samples of IRI-injected mice. In addition, an increased TLR4 imunoexpression was detected in that group (IRI D5: 4[3-4] and D7: 4[3-4]) when compared with saline control (1.5[1-4]). Gene deletion to TLR2 and MyD88, but not to TLR4 or TLR9, prevented weight loss, diarrhea, intestinal morphometric alterations, neutrophil infiltration in the gut and bacteremia development versus the IRI-injeted WT group (P<0.05). However, NOD1 deletion was protective only against IRI-induced diarrhea without affecting the inflammatory infiltration. Furthermore, SN-38 promoted a marked neutrophil infiltration in ileum loops (P<0.05) but did not induce intestinal secretion of liquids (P>0.05) versus saline injected mice. Besides, cultured intestinal cells (IEC-6) incubated with SN-38 presented morphological changes in comparison to DMEN-cultured cells. Conclusions: IRI induced functional alterations in the gut and also bacteremia and bacterial translocation to peripheral organs. TLR2 and MyD88 deficiency prevented IRI-related intestinal damage and the diarrhea. However, NOD1 deficiency was protective only against diarrhea development. In addition, SN-38 might be responsible for the intestinal inflammatory reaction without affecting gut secretion of liquids.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Plants are constantly exposed to a variety of stresses conditions. However, they react to biotic stresses by triggering a set of defense mechanisms including the synthesis of defensive substances as the pathogenesis-related (PR) proteins. The PR-protein named osmotin can be induced under osmotic stress and water shortage conditions. Osmotin-like proteins have been purified from latex and some of them are related to antifungal activity. The aim of this study was to investigate the osmotin in the following species laticifers: C. grandiflora, P. rubra, T. peruviana, H. drasticus and C. papaya to isolate and evaluate its antifungal activities. Immunoaffinity column chromatography with anti-CpOsm antibodies were performed in order to purify these osmotin-like. They were detected in latex of C. grandiflora and P. rubra by immunoassays the ELISA, Dot Blot and Western Blot using anti-CpOsm antibody (the osmotin of C. procera latex). Osmotin of C. procera, C. grandiflora, P. rubra and H. drasticus were identified by mass spectrometry. However, the osmotin from C. procera was co-purified with cysteine proteases. The co-purified cysteine protease from C. procera was identified as Procerain B. The alignment and the 3-D structure analysis of Procerain B and CpOsm revealed the presence of a similar sequence in both proteins. This sequence might be an epitope which allows the anti-antibody recognition. The osmotin from C. grandiflora, and P. rubra did not show antifungal activity against Fusarium solani and Colletotrichum gloesporioides. Since no correlation between the antifungal activity and the presence of these osmotins were found, the proteolytic activities of these latex protein fractions were evaluated in order to correlate with the antifungal activity C. procera and C. grandiflora showed a strong proteolytic activity. In latex, the cysteine proteases are more often related to antifungal activity than osmotin, which might explain, at least in part, the antifungal activity performed by C. grandifora and not for its osmotin. Further studies on the role of osmotin in physiology laticifers plants are needed. / As plantas estÃo constantemente sujeitas a diversos tipos de estresse, tanto biÃticos como abiÃticos, resultando em respostas de defesa. Decorrente disto, os vegetais sintetizam certas proteÃnas denominadas de proteÃnas relacionadas à patogÃnese (PR proteÃna). As Pr-proteÃnas chamadas de osmotinas podem ser induzidas sob condiÃÃes de estresse osmÃtico, frio e escassez de Ãgua. Osmotinas tem sido purificadas de fluidos laticÃferos e algumas delas estÃo relacionadas com a atividade antifÃngica. O objetivo do presente trabalho foi prospectar osmotinas, bem como isolÃ- las e avaliar suas atividades antifÃngicas, nos fluidos laticÃferos das seguintes espÃcies: C. grandiflora, P. rubra, T. peruviana, H. drasticus e C. papaya. Nos lÃtex de C. grandiflora e P. rubra foram detectadas osmotinas atravÃs de imunoensaios em placa de ELISA, Dot Blot e Westen Blot, utilizando os anticorpos anti-CpOsm (osmotina do lÃtex de C. procera). Cromatografia de imunoafinidade em coluna com anticorpos anti-CpOsm foram realizadas com o intuito de purificar estas osmotinas. AnÃlises por meio de espectrometria de massas, revelaram a presenÃa de osmotina em C. procera, C. grandiflora, P. rubra e H. drasticus. No entanto, a osmotina de C. procera foram co-purificadas com proteases cisteÃnicas. A protease cisteÃnica co- purificada no lÃtex de C. procera foi identificada como Proceraina B. O alinhamento e a anÃlise da estrutura tridimensional da Proceraina B e CpOsm revelaram a presenÃa de uma sequÃncia semelhante em ambas as proteÃnas, que pode ser um epÃtopo disponÃvel ao reconhecimento do anticorpo anti-CpOsm. As osmotinas isoladas de C. grandiflora e P. rubra nÃo apresentaram atividade antifÃngica contra F. solani e C. gloesporioides. Desde que nÃo houve correlaÃÃo entre a atividade antifÃngica e à presenÃa destas osmotinas, as atividades proteolÃticas das fraÃÃes proteicas foram avaliadas a fim de correlaciona-las à atividade antifÃngica. Nos fluidos laticÃferos, as proteases cisteÃnicas estÃo mais frequentemente relacionadas à atividade antifÃngica do que as osmotinas. Estudos mais aprofundados sobre a funÃÃo das osmotinas na fisiologia de plantas laticÃferas sÃo necessÃrios.