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Este trabajo de tesis pretende profundizar el conocimiento de las vacuolas asociadas a la senescencia (VAS) a través de tres temáticas: - el desarrollo, entendido como la variación temporal de las VAS, su biogénesis y el efecto de moduladores de la senescencia; - la caracterización de la actividad biológica de las VAS participando en el desmantelamiento del aparato fotosintético; - y la relación entre el mecanismo de autofagia y el desarrollo de las VAS. En general, para abordar estos objetos de estudios se empleó un sistema sencillo y frecuentemente empleado en trabajos sobre senescencia foliar. El modelo de senescencia inducida permite trabajar en un sistema relativamente homogéneo y reproducible. Consiste en separar las hojas de la planta, tratarlas con un precursor de la hormona etileno, denominado etefón, y almacenarlas en oscuridad. De esta manera, la senescencia es inducida por el corte y la oscuridad, y sincronizada a nivel tisular por el tratamiento hormonal.

Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas Recombinantes y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las proteínas son los polímeros más complejos sintetizados en la naturaleza, estas deben plegarse y adoptar complicadas estructuras tridimensionales para cumplir su función. Más aún, algunas proteínas requieren enhebrar su cadena principal formando un nudo para llegar a su estructura final. Entender como estos nudos (o topologías anudadas) afectan las propiedades y función de las proteínas ha sido un tema de gran interés en biofísica. Así como una cuerda obtiene una nueva función o comportamiento con un nudo, las proteínas anudadas podrían tener propiedades únicas, muy distintas a su contraparte desanudada. Simulaciones moleculares realizadas con polímeros con similar grado de compactación de las proteínas, indican que si el plegamiento de una proteína fuera un proceso al azar la probabilidad de que estas formen un nudo puede llegar a ser de un 90%. Sin embargo sólo un 0,5% de las estructuras de proteínas conocidas poseen un nudo. En consecuencia, se ha propuesto que las proteínas con topologías anudadas han sido seleccionadas negativamente durante la evolución. La presente tesis tiene como objetivo dilucidar si las topologías anudadas en proteínas dificultan procesos biológicos asociados a la translocación de proteínas. Los procesos de translocación de proteínas son fundamentales para la viabilidad celular, ya que permiten la correcta localización celular de proteínas así como también su degradación selectiva. Experimentos in silico muestran que los nudos podrían obstruir el paso de las proteínas que los contienen obstruyendo su translocación a través de canales o poros estrechos. Para poner a prueba esta hipótesis se utilizó la proteasa ATP dependiente ClpXP de Escherichia coli como un modelo para ensayar la translocación y degradación de proteínas anudadas tipo 31. Esta proteasa se encarga de degradar selectivamente sustratos proteicos, desplegándolos mecánicamente para luego translocarlos a través de su estrecho poro central. Si las topologías anudadas dificultan estos procesos se podría explicar su baja representación en la naturaleza. Se encontró que la proteína anudada MJ0366, de Methanocaldococcus jannaschii, se degrada fácilmente por ClpXP cuando su degradación comienza desde su extremo C-terminal. Sin embargo, cuando se agregó la proteína fluorescente verde (GFP), que normalmente es degradada por ClpXP, al extremo libre de MJ0366 (extremo N-terminal), la proteasa es incapaz de degradar este sustrato multidominio liberando un producto parcialmente degradado. El peso molecular de este producto corresponde a GFP más 48 aminoácidos, este tamaño sugiere que el nudo de MJ0366 se aprieta contra el dominio plegado de GFP, protegiéndola de la degradación. No obstante, cuando se incrementa la distancia entre GFP y MJ0366, mediante la inserción de un polipéptido desplegado, la protección de GFP disminuye dramáticamente. Estos resultados indican la existencia de dos posibles vías para la degradación de sustratos anudados multidominio: i) el nudo se desliza y aprieta contra GFP deteniendo la degradación, o ii) el nudo es translocado por ClpXP cuando este se aprieta antes de llegar GFP. En este último caso ClpXP puede degradación de todo el sustrato. Para estudiar en mayor detalle el mecanismo de degradación de los sustratos multidominio anudados, se realizaron ensayos de degradación in singulo en pinzas ópticas de alta resolución. Esta metodología permitió estudiar los eventos de desplegamiento y translocación separadamente. Resultados preliminares, muestran que el nudo no afecta la estabilidad mecánica de MJ0366, sino que afecta la eficiencia de translocación de MJ0366 y la capacidad de ClpXP para desplegar GFP. Estos resultados son la primera evidencia experimental de que las topologías anudadas pueden detener procesos asociados a la translocación y describen por primera vez, in vitro, la dinámica del movimiento de un nudo en una cadena polipeptídica / Proteins are the most complex polymers synthesized by the nature, they have to fold and adopt intricate three-dimensional structures to fulfill its functions. Even more, some proteins need to thread its main chain and form a knot to achieve its native state. How these knots (or knotted topologies) affect the properties and functions of proteins is a subject of great interest in biophysics. In the same way that a knot can give new functions or behaviors to a rope, knotted proteins could have unique properties, very different from unknotted ones. Molecular simulations have shown that randomly compacted protein polymers have a high probability to form knots. However, only 0.5% of the protein structures in the protein data bank present a knot in their structures, in consequence it has been proposed that knotted topologies have been negatively selected by evolution. The aim of this thesis is to determine if knotted topologies in proteins hinder biological processes associated with protein translocation. Translocation of proteins is a fundamental process for cell viability; it allows the correct localization of proteins in the cell and the control of protein levels through degradation. Molecular dynamics have shown that knots in proteins can obstruct narrow pores during translocation, but there is no experimental evidence yet. To test this hypothesis, we used the ClpXP ATP dependent protease of Escherichia coli to study the translocation of knotted proteins. To degrade its protein substrates, ClpXP needs to mechanically unfold them and translocate their polypeptide chain through its narrow pore. If knotted topologies can obstruct protein degradation, it could explain why there are so few knotted proteins. It was found that ClpXP easily degrade a knotted protein of Methanocaldococcus jannaschii, MJ0366, when a degradation tag is added to its C-Terminal end. However, when the green fluorescent protein (GFP), a normally degradable domain, is added to the N-Terminal end of MJ0366, ClpXP is unable to degrade this multidomain substrate releasing a partially degraded product with an intact GFP domain. The molecular weight of this partially degraded product suggests that the knot tightens against the folded domain of GFP, protecting it from degradation. However, when the distance between MJ0366 and GFP increased, by the insertion of an unfolded polypeptide, the degree of protection of GFP decrease dramatically. This results indicates two possible outcomes for multidomain knotted substrate degradation: i) the knot can slide and tighten against GFP, thus stopping degradation, or ii) the knot is translocated through ClpXP pore when the knot tightening occurs before reaching GFP, leading to complete substrate degradation. To study the mechanism of degradation of the knotted multidomain substrates in detail, in singulo degradation assays where performed in high resolution optical tweezers. This approach allowed the characterization of the impact of the knotted topologies in the unfolding and translocation steps. Preliminary results show that the knot does not affect the mechanically stability of MJ0366, but can generate pauses during translocation and even stalls ClpXP for minutes when trying to unfold GFP. These results are the first experimental evidence of knotted topologies impairing a biological process associated with translocation and describe, in vitro, the dynamic of knot movement on a polypeptide chain / Fondecyt 1151274; CONICYT

Las proteasas aspárticas típicas de plantas (o tipo pepsina) han sido escasamente estudiadas en comparación con sus contrapartes de origen no vegetal. Una excepción a esta afirmación, lo constituyen las cardosinas (Cynara cardunculus) usadas en la manufactura de quesos y la fitepsina (Hordeum vulgare), que al día de hoy continúa siendo una de las pocas proteasas de esta clase caracterizada estructuralmente y por tanto, el modelo utilizado en esta área. Una de las principales razones por las cuales las PAs de plantas no han sido objeto de mayor cantidad de estudios es su escasa abundancia natural. Ésto resulta especialmente cierto en el caso de sus precursores, los cuales contienen el llamativo dominio PSI (inserto específico de plantas), único entre las PAs. En un intento por identificar nuevas fuentes vegetales de PAs típicas, extractos de flores de varias especies pertenecientes a la familia Asteraceae que crecen en Argentina fueron probados en ensayos de coagulación de leche. Una de las especies que mostró esta capacidad coagulante sugiriendo por tanto la presencia de PAs, fue Cirsium vulgare -comúnmente conocido como cardo negro y considerada una maleza en los campos de nuestra región. Fundamentalmente debido a su amplia disponibilidad y a la ausencia de estudios reportados sobre sus PAs, se decidió emplear esta especie de la familia Asteraceae como material vegetal. En este contexto, el presente trabajo intenta generar un aporte al conocimiento de las PAs de origen vegetal mediante el estudio de procirsina, una proenzima de C. vulgare perteneciente a la familia A1, y del dominio PSI contenido en su secuencia.

Es propósito del presente trabajo aportar al conocimiento en relación a los posibles usos medicinales de especies de bromeliáceas autóctonas de nuestro país no estudiadas aún para dichos fines. Bajo la suposición de que las proteasas de Bromelia hieronymi, B balansae y Pseudananas macrodontes, por pertenecer al mismo tipo catalítico y a la misma subfamilia vegetal, podrían mostrar actividades biológicas similares a las proteasas de Ananas comosus, nos planteamos como objetivo general de la presente tesis la búsqueda de posibles efectos farmacológicos de extractos ricos en cisteínendopeptidasas obtenidos de frutos de Bromelia hieronymi, B. balansae y Pseudananas macrodontes y su comparación con bromelina. Y como objetivos específicos: - Evaluar el efecto antiinflamatorio de los extractos de B. hieronymi, B. balansae y P. macrodontes. - Evaluar los efectos de los extractos de B. hieronymi, B. balansae y P. macrodontes sobre algunos de los componentes de la hemostasia. - Evaluar los extractos de B. hieronymi, B. balansae y P. macrodontes como posibles agentes antitumorales. - Tratar de establecer la posible relación entre los efectos medidos y la actividad proteolítica de las cisteínendopeptidasas estudiadas.