Os cereais representam importantes fontes de proteína para alimentação humana e animal. Entretanto, são caracterizados pela baixa qualidade nutricional de suas proteínas devido à composição desbalanceada de aminoácidos, causada pelo excesso dos aminoácidos prolina e glutamina e deficiência de lisina, treonina e triptofano. As proteínas de reserva prolaminas constituem 50% do conteúdo total de proteínas no endosperma e são as principais responsáveis por tais características nos cereais. As informações sobre o metabolismo de lisina e o acúmulo de proteínas de reserva no endosperma vêm sendo utilizadas para desenvolver e aplicar estratégias em programas de melhoramento de plantas que visam suprir a deficiência de lisina encontrada nos cereais. Lange e colaboradores (2007) relataram a produção de linhagens transgênicas de cevada com padrão de proteínas de reserva alterado e que apresentaram incremento no teor de lisina e outros aminoácidos essenciais. O presente trabalho teve como objetivo identificar os mecanismos responsáveis pelas alterações observadas. Para tanto, avaliou-se a atividade das enzimas envolvidas na síntese e degradação de lisina, além da caracterização das proteínas de reserva e sua composição de aminoácidos. Observou-se redução na fração protéica das prolaminas (5,91 a 18,34%) e incrementos compensatórios na fração protéica das glutelinas (2,16 a 6,52%). As demais frações apresentaram respostas variáveis dependendo do evento avaliado. Além disso, a composição de aminoácidos foi alterada nas diferentes frações protéicas. As prolaminas exibiram incrementos nos teores de lisina (1,79 a 49,13%), treonina (5,04 a 22,60%) e metionina (13,57 a 45,38%), enquanto que as globulinas aumentaram principalmente o conteúdo de metionina (32,30 a 142,56%). Para os aminoácidos solúveis, foram observados incrementos na ordem de duas a três vezes de histidina, lisina, fenilalanina e metionina. A análise das enzimas envolvidas no metabolismo de lisina revelou que ocorreram alterações nas três principais enzimas da via do ácido aspártico. A enzima aspartato quinase (AK) apresentou aumentos na atividade (4,44 a 47,27%), entretanto, foi mais sensível a inibição causada por lisina. A enzima dihidrodipicolinato sintase (DHDPS) também apresentou incremento na atividade (1,50 a 66,32%), mas diferente da AK, foi menos sensível à inibição causada por lisina. A enzima homoserina desidrogenase (HSDH), a qual compete o substrato ASA com a enzima DHDPS, exibiu redução na atividade (3,36% a 28,80%) (exceto um evento de transformação) e foi menos sensível a inibição causada por treonina. Embora as enzimas envolvidas na degradação de lisina também foram alteradas, os resultados foram variáveis para os diferentes eventos. Para aqueles que foram observados redução na atividade da enzima lisina cetoglutarato redutase (LOR), foi também verificado para enzima sacaropina desidrogenase (SDH), mas na ordem de duas vezes, sendo válido para aqueles que apresentaram incremento. Este trabalho mostrou que a alteração no padrão de proteínas de reserva ocasionou mudanças no metabolismo de aminoácidos, neste caso a lisina, para suprir a demanda necessária para incorporação em proteínas de reserva / Cereals represent an important source of protein to human food and animal feed. However, they are characterized by low nutritional quality of proteins due to the unbalanced composition of amino acids, caused by the excess of the amino acids proline and glutamine and deficiency of lysine, threonine and tryptophan. The prolamin storage proteins constitute 50% of the total protein content in the endosperm and is primarily responsible for these characteristics in cereals. Information on the metabolism of lysine and accumulation of storage proteins in endosperm have been used to develop and implement strategies in plant breeding programs that aim to address the deficiencies found in cereals. Lange and coworkers (2007) reported the production of transgenic lines of barley with a pattern of storage proteins that showed altered and increase in the levels of lysine and other amino acids. This study aimed to identify what were the mechanisms responsible for observed changes. For this, we evaluated the activity of enzymes involved in synthesis and degradation of lysine, besides the characterization of storage proteins and their amino acid composition. There was a reduction in the prolamin protein fraction (5.91 to 18.34%) and compensatory increases in the glutelin fractions (2.16 to 6.52%). The other fractions had variable responses depending on the event evaluated. Moreover, the amino acid composition was changed in the different protein fractions. Prolamins exhibited increases in levels of lysine (1.79 to 49.13%), threonine (5.04 to 22.60%) and methionine (13.57 to 45.38%), whereas increases were mainly globulins content of methionine (32.30 to 142.56%). With respect to soluble amino acids, increases were observed in the order of 2-3 fold of histidine, lysine, phenylalanine and methionine. Analysis of enzymes involved in lysine metabolism showed that changes in three key enzymes of the pathway of aspartic acid. The enzyme aspartate kinase (AK) showed increase in activity (4.44 to 47.27%), however, was more sensitive to inhibition by lysine. The enzyme dihydrodipicolinate synthase (DHDPS) also showed increased activity (from 1.50 to 66.32%), but unlike the AK, was less sensitive to inhibition by lysine. The enzyme homoserine dehydrogenase (HSDH) that competes for the substrate ASA with the DHDPS, exhibited reduced activity (3.36% to 28.80%) (an exception one transgenic line) and was less sensitive to inhibition by threonine. The enzymes involved in degradation of lysine were also changed, though the results varied for different events. Those who observed decreased activity of the enzyme lysine ketoglutarate reductase (LOR) was also found for enzyme saccharopine dehydrogenase (SDH), but the order of twice, which was valid for those who had increased. This study showed that the change in the pattern of storage proteins produced changes in amino acid metabolism, in this case lysine, to supply the demand needed for incorporation into storage proteins.

O produto do gene thi1 de Arabidopsis thaliana está provavelmente envolvido na biossíntese de tiamina (vitamina B1) e na proteção do DNA organelar contra danos. Estudos sobre a biossíntese da tiamina em plantas sugerem uma localização plastidial para este mecanismo, o que está de acordo com a existência de um peptídeo de trânsito cloroplástico (TP) na região N-terminal de THI1. Por outro lado, em leveduras a tiamina é sintetizada em mitocôndrias. Interessantemente, o cDNA de thi1 de A. thaliana complementa uma cepa de levedura com disrupção no gene homólogo thi4. A análise da seqüência de aminoácidos de THI1 revelou a presença de uma região capaz de formar uma estrutura do tipo a-hélice anfifílica, freqüentemente encontrada em preseqüências mitocondriais, localizada logo após o peptídeo de trânsito cloroplástico. O papel desta região na localização da proteína THI1 nas mitocôndrias foi comprovado a partir de ensaios envolvendo construções de genes quiméricos (contendo ou não a putativa seqüência de direcionamento mitocondrial) e um gene repórter (uidA). Estas construções foram introduzidas em plantas de tabaco e a localização da atividade GUS foi determinada nas frações subcelulares das plantas transgênicas. Análise direta da presença de THI1 nas mitocôndrias e cloroplastos de Arabidopsis foi realizada via imunolocalização. Também foram fornecidas evidências que as duas isoformas organelares são codificadas por um único transcrito nuclear. Experimentos de transcrição/tradução in vitro indicaram a ocorrência de dois produtos da tradução a partir de códons de iníciação em fase de leitura. Mutações sítio-específicas na seqüência de thi1 acoplados à experimentos usando a proteína fluorescente verde (GFP) mostraram que a tradução no primeiro AUG determina a localização da proteína nos cloroplastos, enquanto que a tradução no segundo AUG é responsável pelo endereçamento da proteína às mitocôndrias. A análise do contexto para início da tradução revelou que a região em torno do primeiro AUG é mais favorável para a tradução do mRNA de thi1. Além disso, observou-se a presença de uma forte estrutura em "grampo de cabelo" próximo ao segundo códon AUG, indicando um contexto subótimo capaz de interferir na tradução. Estas observações confirmaram os dados obtidos a partir da tradução in vitro na qual a iniciação se dá preferencialmente no primeiro AUG o que pode sugerir uma maior necessidade da proteína nos plastídeos. / Arabidopsis thaliana thi1 gene product is probably involved in both thiamine biosynthesis as well as protection of organellar DNA from damage. Studies of thiamine biosynthesis in plants suggest a plastid location for the pathway, which is in agreement with the predicted THI1 N-terminal chloroplastic transit peptide (TP). On the other hand, thiamine is synthesized in mitochondria in yeast cells. Interestingly, A. thaliana thi1 cDNA complements a yeast strain disrupted for the homologous thi4 gene. Analysis of THI1 amino acid sequence revealed the presence of a putative amphiphilic a-helix, which is typical for mitochondrial presequences, located downstream of the chloroplast transit peptide. The role of this sequence on mitochondrial import has been shown by chimeric gene constructs (carrying or not the putative mitochondrial presequence) and the uidA reporter gene. These constructions have been introduced into tobacco plants and the GUS activity has been measured in subcellular fractions of transgenic plants. Direct analysis of THIp in mitochondria and chloroplasts has been done via ImmunoGold labelling experiments. Additional evidence suggested that the two organellar isoforms were encoded by a single nuclear transcript. In vitro transcription/translation experiments revealed the presence of two translational products by a differential usage of two in-frame translational start codons. Coupling site-specific mutations on THI1 encoding sequence with green fluorescent protein (GFP) gene fusions showed that translation initiation in the first AUG directs translocation of THI1 to plastids. However, when translation initiates from the second AUG THI1 is addressed to mitochondria. Analysis of the translation efficiency of thi1 mRNA revealed that the best context for translation initiation is present at the first AUG. In addition, it has been shown a suboptimal context at the second AUG and a strong stem-and-loop structure which is likely to slow translation. These observation confirm the in vitro translation data in which translation occurs preferentially in the first AUG, what could suggest a higher requirement of the protein in plastids.

O gênero Eucalyptus é a fonte principal de madeira para a indústria de papel e celulose de países tropicais e subtropicais e tem sido extensivamente estudado. Apesar de sua importância econômica, muito pouco é conhecido sobre o controle genético da formação da madeira (xilogênese) no eucalipto. Diferentes propriedades da madeira são observadas durante o desenvolvimento das árvores e a madeira é classificada como madeira juvenil e adulta. A madeira juvenil comparada à adulta apresenta células com paredes delgadas, alta concentração de lignina e baixa densidade; características indesejáveis para a indústria florestal. A identificação de proteínas e genes que regulam os processos genéticos de formação da madeira juvenil e adulta é, portanto, alvo potencial para estudos relacionados a modificações específicas visando melhorar a qualidade da madeira. O objetivo deste trabalho foi identificar as proteínas da região cambial de árvores de Eucalyptus grandis envolvidas no processo de formação da madeira adulta. A proteína total foi extraída de árvores com 22 anos e submetida à eletroforese bidimensional. Os spots foram isolados de cada uma das repetições do gel e após digestão tríptica, submetidos ao sequenciamento por cromatografia líquida associada ao espectrômetro de massas Q-TOF Ultima API (Waters, UK). Os espectros foram analisados pelo programa MASCOT MS/MS Ion Search, utilizando o banco de dados MSDB. Um total de 82 proteínas foram identificadas e classificadas em seis categorias funcionais: metabolismo e energia (36%), processos celulares (11%), transporte (2%), estrutura e organização da estrutura (11%), vias de informação (30%) e sem função definida (10%). Muitas das proteínas identificadas participam dos mecanismos de controle da biossíntese da parede celular e, conseqüentemente, da formação da madeira. Os dados gerados irão facilitar uma futura comparação e seleção de proteínas diferencialmente expressas em árvores juvenis e adultas durante xilogênese. / The Eucalyptus genus is the main source of hardwood for the pulp and paper industry in tropical and subtropical countries and is being extensively studied. Despite its economical importance, very little is known about the genetic control of wood formation (xylogenesis) in eucalypts. Different wood properties are observed during tree development and the wood is classified as juvenile and mature. The juvenile wood is characterized by cells with large lumen and thinner walls, lower density, higher lignin content and poor quality for pulp production, when compared to mature wood. The identification of proteins and genes that regulate the process in both mature and juvenile wood formation is, therefore, a potential target for studies related to specific modifications to alter wood quality. The aim of this work was to identify proteins which participate in the process involved in mature wood formation by isolating proteins from the cambial region of Eucalyptus grandis. The total protein was extracted from 22 year-old trees and two-dimensional gel electrophoresis was carried out. Proteins were excised from the gels and after tryptic digestion, MS analysis was conducted by on line chromatography using a Cap-LC coupled to a Q-TOF Ultima API mass spectrometer (Waters, UK). The spectra were processed using MASCOT MS/MS Ion Search (www.matrixscience.com), and the sequences searched against MSDB database. A total of 82 proteins were identified and classified into six main functional categories: metabolism and energy (36%), cellular processes (11%), transport (2%), structure and structural organization (11%), information pathways (30%), non defined function (10%). Many of the identified proteins play a role in the mechanisms involved in the control of cell wall biosynthesis, and consequently in wood formation. The generated data will facilitate a further comparison and selection of proteins differentially expressed in mature and juvenile trees during xylogenesis.

Na célula eucariota, os processos metabólicos estão compartimentalizados em organelas e proteínas sintetizadas no citosol são endereçadas para elas por meio de sistema celular específico. Devido a sobreposições funcionais entre organelas, uma dada proteína pode ser requerida em mais de um compartimento. É o caso de proteínas com duplo direcionamento, em que um gene nuclear é capaz de gerar produtos protéicos direcionados para mais de uma organela. Cerca de 60 proteínas de plantas já tiveram seu duplo direcionamento demonstrado, a maioria para mitocôndrias e cloroplastos, portanto um fenômeno não tão raro como imaginado. Estudos recentes procuram esclarecer os mecanismos que permitem esse duplo direcionamento, mesmo existindo fatores celulares que garantem a especificidade do transporte para cada organela. O presente trabalho está dividido em três partes. Na primeira, foram investigados aspectos evolutivos do duplo direcionamento. Na análise comparativa de famílias gênicas com membros cujos produtos protéicos apresentam duplo direcionamento, em Arabidopsis thaliana e Oryza sativa, foi demonstrada a conservação do duplo direcionamento de monodeidroascorbato redutase, metionina aminopeptidase e, provavelmente, de THI1 (enzima da biossíntese de tiazol), entre as duas espécies. Os dados sugeriram um mesmo padrão de evolução em famílias incluindo membros com duplo direcionamento. Na segunda parte, o foco foi a seqüência de duplo direcionamento. Documentado o duplo direcionamento, para mitocôndrias e cloroplastos, de proteínas de ligação ao RNA, RBP1a, RBP1b e RPS19, mutações sítiodirigidas foram introduzidas na seqüência de direcionamento de RBP1b. A importância de aminoácidos positivos para o direcionamento de proteínas para mitocôndrias foi confirmada. Demonstrou-se que a mutação da alanina na posição 2, conservada em seqüências de direcionamento ambíguas para mitocôdrias e cloroplastos, não afeta o duplo direcionamento de RBP1b. A informação para o duplo direcionamento foi localizada entre os 17 primeiros aminoácidos da região amino-terminal. Os sinais de direcionamento para cloroplastos se distribuíram ao longo da seqüência. Enquanto a metade amino-terminal da seqüência foi suficiente para determinar o duplo direcionamento, a seqüência compreendendo os 13 aminoácidos seguintes afetaram a eficiência do transporte. Nessas análises, mostrou-se a adequação de método quantitativo na medida dos sinais de fluorescência da GFP, para ser aplicado em estudos quantitativos do direcionamento de proteínas para mitocôndrias e cloroplastos, in vivo. Na terceira parte, o foco foi o mecanismo traducional do duplo direcionamento de THI1, em A. thaliana. Entretanto, não foi possível testar a hipótese da presença de um sítio interno de entrada do ribossomo (IRES) no mRNA de thi1, pois não se encontrou um sistema de expressão transiente capaz de reproduzir dados da literatura que mostraram o duplo direcionamento de THI1. Nos sistemas testados, a proteína foi encontrada somente em cloroplastos, o que inviabilizou o prosseguimento da investigação. / Compartimentalization of the metabolic processes in organelles, each one having a characteristic protein pool and distinct functions, is a property of eukaryote cells. A highly specific cellular system directs proteins, which are synthesized in the cytosol, to the proper organelles. However, due to functional overlaps between organelles, a given protein may be needed in different compartments. This is the case of dual-targeted proteins, which are the product of single nuclear genes, but are somehow directed to different organelles. About 60 plant proteins have had their dual targeting demonstrated, most of them to mitochondria and cloroplasts, the phenomenon being not so rare as previously supposed. Investigations have focused on the mechanisms, which enable protein dual targeting, even in the presence of other cell mechanisms that guarantee the specific protein transport to each organelle. The present work on the subject can be divided in three parts. In the first part, evolutionary aspects of dual targeting were investigated. A comparative analysis of gene families that included members encoding dual-targeted proteins in Arabidopsis thaliana and Oryza sativa demonstrated that the dual targeting of monodehidro-ascorbate reductase, methyonine aminopeptidase and, problably, of the thiazole biosynthetic enzyme THI1 was evolutionary conserved between the two species. In addition, the data suggested the same pattern of evolution for families with members presenting dual targeting. The focus of the second part was the ambiguous sequence for dual targeting. After showing that the RNA-binding proteins RBP1a, RBP1b and RPS19 were dual-targeted to mitochondria and cloroplasts, sitedirected mutations were introduced in the targeting sequence of RBP1b. The importance of positive-charged amino acids for directing the protein to mitochondria was confirmed. Mutation of alanine at position 2, which is conserved in ambiguous sequences, was shown not to affect RBP1b dual targeting. Information for dual targeting was localized among the 17 first amino acids in the amino-terminal region. The signals for directing the protein to cloroplasts appeared distributed along the targeting sequence. While the amino-terminal half of the sequence was sufficient for RBP1b dual targeting, the sequence comprising the next 13 amino acids appeared to affect the efficiency of the transport. In these analyses, a quantitative method to measure the intensity of fluorescent signals of GFP had its efficacy demonstrated to be adopted for in vivo quantitative analysis of dual targeting to mitochondria and cloroplasts. In the third part, the focus was the translational mechanism enabling THI1 dual targeting to mitochondria and cloroplasts, in A. thaliana. It was hypothesized that an internal ribosomal entry site (IRES) was present in thi1 mRNA. However, a transient expression system could not be found that reproduced the literature data demonstrating THI1 dual targeting. In the tested systems the protein was addressed solely to cloroplasts, thus preventing the objective to be pursued.

A proteômica expandiu-se dentro da área biológica a partir da década de 90 com o desenvolvimento de técnicas de ionização branda que permitem analisar macromoléculas por espectrometria de massas (MS) e é uma nova estratégia na busca de genes de interesse e de informações sobre o controle da expressão gênica para a manipulação genética de plantas. Na busca por genes diferencialmente expressos durante o desenvolvimento da madeira, foi estabelecida uma plataforma 2D-LC-MS/MS (eletroforese bidimensional seguida de cromatografia líquida e espectrometria de massas em tandem) e identificadas 72 proteínas da região cambial de Eucalyptus grandis de árvores de 2 anos e 8 meses. A identificação foi feita por homologia com o banco de proteínas SwissProt, com um banco de ESTs específico de Eucalyptus spp. (GENOLYPTUS) e com o NCBI. Os dados de proteínas também foram confrontados com a expressão dos transcritos correspondentes obtidos a partir do mesmo tecido por SAGE (Serial Analysis of Gene Expression). Dentre as proteínas identificadas, a maior parcela (24,1 %) tem função relacionada com resposta a estresse, 20,5 % pertence a metabolismo de energia, 17,8 % são componentes estruturais, 14,3 % participam em metabolismo de macromoléculas e 15,2 % em metabolismos básicos como de nitrogênio, aminoácidos, nucleotídeos, lipídeos e metabolismo secundário. / Proteomics impacted the biological sciences since the 90´s after the development of soft ionization techniques that allow to analyse macromolecules by mass spectrometry (MS). It became a new strategy to identify genes and obtain information about the molecular control of gene expression, of importance to genetic manipulation of plants. In order to search for genes involved in wood quality and to understand gene expression during wood development, a 2D-LC-MS/MS system (bidimensional electrophoresis followed by liquid cromatography coupled to mass spectrometry in tandem) was stablished. 72 proteins from the cambial region of Eucalyptus grandis trees at the age of 2 years and 8 months were identified. The MS/MS spectra were processed using the SwissProt databank, an EST (Expressed Sequence Tags) bank of Eucalyptus spp. (GENOLYPTUS) and the NCBI. A comparation of gene and protein expression was carried out using a databank constructed in our laboratory using SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) obtained from the same cambial tissue. Most identified proteins are related to stress response (24.1 %), 20.5 % participate in energy metabolism, 17.8 % are important to the cell as structural components, 14,3 % are related to macromolecular metabolism and 15,2 % to basic metabolism of nitrogen, amino acids, nucleotides, lipids and secondary metabolism.

A semente de milho, base da alimentação em muitos países na África, Ásia e América Latina, possui ~10% de proteína na semente. Por ser um cereal a proteína da semente de milho apresenta uma baixa concentração de aminoácidos essenciais como: lisina e triptofano. Com a descoberta do milho opaco-2, o qual apresenta um maior teor de lisina e triptofano em suas sementes, surgiu a oportunidade de se desenvolver milhos com qualidade protéica, aumentando o conteúdo de aminoácidos e a qualidade nutricional dos grãos. Assim, surgiu o milho QPM (quality protein maize), milho de alta qualidade protéica, melhorado pelo CIMMYT (México). O QPM possui duas vezes mais lisina que o milho normal mantendo a sua produtividade equivalente. A EMBRAPA, Milho e Sorgo, desenvolveu duas variedades QPM comercializadas: BR451 e BR473. A linhagem QPM 161 (EMBRAPA Milho e Sorgo) teve suas proteínas de reserva analisadas bioquimicamente neste trabalho, concluindo que o QPM 161, possui uma concentração maior de lisina em suas sementes, chegando a superar o BR 451 e a manter a mesma concentração de lisina que o BR 473. Em outra parte do trabalho, sementes imaturas (14, 20 e 14 DAP) das linhagens 161, assim como as do selvagem W22+ e de seus mutantes W22o10, W22o11 e W22o13, foram utilizadas para caracterizar a enzima homoserina quinase (HK). A HK faz parte da via de biossíntese do aminoácido essencial treonina. Constatou-se que uma alta atividade desta enzima está relacionada ao aumento de treonina na semente, porém, a alta atividade de HK foi observada nos menores estágios de maturação. Assim os resultados mostram que mais estudos sobre a regulação desta enzima devem ser realizados para que se possam desenvolver sementes ricas em lisina e também em treonina. / Maize which is the staple food in many countries in Africa, Asia and Latin America, has ~10% of protein in the seeds. Maize seeds protein presents low contents of essential amino acids, such as lysine and tryptophan. Since the discovery of the opaque-2 maize, a recessive mutation that results in high concentrations of lysine and tryptophan, the major challenge has been to develop better quality protein maize to increase the rate of amino acids consumed by population. The QPM (quality protein maize), originally produced and breeded at CIMMYT in Mexico, came to solve the issue. The QPM protein has twice as much lysine and tryptophan, with the same yield of normal maize. The EMBRAPA, Maize and Sorghum, has bred two QPM varieties that are already commercialized (BR 451 and BR 473), but to increase the quality of the Brazilian QPM, EMBRAPA developed a new QPM line, the 161, whose storage proteins were biochemically analyzed in this study. Line 161 exhibited a higher lysine concentration than BR 451, but about the same concentration of that exhibited by BR 473. Further analyses conducted in this research involved the study of immature seeds (14, 20 and 24 DAP) of line 161, and the wild-type W22+ and its counterpart mutants W22o10, W22o11 and W22o13, and the characterization of the enzyme homoserine kinase (HK). HK is a key enzyme of the threonine biosynthetic pathway. The high HK activity was shown to be related to the increased threonine concentration in the maize seeds. HK activity was shown to reach the highest level in the first developmental stage, whereas in the last developmental stage the activity is lower and so is the rate of threonine. Therefore, it is necessary more studies on HK regulation to improve the mature maize seeds with the best rate of lysine and threonine.

O Brasil é um país de vocação florestal, mantendo atualmente grandes áreas reflorestadas com Eucalyptus, cuja madeira é utilizada como matéria-prima em diversas indústrias de base florestal. A projeção é de uma crescente demanda de madeira e, em função disso, é necessário associar novas estratégias aos programas de melhoramento genético, que resultem não somente no aumento da produtividade, como também na adequação de caracteres da qualidade da madeira para um produto final. A qualidade da madeira depende de diversas propriedades do xilema secundário, tecido que constitui a madeira. O desenvolvimento de tecnologias proteômicas, que permitem analisar os genes diretamente ao nível de seus produtos, pode contribuir para o maior entendimento dos processos relacionados à formação da madeira. O objetivo principal deste trabalho foi identificar as proteínas mais abundantemente expressas na região cambial, envolvidas na formação da madeira de Eucalyptus grandis, aos 6,3 anos de idade. A região cambial foi caracterizada por células do câmbio e por células diferenciadas em floema e xilema secundários. A amostragem foi realizada por meio da abertura de painéis nas árvores, seguido da raspagem de sua casca interna e da superfície do fuste. Foram testados dois métodos de extração de proteínas, que utilizam ácido tricloroacético e fenol, respectivamente, a fim de avaliar qual deles proporciona a obtenção de extratos protéicos concentrados e livres de contaminantes. Ensaios foram realizados para ajustar o tempo e o tampão de focalização isoelétrica das proteínas. Um extrato contendo cerca de 500 μg de proteínas foi utilizado para a preparação dos géis 2D de pH 4-7. Dois tipos de coloração de géis foram avaliados. Os spots foram recortados para proceder a digestão tríptica das proteínas. A solução contendo os peptídeos de uma amostra foi analisada por espectrometria de massa. As seqüências experimentais foram contrastadas com uma base de seqüências peptídicas e um banco de ESTs espécie-específico. As imagens dos géis bidimensionais foram analisadas, com a finalidade de fazer inferências sobre o nível de expressão de cada proteína identificada na região cambial, como também correlacioná-la com a expressão de seu transcrito correspondente. O método com fenol mostrou-se o mais eficiente para extrair proteínas da região cambial. Foi observado que as proteínas foram totalmente focalizadas a 74.000 Vh. A coloração com Coomassie Brilliant Blue G-250 permitiu a revelação de um número maior de spots e mostrou-se compatível com a espectrometria de massa. A análise LC/MS/MS das amostras permitiu a identificação de 69 spots, correspondendo a 41 proteínas distintas da região cambial, sendo 34,15% delas, representadas em múltiplos spots, As proteínas identificadas exercem seu papel biológico na produção de energia (22%), em processos celulares (19,5%), como componentes estruturais (17,1%), nos metabolismos de aminoácidos (14,6%) e macromolecular (19,5%), e no transporte de moléculas (2,4%). Oito spots mostraram similaridade de seqüências em ambas bases de dados, mas nenhuma função foi atribuída a eles. A análise da correlação revelou uma tendência para um grupo restrito de proteínas, de que os transcritos que se mostraram pouco abundantes corresponderam a proteínas altamente expressas na região cambial. / Brasil is a country with forestry inclination, currently keeping large areas planted with Eucalyptus, which wood is used as raw material in several forest-based industries. The projection is an increasing demand of wood and, as a function of it, it is necessary to link new strategies to the programs of genetic improvement that result not only in the increase of the productivity, but also in the adequacy of characters of wood quality for a final product. The wood quality depends on several properties of secondary xylem, a tissue that forms the wood. The development of proteomic technologies, which permit to analyze directly the genes at their products’ level, can contribute to a better comprehension of the processes related to the wood formation. The main objective of this work was to identify the most abundant proteins expressed in the cambial region that are involved in the Eucalyptus grandis wood formation at 6.3 years of age. The cambial region was characterized by cambium cells differentiated into secondary phloem and xylem. The sampling was performed by means of opening panels in the trees, followed by rubbing their internal barks and the stem surface. Two protein extraction methods were tested. These methods use trichloroacetic acid and phenol, respectively, in order to evaluate which one proportionates the acquisition of concentrated proteic extracts and is free from contaminants. Essays were performed to adjust the time and the buffer for isoelectric focus of proteins. Extracts containing around 500 μg of protein were used to prepare 2D gels with pH ranging from 4 to 7. Two types of gel staining were evaluated. The spots were cut out in order to obtain the tripitic digestion of the proteins. The solution containing peptides from each sample was analyzed by mass spectrometry. The experimental sequences were contrasted in a peptidic sequences base and in a speciespecific ESTs. The bidimensional gels images were analyzed in order to make inferences about the level of expression of each protein identified in the cambial region, as well as to correlate them with the expression of its corresponding transcript. The method using phenol showed to be more efficiently to extract proteins from the cambial region. It was observed that the proteins were totally focused at 74,000 Vh. The staining with Coomassie Brilliant Blue G-250 allowed the revealing of a higher number of spots and showed to be compatible with mass spectrometry. The LC/MS/MS sample analyses allowed the identification of 69 spots, corresponding to 41 different proteins from the cambial region, where 34.15% of them were represented in multiple spots. The identified proteins play their biological role in the production of energy (22%), in cellular processes (19.5%), as structural components (17.1%), in metabolism of aminoacids (14.6%) and macromolecular metabolism (19.5%), and in the transportation of molecules (2.4%). Eight spots showed similarity in sequences in both databases, but no function was attributed to them. The correlation analysis revealed a tendency for a restrict group of proteins, whose transcripts showed a little abundant, corresponds to proteins highly expressed in the cambial region.

A lisina é um dos aminoácidos essenciais e um dos fatores limitantes ao uso de cereais como o milho na alimentação pois, sem suplementação, não permite a obtenção de uma dieta balanceada. A fim de melhorar a qualidade nutricional dos cereais, várias tentativas têm sido feitas utilizando o melhoramento genético. Com o advento das técnicas de engenharia genética é possível, atualmente, utilizar a biotecnologia para aprofundar estes estudos, a fim de desvendar os complexos mecanismos que controlam o fluxo de aminoácidos nos grãos. O presente trabalho tem como objetivo principal testar uma nova estratégia que se baseia na expressão de uma proteína quimérica, a zeolina, sob controle de um promotor endosperma específico. A zeolina é uma combinação de 421 aminoácidos da faseolina do feijão com 89 aminoácidos da y- zeína, inserida no genoma do milho sob controle de um promotor isolado da -kafirina de sorgo. Para que o objetivo do projeto fosse alcançado, o trabalho foi dividido nas seguintes etapas: i) Síntese da construção e clonagem nos vetores; ii) Transformação de embriões e calos de milho utilizando biobalística e Agrobacterium tumefaciens; iii) Cultura de tecidos para seleção e regeneração das plantas transformadas; iv) Verificação dos eventos de transformação através da análise do DNA, RNA e da proteína do transgene; v) Análises preliminares das plantas transformadas para o padrão das proteínas de reserva e perfil de aminoácidos dos grãos. A construção da zeolina foi amplificada por PCR com primers específicos e clonada nos vetores pCambia3301 e pTF102 sob controle do promotor da -kafirina. Os embriões e calos do milho híbrido HiII foram utilizados na transformação empregando-se a biobalística e Agrobacterium tumefaciens. No final do processo foram produzidas e multiplicadas oito plantas de milho transformadas com a zeolina, confirmadas por testes biológicos, PCR, sequenciamento e testes imunocromatográficos, representando seis eventos de transformação. A expressão gênica, verificada pela detecção do mRNA por PCR, foi constatada em seis eventos de transformação. Para detecção da proteína expressa pelo transgene foi utilizado anticorpo específico para faseolina, através do Western Blot. A banda relativa ao transgene foi detectada em três eventos de transformação. Nas análises preliminares não houve alteração no padrão das frações zeína, globulina, glutelina ou albumina nas plantas transformadas quando comparados com os controles. Também não houve diferenças significantes no teor de aminoácidos solúveis totais entre as plantas transformadas e os controles. Na determinação do perfil de aminoácidos no HPLC, o evento ZEO-3(3) apresentou as maiores concentrações para todos os aminoácidos analisados. Neste evento de transformação o teor de lisina foi de 25,76 mg/g de proteína, enquanto os controles apresentaram valores de 9,77 e 15,89mg/g de proteína. O evento ZEO-3(3) apresenta-se, portanto, como um candidato para estudos posteriores a fim de revelar os complexos mecanismos que controlam o fluxo de aminoácidos e o acúmulo das proteínas de reserva nos grãos de milho. / Lysine is an essential amino acid and a major factor limiting the use of cereals such as maize for food and feed as, without supplementation, does not allow obtaining a balanced diet. In order to improve the nutritional quality of cereals, several attempts have been made using the conventional breeding. With the advent of genetic engineering techniques it is now possible to use biotechnology to develop further studies and to unravel the complex mechanisms that control the flow of amino acids in grains. The present work aimed at testing a new strategy based on the expression of a chimeric protein, the zeolin, under the control of an endosperm specific promoter. The zeolin is a combination of 421 amino acids of bean phaseolin with 89 amino acids of the maize - zein inserted into the maize genome under the control of a promoter isolated from the protein -kafirin from sorghum. For the goal of the project to be reached, the work was divided into the following steps: i) Synthesis of the construction and the cloning vectors; ii) Transformation of embryos and callus of maize using the biolistic and Agrobacterium tumefaciens methods; iii) Tissue culture for selection and regeneration of transformed plants iv) Verification of transformation events through the analysis of the DNA, RNA and protein from the transgene; v) Preliminary analysis of transformed plants for the storage proteins pattern and amino acid profile of the grains. The zeolin construction was amplified by PCR with specific primers and cloned into the vectors pCambia3301 and pTF102 under the control of the promoter -kafirin. Embryos and callus of HiII hybrid were used in the transformation using the biolistic and Agrobacterium tumefaciens. At the end of the process of transformatio, eight maize plants transformed with zeolin were produced and multiplied, confirmed by biological tests, PCR, sequencing and immunochromatographic tests, representing six transformation events. The gene expression, verified by detection of mRNA by PCR, was found in six events of transformation. The protein translation, verified by Western Blot using an antibody specific for phaseolin, was found in three transformation events. In the preliminary analysis, the pattern of zein, globulin, glutelin or albumin fractions did not change comparing transformed plants with the controls. There were also no significant differences in the content of soluble amino acids among the Western positive transformed plants and the controls. In the HPLC amino acid profile, the event ZEO-3(3) showed the higher concentrations for all amino acids analyzed. In this transformation event the content of lysine was 25,76mg/g protein, while the controls exhibited values of 9,77 and 15,89mg/g protein. Therefore, ZEO-3(3) event presents itself as a candidate for further studies to reveal the complex mechanisms that control the flow of amino acids and accumulation of storage proteins in maize kernels.

Os cereais representam importantes fontes de proteína para alimentação humana e animal. Entretanto, são caracterizados pela baixa qualidade nutricional de suas proteínas devido à composição desbalanceada de aminoácidos, causada pelo excesso dos aminoácidos prolina e glutamina e deficiência de lisina, treonina e triptofano. As proteínas de reserva prolaminas constituem 50% do conteúdo total de proteínas no endosperma e são as principais responsáveis por tais características nos cereais. As informações sobre o metabolismo de lisina e o acúmulo de proteínas de reserva no endosperma vêm sendo utilizadas para desenvolver e aplicar estratégias em programas de melhoramento de plantas que visam suprir a deficiência de lisina encontrada nos cereais. Lange e colaboradores (2007) relataram a produção de linhagens transgênicas de cevada com padrão de proteínas de reserva alterado e que apresentaram incremento no teor de lisina e outros aminoácidos essenciais. O presente trabalho teve como objetivo identificar os mecanismos responsáveis pelas alterações observadas. Para tanto, avaliou-se a atividade das enzimas envolvidas na síntese e degradação de lisina, além da caracterização das proteínas de reserva e sua composição de aminoácidos. Observou-se redução na fração protéica das prolaminas (5,91 a 18,34%) e incrementos compensatórios na fração protéica das glutelinas (2,16 a 6,52%). As demais frações apresentaram respostas variáveis dependendo do evento avaliado. Além disso, a composição de aminoácidos foi alterada nas diferentes frações protéicas. As prolaminas exibiram incrementos nos teores de lisina (1,79 a 49,13%), treonina (5,04 a 22,60%) e metionina (13,57 a 45,38%), enquanto que as globulinas aumentaram principalmente o conteúdo de metionina (32,30 a 142,56%). Para os aminoácidos solúveis, foram observados incrementos na ordem de duas a três vezes de histidina, lisina, fenilalanina e metionina. A análise das enzimas envolvidas no metabolismo de lisina revelou que ocorreram alterações nas três principais enzimas da via do ácido aspártico. A enzima aspartato quinase (AK) apresentou aumentos na atividade (4,44 a 47,27%), entretanto, foi mais sensível a inibição causada por lisina. A enzima dihidrodipicolinato sintase (DHDPS) também apresentou incremento na atividade (1,50 a 66,32%), mas diferente da AK, foi menos sensível à inibição causada por lisina. A enzima homoserina desidrogenase (HSDH), a qual compete o substrato ASA com a enzima DHDPS, exibiu redução na atividade (3,36% a 28,80%) (exceto um evento de transformação) e foi menos sensível a inibição causada por treonina. Embora as enzimas envolvidas na degradação de lisina também foram alteradas, os resultados foram variáveis para os diferentes eventos. Para aqueles que foram observados redução na atividade da enzima lisina cetoglutarato redutase (LOR), foi também verificado para enzima sacaropina desidrogenase (SDH), mas na ordem de duas vezes, sendo válido para aqueles que apresentaram incremento. Este trabalho mostrou que a alteração no padrão de proteínas de reserva ocasionou mudanças no metabolismo de aminoácidos, neste caso a lisina, para suprir a demanda necessária para incorporação em proteínas de reserva / Cereals represent an important source of protein to human food and animal feed. However, they are characterized by low nutritional quality of proteins due to the unbalanced composition of amino acids, caused by the excess of the amino acids proline and glutamine and deficiency of lysine, threonine and tryptophan. The prolamin storage proteins constitute 50% of the total protein content in the endosperm and is primarily responsible for these characteristics in cereals. Information on the metabolism of lysine and accumulation of storage proteins in endosperm have been used to develop and implement strategies in plant breeding programs that aim to address the deficiencies found in cereals. Lange and coworkers (2007) reported the production of transgenic lines of barley with a pattern of storage proteins that showed altered and increase in the levels of lysine and other amino acids. This study aimed to identify what were the mechanisms responsible for observed changes. For this, we evaluated the activity of enzymes involved in synthesis and degradation of lysine, besides the characterization of storage proteins and their amino acid composition. There was a reduction in the prolamin protein fraction (5.91 to 18.34%) and compensatory increases in the glutelin fractions (2.16 to 6.52%). The other fractions had variable responses depending on the event evaluated. Moreover, the amino acid composition was changed in the different protein fractions. Prolamins exhibited increases in levels of lysine (1.79 to 49.13%), threonine (5.04 to 22.60%) and methionine (13.57 to 45.38%), whereas increases were mainly globulins content of methionine (32.30 to 142.56%). With respect to soluble amino acids, increases were observed in the order of 2-3 fold of histidine, lysine, phenylalanine and methionine. Analysis of enzymes involved in lysine metabolism showed that changes in three key enzymes of the pathway of aspartic acid. The enzyme aspartate kinase (AK) showed increase in activity (4.44 to 47.27%), however, was more sensitive to inhibition by lysine. The enzyme dihydrodipicolinate synthase (DHDPS) also showed increased activity (from 1.50 to 66.32%), but unlike the AK, was less sensitive to inhibition by lysine. The enzyme homoserine dehydrogenase (HSDH) that competes for the substrate ASA with the DHDPS, exhibited reduced activity (3.36% to 28.80%) (an exception one transgenic line) and was less sensitive to inhibition by threonine. The enzymes involved in degradation of lysine were also changed, though the results varied for different events. Those who observed decreased activity of the enzyme lysine ketoglutarate reductase (LOR) was also found for enzyme saccharopine dehydrogenase (SDH), but the order of twice, which was valid for those who had increased. This study showed that the change in the pattern of storage proteins produced changes in amino acid metabolism, in this case lysine, to supply the demand needed for incorporation into storage proteins.

A soja geneticamente modificada MON 87701 × MON 89788, Glycine max (L.) Merrill, que expressa genes que codificam a proteína Cry1Ac de Bacillus thuringiensis var. kurstaki Berliner e a proteína 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase de Agrobacterium sp., foi liberada para uso comercial no Brasil em 2010. Para subsidiar um programa de Manejo da Resistência de Insetos (MRI) foi realizada a avaliação de risco de evolução de resistência a Cry1Ac para as pragas-alvo primárias, Anticarsia gemmatalis Hübner e Pseudoplusia includens (Walker), a praga-alvo secundária Heliothis virescens (Fabricius) e as pragas nãoalvo Spodoptera cosmioides (Walker), Spodoptera eridania (Stoll) e Spodoptera frugiperda (J. E. Smith). Em bioensaios com a proteína Cry1Ac purificada incorporada em dieta artificial, verificou-se que Cry1Ac foi extremamente ativa para A. gemmatalis [CL50 (IC 95%) = 0,23 (0,15 - 0,34) g Cry1Ac/mL de dieta], P. includens [CL50 (IC 95%) = 3,72 (2,65 - 4,86) g Cry1Ac/mL de dieta] e H. virescens [CL50 (IC 95%) = 0,026 (0,021 - 0,033) g de Cry1Ac/mL de dieta]. Em contraste, na máxima concentração testada de 100 g Cry1Ac/mL de dieta, S. cosmioides e S. eridania apresentaram mortalidade < 13%, e S. frugiperda de » 50%. Em bioensaios com tecido liofilizado de soja MON 87701 × MON 89788, diluído 25 vezes em dieta artificial, houve 100% de mortalidade para A. gemmatalis e H. virescens e até 96% para P. includens. Entretanto, as lagartas sobreviventes de P. includens apresentaram enfezamento larval > 95%. Em bioensaios com discos de folha em laboratório (para A. gemmatalis, P. includens e H. virescens), vagens (para H. virescens) e elevada infestação em condições de casa de vegetação e de infestação natural em campo (para A. gemmatalis e P. includens) foram obtidas alta eficácia da soja MON 87701 × MON 89788 no controle das pragas-alvo primárias e secundária. Por outro lado, a soja MON 87701 × MON 89788 apresentou baixa eficácia para S. cosmioides e S. eridania (mortalidade < 7%) e atividade intermediária para S. frugiperda (32 a 47% mortalidade). A soja MON 87701 × MON 89788 não afetou os parâmetros biológicos de S. cosmoides e S. eridania. Para S. frugiperda houve prolongamento da fase larval (» 5 dias), menor viabilidade larval e total, aumento no intervalo entre gerações (» 8 dias) e redução na taxa intrínseca de crescimento (» 41%). No contexto do MRI, a soja MON 87701 × MON 89788 expressa a proteína Cry1Ac em níveis que constituem alta dose para A. gemmatalis e H. virescens, e muito próximo a alta dose para P. includens. Por outro lado, para as espécies de Spodoptera, a soja MON 87701 × MON 89788 é um evento de baixa dose, pois permite que indivíduos suscetíveis completem o ciclo biológico. Em termos de MIP, a soja MON 87701 × MON 89788 apresenta um elevado nível de controle de A. gemmatalis, P. includens e H. virescens. No entanto, a soja MON 87701 × MON 89788 não ocasiona controle efetivo de espécies de Spodoptera. As informações obtidas no presente trabalho contribuirão para subsidiar programas de MRI e preservar a durabilidade dessa tecnologia para o MIP-Soja no Brasil. / Genetically modified MON 87701 × MON 89788 soybean, Glycine max (L.) Merrill, expressing genes that code for the Cry1Ac protein of Bacillus thuringiensis var. kurstaki Berliner and the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase protein of Agrobacterium sp., has been registered for commercial use in Brazil in 2010. To develop a program of Insect Resistance Management (IRM) for this event, we conducted resistance risk assessment to the primary target pests, Anticarsia gemmatalis Hübner and Pseudoplusia includens (Walker), the secondary target pest Heliothis virescens (Fabricius) and the non-target pests Spodoptera cosmioides (Walker), Spodoptera eridania (Stoll) and Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) to the Cry1Ac protein. In bioassays with purified Cry1Ac protein incorporated into artificial diet, Cry1Ac was highly active for A. gemmatalis [LC50 (95% FL) = 0.23 (0.15 - 0.34) g Cry1Ac/mL of diet], P. includens [LC50 (95% FL) = 3.72 (2.65 - 4.86) g Cry1Ac/mL of diet] and H. virescens [LC50 (95% FL) = 0.026 (0.021 - 0.033) g Cry1Ac/mL of diet]. In contrast, even at the highest concentration tested of 100 g Cry1Ac/mL of diet, the mortality observed to S. cosmioides and S. eridania was < 13% and to S. frugiperda was » 50%. In bioassays with freeze-dried MON 87701 × MON 89788 soybean tissue, diluted 25 times in artificial diet, there was 100% mortality to A. gemmatalis and H.virescens and up to 96% for P. includens. However, the surviving P. includens larvae showed > 95% larval stunting. In bioassays with leaf discs in the laboratory to (A. gemmatalis, P. includens and H. virescens), pods (H. virescens), high pest infestation studies under greenhouse conditions and in natural infestation in the field (to A. gemmatalis and to P. includens) showed a very high level of efficacy against these primary and secondary target pests. On the other hand, soybean MON 87701 × MON 89788 showed low efficacy to S. cosmioides and S.eridania (mortality < 7%), and intermediate activity to S. frugiperda (32 to 47% of mortality). MON 87701 × MON 89788 soybean did not affect the biological parameters of S. cosmoides and S. eridania. For S. frugiperda, the larval stage was prolonged (» 5 days), with reduction on larval and total viability, increase in generation time (» 8 days) and reduction in the intrinsic rate of increase (» 41%). In the context of IRM, MON 87701 × MON 89788 soybean expresses the Cry1Ac protein at levels that are high-dose for A. gemmatalis and H. virescens, and near to the highdose for P. includens. On the other hand, for the Spodoptera species, MON 87701 × MON 89788 soybean is a low-dose event, because it allows susceptible individuals to complete larval developement. In terms of IPM, MON 87701 × MON 89788 soybean provided a high level of control of A. gemmatalis, P. includens and H. virescens. However, MON 87701 × MON 89788 soybean was not effective to control Spodoptera species. The information obtained in this research will contribute to develop IRM programs and to preserve the durability of this technology for soybean IPM in Brazil.