Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A exposição materna durante o período gestacional a uma dieta restrita em proteínas (LP) prejudica o desenvolvimento do pâncreas endócrino em sua prole e aumenta a susceptibilidade à hipertensão, diabetes e obesidade na vida adulta. Há evidências de que esse fenômeno pode persistir em gerações subsequentes. Objetivou-se avaliar o efeito da restrição proteica sobre o metabolismo da glicose e morfometria pancreática na prole F3 de camundongos ao nascimento e ao desmame. Para tanto, fêmeas virgens de camundongos Suíços (F0) foram acasaladas e receberam dieta normo-proteica (19% de proteína - NP) ou uma dieta isocalórica restrita em proteínas (5% de proteína - LP) durante toda a gravidez. Durante a lactação e o restante do experimento, todos os grupos receberam a dieta NP. Os filhotes machos foram nomeados F1 (NP1 e LP1). As fêmeas F1 e F2 foram acasaladas para produzir F2 e F3 (NP2, LP2, NP3 e LP3), respectivamente. Semanalmente, os filhotes foram pesados e calculada a taxa de crescimento alométrico (log [massa corporal] = log a + log b [idade]). Os animais foram sacrificados nos dias 1 e 21 de idade, a glicemia foi determinada e o pâncreas retirado, pesado e analisado por estereologia e imunofluorescência; a insulina foi mensurada aos 21 dias. Como resultados, os filhotes restritos na primeira geração (LP1) foram menores ao nascer, mas apresentaram um crescimento acelerado nos primeiros sete dias de vida, mostrando catch-up com os controles; a prole LP2 demonstrou a maior massa corporal ao nascimento e tiveram uma taxa de crescimento mais lenta durante a lactação; não houve diferença na massa corporal e na taxa de crescimento na geração F3. A massa de pâncreas foi diminuída em LP1-LP3 ao nascimento, contudo foi aumentada em LP2 ao desmame. A densidade de volume e o diâmetro das ilhotas foram menores em todos os grupos restritos no dia 1 e 21, somente LP1 teve o menor número de ilhotas. Ao nascer, a massa de células beta foi menor em LP1-LP3 e permaneceu baixa durante a lactação. No dia 1 e 21, os filhotes foram normoglicêmicos, entretanto foram hipoinsulinêmicos ao desmame. Portanto, a restrição de proteínas em camundongos durante a gestação produz alterações morfológicas nas ilhotas pancreáticas, sugerindo que a homeostase da glicose foi mantida por um aumento da sensibilidade à insulina durante os primeiros estágios de vida na prole ao longo de três gerações consecutivas. / Exposure of pregnant mice to a low-protein (LP) diet impairs endocrine pancreas development in their offspring and increases susceptibility to hypertension, diabetes and obesity in adulthood. There is evidence that this phenomenon may persist in subsequent generations. We sought to evaluate the effect of protein restriction on glucose metabolism and pancreatic morphometry in the F3 offspring of mice at birth and weaning. Virgin female Swiss mice (F0) were mated and received normal protein diet (19% protein - NP) or an isocaloric low protein diet (5% protein - LP) throughout pregnancy. Lactation and the rest of the experimental groups received NP diet. The male pups were named F1 (NP1 and LP1). F1 and F2 females were mated to produce F2 and F3 (NP2, LP2, NP3 and LP3). Weekly, pups were weighted and calculated the growth rate by allometry (log [body mass] = log a + b log [age]). The mice were sacrificed on days 1 and 21 of age, blood glucose was measured and the pancreas removed, weighed and analyzed by stereology and immunofluorescence, insulin was measured at 21 days. LP pups in the first generation (LP1) were smaller at birth, but had an accelerated growth and within 7 days catch-up growth with controls; LP2 offspring had higher body mass at birth and had a slower growth rate within 21 days; but there was no difference in body mass and growth rate in the F3 generation. The pancreatic mass decreased in LP1 through LP3 at birth but increased in LP2 at weaning. The islet volume density and diameter were smaller in all restricted groups at day 1 and 21, and LP1 had the lowest islet number; at birth, beta cell mass was smaller in LP1 through LP3 and remained low throughout suckling. At day 1 and 21, pups were normoglycemic, but were hypoinsulinemic at weaning. Thus, protein restriction in mice during pregnancy produces morphologic changes in pancreatic islets, suggesting that glucose homeostasis is maintained by an increased sensitivity to insulin during the early stages of life in offspring over three consecutive generations.

Orientadores: Patricia Aline Boer, Jose Antonio Rocha Gontijo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T02:51:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mesquita_FlaviaFernandes_D.pdf: 7289105 bytes, checksum: 59a407e77182fcf42a71858f95503a9b (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O desenvolvimento renal é finamente orquestrado por diversos fatores e pequenas modificações neste mecanismo podem resultar no fenótipo de menor número de glomérulos, até agenesia renal. A programação fetal por restrição proteica gestacional está relacionada com a hipertensão arterial manifestada no indivíduo adulto submetido à dieta hipoproteica durante a fase uterina. Estudos descrevem que a "hipertensão programada" pode estar relacionada ao menor número de nefro (30%) encontrado nestes indivíduos. Dados obtidos em animais também confirmam a relação entre dieta materna e número de nefro em animais adultos. Esta tese tem por objetivo determinar desde qual ponto do desenvolvimento a organogênese renal pode ser influenciada pela restrição proteica gestacional, bem como determinar quais adaptações renais, morfológicas e funcionais, o animal sofre em sua vida adulta, relacionadas ao perfil hipertensivo. Ratos Wistar fêmea foram submetidas a dieta hipoproteica durante a gestação, e a prole de machos foi estudada nos experimentos seguintes: A cultura de metanefro mostrou que na idade gestacional de 14.25 dias, o metanefro do embrião desnutrido proteicamente já está "programado" a se ramificar menos do que o controle, gerando menor número de pontos de formação de nefros. A quantificação de glomérulos em embriões de 17.5 dias foi compatível com o resultado do estudo "in vitro". Estudo utilizando PCR em tempo real para avaliar o sistema renina-angiotensina durante a nefrogênese revelou que este sistema não está alterado enquanto intra-utero, no entanto, a expressão de mRNA de renina, angiotensinogênio e receptores de angiotensina II após o nascimento é excessiva quando comparado ao animal controle. Experimentos em animais adultos que sofreram restrição proteica intra-utero revelaram que os receptores de angiotensina II estão regulados negativamente nos rins, comparados aos animais controle. Os animais "programados" nasceram com baixo peso e também apresentaram pressão arterial elevada a partir da 12a semana de vida. A análise da função renal mostrou que a filtração glomerular não está alterada, mesmo com menor número de nefros apresentado neste modelo, sugerindo uma hiperfiltração decorrente da hipertrofia glomerular e podocitária, confirmadas por microscopia eletrônica. Além disso, a fração de excreção de sódio proximal é menor nos animais desnutridos, podendo ser dependente da ação da angiotensina II no transportador Na/K ATPase na membrana basal do túbulo proximal cuja expressão é elevada. O presente estudo demonstrou que a restrição proteica gestacional durante as primeiras semanas de gestação é suficiente para determinar a redução na nefrogênese, levando os rins a adaptações envolvidas no estabelecimento e/ou manutenção da hipertensão arterial / Abstract: The kidney development is a complex mechanism orchestrated by different factors and any alterations at this stage can change the phenotype from a low nephron number to renal agenesis. The maternal protein restriction is related with adult hypertension after low protein diet in utero. Many studies have been demonstrated that "programmed hypertension" can be linked with the low nephron number found in these adults. Animal studies have been found equal relation between maternal diet and nephron number at adult age. Our objective is to determine from each point of development the renal organogenesis can suffer gestational protein restriction influence. Also we look for understand which morphological and functional renal adaptations rats present on adult age, and if these alteration are linked with hypertension. The metanephroi culture shows that at gestational age 14.25, the metanephros from undernourished embryo is already programmed to branch less than control animal, leading to low number of nephron formation sites. The stererological study showed the same result that the "in vitro" study, showing less glomeruli at 17.5 gestational days. RT-PCR for renin-angiotensin system shows that this system is not altered in kidneys from programmed group during intra-uterine life, however renin, angiotensinogen and angiotensin II receptors mRNA expression are up-regulated after birth when compared with control animals. Adult animals from low protein diet in utero showed that angiotensin II receptors are down-regulated in kidneys, when compared with animals that received normal food in utero. These animals also have an up-regulated expression of angiotensin II receptors in adrenals. The "programmed" animals had low birth weight and high arterial pressure from 12th week-age. The renal function study showed that glomerular filtration is not altered, even with low nephron number, what suggests a hyperfiltration, that may be linked with glomerular and podocitary hypertrophy. Indeed, proximal sodium excretion fraction is lower in low birth weight animals, suggesting an angiotensin II action at the basal membrane Na/K ATPase. By western blot, we found that Na/K ATPase protein is up-regulated on kidneys from low protein diet animals. This study demonstrated that early gestational protein restriction is enough to determine the impaired nephrogenesis, leading to renal adaptations to support the establishment of arterial hypertension / Doutorado / Medicina Experimental / Doutor em Fisiopatologia Medica

O epitélio gástrico de ratos passa por modificações morfofisiológicas importantes durante o primeiro mês de vida pós-natal e a dieta é um dos principais fatores que influenciam esse desenvolvimento. Ratos receberam dieta com 20% (C) ou 8% (RP) de proteína, durante o período pré e pós-natal. Avaliamos em ratos de 14, 30 e 50 dias os efeitos da restrição protéica sobre proliferação celular no epitélio gástrico, massa do estômago e corpórea, comprimento do intestino e, expressão de ghrelina no estômago e no plasma. O grupo RP apresentou proliferação celular, massa do estômago e corpórea e comprimento do intestino reduzidos em relação ao grupo C. E maior imunomarcação para ghrelina em animais RP com 30 e 50d em comparação ao grupo C. Não houve diferença na imunomarcação entre animais de 14d. Os níveis plasmáticos de ghrelina apresentaram a mesma tendência observada na imunomarcação. O consumo de quantidade adequada de proteína é importante durante o desenvolvimento gástrico de ratos e a ghrelina apresenta resposta hormonal diferente de acordo com a idade do animal. / The gastric epithelium of rats undergoes morphophysiological changes throughout the first month of life and diet is one of the main factors influencing the development. Rats were fed a 20% (NP) or 8% (RP) protein diet throughout the pre- and post-natal life. We analyzed the cell proliferation and observed the body and stomach weight and small intestine length at 14, 30 and 50 days rats. Additionally, we evaluated ghrelin in gastric epithelium and its plasma levels. Cell proliferation in the gastric epithelium, body and stomach weight and small intestine length were reduced in RP animals when compared to NP animals. We observed an increase in the number of labeled cells for ghrelin in 30- and 50-d-old RP rats when compared to the NP group and no difference was found in 14-d-old animals. Plasma ghrelin levels showed the same results observed in immunohistochemical reactions. These results emphasize the importance of diet protein on the development of gastric mucosa and protein restriction seems to differently modulate ghrelin response at different ages.

Made available in DSpace on 2017-07-10T14:17:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leslie Jeronimo.pdf: 1310262 bytes, checksum: 31b9beed076ffaa86c2f666ef6e3d8f6 (MD5) Previous issue date: 2013-08-16 / Protein energy malnutrition causes changes in several organs and systems and the earlier malnutrition occurs, more intense and permanent will be its effects. This study aimed to evaluate the morphological and morphometric aspects of the muscle fibers and neuromuscular junctions (end-plates) of the extensor digitorum longus (EDL) of rats subjected to maternal protein restriction during the periods of gestation and lactation. Wistar rats were divided into four groups: 1) control group 21 days - the offspring of mothers fed during gestation and lactation a normal protein diet (17 %); 2) restricted group 21 days - the offspring of mothers fed during gestation and lactation with a low protein diet (6 %); 3) control group 365 days - the offspring of mothers fed during gestation and lactation on a normal protein diet (17 %) until the day of weaning, and after this period the diet was standard diet until age 365 days; and 4) restricted group 365 days - the offspring of mothers fed during gestation and lactation with a low protein diet (6 %) until the day of weaning, and after this period the diet was standard diet until age 365 days. After the periods of 21 and 365 days, the male rats of each group were weighed and euthanized for the removal of the EDL muscle. The hematoxylin-eosin (HE) technique was performed for the histological analysis of the muscle fibers and histoenzymological analysis was performed using nicotinamide adenine dinucleotide tetrazolium reductase (NADH - TR). The ultrastructural study of the EDL muscle fibers was conducted using a transmission electron microscope. For the end-plates staining, muscle samples were subjected to nonspecific esterase reaction. Restricted animals with 21 or 365 days old showed a significant decrease in body weight. Histological analysis of the fibers in the restricted animals aged 21 days showed an increased amount of fetal fibers, myotubes and centered nuclei, compared with the respective control group. Histoenzymological analysis revealed a significant decrease in the area of type IIa fibers in the animals of the restricted group aged 365 days compared with the control group of the same age. Regarding the ultrastructural study, the EDL muscle of restricted animals with 21 days old showed dissolution of the Z line, the presence of lipid droplets in the midst of myofibrils, myelin figures in the subsarcolemmal and intramiofibrilar regions and nuclei in the central position in the muscle fiber line were frequent. Disorganization of the Z line and the myofibrils was also found in animals from the restricted group aged 365 days. The analysis of the end-plates showed a significant decrease in the area, and in the major and minor diameters of the restricted animals aged 21 days compared to their respective controls. These results suggest that maternal protein restriction during gestation and lactation alters the development and morphology of the offspring skeletal muscle / A desnutrição energético proteica (DEP) causa alterações em diversos sistemas e órgãos, sendo seus efeitos mais intensos e permanentes quanto mais precocemente ocorrer a desnutrição. O presente trabalho buscou avaliar os aspectos morfológicos e morfométricos das fibras musculares e junções neuromusculares (JNMs) do músculo extensor longo dos dedos (EDL) de ratos submetidos à restrição proteica materna, durante os períodos de gestação e lactação. Ratos da linhagem Wistar foram divididos em quatro grupos: Grupo controle 21 dias - prole de mães alimentadas durante a gestação e lactação com ração normoproteica (17%); Grupo restrito 21 dias - prole de mães alimentadas durante a gestação e lactação com ração hipoproteica (6%); Grupo controle 365 dias - prole de mães alimentadas durante a gestação e lactação com ração normoproteica (17%) até o dia do desmame e, após este período, a dieta fornecida para a prole foi ração normoproteica até a idade de 365 dias e Grupo restrito 365 dias - prole de mães alimentadas durante a gestação e lactação com ração hipoproteica (6%) até o dia do desmame e, após este período, a dieta fornecida foi ração normoproteica até a idade de 365 dias. Após os períodos 21 e 365 dias, os ratos machos de cada grupo foram pesados e eutanasiados para a retirada do músculo EDL. Para o estudo histológico das fibras musculares foi realizado a técnica Hematoxilina-Eosina (HE) e para análise histoenzimológica foi feita a marcação com o Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo - Tetrazolium Reductase - (NADH-TR). O estudo ultraestrutural das fibras musculares do EDL foi conduzido no microscópio eletrônico de transmissão. Para a marcação das JNMs, amostras do músculo foram submetidas à reação Esterase Inespecífica. Os resultados mostraram diminuição do peso corpóreo nos animais restritos com 21 e 365 dias de idade. A análise histológica das fibras musculares nos animais restrito com 21 dias mostrou maior quantidade de fibras fetais, miotubos e núcleos centralizados, quando comparado com seu respectivo grupo controle. O estudo histoenzimológico revelou uma diminuição significativa da área das fibras tipo IIa nos animais do grupo restrito 365 dias de idade em relação ao grupo controle de mesma idade. Quanto ao estudo ultraestrutural, o músculo EDL nos animais do grupo restrito 21 dias apresentou dissolução da linha Z, presença de gotículas de lipídios em meio às miofibrilas e figuras de mielina nas regiões subsarcolemal e intramiofibrilar e núcleos em posição central na fibra muscular foram frequentes. No grupo restrito 365 dias também foi verificado uma desorganização da linha Z e das miofibrilas. A análise das JNMs mostrou que houve diminuição significativa da área e dos diâmetros maior e menor nos animais restritos com 21 dias quando comparado com seu respectivo grupo controle. Esses resultados sugerem que restrição proteica materna durante a gestação e lactação altera o desenvolvimento e morfologia do músculo estriado esquelético da prole

Orientador: Luis Fernando Barbisan / Resumo: Perturbações no ambiente uterino e nos estágios iniciais da vida, por fatores nutricionais e/ou alterações hormonais, podem predispor os recém-nascidos a doenças crônicas na vida adulta. A restrição proteica gestacional (RPG) e a exposição ao Bisfenol A (BPA), nas fases pré e pós-natal, alteram o desenvolvimento mamário e aumentam a suscetibilidade a carcinogênese mamária. Assim, este trabalho investigou os possíveis efeitos da RPG e sua associação com a exposição pós-natal ao BPA sobre o desenvolvimento da glândula mamária e a suscetibilidade à carcinogênese mamária induzida pela 7,12-dimetilbenzantraceno (DMBA). Fêmeas prenhes da linhagem Sprague-Dawley foram alocadas em quatro grupos experimentais: dieta normoproteica (DNP); dieta hipoproteica (DHP); DNP+BPA e DHP+BPA. O BPA (1 mg/L) foi ministrado na água de beber à prole do dia pós-natal (DPN) 21 até o DPN 51. No DPN 51, fêmeas da prole (n=10/grupo) foram eutanasiadas para avaliação das glândulas mamárias, enquanto o restante (n=11/grupo) recebeu dose única de DMBA (30 mg/kg, i.g.), e foram eutanasiadas no DPN 250 para avaliação de tumores mamários. A RPG e a exposição ao BPA não alteraram o crescimento da árvore mamária, as unidades de brotos e ductos terminais (TEBs e TDs), a proliferação celular (Ki-67), a expressão do receptor de estrógeno β (RE-β) e área ocupada por fibras colágenas nas glândulas mamárias no DPN 51. Entretanto, nos grupos DHP e DNP+BPA houve redução na área correspondente ao tecido epitelial glandul... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Disturbances in the uterine environment and in the early stages of life, due to nutritional factors and/or hormonal changes, may predispose newborns to chronic diseases in adult life. Gestational protein restriction (GPR) and exposure to Bisphenol A (BPA), in the pre and postnatal phases alter breast development and increase susceptibility to mammary carcinogenesis. Therefore, the aim of this study was to investigate the possible effects of GPR and its association with postnatal exposure to BPA on mammary gland development and on susceptibility to 7,12-dimethylbenzanthracene (DMBA) induced mammary carcinogenesis. For this purpose, pregnant females of the Sprague-Dawley strain were allocated into four experimental groups: normoprotein diet (NPD); hypoproteic diet (HPD); NPD+BPA and HPD+BPA. BPA (1 mg/L) was given in drinking water to offspring from postnatal day (PND) 21 to PND 51. At the PDN 51, offspring females (n=10/group) were euthanized for mammary glands evaluation, while the remainder (n=11/group) received a single dose of DMBA (30 mg/kg, ig) and were euthanized at the PND 250 for breast tumors evaluation. GPR and BPA exposure did not alter the growth of the mammary tree, number of bud and terminal duct (TEBs and TDs), cell proliferation (Ki-67), expression of estrogen receptor β (ER-β) and collagen fibers area in the mammary glands at PDN 51. However, in the HPD and NPD+BPA groups was a decreased area corresponding to the glandular epithelial tissue and the associatio... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Fêmeas Wistar foram alimentadas durante o período gestacional e a primeira metade da lactação (10 primeiros dias de lactação) com dieta normoprotéica (19 g proteína / Kg dieta) (grupo NP) e dieta restrita em proteínas (5 g proteína / Kg dieta) (grupo LP). Paralelamente a este esquema de alimentação, elas também receberam, diariamente, por gavagem, o óleo de peixe (Fo, rico em ácido graxo poliinsaturado- AGPi n-3). Os filhotes foram subdivididos em 4 grandes grupos: NP, NP-Fo, LP e LP-Fo, sendo acompanhados até os 6 meses de idade, data na qual ocorreu a eutanásia. No momento do sacrifício, o coração foi removido e devidamente preparado para a análise em microscopia de luz e estereologia. A partir do terceiro mês, os animais do grupo LP (ambos os gêneros) exibiram um aumento na pressão arterial sistólica (hipertensão moderada), mantendo esse comportamento até o final do experimento (6 meses de idade). No entanto, a suplementação materna com o Fo foi capaz de minimizar os efeitos da desnutrição sobre a pressão arterial. Não houve diferença significante no índice corporal entre os grupos de mães suplementadas com o Fo. O ventrículo esquerdo do grupo LP (ambos os sexos) demonstrou maior espessura quando comparado ao grupo NP (+25% nos machos, P=0,01, +22% nas fêmeas, P=0,001); entretanto, o grupo LP-Fo manifestou menor espessura quando comparado com o grupo LP (-23% nos machos, P=0,001, -12% nas fêmeas, P=0,02). Os machos do grupo LP apresentaram significativamente menor vascularização intramiocárdica quando correlacionado ao grupo NP (-50%, P=0,01), enquanto os machos do grupo LP-Fo exibiram um incremento de 89% na microcirculação, quando comparados ao grupo LP (P=0,004). Ambos os gêneros do grupo LP manifestaram maior quantidade de fibrose intersticial quando comparados ao grupo NP. Vale ressaltar que a suplementação materna de Fo foi benéfica apenas no grupo LP. Sendo assim, nossos dados sugerem claramente que a suplementação materna com Fo, durante o período perinatal, é capaz de prevenir o remodelamento cardíaco adverso e a hipertensão provocados pela restrição protéica materna in útero e na lactação, tornando-se assim uma opção não farmacológica viável para a prevenção e/ou redução dos danos ocasionados pela programação em humanos. / Female Wistar rats fed in gestation and first 10 lactation days with normal protein diet (19 g protein/kg diet) (NP group) or low-protein diet (5g protein/kg diet) (LP group), also received daily fish oil supplement (Fo, n-3 PUFA rich) during same period. Offspring put in groups NP, NP-Fo, LP, LP-Fo, until sacrifice at 6-mo-old when hearts removed, prepared for light microscopy and stereology. There was mild hypertension in both LP genders from 3- until 6 mo-old. Blood pressure affected by undernutrition was minimized by maternal Fo supplementation. In body index between groups there was no significant difference with maternal Fo supplementation. The left ventricle was thicker in both genders of LP groups compared to counterpart NP groups (+25% in male LP group, P=0.01, +22% in female LP group, P=0.001); however, less thick in LP-Fo groups compared to LP groups (-23% in male LP-Fo group, P=0.001, - 12% in female LP-Fo group, P=0.02). Male LP group offspring had significantly smaller intramyocardial microcirculation than NP group (-50%, P=0.01), while male LP-Fo group had 89% higher microcirculation than LP group (P=0.004). Both gender LP group offspring had significantly higher interstitial fibrosis compared with NP groups. The maternal Fo supplementation has beneficial effects in LP , but not in NP offspring. In conclusion, our data clearly indicate postnatal hypertension and collateral cardiovascular adverse remodeling, programmed by low-protein diet in utero and lactation was prevented by perinatal supplementation with fish oil, n-3 PUFA rich, providing a viable non-pharmacologic option for preventing and/or reducing adverse programming outcomes in human.

Submitted by Muriele Bertagna Varuzza null (mbvaruzza@aluno.ibb.unesp.br) on 2018-02-27T20:55:50Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado Muriele Bertagna Varuzza.pdf: 4268193 bytes, checksum: 9b5e69a8c4d6ccec96ff6ee74a116eca (MD5) / Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2018-03-05T17:34:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 varuzza_mb_me_bot.pdf: 4268193 bytes, checksum: 9b5e69a8c4d6ccec96ff6ee74a116eca (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-05T17:34:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 varuzza_mb_me_bot.pdf: 4268193 bytes, checksum: 9b5e69a8c4d6ccec96ff6ee74a116eca (MD5) Previous issue date: 2018-02-09 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Perturbações no ambiente uterino e nos estágios iniciais da vida, por fatores nutricionais e/ou alterações hormonais, podem predispor os recém-nascidos a doenças crônicas na vida adulta. A restrição proteica gestacional (RPG) e a exposição ao Bisfenol A (BPA), nas fases pré e pós-natal, alteram o desenvolvimento mamário e aumentam a suscetibilidade a carcinogênese mamária. Assim, este trabalho investigou os possíveis efeitos da RPG e sua associação com a exposição pós-natal ao BPA sobre o desenvolvimento da glândula mamária e a suscetibilidade à carcinogênese mamária induzida pela 7,12-dimetilbenzantraceno (DMBA). Fêmeas prenhes da linhagem Sprague-Dawley foram alocadas em quatro grupos experimentais: dieta normoproteica (DNP); dieta hipoproteica (DHP); DNP+BPA e DHP+BPA. O BPA (1 mg/L) foi ministrado na água de beber à prole do dia pós-natal (DPN) 21 até o DPN 51. No DPN 51, fêmeas da prole (n=10/grupo) foram eutanasiadas para avaliação das glândulas mamárias, enquanto o restante (n=11/grupo) recebeu dose única de DMBA (30 mg/kg, i.g.), e foram eutanasiadas no DPN 250 para avaliação de tumores mamários. A RPG e a exposição ao BPA não alteraram o crescimento da árvore mamária, as unidades de brotos e ductos terminais (TEBs e TDs), a proliferação celular (Ki-67), a expressão do receptor de estrógeno β (RE-β) e área ocupada por fibras colágenas nas glândulas mamárias no DPN 51. Entretanto, nos grupos DHP e DNP+BPA houve redução na área correspondente ao tecido epitelial glandular e a associação (DHP+BPA) aumentou a área ocupada pelo fat pad. A exposição ao BPA (DNP+BPA e DHP+BPA) aumentou os índices apoptóticos, a RPG aumentou a expressão do receptor de estrógeno α (RE-α) e a associação (DHP+BPA) aumentou os receptores de progesterona (RP) nas glândulas mamárias no DPN 51. Os grupos DHP, DNP+BPA e DHP+BPA apresentaram menor latência tumoral. Além disso, os grupos que receberam BPA apresentaram maior incidência e multiplicidade tumoral. Considerando esses resultados, podemos concluir que a RPG e o BPA aumentaram a suscetibilidade ao desenvolvimento de tumores mamários induzidos pela DMBA, mas a associação (DHP+BPA) não levou ao aumento do risco. / Disturbances in the uterine environment and in the early stages of life, due to nutritional factors and/or hormonal changes, may predispose newborns to chronic diseases in adult life. Gestational protein restriction (GPR) and exposure to Bisphenol A (BPA), in the pre and postnatal phases alter breast development and increase susceptibility to mammary carcinogenesis. Therefore, the aim of this study was to investigate the possible effects of GPR and its association with postnatal exposure to BPA on mammary gland development and on susceptibility to 7,12-dimethylbenzanthracene (DMBA) induced mammary carcinogenesis. For this purpose, pregnant females of the Sprague-Dawley strain were allocated into four experimental groups: normoprotein diet (NPD); hypoproteic diet (HPD); NPD+BPA and HPD+BPA. BPA (1 mg/L) was given in drinking water to offspring from postnatal day (PND) 21 to PND 51. At the PDN 51, offspring females (n=10/group) were euthanized for mammary glands evaluation, while the remainder (n=11/group) received a single dose of DMBA (30 mg/kg, ig) and were euthanized at the PND 250 for breast tumors evaluation. GPR and BPA exposure did not alter the growth of the mammary tree, number of bud and terminal duct (TEBs and TDs), cell proliferation (Ki-67), expression of estrogen receptor β (ER-β) and collagen fibers area in the mammary glands at PDN 51. However, in the HPD and NPD+BPA groups was a decreased area corresponding to the glandular epithelial tissue and the association (HPD+BPA) increased the fat pad. Exposure to BPA (NPD+BPA and HPD+BPA) increased apoptotic indexes, GPR increased estrogen receptors α expression (ER-α) while their association (HPD+BPA) increased progesterone receptors (PR) in the mammary glands. The groups HPD, NPD+BPA and HPD+BPA also showed lower tumor latency. In addition, the groups that received BPA presented higher tumor incidence and multiplicity. These results suggests that GPR and BPA exposure increased the susceptibility to mammary carcinogenesis induced by DMBA, but the association (HPD+BPA) did not increase the risk. / Processo Fapesp nº 2016/01220-2

Fêmeas Wistar foram alimentadas durante o período gestacional e a primeira metade da lactação (10 primeiros dias de lactação) com dieta normoprotéica (19 g proteína / Kg dieta) (grupo NP) e dieta restrita em proteínas (5 g proteína / Kg dieta) (grupo LP). Paralelamente a este esquema de alimentação, elas também receberam, diariamente, por gavagem, o óleo de peixe (Fo, rico em ácido graxo poliinsaturado- AGPi n-3). Os filhotes foram subdivididos em 4 grandes grupos: NP, NP-Fo, LP e LP-Fo, sendo acompanhados até os 6 meses de idade, data na qual ocorreu a eutanásia. No momento do sacrifício, o coração foi removido e devidamente preparado para a análise em microscopia de luz e estereologia. A partir do terceiro mês, os animais do grupo LP (ambos os gêneros) exibiram um aumento na pressão arterial sistólica (hipertensão moderada), mantendo esse comportamento até o final do experimento (6 meses de idade). No entanto, a suplementação materna com o Fo foi capaz de minimizar os efeitos da desnutrição sobre a pressão arterial. Não houve diferença significante no índice corporal entre os grupos de mães suplementadas com o Fo. O ventrículo esquerdo do grupo LP (ambos os sexos) demonstrou maior espessura quando comparado ao grupo NP (+25% nos machos, P=0,01, +22% nas fêmeas, P=0,001); entretanto, o grupo LP-Fo manifestou menor espessura quando comparado com o grupo LP (-23% nos machos, P=0,001, -12% nas fêmeas, P=0,02). Os machos do grupo LP apresentaram significativamente menor vascularização intramiocárdica quando correlacionado ao grupo NP (-50%, P=0,01), enquanto os machos do grupo LP-Fo exibiram um incremento de 89% na microcirculação, quando comparados ao grupo LP (P=0,004). Ambos os gêneros do grupo LP manifestaram maior quantidade de fibrose intersticial quando comparados ao grupo NP. Vale ressaltar que a suplementação materna de Fo foi benéfica apenas no grupo LP. Sendo assim, nossos dados sugerem claramente que a suplementação materna com Fo, durante o período perinatal, é capaz de prevenir o remodelamento cardíaco adverso e a hipertensão provocados pela restrição protéica materna in útero e na lactação, tornando-se assim uma opção não farmacológica viável para a prevenção e/ou redução dos danos ocasionados pela programação em humanos. / Female Wistar rats fed in gestation and first 10 lactation days with normal protein diet (19 g protein/kg diet) (NP group) or low-protein diet (5g protein/kg diet) (LP group), also received daily fish oil supplement (Fo, n-3 PUFA rich) during same period. Offspring put in groups NP, NP-Fo, LP, LP-Fo, until sacrifice at 6-mo-old when hearts removed, prepared for light microscopy and stereology. There was mild hypertension in both LP genders from 3- until 6 mo-old. Blood pressure affected by undernutrition was minimized by maternal Fo supplementation. In body index between groups there was no significant difference with maternal Fo supplementation. The left ventricle was thicker in both genders of LP groups compared to counterpart NP groups (+25% in male LP group, P=0.01, +22% in female LP group, P=0.001); however, less thick in LP-Fo groups compared to LP groups (-23% in male LP-Fo group, P=0.001, - 12% in female LP-Fo group, P=0.02). Male LP group offspring had significantly smaller intramyocardial microcirculation than NP group (-50%, P=0.01), while male LP-Fo group had 89% higher microcirculation than LP group (P=0.004). Both gender LP group offspring had significantly higher interstitial fibrosis compared with NP groups. The maternal Fo supplementation has beneficial effects in LP , but not in NP offspring. In conclusion, our data clearly indicate postnatal hypertension and collateral cardiovascular adverse remodeling, programmed by low-protein diet in utero and lactation was prevented by perinatal supplementation with fish oil, n-3 PUFA rich, providing a viable non-pharmacologic option for preventing and/or reducing adverse programming outcomes in human.

O epitélio gástrico de ratos passa por modificações morfofisiológicas importantes durante o primeiro mês de vida pós-natal e a dieta é um dos principais fatores que influenciam esse desenvolvimento. Ratos receberam dieta com 20% (C) ou 8% (RP) de proteína, durante o período pré e pós-natal. Avaliamos em ratos de 14, 30 e 50 dias os efeitos da restrição protéica sobre proliferação celular no epitélio gástrico, massa do estômago e corpórea, comprimento do intestino e, expressão de ghrelina no estômago e no plasma. O grupo RP apresentou proliferação celular, massa do estômago e corpórea e comprimento do intestino reduzidos em relação ao grupo C. E maior imunomarcação para ghrelina em animais RP com 30 e 50d em comparação ao grupo C. Não houve diferença na imunomarcação entre animais de 14d. Os níveis plasmáticos de ghrelina apresentaram a mesma tendência observada na imunomarcação. O consumo de quantidade adequada de proteína é importante durante o desenvolvimento gástrico de ratos e a ghrelina apresenta resposta hormonal diferente de acordo com a idade do animal. / The gastric epithelium of rats undergoes morphophysiological changes throughout the first month of life and diet is one of the main factors influencing the development. Rats were fed a 20% (NP) or 8% (RP) protein diet throughout the pre- and post-natal life. We analyzed the cell proliferation and observed the body and stomach weight and small intestine length at 14, 30 and 50 days rats. Additionally, we evaluated ghrelin in gastric epithelium and its plasma levels. Cell proliferation in the gastric epithelium, body and stomach weight and small intestine length were reduced in RP animals when compared to NP animals. We observed an increase in the number of labeled cells for ghrelin in 30- and 50-d-old RP rats when compared to the NP group and no difference was found in 14-d-old animals. Plasma ghrelin levels showed the same results observed in immunohistochemical reactions. These results emphasize the importance of diet protein on the development of gastric mucosa and protein restriction seems to differently modulate ghrelin response at different ages.

Une des caractéristiques les plus connues de la programmation métabolique est qu’un événement commun physiopathologique à l'âge adulte obtenu indépendamment du stress nutritionnel au début de la vie. Cela a conduit à penser que les altérations métaboliques dûes au stress nutritionnel précoce pouvaient résulter de la programmation seulement d’un petit nombre de gènes qui agissent comme gardiens d'un réseau de gènes ou d'une voie de signalisation. Ici nous avons l’intention de tester cette hypothèse par l'analyse combinée du transcriptome et méthylome avec des échantillons de foie des rats nés de mères nourries avec une alimentation restreinte en protéines (MPR) ou carencée en donneur de méthyles (MDD) pendant la gestation et la lactation et comparer entre les 2 modèls. Au moment du sevrage, la progéniture MDD a été sacrifiée, tandis que la progéniture du groupe MPR a reçu une nourriture standard jusqu'à l'âge de 6 mois. Les rats à jours 21 nés de mères nourries avec un régime MDD ont 3.269 gènes surexprimé (P <0,0009) et 2.841 gènes sous-exprimés (P <0,0004) par rapport aux témoins. Les modifications de méthylation de l'ADN ont été trouvées dans les régions promotrices de 1.032 gènes. Les analyses fonctionnelles ont révélé que ces gènes sont principalement impliqués dans le métabolisme des lipides et du glucose, du système nerveux, la coagulation, le stress du réticulum endoplasmique et la fonction mitochondriale. Les master genes présentant des changements à la fois dans l'expression et la méthylation d'ADN sont limités à 266 gènes et ils sont principalement impliqués dans le système rénine-angiotensine, le métabolisme de la mitochondrie et de l'homéostasie phospholipide. La plupart de ces master genes participent à la Non Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD). La restriction protéique maternelle (MPR) a entraîné une augmentation de la masse grasse abnominale, de l'hypertriglycéridémie, de l'hypercholestérolémie et un taux élevé d’acides gras par rapport aux témoins. 3.020 gènes sont surexprimés (P<0,0003) et 3.601 sous-exprimés (P<0,002) au niveau du transcriptome et 3.968 gènes modifiés au niveau du méthylome par rapport aux témoins. L'analyse fonctionnelle a indiqué que les gènes surexprimés sont principalement impliqués dans les voies métaboliques et les gènes sous-exprimés et différemment méthylés sont principalement impliqués dans des processus du développement. 998 master genes ont été trouvés, et léanalyse fonctionnelle de ces gènes a indiqué un effet significatif sur le développement des tissus, la régulation de la transcription et le métabolisme, et beaucoup d'entre eux sont associés à des maladies chroniques comme l'hypertension, l'obésité centrale et le diabète. L'expression des gènes et la méthylation de l'ADN du génome obtenus en utilisant ces modèles ont été comparés aux données de méthylome et de transcriptome précédemment obtenus à partir de foie des rats restreints en protéines et sacrifiés à la naissance. Cette analyse a révélé un ensemble commun de 46 gènes qui sont sur-exprimés et 42 gènes sous-exprimés dans les trois modèles de programmation métabolique par rapport aux animaux témoins. La plupart des gènes surexprimés sont impliqués dans la régulation de la fonction mitochondriale alors que les gènes sous-exprimés sont principalement impliquées dans la régulation de la prolifération cellulaire et l'expression des gènes. Nous avons identifié également un ensemble de 122 gènes dont les niveaux de méthylation ont été modifiés à la fois par une carence en donneurs de méthyle et une restriction protéique. Ces observations soutiennent l’hypothèse qu’un petit nombre de gènes essentiels sont à la base de la programmation de troubles métaboliques, indépendamment du stress nutritionnel / One of the most striking features of metabolic programming is that a common physiopathological output at adulthood is obtained irrespective to the nutritional insult during early life. This has suggested that the metabolic alterations due to early nutritional stress might result from the programming of only a small number of genes which act as gatekeepers of a fundamental gene network or signalling pathway. Here we aimed to test this hypothesis through the combined analysis of the transcriptome and methylome in rat liver samples derived from animals born to dams fed either a protein-restricted diet (MPR) or a methyl donor deficient (MDD) diet through gestation and lactation. At weaning, the offspring born to MDD dams were sacrificed whereas the pups from the MPR group were fed standard chow until the age of 6 months. 21-day-old rats born to mothers fed a MDD diet during gestation and lactation have 3,269 over-expressed (P<0.0009) and 2,841 under-expressed (P<0.0004) genes compared to controls. Modifications of DNA methylation were found in the promoter regions of 1,032 genes. Functional analyses revealed that these genes are mainly involved in glucose and lipid metabolism, nervous system, coagulation, endoplasmic reticulum stress and mitochondrial function. Master genes exhibiting changes in both gene expression and DNA methylation are limited to 266 genes and are mainly involved in the renin-angiotensin system, mitochondrion metabolism and phospholipid homeostasis. Most of these master genes participate in Non Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD). Maternal protein restriction (MPR) resulted in increased fat mass, hypertriglyceridemia, hypercholesterolemia and high fatty acids compared to control. 3,020 genes were up-regulated (p < 0.0003) and 3,601 (p ? 0.002) down-regulated by MPR compared to controls. Modifications of DNA methylation was found in 3,968 genes. The functional analysis indicated that the overexpressed genes were mainly involved in metabolic pathways and the under-expressed and differentially methylated genes were mainly involved in physiological process. 998 master genes were found, functional analysis of these genes indicated a significant effect on tissue development, regulation of transcription and metabolism, and many of them are associated with chronic diseases such as hypertension, central obesity and diabetes. The genome-wide expression and DNA metylation results obtained using these models, were compared to previous methylome and transcriptome data obtained using liver from MPR pups sacrificed at birth. This analysis revealed a common set of 46 genes that were up regulated and 42 genes down regulated in the three models of metabolic programming compared to control animals. Most of the up regulated genes are involved in the regulation of mitochondrial function whereas the down-regulated genes are mainly involved in the regulation of cell proliferation and gene expression. We identified also a set of 122 genes whose methylation levels were changed both by methyl donor deficiency and protein-restriction. These observations sustain the hypothesis that a small set of core genes underlies the programming of metabolic disorders irrespective of the nutritional insult