A existência de uma proteína mitocondrial desacopladora em plantas, PUMP, foi demonstrada em 1995. A PUMP, como a proteína desacopladora de mitocôndrias de tecido adiposo marrom, UCP1, e outras proteínas homólogas descobertas posteriormente, aumenta a condutividade de membrana a H+. Nucleotídeos de purina, PN, inibem a atividade das proteínas desacopladoras e o mecanismo de condução de H+ depende da presença de ácidos graxos livres, FFA. A atividade e a expressão da PUMP são estimuladas pela exposição ao frio e mudam durante o amadurecimento de frutos. A expressão do gene da PUMP de Arabidopsis thaliana em E. coli permite a obtenção de AtPUMP. Neste trabalho, analisando a funcionalidade da AtPUMP incorporada em proteolipossomos, demonstramos que esta proteína é funcional. A incorporação de proteínas desacopladoras em proteolipossomos fornece um sistema modelo que permite analisar as suas propriedades funcionais e mecanísticas. A condutância a H+ em proteolipossomos contendo PUMP isolada de batata foi claramente ativada por FFA. Contudo, a inibição por PN não se mostrou reprodutível. A AtPUMP, reconstituída em proteolipossomos, foi ativada por FFA com Km\'s aparentes de: 42 µM (ácido linoleico, LA), 55 µM (ácido láurico) e 70 µM (ácido palmítico), e inibida por PN com Ki\'s aparentes de: 0.8 mM (GDP), 0.85 mM (ATP), 0.98 mM (GTP) e 1.4 mM (ADP). O efluxo de H+ ativado por LA mediado por AtPUMP aumentou exponencialmente em função do potencial transmembrânico (Δψ). O coeficiente de partição (KP) entre a fase aquosa e proteolipossomos contendo AtPUMP para o LA de 64170, foi ~1,6 vezes superior que ao KP obtido para o LA em lipossomos. Em ensaios de ligação obtidos usando microcalorimetria de titulação isotérmica (ITC), determinou-se que a AtPUMP tem, provavelmente, dois sítios de ligação para o LA e que essa interação é exotérmica. Em ensaios de microcalorimetria com suspensão de mitocôndrias de batatas, determinou-se que há uma correlação linear entre o calor produzido e o oxigênio consumido (65,6 kcal/mol O2) quando a PUMP foi ativada por LA. Através dos resultados obtidos até então, concluo que a PUMP (AtPUMP) é um desacoplador mitocondrial presente em plantas. Os estudos apresentados aqui, de reconstituição em lipossomos, foram essenciais para a compreensão da regulação da atividade dessa proteína. Além disso, foram obtidas as primeiras medidas diretas de liberação de calor pela PUMP por microcalorimetria. / In 1995, a plant mitochondrial uncoupling protein, PUMP, was first described. PUMP, like the known uncoupling protein from brown adipose tissue, UCP1, increases the inner mitochondrial membrane permeability to H+. H+ transport is dependent on the presence of free fatty acids, FFA, and it is inhibited by purine nucleotides, PN. PUMP expression and activity are stimulated by cold exposure, which may vary during fruit ripening. By expressing a full length cDNA encoding the Arabidopsis UCP in E. coli, the recombinant AtPUMP was obtained. In this study, AtPUMP was incorporated in proteoliposomes and the functionality of the protein was demonstrated. The incorporation of uncoupling proteins in proteoliposomes constitutes a model that allows the functional and the mechanistic analysis of these proteins. The H+ conductance mediated by reconstituted potato PUMP was, undoubtedly, activated by FFA. However, the inhibition by PN was not reproducible. Reconstituted AtPUMP was activated by FFA and the apparent Km\'s were determined: 42 µM (linoleic acid, LA), 55 µM (lauric acid) and 70 µM (palmitic acid). Reconstituted AtPUMP was inhibited by PN, and the apparent Kis were determined: 0.8 mM (GDP), 0.85 mM (ATP), 0.98 mM (GTP) and 1.4 mM (ADP). AtPUMP mediated H+ efflux rate, activated by LA, was exponentially dependent on membrane potential (Δψ). The partition coefficient (KP) between the aqueous phase and the membrane phase was determined for LA. The KP was 1.6 times higher for AtPUMP proteoliposomes than for liposomes. Using Isothermal Titration Microcalorimetry (ITC), we verified that there is a linear correlation between the heat produced and oxygen depletion (65,2 kcal/mol O2) in a suspension of potato mitochondria, when PUMP was activated by LA. Using ITC we also determined that LA might bind to two different sites in AtPUMP. Based on the results obtained, we concluded that PUMP (or AtPUMP) is a plant mitochondrial uncoupler. The reconstitution assays permitted the study of FFA and PN regulation. In addition, our results represent the first direct confirmation that fatty acids regulate heat release in plant mitochondria, a process that may play a role in cold adaptation, fruit ripening and flower blossoming.

O elevado valor sócioeconômico da soja é atribuído, em grande parte, à combinação muito favorável de altos teores de proteína e óleo, juntamente com níveis adequados de produtividade de grãos. Porém, existe uma alta correlação negativa entre os teores de proteína e óleo, fato que dificulta o melhoramento simultâneo destes caracteres. Além disso, também existe tendência de correlação negativa e moderada entre o teor de proteína e a produtividade de grãos. Existem evidências de que a seleção para densidade da semente pode promover ganhos indiretos simultâneos no teor de proteína e na produtividade de grãos. Assim, os principais objetivos deste trabalho foram: a) estimar parâmetros genéticos relacionados com a herança da densidade da semente; b) avaliar a eficiência da seleção para densidade da semente no melhoramento do teor de proteína e da produtividade de grãos. Para o estudo de herança foram utilizados quatro cruzamentos diferentes: USP98-06.011.10 x Abura, MSOY 8001 x Abura, USP98-06.027.03 x Biloxi e USP98-06.009.01 x PI 239.235, sendo que os parentais e as plantas F2 foram avaliados durante a safra 2006/07. Já para avaliar as respostas correlacionadas à seleção para densidade da semente foram delineados três experimentos distintos: Experimento Inicial, no qual foram avaliadas 520 progênies F7:6, durante a safra 2005/06; Experimento Densidade, em que foram avaliadas 100 progênies F8:6 selecionadas para densidade da semente; Experimento Alimentos, em que foram avaliadas 100 progênies F8:6 selecionadas para soja tipo alimento. Os dois últimos experimentos foram realizados durante a safra 2006/07, e as progênies avaliadas neles foram selecionadas dentre as 520 progênies F7:6 do Experimento Inicial. Os resultados permitiram chegar as seguintes conclusões: a) existe ampla variabilidade genética para densidade da semente; b) a herdabilidade no sentido amplo para este caráter é baixa quando estimada na geração F2, mas em geração avançada de endogamia atinge valor alto; c) a herança genética é aditiva e, assim, o caráter não manifesta heterose; d) existe correlação moderada e positiva da densidade da semente com a produtividade de grãos e o teor de proteína e, por outro lado, a correlação entre a densidade da semente e o teor de óleo é negativa; e) é possível identificar genótipos tipo alimento com médias altas de produtividade de grãos e teor de proteína; f) a seleção para aumentar a densidade da semente é eficiente no melhoramento simultâneo do teor de proteína e da produtividade de grãos, permitindo a obtenção de genótipos com alta produtividade de proteína; g) a seleção para reduzir a densidade da semente não promove aumentos significativos do teor de óleo. / The high socioeconomic importance of soybean is mainly attributed to its much favorable combination of high protein and oil contents, together with appropriate levels of seed yield. However, there is a high negative correlation between protein and oil contents, fact that difficult the simultaneous breeding of these traits. Besides, also there is tendency of negative and moderate correlation between protein content and seed yield. There are evidences that the selection for seed density can promote indirect responses in protein content and seed yield, simultaneously. The main objectives of this work were: a) to estimate genetic parameters related to inheritance of seed density; b) to evaluate the efficiency of selection for seed density in breeding protein content and seed yield. In the inheritance study, four different crosses were used: USP98-06.011.10 x Abura, M-SOY 8001 x Abura, USP98-06.027.03 x Biloxi e USP98-06.009.01 x PI 239.235. The parents and F2 plants were evaluated during the 2006/07 season. For evaluating the correlated responses to selection for seed density three different experiments were designed: the Initial Experiment, in which were evaluated 520 F7:6 progenies, during the 2005/06 season; the Seed Density Experiment, in that were evaluated 100 F8:6 progenies selected for seed density; and the Food Soybean Experiment, in that were evaluated 100 F8:6 progenies selected for food type soybean. The last two experiments were accomplished during the 2006/07 season, and the progenies were selected among the 520 F7:6 progenies of the Initial Experiment. The results allowed the following conclusions: a) there is genetic variability for seed density; b) the broad sense heritability for seed density is low in F2 and high in advanced generations; c) the genetic inheritance is additive, because this, there is no heterosis for seed density; d) there is moderate and positive correlation of seed density with seed yield and protein content, but the correlation between seed density and oil content is negative; e) is possible to identify food type genotypes with high means of seed yield and protein content; f) the selection to increase seed density is efficient in breeding protein content and seed yield simultaneously, obtaining genotypes with high protein yield; g) the selection to reduce seed density promote no significant increases of oil content.

O Eucalyptus é o gênero mais importante para a indústria brasileira de papel e celulose. Eucalyptus grandis Hill ex. Maiden e seus híbridos são preferencialmente usados pela indústria devido ao rápido crescimento e alta produtividade volumétrica. Embora possua características adequadas à utilização comercial, vários estresses abióticos e bióticos influenciam sua produção. O IPGRI (International Plant Genetic Resources Institute) destaca a Puccinia psidii como sendo a maior ameaça para a cultura nos tempos atuais. A doença não co-evoluiu com o hospedeiro e por essa razão, torna o patógeno um elemento potencial a vencer as barreiras impostas pelo hospedeiro. O fungo ataca plantas jovens, incluindo mudas em viveiros, plantas em jardins clonais e plantações comercias com até 2 anos de idade. Com o objetivo de identificar proteínas diferencialmente expressas e avaliar as mudanças ocorridas na composição química da parede celular das folhas, o presente trabalho analisou o impacto da presença do fungo sobre os clones comerciais, resistentes (7) e suscetíveis (24), de eucalipto. Os clones de E. grandis, 7 e 24, previamente inoculados com uredósporos de P. psidii, foram utilizados para extração de proteínas após 24 horas de interação com o fungo. As análises foram realizadas com auxílio de SDS-PAGE de primeira e segunda dimensão, em gradiente de pH na faixa de 4-7, utilizando-se 750 µg de proteínas. As imagens dos géis, em triplicata, analisadas pelo programa (Image Master Elite v. 3.01), possibilitaram a identificação de 466 spots. A comparação entre os perfis eletroforéticos dos clones que foram analisados e os controles não inoculados, mostrou que o processo de infecção do fungo nas plantas induziu o aparecimento de 72 spots exclusivos para o clone 7 além de alterações do volume de outros 115 spots. Já para o clone 24, a exposição ao fungo promoveu o aparecimento de 22 spots exclusivos e alterações de outros 98. Os perfis eletroforéticos dos clones controle, que não foram expostos ao fungo, mostraram diferenças genéticas entre os clones 7 e 24. O clone resistente, apresentou grande concentração de spots na região entre 14 a 45 kDa. Já para o clone suscetível, os spots se concentraram na região entre 25 a 97 kDa. A avaliação do conteúdo de carboidratos e ácidos urônicos da parede celular mostrou alterações no conteúdo dos açúcares no material inoculado com P. psidii, após 24 horas, 6 e 12 dias de inoculação. Os teores de glicose observados para os clones 7 e 24, já após 24 horas da inoculação, mostraram-se bastante alterados, indicando que esse açúcar possui papel chave no processo de formação da parede celular e conseqüentemente no mecanismo de defesa vegetal. / Eucalyptus is the most important genus for the Brazilian pulp and paper industry. Eucalyptus grandis Hill ex. Maiden and hybrids are preferentially used by the industry due to its rapid growth and high volumetric productivity. Although they possess characteristics adequate for commercial use, various biotic and abiotic stresses influence production. IPGRI (International Plant Genetic Resources Institute) highlight Puccinia psidii as the largest current threat to the culture. The disease did not co-evolve with the host and for this reason has become the pathogen with most potential to overcome the barriers imposed by the host. The fungus attacks young plants, including saplings in nursery, clonal gardens and commercial plants up to 2 years-old. With the objectives of identifying the proteins differentially expressed and evaluate the changes occurring in the chemical composition of the cell walls in the leaves, the present work analyzed the impact of the presence of the fungus on the commercial eucalyptus clones, resistant (7) and susceptible (24). The E. grandis clones (7 and 24) were inoculated with P. psidii urideospores and proteins extracted after 24 hours interaction with the fungus. The analyses were carried out using a pH gradient (4-7) in the first and SDS-PAGE in the second dimension, loading 750 µg onto the gel. The gel images, in triplicate, were analyzed using the software Image Master Elite v. 3.01, allowing the identification of 466 spots. The electrophoretic profiles for each clone were analyzed and compared to the uninoculated controls, showing that the fungal infection process induced the appearance of 72 exclusive spots in clone 7 and an alteration in the volume of another 115 spots. In clone 24, exposure to the fungus induced the appearance of 22 exclusive spots and altered another 98. The electrophoretic profiles of the control clone, not exposed to the fungus, demonstrated genetic differences between the 7 and 24. The resistant clone (7) presented a large concentration of spots around 14 to 45 kDa. In contrast, the susceptible clone (24) presented a concentration of spots around 25 to 97 kDa. Evaluation of the carbohydrate and uronic acid content of the cell wall showed an alteration in the sugar content in the material exposed to P. psidii after 24 hour, 6 and 12 days after inoculation. The glucose levels observed for clones 7 and 24 were considerable altered 24 hours after inoculation, indicating that this sugar has a key role in cell wall formation and consequently in the plant defense mechanism.

THI1 é provavelmente uma proteína bifuncional, uma vez que está envolvida na biossíntese de tiamina e na estabilidade do DNA organelar, notadamente o mitocondrial. Interessantemente, a biossíntese de tiamina ocorre em compartimentos distintos em plantas (cloroplastos) e em leveduras (mitocôndrias). Ensaios de complementação funcional mostraram que o gene thi1 de Arabidopsis thaliana é capaz de complementar uma cepa mutante de levedura para o gene ortólogo. A proteína THI1 de Arabidopsis thaliana é codificada por um único gene. Uma análise detalhada da região N-terminal da proteína, responsável pela sua localização na células, revelou a presença de duas sequências de direcionamento adjacentes. Na extremidade N-terminal encontra-se um peptídeo de trânsito cloroplástico seguida por uma região capaz de formar uma α-hélice anfifílica, tipicamente encontrada em pré-sequências de direcionamento mitocondriais. Com o objetivo de avaliar se a localização final de THI1 pode apresentar um tipo de regulação temporal ou espacial, foram obtidas plantas transgênicas expressando a proteína THI1 fundida a GFP ("green fluorescent protein"). Análises dessas plantas por meio de microscopia confocal revelaram que THI1 está presente majoritariamente em cloroplastos e raramente em mitocôndrias. Ao contrário do que acontece em Arabidopsis thaliana, em cana de açúcar foram encontrados pelo menos três isoformas/parálogos de thi1. O alinhamento da seqüência de aminoácidos dessas isoformas com a THI1 de Arabidopsis thaliana revelou alta similaridade, inclusive na seqüência de direcionamento. Com o intuito de avaliar o padrão de direcionamento dessas isoformas de cana de açúcar foram obtidas construções gênicas contendo ou a seqüência de direcionamento completa ou o peptídeo de trânsito cloroplástico ou a pré-seqüência mitocondrial, fundidas a GFP sob o comando do promotor 35S. A expressão transiente dessas construções em epiderme de cebola, revelou que no caso das construções contendo a seqüência de direcionamento completa ou o peptídeo de trânsito, o direcionamento ocorreu apenas para os cloroplastos. No caso das construções contendo somente a seqüência de direcionamento mitocondrial a GFP permaneceu difundida no citoplasma. Além do aspecto do direcionamento, THI1 foi avaliada sob o ponto de vista filogenético. As análises filogenéticas mostram que thi1 é raramente encontrado em bactérias mas é amplamente distribuído em Archaea. As distâncias genéticas indicam que provavelmente os eucariontes herdaram thi1 de Archaea. As poucas bactérias que possuem esse gene provavelmente obtiveram-no por meio de herança horizontal. / THI1 is probably a bifunctional protein, since it is involved in thiamin biosynthesis and organelar genome stability mainly the mitochondrial. Interestingly, the thiamin biosynthesis occurs at different compartments in plants (chloroplasts) and yeasts (mitochondria). Functional complementation assays showed that Arabidopsis thaliana thi1 gene is able to complement a yeast mutant strain for the hortolog gene. The Arabidopsis thaliana THI1 is encoded by a single copy gene. A detailed analysis of the THI1 N-terminal region, that is responsible for its targeting in cells, reveled the presence of two in tanden directing sequences. At N-terminal region there is a chloroplastic transit peptide followed by a region able to form an anfifilic α-helix frequently present in mitochondrial presequences. Aiming to evaluate if the THI1 final localization could present a temporal or spacial regulation, transgenic plants expressing THI1 fused to GFP ("green fluorescent protein") where obtained. Confocal microscopy analysis of these transgenic plants showed that THI1 is mainly found in chloroplasts and barely found in mitochondrias. Different from what happens in Arabidopsis thaliana, in sugar cane where founded at least three thi1 isoforms/paralogs. The amino acids sequence alignment of these isoforms with the thi1 one, reveled high similarity including the targeting sequence. To evaluate the directing standard of these sugarcane isoforms, gene constructions made by the complete targeting sequence or the chloroplastic transit peptide or the mitochondrial presequence, fused to GFP under the guidance of 35S promotor, where obtained. A transient expression of these gene constructios in epidermal onion cells prove that in the case of the constructions containing either the complete targeting sequence or the chloroplastic transit peptide the directing occurred only to chloroplasts. On the other hand, the constructions containing the mitochondrial pre sequence, GFP were kept defused in the citoplasm. Besides the directing aspect, THI1 were evaluated under the filogenetic point of view. Filogenetic analysis showed that thi1 is rarely found in bacteria but is widely distributed in Archaea. The genetic distances pointed out that probably eucaryotes THI1 came from Archaea. This gene in a few bacterias probably were inherited by lateral transference.

O elevado valor sócioeconômico da soja é atribuído, em grande parte, à combinação muito favorável de altos teores de proteína e óleo, juntamente com níveis adequados de produtividade de grãos. Porém, existe uma alta correlação negativa entre os teores de proteína e óleo, fato que dificulta o melhoramento simultâneo destes caracteres. Além disso, também existe tendência de correlação negativa e moderada entre o teor de proteína e a produtividade de grãos. Existem evidências de que a seleção para densidade da semente pode promover ganhos indiretos simultâneos no teor de proteína e na produtividade de grãos. Assim, os principais objetivos deste trabalho foram: a) estimar parâmetros genéticos relacionados com a herança da densidade da semente; b) avaliar a eficiência da seleção para densidade da semente no melhoramento do teor de proteína e da produtividade de grãos. Para o estudo de herança foram utilizados quatro cruzamentos diferentes: USP98-06.011.10 x Abura, MSOY 8001 x Abura, USP98-06.027.03 x Biloxi e USP98-06.009.01 x PI 239.235, sendo que os parentais e as plantas F2 foram avaliados durante a safra 2006/07. Já para avaliar as respostas correlacionadas à seleção para densidade da semente foram delineados três experimentos distintos: Experimento Inicial, no qual foram avaliadas 520 progênies F7:6, durante a safra 2005/06; Experimento Densidade, em que foram avaliadas 100 progênies F8:6 selecionadas para densidade da semente; Experimento Alimentos, em que foram avaliadas 100 progênies F8:6 selecionadas para soja tipo alimento. Os dois últimos experimentos foram realizados durante a safra 2006/07, e as progênies avaliadas neles foram selecionadas dentre as 520 progênies F7:6 do Experimento Inicial. Os resultados permitiram chegar as seguintes conclusões: a) existe ampla variabilidade genética para densidade da semente; b) a herdabilidade no sentido amplo para este caráter é baixa quando estimada na geração F2, mas em geração avançada de endogamia atinge valor alto; c) a herança genética é aditiva e, assim, o caráter não manifesta heterose; d) existe correlação moderada e positiva da densidade da semente com a produtividade de grãos e o teor de proteína e, por outro lado, a correlação entre a densidade da semente e o teor de óleo é negativa; e) é possível identificar genótipos tipo alimento com médias altas de produtividade de grãos e teor de proteína; f) a seleção para aumentar a densidade da semente é eficiente no melhoramento simultâneo do teor de proteína e da produtividade de grãos, permitindo a obtenção de genótipos com alta produtividade de proteína; g) a seleção para reduzir a densidade da semente não promove aumentos significativos do teor de óleo. / The high socioeconomic importance of soybean is mainly attributed to its much favorable combination of high protein and oil contents, together with appropriate levels of seed yield. However, there is a high negative correlation between protein and oil contents, fact that difficult the simultaneous breeding of these traits. Besides, also there is tendency of negative and moderate correlation between protein content and seed yield. There are evidences that the selection for seed density can promote indirect responses in protein content and seed yield, simultaneously. The main objectives of this work were: a) to estimate genetic parameters related to inheritance of seed density; b) to evaluate the efficiency of selection for seed density in breeding protein content and seed yield. In the inheritance study, four different crosses were used: USP98-06.011.10 x Abura, M-SOY 8001 x Abura, USP98-06.027.03 x Biloxi e USP98-06.009.01 x PI 239.235. The parents and F2 plants were evaluated during the 2006/07 season. For evaluating the correlated responses to selection for seed density three different experiments were designed: the Initial Experiment, in which were evaluated 520 F7:6 progenies, during the 2005/06 season; the Seed Density Experiment, in that were evaluated 100 F8:6 progenies selected for seed density; and the Food Soybean Experiment, in that were evaluated 100 F8:6 progenies selected for food type soybean. The last two experiments were accomplished during the 2006/07 season, and the progenies were selected among the 520 F7:6 progenies of the Initial Experiment. The results allowed the following conclusions: a) there is genetic variability for seed density; b) the broad sense heritability for seed density is low in F2 and high in advanced generations; c) the genetic inheritance is additive, because this, there is no heterosis for seed density; d) there is moderate and positive correlation of seed density with seed yield and protein content, but the correlation between seed density and oil content is negative; e) is possible to identify food type genotypes with high means of seed yield and protein content; f) the selection to increase seed density is efficient in breeding protein content and seed yield simultaneously, obtaining genotypes with high protein yield; g) the selection to reduce seed density promote no significant increases of oil content.

A existência de uma proteína mitocondrial desacopladora em plantas, PUMP, foi demonstrada em 1995. A PUMP, como a proteína desacopladora de mitocôndrias de tecido adiposo marrom, UCP1, e outras proteínas homólogas descobertas posteriormente, aumenta a condutividade de membrana a H+. Nucleotídeos de purina, PN, inibem a atividade das proteínas desacopladoras e o mecanismo de condução de H+ depende da presença de ácidos graxos livres, FFA. A atividade e a expressão da PUMP são estimuladas pela exposição ao frio e mudam durante o amadurecimento de frutos. A expressão do gene da PUMP de Arabidopsis thaliana em E. coli permite a obtenção de AtPUMP. Neste trabalho, analisando a funcionalidade da AtPUMP incorporada em proteolipossomos, demonstramos que esta proteína é funcional. A incorporação de proteínas desacopladoras em proteolipossomos fornece um sistema modelo que permite analisar as suas propriedades funcionais e mecanísticas. A condutância a H+ em proteolipossomos contendo PUMP isolada de batata foi claramente ativada por FFA. Contudo, a inibição por PN não se mostrou reprodutível. A AtPUMP, reconstituída em proteolipossomos, foi ativada por FFA com Km\'s aparentes de: 42 µM (ácido linoleico, LA), 55 µM (ácido láurico) e 70 µM (ácido palmítico), e inibida por PN com Ki\'s aparentes de: 0.8 mM (GDP), 0.85 mM (ATP), 0.98 mM (GTP) e 1.4 mM (ADP). O efluxo de H+ ativado por LA mediado por AtPUMP aumentou exponencialmente em função do potencial transmembrânico (Δψ). O coeficiente de partição (KP) entre a fase aquosa e proteolipossomos contendo AtPUMP para o LA de 64170, foi ~1,6 vezes superior que ao KP obtido para o LA em lipossomos. Em ensaios de ligação obtidos usando microcalorimetria de titulação isotérmica (ITC), determinou-se que a AtPUMP tem, provavelmente, dois sítios de ligação para o LA e que essa interação é exotérmica. Em ensaios de microcalorimetria com suspensão de mitocôndrias de batatas, determinou-se que há uma correlação linear entre o calor produzido e o oxigênio consumido (65,6 kcal/mol O2) quando a PUMP foi ativada por LA. Através dos resultados obtidos até então, concluo que a PUMP (AtPUMP) é um desacoplador mitocondrial presente em plantas. Os estudos apresentados aqui, de reconstituição em lipossomos, foram essenciais para a compreensão da regulação da atividade dessa proteína. Além disso, foram obtidas as primeiras medidas diretas de liberação de calor pela PUMP por microcalorimetria. / In 1995, a plant mitochondrial uncoupling protein, PUMP, was first described. PUMP, like the known uncoupling protein from brown adipose tissue, UCP1, increases the inner mitochondrial membrane permeability to H+. H+ transport is dependent on the presence of free fatty acids, FFA, and it is inhibited by purine nucleotides, PN. PUMP expression and activity are stimulated by cold exposure, which may vary during fruit ripening. By expressing a full length cDNA encoding the Arabidopsis UCP in E. coli, the recombinant AtPUMP was obtained. In this study, AtPUMP was incorporated in proteoliposomes and the functionality of the protein was demonstrated. The incorporation of uncoupling proteins in proteoliposomes constitutes a model that allows the functional and the mechanistic analysis of these proteins. The H+ conductance mediated by reconstituted potato PUMP was, undoubtedly, activated by FFA. However, the inhibition by PN was not reproducible. Reconstituted AtPUMP was activated by FFA and the apparent Km\'s were determined: 42 µM (linoleic acid, LA), 55 µM (lauric acid) and 70 µM (palmitic acid). Reconstituted AtPUMP was inhibited by PN, and the apparent Kis were determined: 0.8 mM (GDP), 0.85 mM (ATP), 0.98 mM (GTP) and 1.4 mM (ADP). AtPUMP mediated H+ efflux rate, activated by LA, was exponentially dependent on membrane potential (Δψ). The partition coefficient (KP) between the aqueous phase and the membrane phase was determined for LA. The KP was 1.6 times higher for AtPUMP proteoliposomes than for liposomes. Using Isothermal Titration Microcalorimetry (ITC), we verified that there is a linear correlation between the heat produced and oxygen depletion (65,2 kcal/mol O2) in a suspension of potato mitochondria, when PUMP was activated by LA. Using ITC we also determined that LA might bind to two different sites in AtPUMP. Based on the results obtained, we concluded that PUMP (or AtPUMP) is a plant mitochondrial uncoupler. The reconstitution assays permitted the study of FFA and PN regulation. In addition, our results represent the first direct confirmation that fatty acids regulate heat release in plant mitochondria, a process that may play a role in cold adaptation, fruit ripening and flower blossoming.

Os isolados protéicos de soja são utilizados como ingredientes em diversos alimentos e sua utilização vêm aumentando juntamente com o aumento das pesquisas sobre os metabólitos secundários da soja, as isoflavonas. Alguns efeitos benéficos vem sendo associados às isoflavonas, entre estes a sua ação antioxidante, a redução ao risco de câncer, doenças cardiovasculares e osteoporose. O objetivo deste estudo foi o de otimizar as condições de extração das isoflavonas e de suas formas conjugadas a partir da farinha desengordurada de soja, visando o preparo de isolado protéico de soja. Os resultados mostraram que a obtenção de isolados protéicos de soja com teor aumentado de isoflavonas depende da utilização de condições brandas de centrifugação para a separação do precipitado isoelétrico, assim como da utilização de água acidificada na sua lavagem. A presença de isoflavonas no isolado resulta de três fatores, o primeiro referindo-se à associação entre isoflavonas e proteínas através de interações hidrofóbicas, eletrostáticas, e pontes de hidrogênio; o segundo à menor solubilidade das isoflavonas presentes na farinha desengordurada de soja no pH isoelétrico; e o último ao processo de carreamento (físico) das isoflavonas pelas proteínas insolubilizadas. / Soy protein isolates are used as ingredients in several food products and their use is increasing together with the increase of the researches on the secondary metabolites of soy, the isoflavones. Some beneficial effects have been associated to the isoflavones, among these their antioxidant action, prevention of cancer, cardiovascular diseases and osteoporosis. The objective of this study was to optimize the extraction conditions of the isoflavones from the defatted soy flour, seeking the preparation of soy protein isolates. The results showed that the obtention of soy protein isolates with increased content of isoflavones depends on the use of mild conditions of centrifugation for the separation of the isoelectric precipitate, as well as on the use of water acidified in the washing step. The presence of isoflavones in the isolates resulted from three factors, the first refers to the association between isoflavones and proteins through hydrophobic; and electrostatic interactions, and hydrogen bonding; the second to the decreased solubility of the isoflavones extracted from the defatted soy flour in the isoelectric pH; and the last to the carrying process (physical) of isoflavones by the precipitating proteins.

A adubação equilibrada com nitrogênio, potássio e boro pode alterar a nutrição, produção e valor nutritivo das gramíneas forrageiras. Mediante as aplicações de combinações de doses de nitrogênio, potássio e boro objetivou-se avaliar os efeitos: a) nos aspectos morfológicos, na produção de massa seca e no estado nutricional da parte aérea; b) nas características morfológicas, produtivas e nutricionais das raízes e, c) nos componentes de parede celular e fracionamento de proteínas do capim-tanzânia. O experimento foi conduzido em casa de vegetação no período de janeiro a maio de 2010, utilizando quartzo moído como substrato. Cinco doses de nitrogênio (2, 10, 18, 26 e 34 mmol L-1) foram combinadas com cinco doses de potássio (0,2; 3,1; 6,0; 8,9 e 11,8 mmol L-1), que foram combinadas com cinco doses de boro (0; 45,45; 90,90; 136,35 e 181,80 mol L-1) em fatorial 53 fracionado, perfazendo 23 combinações de nitrogênio, potássio e boro, com quatro repetições. Realizaram-se três cortes das plantas de capim-tanzânia, nos seguintes períodos: 32 dias após o transplantio, 39 dias após o primeiro corte e 45 dias após o segundo corte. As doses de boro não interferiram nos aspectos produtivos e morfológicos da parte aérea e das raízes nem na composição de parede celular e frações proteicas. O boro somente influenciou a concentração de nitrogênio, potássio e boro da parte aérea. A interação doses de nitrogênio x doses de potássio foi significativa para as variáveis número de perfilhos, número de folhas, área foliar, valor SPAD e produção de massa seca da parte aérea. Com o pouco crescimento da planta ocorreu acumulação de nitrogênio, potássio e boro e diluição desses nutrientes nas folhas diagnósticas com a maior produção das plantas. A produção de massa seca das raízes, comprimento total e superfície total aumentaram com as combinações de doses de nitrogênio e potássio. As concentrações de nitrogênio, potássio e boro nas raízes foram influenciadas pela combinação das doses de nitrogênio com potássio. As concentrações de nitrato e amônio foram influenciadas positivamente pela combinação das doses de nitrogênio e potássio, tendo ocorrido maior concentração de amônio do que nitrato nas raízes. Com o aumento das doses de nitrogênio e potássio o comprimento específico e a superfície específica das raízes diminuíram. Os teores de FDN, FDA aumentaram e a relação FE+LM/CB diminuiu com as doses de potássio no segundo e terceiro cortes. O teor de PB no segundo corte aumentou com as doses de nitrogênio e diminuiu com as doses de potássio. As frações proteicas B1+B2 aumentaram e a fração B3 diminuiu no segundo e terceiro cortes com o aumento das doses de nitrogênio. A fração C para o terceiro corte diminuiu com as doses de nitrogênio. A combinação das doses de nitrogênio e potássio aumentou os teores da fração A para o terceiro corte. O suprimento de nitrogênio e potássio proporcionou aumento nos aspectos produtivos, morfológicos e nutricionais da parte aérea e das raízes, além de ter melhorado o valor nutritivo do capim-tanzânia. / The balanced fertilization with nitrogen, potassium and boron may change plant nutrition, yield and nutritive value of forage grass. Through the supply of combinations of nitrogen, potassium and boron it was aimed to evaluate the following effects on Tanzania guineagrass: a) plant morphology, dry matter production and nutritional status in the shoots; b) morphological, productive and nutritional aspects in the roots and c) cell wall components and protein fractions in the shoots. The experiment was conducted in a greenhouse from January to May 2010, using ground quartz as substrate. Five rates of nitrogen (2, 10, 18, 26 and 34 mmol L-1) were combined with five rates of potassium (0.2, 3.1, 6.0, 8.9 and 11.8 mmol L-1) and five rates of boron (0, 45.45, 90.90, 136.35 and 181.8 mol L-1) in 53 fractionated factorial design, which had 23 combinations of nitrogen, potassium and boron, with four replications. Three harvests of Tanzania guineagrass were made: 32 days after transplanting, 39 days after the first harvest and 45 days after the second harvest. Boron rates did not interfere with production and morphological aspects of shoots and roots and in cell wall composition and protein fractions. Boron only influenced the concentration of nitrogen, potassium and boron in the shoots. The interaction nitrogen rates x potassium rates was significant for the number of tillers, number of leaves, leaf area, SPAD value and shoots dry matter production. When plants had short growth, nitrogen, potassium and boron accumulated in plant tissues and those nutrients were diluted in plants with great growth. The dry mass of roots, total root length, total root area increased with the combination of nitrogen and potassium rates. The concentration of nitrogen, potassium and boron were influenced by the combinations of nitrogen and potassium rates. The concentrations of nitrate and ammonium were positively influenced by the combinations of nitrogen and potassium rates, and higher concentrations of ammonium than nitrate were found in root tissues. Root specific length and specific surface area decreased as rates of nitrogen and potassium increased. The NDF and ADF increased and EF+MB/SS ratio decreased with the potassium rates in the second and third harvests. The CP content of the second harvest increased with the nitrogen and decreased with potassium rates. Fractions B1+B2 increased and fraction B3 decreased for the second and third harvests with increasing nitrogen rates. The fraction C for the third harvest decreased with nitrogen rates. The combination of nitrogen and potassium increased the content of fraction A in the third harvest. Nitrogen and potassium supply provided to increase the productive changes, morphological and nutritional aspects in shoots and roots well as it improved the nutritive value of Tanzania guineagrass.

A adubação equilibrada com nitrogênio, potássio e boro pode alterar a nutrição, produção e valor nutritivo das gramíneas forrageiras. Mediante as aplicações de combinações de doses de nitrogênio, potássio e boro objetivou-se avaliar os efeitos: a) nos aspectos morfológicos, na produção de massa seca e no estado nutricional da parte aérea; b) nas características morfológicas, produtivas e nutricionais das raízes e, c) nos componentes de parede celular e fracionamento de proteínas do capim-tanzânia. O experimento foi conduzido em casa de vegetação no período de janeiro a maio de 2010, utilizando quartzo moído como substrato. Cinco doses de nitrogênio (2, 10, 18, 26 e 34 mmol L-1) foram combinadas com cinco doses de potássio (0,2; 3,1; 6,0; 8,9 e 11,8 mmol L-1), que foram combinadas com cinco doses de boro (0; 45,45; 90,90; 136,35 e 181,80 mol L-1) em fatorial 53 fracionado, perfazendo 23 combinações de nitrogênio, potássio e boro, com quatro repetições. Realizaram-se três cortes das plantas de capim-tanzânia, nos seguintes períodos: 32 dias após o transplantio, 39 dias após o primeiro corte e 45 dias após o segundo corte. As doses de boro não interferiram nos aspectos produtivos e morfológicos da parte aérea e das raízes nem na composição de parede celular e frações proteicas. O boro somente influenciou a concentração de nitrogênio, potássio e boro da parte aérea. A interação doses de nitrogênio x doses de potássio foi significativa para as variáveis número de perfilhos, número de folhas, área foliar, valor SPAD e produção de massa seca da parte aérea. Com o pouco crescimento da planta ocorreu acumulação de nitrogênio, potássio e boro e diluição desses nutrientes nas folhas diagnósticas com a maior produção das plantas. A produção de massa seca das raízes, comprimento total e superfície total aumentaram com as combinações de doses de nitrogênio e potássio. As concentrações de nitrogênio, potássio e boro nas raízes foram influenciadas pela combinação das doses de nitrogênio com potássio. As concentrações de nitrato e amônio foram influenciadas positivamente pela combinação das doses de nitrogênio e potássio, tendo ocorrido maior concentração de amônio do que nitrato nas raízes. Com o aumento das doses de nitrogênio e potássio o comprimento específico e a superfície específica das raízes diminuíram. Os teores de FDN, FDA aumentaram e a relação FE+LM/CB diminuiu com as doses de potássio no segundo e terceiro cortes. O teor de PB no segundo corte aumentou com as doses de nitrogênio e diminuiu com as doses de potássio. As frações proteicas B1+B2 aumentaram e a fração B3 diminuiu no segundo e terceiro cortes com o aumento das doses de nitrogênio. A fração C para o terceiro corte diminuiu com as doses de nitrogênio. A combinação das doses de nitrogênio e potássio aumentou os teores da fração A para o terceiro corte. O suprimento de nitrogênio e potássio proporcionou aumento nos aspectos produtivos, morfológicos e nutricionais da parte aérea e das raízes, além de ter melhorado o valor nutritivo do capim-tanzânia. / The balanced fertilization with nitrogen, potassium and boron may change plant nutrition, yield and nutritive value of forage grass. Through the supply of combinations of nitrogen, potassium and boron it was aimed to evaluate the following effects on Tanzania guineagrass: a) plant morphology, dry matter production and nutritional status in the shoots; b) morphological, productive and nutritional aspects in the roots and c) cell wall components and protein fractions in the shoots. The experiment was conducted in a greenhouse from January to May 2010, using ground quartz as substrate. Five rates of nitrogen (2, 10, 18, 26 and 34 mmol L-1) were combined with five rates of potassium (0.2, 3.1, 6.0, 8.9 and 11.8 mmol L-1) and five rates of boron (0, 45.45, 90.90, 136.35 and 181.8 mol L-1) in 53 fractionated factorial design, which had 23 combinations of nitrogen, potassium and boron, with four replications. Three harvests of Tanzania guineagrass were made: 32 days after transplanting, 39 days after the first harvest and 45 days after the second harvest. Boron rates did not interfere with production and morphological aspects of shoots and roots and in cell wall composition and protein fractions. Boron only influenced the concentration of nitrogen, potassium and boron in the shoots. The interaction nitrogen rates x potassium rates was significant for the number of tillers, number of leaves, leaf area, SPAD value and shoots dry matter production. When plants had short growth, nitrogen, potassium and boron accumulated in plant tissues and those nutrients were diluted in plants with great growth. The dry mass of roots, total root length, total root area increased with the combination of nitrogen and potassium rates. The concentration of nitrogen, potassium and boron were influenced by the combinations of nitrogen and potassium rates. The concentrations of nitrate and ammonium were positively influenced by the combinations of nitrogen and potassium rates, and higher concentrations of ammonium than nitrate were found in root tissues. Root specific length and specific surface area decreased as rates of nitrogen and potassium increased. The NDF and ADF increased and EF+MB/SS ratio decreased with the potassium rates in the second and third harvests. The CP content of the second harvest increased with the nitrogen and decreased with potassium rates. Fractions B1+B2 increased and fraction B3 decreased for the second and third harvests with increasing nitrogen rates. The fraction C for the third harvest decreased with nitrogen rates. The combination of nitrogen and potassium increased the content of fraction A in the third harvest. Nitrogen and potassium supply provided to increase the productive changes, morphological and nutritional aspects in shoots and roots well as it improved the nutritive value of Tanzania guineagrass.