Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas Recombinantes y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / La topología de una proteína, definida como el camino tridimensional que sigue la cadena polipeptídica en el espacio, impone restricciones naturales al conjunto de movimientos que esta puede realizar para alcanzar su estado nativo. Por esta razón esta propiedad define el mecanismo de plegamiento de una proteína. Sin embargo, en los últimos años se han descrito proteínas que obligan a la cadena polipeptídica a buscar su camino de plegamiento a través de intrincados y complejos movimientos, es el caso de las proteínas anudadas. Estas proteínas suponen un desafío para las teorías de plegamiento actuales y han abierto nuevas interrogantes respecto al mecanismo de plegamiento de las proteínas. La primera proteína anudada fue identificada en el año 2000, desde entonces se han descrito muchas otras llegando a representar del 2% del Protein data bank (PDB). Esta baja abundancia relativa de proteínas anudadas contrasta con lo observado en simulaciones de modelos de polímeros que indican que la probabilidad de formar este tipo de estructuras es alta. Esto hace pensar que las proteínas evitan la formación de nudos. No obstante no se conoce la tendencia natural de una proteína a anudarse. Otra interrogante que nace del estudio de proteínas anudadas tiene relación con la función que cumplen estas estructuras en las proteínas que las presentan y cómo estas proteínas logran plegarse. Se ha demostrado que algunos motivos anudados se conservan en distintas familias y superfamilias a pesar de su baja identidad de secuencia. Esta evidencia sugiere que dichos motivos podrían aportar alguna ventaja comparativa a las proteínas que los presentan. En este aspecto, estudios teóricos y evidencias experimentales indican que la topología anudada podría aumentar la estabilidad de las proteínas. Sin embargo, ninguno de dichos estudios explica cómo la topología anudada confiere estabilidad. En este trabajo tratamos de determinar las consecuencias que tiene sobre el mecanismo de plegamiento de una proteína el obligar a su cadena polipeptídica a anudarse. Para ello se comparó el proceso de plegamiento de una proteína anuda con la de su contraparte no-anudada. Experimentalmente esto sugiere dos desafíos importantes: primero, es necesario que la formación del nudo no altere significativamente la estructura de la proteína. Segundo, es indispensable poder controlar la topología del estado desplegado para asegurar la homogeneidad de los estados termodinámicos estudiados. El primer desafío fue abordado utilizando como modelo de estudio la proteína mARC de la superfamilia de factores de transcripción RHH. Esta es una versión monomérica del represor ARC del fago p22 generada al unir el extremo carboxilo de una subunidad con el extremo amino de la siguiente utilizando un péptido conector de 15 aminoácidos rico en glicina. Modelos por homología de mARC muestran que el péptido conector puede formar un lazo flexible que no genera contactos con el centro hidrofóbico de la proteína. De esta manera, dependiendo de la posición de dicho lazo se pueden generar dos conformaciones de mARC, una conformación anudada y otra no-anudada. El segundo desafío experimental fue abordado caracterizando el mecanismo de plegamiento de mARC utilizando pinzas ópticas. Esta aproximación permite estirar la proteína desde sus extremos y aplicar una fuerza sobre ella, de esta forma se puede controlar la topología del estado desplegado y con ello poder comparar la diferencia de energía libre entre el estado desplegado anudado y no-anudado de mARC. Por otra parte, mediante un rearreglo de los elementos de estructura secundaria de mARC puede generarse una permutante no circular de ella, pARC. Esta proteína presenta la misma arquitectura y estabilidad al equilibrio que mARC pero su topología le impide formar nudos. Así, esta permutante fue utilizada como control del efecto topológico del anudamiento de mARC. Los resultados obtenidos al estirar mARC a velocidad constante permitieron identificar dos tipos de moléculas con largos de contorno (L0 largo de una molécula completamente estirada) diferentes. Un grupo de moléculas presentó un L0 de 37 ± 7 nm, que coincide con lo esperado para la conformación anudada de mARC. El otro grupo mostró un L0 de 43 ± 7 nm, esperado para la conformación no-anudada de esta proteína. Al contrario, pARC sólo mostró un tipo de moléculas con un L0 de 22 ± 7 nm. De estos resultados se concluye que mARC está presente en dos conformaciones, una anudada y otra no anudada. De los experimentos de estiramiento a velocidad constante se obtuvo el trabajo irreversible, realizado fuera del equilibrio, asociado a las transiciones de desplegamiento y replegamiento de mARC y pARC. Utilizando el teorema de Crooks fue posible calcular, a partir de estos datos, el ΔG en condición de equilibrio para el desplegamiento de las conformaciones anudada (ΔG1= 21,8 ± 0,4 kcal/mol) y no-anudada (ΔG2= 12,3 ± 0,5 kcal/mol) de mARC así como también de pARC (ΔG3= 7 ± 0,4 kcal/mol). Estos resultados indican que mARC anudado es más estable que mARC no-anudado por 8,9 ± 0,9 kcal/mol, este valor corresponde al costo energético de anudar una cadena polipeptídica de 120 residuos en su estado desplegado. Esta es la primera vez que es posible determinar experimentalmente este valor. Además, esta diferencia de energía explica, cómo es que la topología anudada confiere estabilidad en esta proteína. Para caracterizar cinéticamente las proteínas se realizaron experimentos a fuerza constante. Sólo fue posible estudiar dos moléculas de mARC las cuales, a pesar de las diferencias que muestran en sus parámetros cinéticos calculados, corresponden a la conformación no-anudada de la proteína. No fue posible realizar estudios cinéticos con pARC / The topology of a protein, defined as the tridimensional path of the polypeptide chain in space, restricts the moves that the chain can perform for searching its native state. For this reason this property defines the folding mechanism of a protein. However, in recent years has been discovered some proteins that seek their native states through complex and intricate movements. Such is the case of knotted proteins which topology challenge current theories of protein folding and have opened new questions about protein folding mechanisms. The first knotted structure was identified in 2000, since then many others have been discovered reaching the 2% of the structures in the Protein data bank (PDB). The low relative abundance of the knotted structures contrast with simulation of polymer models showing that knotted structures are easy to exist in those systems. This suggests that proteins somehow have avoided knotted topologies. Another interesting thing to investigate about knotted proteins is the function that may have the knotted topology on this proteins and how that structures may fold. It has been determined that some knotted motifs are conserved in families and superfamilies despite of the low sequence identity. These results suggest that knotted motifs could provide some comparative advantage with respect to normal proteins. In this regard some theoretical and experimental evidence show that knotted topologies could enhance the stability of proteins. Nevertheless, none of these studies explain how this topologies does it. In this work we seek to elucidate the energetic consequence that brings the knotting of a polypeptide chain to its folding mechanism. For this, we compare the folding process of a knotted protein with their unknotted counterpart. In terms of experimental approach this problem impose two challenges, the first one is that the knot formation should don’t disturb the structure of the protein. The second one is that we must control de topology of the unfolded state in order to ensure the homogeneity of the thermodynamic species under experimentation. The first challenge was archived using the mARC protein from the RHH superfamily of transcription factors. This protein is a monomeric version of the ARC repressor from the p22 phage and it was constructed connecting the C terminus of the first subunit to the N terminus of the next one using a 15 residue glycine-rich polypeptide linker. Structural models mARC shows that the linker forms a flexible loop that doesn’t form contacts with hydrophobic core of the protein. Moreover, homology models indicate that the loop can move around the protein generating two conformations: a knotted and an unknotted one. The second challenge was addressed by characterizing the folding mechanism of mARC using optical tweezers. This approximation allows us to pull the protein from its C and N-terminal ends to control the topology of the unfolded state and thus to compare the energy differences between the knotted unfolded state and the unknotted unfolded state of mARC. In the other hand, by a rearrangement of the secondary structure of mARC it is possible to generate a non-cyclic permutant, pARC. This protein is reported to have the same architecture and folding stability of mARC but, its topology prevents knotting. So, pARC was used as a topological control of the effect of knotting the mARC protein. We found that mARC can be captured in two conformations characterized by different contour length (L0, total extension of a polymer chain). One group of molecules has a L0 of 43 ± 7 nm and corresponds to the expected for the unknotted conformation of mARC. The other group of molecules shows a L0 of 37 ± 7 nm and corresponds to the expected for the knotted conformation. On the contrary pARC only shows one type of molecules characterized by a L0 of 22 ± 7 nm. All together these results support the hypothesis that mARC is present in two conformations, one knotted and other unknotted. Moreover, applying Crook’s theorem to the irreversible work associated to the unfolding and refolding transitions of mARC and pARC allowed to determine the free energy (ΔG) at equilibrium required to the unfold the knotted (ΔG1= 21,8 ± 0,4 kcal/mol), unknotted (ΔG2= 12,3 ± 0,5 kcal/mol) conformations of mARC and pARC (ΔG3= 7 ± 0,4 kcal/mol). These results indicate that knotted mARC is more stable than their unknotted counterpart by 8,9 ± 0,9 kcal/mol mainly due to the energetic cost to tie the unfolded state of the protein. This value corresponds to the energetic cost of knotting a polypeptide chain of 120 residues in its unfolded state and explains the source of the stabilizing effect of the knotted topology in mARC. For the kinetic characterization we performed constant force experiments. It was only possible to study two molecules of mARC. Despite of the differences between the kinetic parameters calculated for them, both corresponds to the unknotted conformation of the protein / Fondecyt

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No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Diorginis José Soares Ferreira.pdf: 7430851 bytes, checksum: b0071e6c1a08fccd23f19cd285907b7d (MD5) Previous issue date: 2017-07-25 / CAPES / Extensivos estudos vêm mostrando a influência de estímulos ambientais durante as fases críticas de desenvolvimento do sistema nervoso central no surgimento/progressão de doenças na vida adulta, incluindo as cardiovasculares. Uma das hipóteses está relacionada a modificação de padrões moleculares e celulares na tentativa de preparar o indivíduo ao ambiente que será exposto posteriormente (resposta adaptativa preditiva). Nesse contexto, nosso laboratório tem voltado seus esforços em entender como a restrição proteica materna modula o equilíbrio oxidativo da prole em diferentes fases da vida. No sistema nervoso central, o tronco encefálico tem se destacado devido sua importância na regulação do controle central cardiovascular, onde o estresse oxidativo está intimamente relacionado à hipertensão neurogênica através da desregulação da resposta autonômica. O estresse oxidativo é um estado celular caracterizado pelo desequilíbrio entre produção e remoção de elementos oxidantes (espécies reativas), sendo a mitocôndria uma das principais fontes produtoras dessas espécies reativas. Diante disso, o presente estudo foi desenvolvido para avaliar os efeitos da restrição proteica nos períodos críticos do desenvolvimento (gestação e lactação) sobre a função mitocondrial e o equilíbrio oxidativo do tronco encefálico de forma imediata e tardia. Ratas gestantes da linhagem Wistar foram alimentadas ad libitum com dieta normoproteica (NP; caseína 17%) ou hipoproteica (LP; caseína 8%) durante toda gestação e lactação. Ao desmame e aos 128 dias depois, os filhotes machos foram eutanaziados e o tronco encefálico rapidamente removido para as análises da bioenergética mitocondrial, produção de espécies reativas, potencial elétrico de membrana mitocondrial (ΔΨm), biomarcadores de estresse oxidativo e defesa antioxidante. Ao desmame, a restrição proteica materna induziu uma disfunção na bioenergética mitocondrial. Animais que sofreram o insulto nutricional apresentaram menor capacidade de consumo de oxigênio e produção de ATP. A esses, associam-se a menor oferta de cofatores reduzidos à cadeia transportadora de elétrons e a diminuição do ΔΨm. Quanto ao equilíbrio oxidativo, a restrição proteica desencadeou um aumento na produção de espécies reativas e redução na capacidade antioxidante não enzimática e estado redox, fato que culminou na oxidação apenas de proteínas. Aos 150 dias, os animais que sofreram a restrição proteica materna ainda apresentavam disfunção na bioenergética mitocondrial. Entretanto, a menor capacidade fosforilativa não fora associada a menor oferta de cofatores reduzidos, mas ao desacoplamento mitocondrial desencadeado pela proteína desacopladora 2 (UCP2), o que gradualmente reduz o ΔΨm e compromete a conservação de energia. A produção de espécies reativas mitocondriais manteve-se aumentada e, agora, somada ao aumento na produção de oxido nítrico e redução da dismutação do superóxido desencadearem grande oxidação a lipídeos. Em resumo, nossos resultados indicam que a disfunção mitocondrial se inicia imediatamente após o insulto nutricional e pode comprometer gradualmente a condução de prótons, conservação de energia, integridade de lipídios e levar à disfunção no tronco encefálico durante o envelhecimento. / Several studies have been demonstrating the relationship between enviromental stimulus during critical development periods of central nervous system on the rise and progression of diseases later in life, including the cardiovascular. One of the hypotheses is related to molecular and cellular changes in the attempt to prepare the organism to the following enviroment (predictive adaptive response). In this context, ou laboratory has focused on understand how the maternal protein restriction modulates the offspring oxidative balace in different life periods. In the central nervous system, the brainstem has standed out due its role in the regulation of the central cardiovascular control, wherein the oxidative stress is close related to the autonomic dysregulation-induced neurogenic hypertension. The oxidative stress is a cellular condition characterized by the imbalance between production and removal of oxidant elements (reactive species), being the mitochondria one of the major producers of those species. Thereby, the current study was performed to evaluate the immediate and extended effects of the protein restriction during critical development periods (gestation and lactation) upon the immediate and late consequences in the mitochondrial bioenergetics and the oxidative balance in the brainstem. Pregnant Wistar rats were fed ad libitum with normoprotein (NP; 17% protein-casein) or low-protein (LP; 8% protein-casein) diet throughout pregnancy and lactation periods. At weaning and 128 days later, the male offsprings were euthanized and the brainstem was quickly removed to assess the mitochondria bioenergetics, reactive species (RS) production, mitochondrial electric membrane potential (ΔΨm), oxidative stress biomarkers and antioxidant defense. At weaning, maternal protein restriction induced a mitochondrial dysfunction. Animals that suffered the nutritional insult presented lower oxygen consumption capacity and ATP production. These results were associated to the reduction in the reduced cofactors supply to electrical transporter chain and to the ΔΨm reduction. Regarding oxidative balance, the protein restriction triggered an increase in the reactive species production and a decrease in the non-enzymatic antioxidant capacity and redox status, which together, culminated in the oxidative damage only to protein. At 150 days of life, the animals that suffered the maternal protein restriction still showed a dysfunction in the mitochondrial bioenergetics. At this age, the lower phosphorylation capacity was not associated to the reduced cofactors supply, but for the mitochondrial uncoupling by uncoupling protein 2 (UCP2) which gradually reduces the ΔΨm and compromises the energy conservation. The mitochondrial reactive species production was keept augmented, which added to the increase in the nitric oxide production and to the superoxide dismutation reduction triggered a cogent lipid oxidation. In summary, our results indicate that the mitochondrial dysfunction begins immediatly after nutritional insult and may gradually compromise the proton conduction, energy conservation, lipid integrity, leading to brainstem dysfunction during ageing.

Orientador: Luiz Edivaldo Pezzato / Resumo: O zebrafish, teleósteo de água doce, apresenta características biológicas e genéticas favoráveis para pesquisas biológicas, entretanto, faltam informações sobre sua exigência nutricional. Neste sentido este trabalho objetivou determinar sua exigência proteica. Utilizou-se 900 juvenis com 25,2±1,98 mg e 12,95 ± 1,91 mm, distribuídos em 30 aquários de 15 L de volume (30 peixes/aquário) num delineamento inteiramente casualizado com cinco tratamentos e seis repetições. As dietas semipurificadas foram formuladas para conter 27,6; 33,2; 38,2; 43,8 e 49,2% de proteína bruta (PB). Após 62 dias, constatou-se que o teor de 27.6% PB foi mais efetivo (p<0.01) para a taxa de eficiência proteica. Entretanto, não houve diferença entre tratamentos para peso, comprimento, taxa de eficiência alimentar e de crescimento especifico, consumo de ração e sobrevivência. Em relação a utilização dos nutrientes e composição corporal, a dieta contendo 38,2% de PB proporcionou melhores respostas (p<0.01) para retenção e taxa de retenção de nitrogênio, retenção de energia e quantidade de energia corporal. Pode-se concluir que, dieta contendo 27.6% PB foi adequada para obtenção da melhor taxa de eficiência proteica e desempenho zootécnico e 38,2% PB para utilização dos nutrientes e energia pelo zebrafish. / Abstract: The zebrafish, teleost freshwater, shows biological and genetic characteristics tha are propitious for biological research . However, there is a lack of information about their nutritional requirements, considering this the purpose of this study is to determine its protein requirement. Were used 900 fingerlings with 25,2±1,98 mg distributed into 30 fish tanks of 15 liters of capacity (30 fishes/fish tank) in a completely randomized with five treatment and six repetitions. The Semipurified diets were formulated to include 27.6; 33.2; 38.2; 43.8; 49,2% of crude protein (CP). After 62 days, it was found that the percentage of 27.6% CP were more efective (p<0.01) to protein efficiency ratio. Although there was no difference between treatments for weight, length, feed efficiency rate and specific growth, feed intake and survival. In relation the use of nutrients and body composition, diet containing 38.2% crude protein provided better responses (p<0,01) for retention and nitrogen retention rate, energy retention and amount of body energy. We can be concluded that a diet containing 27.6% CP was adequate to obtain the best protein efficiency ratio and growth performance and 38.2% CP for use of nutrients and energy for the zebrafish. / Mestre

A proteína colibistina (CB), uma Rho GEF neuro-especifica, apresenta papel importante na formação e funcionamento das sinapses inibitórias do sistema nervoso central por interagir com a proteína scaffold gefirina e com receptores GABAA e promover o agrupamento e transporte dessas proteínas para a membrana pós-sináptica. Recentemente, nosso grupo de pesquisa identificou interação de CB com um complexo proteico que controla o início da tradução em eucariotos (complexo eIF3), o que sugeriu pela primeira vez que essa proteína pode estar envolvida também na regulação da tradução em células neurais. Ainda, já havia sido descrito que gefirina, parceira funcional de CB, interage com mTOR, uma quinase que desempenha papel fundamental no controle do início da tradução. Contudo, até o momento não havia estudos adicionais investigando o papel de CB neste cenário. Assim sendo, o presente trabalho teve como objetivo investigar o envolvimento da proteína CB no controle do início da síntese proteica mediada pela via de sinalização mTORC1. Foram utilizados dois modelos experimentais: i) um sistema de expressão heteróloga - superexpressão de CB em células HEK293T, e ii) um modelo endógeno de expressão - células neuroprogenitoras derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iNPCs) provenientes de indivíduos controles e de um paciente com deleção no gene da CB. Por meio de experimentos de coimunoprecipação nós verificamos que CB interage fisicamente com mTOR nos dois modelos experimentais utilizados. Ainda, nossos resultados mostraram que CB parece modular a atividade da via mTORC1, e nas iNPCs derivadas do paciente a ausência de CB leva a um aumento na ativação desta via de sinalização. Em concordância com esses resultados, nós observamos aumento em neo-síntese proteica nas iNPCs provenientes do paciente, o que pode ser um mecanismo patofisiológico contribuindo para as alterações cognitivas e comportamentais observadas no paciente. Embora estudos adicionais sejam necessários para melhor entender os mecanismos moleculares deste controle de início de tradução mediado por CB, nós sugerimos um modelo no qual CB, por interagir fisicamente com mTOR e eIF3, sequestra estas proteínas e impede que mTOR ative seus alvos e desencadeie a formação do complexo de inicio de tradução. Em conclusão, nossos resultados oferecem novas evidências do envolvimento de CB no controle da síntese proteica / Collybistin (CB), a neural specific RhoGEF, plays key roles in inhibitory synapse formation and function that cluster and localize the scaffold protein gephyrin and GABAA receptors to the neural postsynaptic membrane. We have recently reported that CB interacts with a protein complex that controls translation initiation in eukaryotic cells (eIF3 complex), which suggested for the first time that this protein may also act as regulator of protein synthesis in neural cells. Moreover, it has been previously described that gephyrin, the CB functional partner, interacts with mTOR, a kinase that plays a pivotal role in the control of translation initiation. However, until now there were no further studies investigating the role of CB in this scenario. The purpose of this study was to investigate if CB is involved in the control of translational initiation mediated by the mTORC1 signaling pathway. Two experimental models were used: i) a heterologous expression system - overexpression of CB in HEK293T cells, and ii) an endogenous expression model - neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells (iNPCs) from control individuals and a patient with a deletion of the entire CB gene. We performed coimmunoprecipitation experiments and verified that CB physically interacts with mTOR both in 293T cells and in control iNPCs. In addition, our results show that CB appears to modulate the activity of mTORC1 pathway, and the absence of CB leads to increased mTORC1 signaling activation in patient\' iNPCs. In agreement with these results, we observed increased de novo cap-dependent translation in patient cells, which could be a pathophysiological mechanism contributing to cognitive and behavioral abnormalities observed in the patient. Although further studies are needed to better understand the molecular details of CB-mediated translational control, we suggest a model whereby CB, by physically interacting with mTOR and eIF3, sequesters these proteins, thereby preventing both the ability of mTOR to activate its targets and the formation of the translational initiation complex. In conclusion, our results offer new insights into the role of CB in protein synthesis control

Orientador: Maeli Dal Pai / Resumo: A restrição nutricional durante os períodos de gestação e lactação, pode provocar adaptações fisiológicas no feto (programação fetal), estando relacionada com riscos de doenças cardiovasculares e metabólicas, além de alterações musculares nos adultos. O comprometimento muscular pode trazer consequências futuras na vida do indivíduo, dada a sua relevância na geração de força e locomoção, bem como na longevidade e qualidade de vida em idosos, fase em que ocorre aperda de massa muscular (sarcopenia). O objetivo deste trabalho foi analisar aspectos celulares e moleculares, através de técnicas morfológicas e moleculares, dos músculos Sóleo (SOL) e Extensor Longo dos Dedos (EDL) de ratos jovens e senis (21 e 540 dias) provenientes de mães alimentadas com uma dieta de baixo conteúdo protéico (6%) durante a gestação e lactação. Foram utilizados Ratos Sprague Dawley aos 21 e 540 dias, provenientes de dois grupos de genitoras submetidas a diferentes dietas (hipoproteica: 6% e padrão: 17% de proteína) durante toda a gestação e lactação. Amostras dos músculos SOL e EDL foram coletadas para as análises morfológica, imunofluoerescência e moleculares. Nossos resultados demonstraram que os animais do grupos restritos apresentaram menor peso em ambos os períodos comparado aos animais dos grupos controles. O músculo SOL apresentou diminuição da área de secção transversal (AST) das fibras musculares aos 21 e 540 dias, enquanto o músculo EDL apresentou diminuição da AST apenas aos 21 dias; nenhu... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nutritional restriction during gestation and lactation can cause physiological adaptations in the fetus (fetal programming), being related to risks of cardiovascular and metabolic diseases, as well as muscular changes in adults. Muscle impairment may cause future consequences in the individual's life, given the relevance of this tissue in the generation of strength and locomotion, as well as, the longevity and quality of life in the elderly where muscle loss occurs (sarcopenia). The objective of this work is to analyze cellular and molecular aspects of SOL and EDL muscles of young and senile rats (21 days and 540 days) from mothers fed with a diet of low protein content (6%) during gestation and lactation. Sprague-Dawley rats were used at 21 and 540 days from two groups of mothers submitted to different diets (hypoproteic: 6% and standard: 17% protein) throughout gestation and lactation. Samples of SOL and EDL muscles were collected for morphological, immunofluorescence and molecular analyzes. Our results showed that the animals in the restricted groups had lower weight in both periods compared to the animals of the control groups. The SOL muscle showed a decrease in the cross-sectional area (CSA) of the muscle fibers at 21 and 540 days, whereas the EDL muscle presented a decrease of CSA only at 21 days; no change in the frequency of muscle fiber types was observed in the muscles and in the periods analyzed. At 21 days no differences were observed in the gene expression of th... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

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Orientador: Raquel Fantin Domeniconi / Resumo: O ambiente desempenha papel crucial durante o desenvolvimento fetal, podendo influenciar diretamente a saúde da prole. Assim, o estado nutricional materno é essencial para a saúde e bem-estar do feto. Há relatos de alterações em parâmetros relacionados à função epididimária, em animais adultos, cujas mães sofreram restrição de proteína durante as fases de gestação e lactação. A origem das alterações funcionais no epidídimo pode estar relacionada à fatores hormonais, bem como na expressão de seus receptores, e por meio da modulação de moléculas de sinalização como FGFs (Fator de crescimento de Fibroblastos), vias da ERK e Wnt, e à funcionalidade da Src, ou seja, proteínas relacionadas aos processos do desenvolvimento epididimário. No entanto, não há informações que esclareçam as causas dessas alterações ou como a restrição proteica atua ao longo do desenvolvimento pré e pós-natal do epididímo. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar o impacto da restrição proteica materna, no ducto mesonéfrico e no epidídimo nas fases iniciais do desenvolvimento. Assim, ratas Wistar prenhes foram divididas em dois grupos experimentais que receberam uma dieta de normoproteica (NP; 17% de proteína; n=19) ou hipoproteica (HP; 6% de proteína; n=19) durante a gestação e a lactação. Cinco ratas prenhes de cada grupo foram eutanasiadas para coleta dos ductos mesonéfricos dos embriões no dia gestacional (DG)17,5 e as demais permaneceram até os dias pós-natais (DPN) 7 ou 14. Os filhotes mach... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The environment plays a crucial role during fetal development and can directly influence the health of the offspring. Thus, maternal nutritional status is essential for fetus' health and well-being. There have been reports of alterations in parameters related to epididymal function in adult animals whose mothers suffered protein restriction during the gestation and lactation. The origin of the functional alterations in the epididymis can be related to the hormonal factors, as well as in the expression of its receptors, and on signaling molecules modulation like FGFs (Fibroblast Growth Factor), ERK and Wnt pathways, and functionality of Src, or proteins related to epididymal development. However, there is no information to clarify the causes of these changes or how protein restriction acts throughout pre and postnatal development. The aim of this study was to evaluate the impact of maternal protein restriction on the mesonephric duct and in the early stages of epididymal development. Pregnant female Wistar rats were divided into two groups that received either normoprotein (17%; NP) or low-protein (6%; LP) diet ad libitum during gestation and lactation. Five pregnant rats from each group were euthanized to collect the mesonephric ducts on gestational day (DG) 17.5 and the others rats remained until the postnatal days (PND) 7 or PND14. The male offspring had their biometric parameters verified and were euthanized. Blood was collected for sex hormones analysis and genital organs... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Flávio Dutra de Resende / Resumo: O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito da suplementação de extrato de taninos (ET) e a inclusão de diferentes níveis de ureia na alimentação de bovinos Nelores na fase de crescimento durante o período da seca. A área de pastejo era formada por forrageira Urochloa brizantha cv. Marandu (PB = 5,9% e FDN = 74,8%). Os suplementos proteico energéticos eram ofertados, diariamente, na quantidade de 3 g/kg PC (PB = 26%). O arranjo dos tratamentos foi em fatorial 2 × 2: Fator 1 - baixa (3%) e alta (5%) de inclusão de ureia; Fator 2 - inclusão ou não de ET (0,7 g/kg MS de suplemento; SilvaFeed ByPro®). No primeiro experimento (n = 8, 293 kg ± 5,6 duplo quadrado latino), foi observada tendência de aumento da digestibilidade da PB com a inclusão de ET (P = 0,06). A alta ureia no suplemento promoveu uma tendência de aumento da ureia sérica nas primeiras horas após a suplementação (P = 0,08). Além disso, o tratamento com ureia interagiu com o tempo para N-NH3 no rúmen (P < 0,01), sendo maior às 6 horas pós-suplementação para alta ureia. O ET aumentou a riqueza e reduziu a diversidade bacteriana. A análise de componentes principais indicou que a variação da microbiota ocorreu principalmente em função das diferentes inclusões de ureia nos suplementos. No segundo experimento, [n = 64, 294 kg ± 15,2, delineamento em blocos casualizados, blocagem por peso corporal (PC)], verificou-se que o desempenho não foi influenciado pelos tratamentos (P ≥ 0,21). Em conclusão, o desempenho e os parâme... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to evaluate the effect of tannins extracts (ET) supplementation and different levels of urea inclusion in Nellore cattle feed in the growing phase during the dry season. The grazing area was constituted by Urochloa brizantha cv. Marandu (CP = 5.9% and NDF = 74.8%). The energy protein supplements were offered daily in the amount of 3 g/kg BW (CP = 26%). The treatment arrangement was in factorial 2 × 2: Factor 1 - low (3%) and high (5%) inclusion of urea; Factor 2 – With or without inclusion of ET (0.7 g / kg MS of supplement, SilvaFeed ByPro®). In the first experiment (n = 8, 293 kg ± 5.6 double latin square), a trend of increased digestibility of PB was observed with the inclusion of ET (P = 0.06). High supplemental urea promoted a tendency for serum urea to increase in the first hours after supplementation (P = 0.08). In addition, treatment with urea interacted with time for N-NH3 in the rumen (P <0.01), being greater at 6 hours post-supplementation for high urea. ET increased richness and reduced bacterial diversity. Principal component analysis indicated that microbiota variation occurred mainly due to the different urea inclusions in the supplements. In the second experiment, [n = 64, 294 kg ± 15.2, randomized block design, blocking by body weight (PC)], it was found that performance was not influenced by treatments (P ≥ 0.21). In conclusion, performance and digestive parameters were not affected by higher urea inclusion in the dry period and ET ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

El sistema de producción de carne de vacuno en España es muy específico. Es un sistema totalmente desligado de la tierra, con animales sacrificados jóvenes y alimentados durante todo el engorde a base de piensos concentrados ricos en cereales, produciendo la característica carne rosada. En los últimos años, ha cobrado interés la inclusión de leguminosas grano en estas dietas, con el problema de que estos suplementos están relativamente poco caracterizados en estas condiciones alimentarias, ya que la degradabilidad de suplementos proteicos puede reducirse en dietas concentradas. Por otra parte, la cebada y el maíz son los cereales más utilizados y aunque tienen diferentes velocidades de degradación ruminal del almidón, se han realizado pocos esfuerzos para sincronizar su degradación con fuentes proteicas de similares características y así maximizar la eficiencia de la fermentación ruminal. En el marco de la falta de información sobre la fermentación ruminal de terneros jóvenes alimentados con dietas concentradas nos planteamos los siguientes objetivos:a) Caracterizar la fermentación ruminal y la degradabilidad de la proteína de suplementos vegetales durante todo el engorde.b) Estudiar los efectos de la sincronización de la degradabilidad ruminal del almidón de la cebada y el maíz con dos fuentes proteicas, sobre la fermentación ruminal y sobre los parámetros productivos y el comportamiento de ingestión. En el primer experimento con un diseño de medidas repetidas estudiamos como evolucionaba la fermentación ruminal y la degradación de la proteína de 4 suplementos vegetales (dos leguminosas y dos subproductos de la extracción de aceite) en 6 terneras en crecimiento entre los 80 y los 250 kg alimentadas con dietas concentradas con distinta proporción de fibra. Una dieta contenía un 12% de paja de cebada y la otra un 30% de alfalfa deshidratada, y ambas eran isoenergéticas e isoproteicas. Observamos que aunque en ambas dietas la actividad celulolítica, estimada a través de la degradación ruminal de la FND de una muestra de heno de alfalfa incubada in situ, era muy baja, fue ligeramente superior en la dieta que tenía mayor proporción de forraje. La dieta con un 30% de alfalfa deshidratada también presentó mayor degradabilidad ruminal de las dos leguminosas grano (guisante y altramuz) incubadas in situ. Con la edad aumentó la ingestión total de carbohidratos no fibrosos y la fermentación se volvió más amilolítica y proteolítica, aumentando la concentración de AGV totales, la proporción de propionato y la degradabilidad efectiva de la proteína de los suplementos incubados, a excepción de la harina de soja. Estas mismas dietas se administraron en el segundo experimento a 4 terneras de 300 kg de peso vivo, asignadas a un diseño de cross-over para estudiar el efecto del nivel de fibra de la dieta sobre la fermentación ruminal y la degradación proteica de 7 suplementos proteicos de origen vegetal en la última fase de engorde. El perfil de fermentación ruminal no se vio afectado por el nivel de fibra de la dieta, siendo un perfil básicamente amilolítico. La degradación de la FND del heno de alfalfa también fue muy baja (25,5%) y la degradación de las leguminosas grano fue más baja que los valores aportados por los sistemas de referencia, siendo los valores obtenidos más adecuados para estas condiciones de producción. Los valores de degradación de la harina de soja y la harina de girasol fueron similares a los aportados por las tablas de referencia, sin verse afectados por el nivel de fibra de la dieta. Para el estudio de la sincronización de la degradabilidad ruminal entre fuentes de energía y de proteína, combinamos la cebada y el maíz con dos fuentes proteicas, harina de soja y harina de girasol, que demostraron tener diferente velocidad de degradación ruminal en los experimentos 1 y 2. De estas combinaciones resultó una dieta sincronizada para una fermentación rápida (cebada-girasol); una dieta sincronizada para una fermentación lenta (maíz-soja) y dos dietas desincronizadas con un componente de fermentación rápida y uno de fermentación lenta (cebada-soja y maíz-girasol). Las 4 dietas eran isoproteicas e isoenergéticas y con una relación forraje:concentrado cercana a 10:90. In vitro, con el sistema de fermentadores de doble flujo continuo observamos una potenciación de la fermentación ruminal por efecto de la sincronización, sin que se viera afectada por el pH ruminal que se mantuvo constante a 6,2 o fluctuante, 12 h a 5,8 y 12 h a 6,4, simulando una acidosis crónica, frecuente en este tipo de dietas. In vivo, estas dietas fueron asignadas a 4 terneras de 132 kg en un diseño de cuadrado latino 4 x 4, sin observar ningún efecto de la sincronización sobre la fermentación ruminal ni sobre la digestibilidad de todo el tracto. El tipo de carbohidrato afectó a la ingestión, siendo mayor en los tratamientos que contenían maíz. Los animales que recibían la dieta sincronizada para una fermentación rápida (cebada-girasol) redujeron su ingestión y rumiaron durante más tiempo el forraje sin que sufrieran problemas de acidosis ruminal. / Beef production in Spain is very specific. The production system is completely detached from the land and calves are fed high concentrate diets based on cereals from weaning to slaughtering at a young age, producing a tender and pink meat. The use of legume seeds in these high concentrate diets is increasing, although these protein supplements are poorly characterized in these feeding conditions and protein degradation can be reduced in such diets. Moreover, barley and corn are the main cereal grains used in high concentrate beef cattle diets. These cereals differ in their starch content and in their fermentation rate and extent of rumen degradation, but few efforts have been made to synchronize their degradation with protein supplements of similar degradation characteristics and maximize the efficiency of ruminal fermentation. Due to the lack of information about ruminal fermentation in young beef cattle fed high concentrate diets, the following objectives were proposed:a) To characterize ruminal fermentation and estimate ruminal nitrogen degradability of plant protein supplements during the fattening period. b) To study the effects of synchrony of ruminal degradability of corn and barley starch with protein sources of different rates and extents of degradation, on ruminal fermentation, animal performance and feeding behavior. In the first experiment, six Holstein heifers growing from 80 to 250 kg were used in a repeated measures trial to study the changes in ruminal fermentation and protein degradation of four plant protein supplements (two legume seeds and two by products from the oil industry). Heifers were fed two isoenergetic and isonitrogenous high concentrate diets with different fiber content. One diet contained 12% barley straw and the other 30% dehydrated alfalfa as forage source. Cellulolytic activity, estimated as NDF degradation of alfalfa hay incubated in situ, was very low in both diets, but it was slightly higher in the diet with 30% dehydrated alfalfa. In situ nitrogen degradability of legume seeds (peas and lupin seeds) was also higher in the diet with a higher proportion of forage. With age, gross nonstructural carbohydrate intake increased and ruminal fermentation became more amilolytic and proteolitic, increasing total VFA concentration, propionate proportion and nitrogen effective degradability of protein supplements, except for soybean meal. These two diets were assigned in the second experiment to four 300-kg growing heifers in a cross-over design to study the effect of dietary fiber level on ruminal fermentation and in situ nitrogen degradability of seven protein supplements (5 legume seeds) at the end of the fattening period. The ruminal fermentation pattern was basically amilolytic in both diets, and was not affected by dietary fiber content. Neutral detergent fiber degradation of alfalfa hay was also very low (25.5%) and values of effective degradation on legume seeds were lower than values reported by reference feeding systems, the values obtained in the present experiment being more adequate for beef cattle fed high concentrate diets. Effective degradation of soybean meal and sunflower meal were similar to values reported by feeding systems and not affected by NDF content of diets.To study the effects of synchrony of rumen degradability between energy and protein sources, barley and corn and two protein sources, soybean meal, SBM, and sunflower meal, SFM, differing in their rate and extent of rumen degradation were combined. This resulted in a synchronized rapid fermentation diet (barley-SFM), a synchronized slow fermentation diet (corn-SBM) and two unsynchronized diets with a rapidly and slowly fermenting component (barley-SBM and corn-SFM). All diets were isoenergetic and isonitrogenous with a forage to concentrate ratio close to 10:90. In vitro, with a dual flow continuous culture system, ruminal fermentation was enhanced in synchronized diets (Barley-SFM and corn-SBM). No effect of ruminal pH, which was held constant at 6.2 or fluctuant 12 h at 5.8 and 12 h at 6.4, simulating subclinical acidosis frequently associated with these diets, was observed. In vivo, these diets were fed to four 132-kg heifers assigned to a 4 x 4 Latin square design, but synchronization had no effect on ruminal fermentation or on apparent total tract digestibility. The type of carbohydrate affected intake, being higher for corn than barley based diets. Heifers fed the rapid synchronized diet (barley-SFM) reduced intake and increased time spent chewing per unit of forage intake, avoiding problems of ruminal acidosis.

Se ha estudiado el valor nutricional del contenido proteico de la hoja de coca (Erythroxylum coca Lamarck var. Coca). Para lograr éste objetivo se aislaron por precipitación a pH 5.1 y 4.0 dos fracciones proteicas de un extracto alcalino de ésta hoja preparado con una solución de “tocra” (sustancia alcalina utilizada con la coca en el hábito de su masticación).Después de una purificación parcial con solventes de extracción (éter dietílico ,acetona ,alcohol 96°) de la mezcla de ambas fracciones proteicas, se prepararon dos dietas Experimentales con diferentes niveles de proteína (FP COCA 4.5% y FP COCA 9.0%). De igual modo se prepararon dos dietas Controles a base de caseína (CAS 4.5% y CAS 9.0%). Estas dietas fueron administradas ad libitum por 10 días, a grupos de ratas (n=6-9) en desarrollo. Al término de éste periodo los animales fueron sacrificados ,determinándose los valores de los índices PER, las actividades de arginasa hepática y los pesos de los órganos y de sus contenidos proteicos. Los resultados mostraron que los índices PER fueron menores y las actividades de la arginasa hepática mayores en los animales de los grupos FP COCA ,que en los animales alimentados con caseína. En grupos mejor alimentados , FP COCA 9.0% y CAS 9.0% estos valores fueron PER:1.4 ; arginasa 63.6±14.6 μmoles de ornitina/mg de proteína hepática y PER: 3.8 ; arginasa 51.4±9.6 μmoles de ornitina /mg de proteína hepática respectivamente. Los pesos de los órganos fueron igualmente menores en los grupos FP COCA pero sus contenidos proteicos fueron semejantes al de los grupos controles. Estos hallazgos sugieren que la proteína de la coca, cuando es dada en un valor del 9.0% tiene un valor importante el cual puede ser mejorado si se lograse suplementar con otras proteínas. Así mismo los resultados sugieren que se debe obtener fracciones proteicas de mayor pureza para determinar con mayor exactitud su calidad. / NUTRITIONAL VALUE OF THE PROTEIN OF COCA LEAF(Erythroxylum coca)The study was designed to search the biological value of the protein contents in the coca leaf (Erythroxylum coca) .To aproach this two protein fractions were isolated from an alkaline coca leaves extract prepared with “tocra” (alkaline substance used with coca for chewing) by precipitating them at two different pH(5.1 and 4.0).After partial purification by extracting solvents (diethyl ether ,acetone and ethanol 96 °) of the mixture of both fractions two Experimental diets with different protein levels (FP COCA 4.5% and FP COCA 9.0%) were prepared. Likewise two casein Control diets (CAS 4.5% and CAS 9.0%) were made. All diets were fed ad libitum for 10 days to groups (n=6-9) of growing rats. Ending this period protein efficiency ratio (PER) liver arginase activity , tissue weights and its protein contents were determined. Results show minor PER index values but major arginase activities in both Experimental groups than in Control groups .In FP COCA 9.0% group , PER 1.4;arginase 63.6 ±14.6 μmoles of ornitina/mg liver protein and in CAS 9.0% group, PER 3.8 ; arginase 51.4 ±9.6 μmoles of ornitina/mg liver protein. Tissue weights were also diminished but its protein contents were similar .These findings suggest that protein of coca leaf given at 9% has some important biological value wich could be improved by supplementation with other proteins. Moreover ,these results prompt also to us to obtein a more purified coca leaf protein for improving its utilization.