Le repliement des protéines est un des problèmes centraux de la biologie. Il s'agit de comprendre comment la chaîne polypeptidique d'une protéine se replie pour acquérir sa structure tridimensionnelle biologiquement active. Il a été démontré dans les années 60 que la forme repliée de la protéine est le plus stable d'un point de vue thermodynamique et qu'il est défini par la structure primaire. La réaction de repliement correspond ainsi à la dernière étape de l'utilisation de l'information contenue dans l'ADN. Cependant, Il est possible que les protéines se replient mal et interagissent entre elles pour former des fibres amyloïdes. Ce sont des agrégats structurés impliqués dans plusieurs maladies comme la maladie d'Alzheimer, de Parkinson... <br>Ces phénomènes sont étudiés ici dans le cas de l'alpha-lactalbumine, une protéine du lait qui possède un site de liaison pour le calcium. Le repliement est tout d'abord étudié en présence de métaux se liant au site du calcium. Ces expériences sont couplées à des expériences de dénaturation thermiques pour caractériser le rôle de la fixation des métaux sur les différents états de la protéine et son influence sur la cinétique de repliement.<br>La réaction est ensuite caractérisée en absence d'ion métallique. Elle est alors beaucoup plus lente et complexe. Différentes techniques spectroscopiques sont utilisées. Les résultats obtenus permettent de proposer un schéma réactionnel selon lequel un état précurseur de fibres amyloïdes est transitoirement peuplé. Enfin, pour compléter cette étude, les effets des interactions entre protéines sur la formation de fibres amyloïdes ont été étudiés pour différentes concentrations en sel.

La protochlorophyllide oxydoréductase catalyse la réduction de la protochlorophyllide en chlorophyllide, pénultième étape de la synthèse de la chlorophylle chez les plantes. Cette réaction présente la particularité d'être photoactivable. Après le déclenchement de la réaction par la lumière, plusieurs intermédiaires réactionnels apparaissent, présentant des signatures spectroscopiques distinctes. L'étude du mécanisme catalytique à basse température permet d'isoler chacun de ces intermédiaires et de les caractériser. <br /><br />Nous avons d'abord mis en évidence que la longueur d'onde et l'intensité de la source de lumière choisie pour déclencher la réaction à basse température influait directement sur le mécanisme réactionnel suivi, révélant par la même l'existence d'une « branche morte » de la réaction, dont le produit n'est pas la chlorophyllide.<br /><br />Nous avons ensuite suivi par spectroscopie d'absorption et de fluorescence le déroulement des deux mécanismes réactionnels : la branche physiologique et la « branche morte ». Ces études ont été réalisées entre 100 et 293 K dans des solutions de viscosités différentes, afin de faire varier la température de transition vitreuse (Tg) du solvant. En suivant en parallèle Tg et la formation des différents états intermédiaires, nous avons montré que les étapes initiales du premier mécanisme étaient couplées avec cette transition alors qu'elles en étaient indépendantes pour le second. Ces travaux ont permis de mettre en évidence l'existence de différents types de mouvements régissant l'activité fonctionnelle de la protéine, certains couplés avec le solvant (« bulk solvent ») et d'autres de type harmonique, indépendants du solvant.

Le virus de l'hépatite C (VHC) est une cause majeure d'affection hépatique chronique, notamment la cirrhose et le cancer du foie. On estime que 170 millions de personnes dans le monde sont des porteurs chroniques du VHC et que 3 à 4 millions de personnes sont infectées chaque année. Un des handicaps majeurs de la recherche sur le VHC est l'absence de systèmes de culture in vitro efficaces et de modèles animaux. Nous avons ainsi choisi une approche recombinante pour l'étude de protéines E1, E2 et p7 du VHC.Les protéines E1, E2 et p7 qui sont impliquées dans des étapes essentielles du cycle viral sont des protéines membranaires. Cependant, l'expression recombinante de cette classe de protéine est extrêmement complexe. En effet, la surexpression des protéines membranaires est souvent toxique pour les cellules hôtes. Ce phénomène est provoqué par l'agrégation ou la dégradation des protéines dans le cytoplasme dû à un manque de membrane disponible pour assurer leur intégration sur la cellule hôte. De plus, la surexpression de protéines membranaires induit la saturation de la machinerie cellulaire liée aux protéines membranaires. Ce détournement empêche le déroulement d'un cycle cellulaire normal et est ainsi fatal pour la cellule hôte. La forte concentration de protéines membranaires ou encore le fait que celles-ci soient hétérologues peut également provoquer la déstabilisation de la membrane de la cellule hôte et de son homéostasie. Afin de nous affranchir de ces limitations, nous avons utilisé une méthode de production des protéines membranaires sous forme native par un système acellulaire en présence de liposomes ; une technologie brevetée par l'université Joseph Fourier et exploitée par la société Synthelis. Dans un premier temps, nous avons procédé à la mise en place du système de production exploitant un lysat bactérien d'E. coli et d'un mélange énergétique complémentaire. Nous avons ensuite utilisé ce system pour étudier la viroporine p7. Cette protéine est essentielle pour la production de particules virales infectieuses et est impliquée dans l'assemblage viral ce qui en fait une cible thérapeutique intéressante. La production de protéoliposomes p7 en grande quantité nous a permis la caractérisation de la protéine par des techniques biochimiques et biophysiques. Nous avons mis en évidence l'inhibition de l'oligomérisation de p7 par le HMA qui ainsi inhibe sa fonction canal ionique. Grâce à la flexibilité du système d'expression acellulaire nous avons caractérisé la structure de la viroporine dans la membrane par réflectivité de neutron et avons confirmé la forme en entonnoir du complexe protéique. Des résultats préliminaires sur les proéoliposomes E1E2 quant à eux permettent d'espérer la production prochaine de particules virales mimant le VHC afin de mieux l'étudier et de lutter contre cette épidémie.L'ensemble de ces résultats confirment la pertinence de l'expression de protéines membranaires sous formes natives en système acellulaire en présence de liposomes. Les protéoliposomes produits constituent des nouveaux outils pour l'étude du VHC et permettent d'envisager de très grandes applications thérapeutiques ainsi que le développement de biomédicaments basés sur l'utilisation de protéines membranaires recombinantes. / The Hepatitis C virus (HCV) is a major cause of chronic liver disease, including cirrhosis and liver cancer. An estimated 170 million people worldwide are chronically infected with HCV and 3 to 4 million people are infected each year. One of the major handicaps of the HCV research is the lack of effective in vitro culture systems and animal models. To adress this issue, we chose a recombinant approach to study the E1, E2 and p7 proteins of HCV.The E1, E2 and p7 proteins are involved in critical steps of the viral cycle. They are membrane proteins, a class of protein that is extremely complex to express. Indeed, overexpression of membrane proteins is often toxic to the host cells. This phenomenon is caused by protein aggregation or degradation in the cytoplasm due to a lack of available membrane space for their integration into the host cell. Moreover, overexpression of membrane proteins induces saturation of the cellular machinery linked to membrane proteins. This diversion prevents the flow of a normal cell cycle and is fatal to the host cell. Destabilization of the host cell's membrane and its homeostatis may also be caused by the high concentration of membrane proteins or their heterologous nature. To circumvent these limitations, we used a method for producing membrane proteins in their native form by a cell-free system in the presence of liposomes; a technology patented by the University Joseph Fourier and licenced by the startup company Synthelis. First, we have set up the cell-free production system using a bacterial lysate from E. coli and a complementary energy mix. We then used this system to study the p7 viroporine. This protein is essential for the production of infectious virus particles and is involved in viral assembly making it an attractive therapeutic target. The production of a large quantity of p7 proteoliposomes allowed us to characterize the protein by biochemical and biophysical techniques. We have demonstrated the inhibition of oligomerization of p7 by HMA, which thereby inhibits its ion channel function. Thanks to the flexibility of the cell-free expression system we have characterized the structure of the viroporine within the membrane in a neutron reflectivity assay and have confirmed the funnel shape of the protein complex. Preliminary results on proteoliposomes E1E2 offer hope for the production viral particles mimicking the hepatitis C virus in order to better study the virus and fight against this epidemic.Together, these results confirm the suitability of the expression of membrane proteins in native forms using a cell-free system in the presence of liposomes. Proteoliposomes products are a new tool for the study of HCV and consideration for very broad therapeutic applications and the development of biopharmaceuticals based on the use of recombinant membrane proteins.

Le virus de la variole ovine est omniprésent dans les élevages de petits ruminants dans les pays d’Afrique du Nord et particulièrement en Tunisie malgré les campagnes de vaccination annuelles mises en place par les autorités vétérinaires du pays. L’optimisation de la souche vaccinale utilisée passe par le développement de vaccins dits de nouvelle génération tels que les vaccins sous unitaires utilisant des protéines reconnues pour induire une réponse humorale protectrice chez l’animal immunisé. Ceci pourrait être une alternative aux stratégies de lutte actuelles permettant de limiter la dissémination du virus en Tunisie. Peu de données existent sur les antigènes protecteurs spécifiques des virus du genre Capripoxvirus. Ce travail de thèse a ciblé, par homologie aux protéines du virus de la vaccine, quatre protéines du genre Capripoxvirus appartenant au virus de la dermatose nodulaire contagieuse potentiellement immuno-dominantes nommées LSDV60, LSDV117, LSDV122 etLSDV141 respectivement homologues des protéines L1, A27, A33 et B5. En premier lieu, une analyse structurale in silico a permis d’identifier les domaines essentiels de chaque protéine et de vérifier le taux de conservation de ces protéines parmi différents virus appartenant à la famille des poxvirus. Une analyse structurale approfondie mettant en évidence la structure primaire, secondaire et tertiaire de la protéine A27 a été réalisée. Suite à cette étude structurale, les protéines ont été produites dans deux systèmes d’expression différents ; le système eucaryote et le système baculovirus-cellules d’insectes afin de caractériser leur antigénicité vis-à-vis de sérums provenant d’animaux immunisés ou éprouvés.La reconnaissance des protéines d’intérêt en vecteur d’expression eucaryote n’a pas été concluante. En revanche, le système d’expression BEVS a permis la production de la protéine A27 (L1, A33 et B5 encours) avec succès sous forme soluble qui a été correctement reconnue par des sérums provenant de caprins naïfs challengés. La mise en évidence de formes trimériques et hexamériques confirment sonantigénicité. Une immunodétection des peptides correspondants à la protéine A27 synthétisés surmembranes (PepScan) combinée à une analyse in silico ont permis d'identifier des zones susceptibles de constituer des régions épitopiques reconnues situés majoritairement en partie N terminale de la protéine. / The sheep pox virus is omnipresent in small ruminant farms in North African countries andparticularly in Tunisia despite the annual vaccination campaigns set up by the Tunisian veterinaryauthorities. The optimization of the used vaccine strain involves the development of the so-called newgeneration vaccines such as subunit vaccines and this, using proteins recognized to induce a protectivehumoral response in the immunized animal. This could be considered as an alternative to currentcontrol strategies limiting virus spread in Tunisia. Few data exist on protective antigens specific toviruses in the genus Capripoxvirus. By homology to vaccinia virus proteins, this thesis work hastargeted four proteins in the genus Capripoxvirus belonging to the potentially immuno-dominantcontagious nodular dermatosis virus named LSDV60, LSDV117, LSDV122 and LSDV141respectively homologues of proteins L1, A27, A33 and B5. First, an in silico structural analysis hasallowed to identify the essential domains of each protein and to check the conservation rate of theseproteins among different viruses belonging to the poxvirus family. A thorough structural analysisidentifying the primary, secondary and tertiary structure of the A27 protein was conducted. Followingthis structural study, the proteins were produced in two different expression systems, namely theeukaryotic system and the baculovirus-insect cell system, in order to characterize their antigenicity tosera from immunized or proven animals. The recognition of the proteins of interest in the eukaryoticexpression vector has not been conclusive. On the other hand, the BEVS expression systemsuccessfully allowed the production of the A27 protein (L1, A33 and B5 in progress) in a solubleform, which was correctly recognized by sera from challenged naïve goats. Identifying trimeric andhexameric forms confirms its antigenicity. An immunodetection of the peptides corresponding toprotein A27 synthesized on membranes (PepScan) combined with an in silico analysis led to identifyzones capable of constituting recognized epitopic regions located predominantly in part N-terminal ofthe protein.

Le vieillissement est un processus complexe qui peut être influencé par des facteurs environnementaux et génétiques. Le syndrome progéroïde de Hutchinson-Gilford (HGPS ou progéria) fourni une preuve irréfutable de l'implication de l'épissage dans le processus de vieillissement. La progéria est une maladie due à une mutation hétérozygote silencieuse qui renforce l'utilisation d'un site 5' d'épissage interne dans l'exon 11 de l'ARN pré-messager LMNA, ce qui entraîne la production d'une protéine tronquée appelée «progérine». Le défaut d'épissage du gène LMNA a aussi lieu dans les cellules de personnes âgées, et la correction de ce défaut permet un sauvetage partiel des anomalies qu'il provoque. Ceci fait de l'ARN pré-messager LMNA une cible très attractive pour des thérapies ayant pour but de corriger l'épissage. Mes travaux de thèse ont montré que cette mutation silencieuse active un site d'épissage 5' dans l'exon 11 en changeant la structure de l'ARN. Ce changement de structure facilite l'interaction de la snRNP U1 avec le site d'épissage et permet ainsi sa modulation par les protéines SR SRSF1 et SRSF6. J'ai aussi participé à la caractérisation d'un nouveau modèle murin qui reproduit l'altération d'épissage des patients HGPS au niveau du gène Lmna souris. De façon surprenante, ce modèle récapitule tous les phénotypes du syndrome HGPS. Les souris homozygotes, dans lesquelles la plupart de la lamine A est convertie en progérine, ne vivent pas plus de 5 mois, alors que les souris hétérozygotes vivent autour d'un an et que les contrôles sauvages vivent deux ans. Étonnamment, des souris qui n'expriment ni la lamine A ni la progérine, mais uniquement de la lamine C, vivent plus longtemps que les souris contrôle, suggérant que la lamine A et la progérine, qui sont produites à partir du même transcrit, participent à la régulation de la durée de la vie. De plus, la caractérisation initiale des souris HGPS indique que l'expression de la progérine est délétère pour le tissu adipeux, établissant ainsi un lien inattendu entre l'épuisement du tissu adipeux et le vieillissement accéléré. Ce nouveau modèle murin est actuellement en train d'être utilisé pour des approches de modulation de l'épissage aberrant du gène LMNA avec des oligonucléotides antisense et des petites molécules chimiques. / Aging is a complex cellular and organismal process that can be influenced by environmental as well as genetic factors. A striking proof-of-concept that splicing regulation plays an important role in the aging process is provided by Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS), a disease caused by a heterozygous silent mutation that enhances the use of an internal 5' splice site in exon 11 of LMNA pre-mRNA and leads to the production of a truncated protein called “progerin”. The LMNA splicing defect also occurs with increased frequency in cells from healthy aged individuals and correction of this defect leads to partial reversal of age-related dysfunction. This makes LMNA pre-mRNA an attractive target for splicing-correction therapies. During my PhD thesis I have characterized the splicing mechanism responsible for progerin production and demonstrated that this process is conserved from mouse to human. I have found that HGPS mutation changes the accessibility of the exon 11 internal 5' splice site, allowing its modulation by U1 snRNP and a subset of SR proteins, namely SRSF6 and SRSF1. I have also participated to the characterization of a new mouse model reproducing human HGPS splicing alteration in the mouse Lmna gene. Strikingly, this model recapitulates all phenotypic manifestations of HGPS. The homozygous mice, where most lamin A is converted to progerin, lived no longer than 5 months, whereas heterozygous mice lived in average one year and wild type littermates up to two years. Unexpectedly, mice expressing neither lamin A nor progerin, but only lamin C, lived longer than wild type littermates mice, suggesting that lamin A and progerin which are produced from the same transcript, control critical steps of lifespan. Furthermore, initial characterization of HGPS mouse model indicated that progerin expression is deleterious for adipose tissue, establishing an unexpected link between adipose tissue depletion and accelerated aging. The new mouse model is currently being used for pharmacological modulation of LMNA aberrant splicing by antisense oligonucleotides and small molecules.

Les protéines sont omniprésentes dans les processus biologiques. Identifier leurs fonctions aide à comprendre et éventuellement à contrôler ces processus. Cependant, si la détermination de la séquence protéique est désormais une procédure de routine, il est souvent difficile d'utiliser cette information pour extraire des connaissances fonctionnelles pertinentes sur le système étudié. En effet, la fonction d'une protéine repose sur ses propriétés chimiques et mécaniques, lesquelles sont définies par sa structure. Ainsi, la prédiction, la compréhension et l'analyse de la structure des protéines sont parmi les principaux défis de la biologie moléculaire.La prédiction et l'analyse des repliements de protéines est le sujet central de cette thèse. Cependant, de nombreuses protéines sont organisées selon des assemblages qui sont symétriques dans la plupart des cas et certaines protéines contiennent des répétitions internes. La conception d'une structure avec des répétitions ou d'un assemblage protéique symétrique est souvent le moyen le plus simple pour l'évolution d'atteindre une certaine fonction. Ceci qui nous a poussé à développer des méthodes spécialement conçues pour les assemblages protéiques symétriques et les protéines avec répétitions internes. Une autre motivation derrière cette thèse était d'explorer et de faire progresser le domaine émergent de l'apprentissage profond appliqué aux données atomistiques tridimensionnelle (3D).Cette thèse s'articule autour de deux parties. Dans la première partie, nous proposons des algorithmes pour analyser la structures des assemblages symétriques de protéines. Nous commençons par définir une mesure de symétrie basée sur la distance euclidienne 3D et décrivons un algorithme permettant de calculer efficacement cette mesure et de déterminer les axes de symétrie des assemblages protéiques. Cet algorithme est capable de traiter tous les groupes ponctuels de symétrie, à savoir les symétries cycliques, dièdrales, tétraédriques, octaédriques et icosaédriques, grâce à une heuristique robuste qui perçoit la correspondance entre sous-unités asymétriques. Nous étendons ensuite les limites du problème et proposons une méthode applicable à des cartes de densité 3D. Nous abordons ce problème à l'aide d'un réseau neuronal profond (DNN), et nous proposons une méthode qui prédit l'ordre de symétrie l'axe de symétrie 3D.Ensuite, nous proposons une architecture DNN pour évaluer la qualité de modèles 3D de repliements de protéines. Nous avons entrainé le DNN en utilisant en entrée la géométrie locale autour de chaque résidu dans un modèle de protéine représenté par une carte de densité, et avons prédit les CAD-scores de ces résidus. Le DNN a été créé pour être invariant par rapport à l'orientation du modèle d'entrée. Nous avons également conçu certaines parties du DNN pour reconnaître automatiquement les propriétés des atomes et sélectionner des descripteurs pertinents. Enfin, nous analysons les descripteurs appris par le DNN. Nous montrons que notre architecture apprend effectivement des propriétés des atomes, des acides aminés et des structures moléculaires de niveau supérieur. Certaines propriétés sont déjà bien étudiées comme les éléments chimiques, les charges partielles atomiques, les propriétés des acides aminés, la structure secondaire des protéines et l'exposition au solvant. Nous démontrons également que notre réseau apprend de nouvelles caractéristiques structurelles.Cette étude présente de nouveaux outils pour la biologie structurale. Certains sont déjà utilisés dans la communauté, par les évaluateurs de CASP par example. Elle démontre également la puissance de l'apprentissage profond pour la représentation de la structure des protéines et son applicabilité aux problèmes des données 3D. / Proteins are ubiquitous for virtually all biological processes. Identifying their role helps to understand and potentially control these processes. However, even though protein sequence determination is now a routine procedure, it is often very difficult to use this information to extract relevant functional knowledge about system under study. Indeed, the function of a protein relies on a combination of its chemical and mechanical properties, which are defined by its structure. Thus, understanding, analysis and prediction of protein structure are the key challenges in molecular biology.Prediction and analysis of individual protein folds is the central topic of this thesis. However, many proteins are organized in higher-level assemblies, which are symmetric in most of the cases, and also some proteins contain internal repetitions.In many cases, designing a fold with repetitions or designing a symmetric protein assembly is the simplest way for evolution to achieve a specific function. This is because the number of combinatorial possibilities in the interactions of designed folds reduces exponentially in the symmetric cases. This motivated us to develop specific methods for symmetric protein assemblies and also for individual proteins with internal repeats. Another motivation behind this thesis was to explore and advance the emerging deep neural network field in application to atomistic 3-dimensional (3D) data.This thesis can be logically split into two parts. In the first part, we propose algorithms to analyse structures of protein assemblies, and more specifically putative structural symmetries.We start with a definition of a symmetry measure based on 3D Euclidean distance, and describe an algorithm to efficiently compute this measure, and to determine the axes of symmetry of protein assemblies. This algorithm is able to deal with all point groups, which include cyclic, dihedral, tetrahedral, octahedral and icosahedral symmetries, thanks to a robust heuristic that perceives correspondence between asymmetric subunits. We then extend the boundaries of the problem, and propose a method applicable to the atomistic structures without atom correspondence, internal symmetries, and repetitions in raw density maps. We tackle this problem using a deep neural network (DNN), and we propose a method that predicts the symmetry order and a 3D symmetry axis.Then, we extend the DNN architecture to recognise folding quality of 3D protein models. We trained the DNN using as input the local geometry around each residue in a protein model represented as a density map, and we predicted the CAD-scores of these residues. The DNN was specifically conceived to be invariant with respect to the orientation of the input model. We also designed some parts of the network to automatically recognise atom properties and robustly select features. Finally, we provide an analysis of the features learned by the DNN. We show that our architecture correctly learns atomic, amino acid, and also higher-level molecular descriptors. Some of them are rather complex, but well understood from the biophysical point of view. These include atom partial charges, atom chemical elements, properties of amino acids, protein secondary structure and atom solvent exposure. We also demonstrate that our network learns novel structural features.This study introduces novel tools for structural biology. Some of them are already used in the community, for example, by the PDBe database and CASP assessors. It also demonstrates the power of deep learning in the representation of protein structure and shows applicability of DNNs to computational tasks that involve 3D data.

Les Anthracyclines (ex : Doxorubicine (Dox)) fréquemment utilisées en chimiothérapie anticancéreuse peuvent conduire à une cardiotoxicité aboutissant à de l’insuffisance cardiaque et à une cardiomyopathie dilatée. Au niveau cellulaire, la Dox est connue pour générer un stress oxydant fort, s’intercaler directement entre les brins d’ADN, inhiber les Topoisomérase II (TopII) ou encore provoquer une détresse énergétique conduisant à la mort aussi bien des cellules tumorales que des cardiomyocytes. Néanmoins, les voies de signalisations/mécanismes moléculaires complets ne sont pas identifiés à ce jour. L’objectif de ce travail de thèse consiste donc à mieux comprendre les mécanismes de la cardiotoxicité de la Dox et à identifier de nouvelles cibles cellulaires cardio-protectrices limitant les effets cardiaques délétères de cette Anthracycline. Dans ce but, nous focalisons nos recherches sur le rôle de la protéine EPAC1, un facteur d’échange pour les petites protéines G directement activé par l’AMPc, dans la réponse des cellules cardiaques à la Dox. EPAC1 est une protéine centrale de la voie de signalisation AMPc dans le cardiomyocyte en réponse à une stimulation β-adrénergique. Or, plusieurs études ont récemment montré l’implication de certains acteurs de cette voie (Rac, RhoA) dans la cardiotoxicité induite par la Dox faisant d’EPAC1 une cible thérapeutique potentielle. Nous avons donc étudié in vitro (cultures primaires de cardiomyocytes de rat nouveau-nés (Dox 1µM)) et in vivo (souris sauvages ou invalidées pour EPAC1 (Dox, iv, 12mg/kg total)) les effets de la Dox sur l’expression et l’activité d’EPAC1 et sur les voies de signalisation qu’il régule. In vivo, les souris sauvages traitées à la Dox développent une cardiomyopathie dilatée associée à une altération de l’homéostasie calcique 15 semaines après traitement. In vitro, la Dox induit des modifications de l’expression/activité d’EPAC1 et de l’homéostasie calcique, la formation de complexes TopIIβ/ADN conduisant à des dommages à l’ADN, une dérégulation de la biogénèse et de l’activité de la chaîne respiratoire mitochondriale et finalement à l’apoptose des cardiomyocytes. L’inhibition pharmacologique (Ce3F4, Esi09) ou génétique d’EPAC1 réduit l’ensemble des dommages cellulaires in vitro et empêche le développement de la cardiomyopathie dilatée in vivo. De manière importante, nous montrons que contrairement à ce qui est observé dans les cellules cardiaques, l’inhibition d’EPAC1 augmente la toxicité de la Dox envers les cellules tumorales et en particulier envers les cellules MCF-7 issues de cancer mammaire métastatique, principale indication de la Dox. Nos résultats suggèrent donc que l’inhibition d’EPAC1 semble être une stratégie thérapeutique prometteuse dans la prévention de la cardiomyopathie induite par les traitements anticancéreux à base d’Anthracyclines. / Doxorubicin (Dox) is an Anthracycline commonly used to treat many types of cancer; unfortunately this chemotherapeutic agent often induces side effects such as cardiotoxicity leading to cardiomyocyte death and dilated cardiomyopathy (DCM). This cardiotoxicity has been related to reactive oxygen species generation, DNA intercalation, topoisomerase II inhibition and bioenergetics alterations resulting in DNA damages and ultimately in cardiomyocyte death. Nevertheless, complete molecular mechanisms are not yet identified. Therefore, there is a need for new treatment options and strategies aiming at reducing Dox side effects in the heart. Among these mechanisms, EPAC1 (Exchange Protein directly Activated by cAMP) signaling could be worth investigating as EPAC1 indirectly activates small G proteins (Rac1 and Rho A), which are known to be involved in Dox-induced cardiotoxicity. Therefore, we have investigated the effect of Dox on EPAC1 signaling in both in vivo mice model (C57BL/6 vs EPAC1 KO mice, iv injections, 12mg/kg) and in vitro model (primary culture of neonatal rat cardiomyocytes (NRVM), Dox 1μM). In vivo, Dox-treated mice developed a DCM associated with Ca2+ homeostasis dysfunction. In vitro, Dox induced DNA damages and cell death associated with huge mitochondrial disorders, characterized by a decrease in mitochondrial biogenesis and respiratory chain activity. This cell death is associated with apoptotic features including mitochondrial membrane permeabilization, caspase activation, cell size reduction and relative plasma membrane integrity. We also observed that Dox led to a modification of the protein level and the activity of EPAC1 in the same manner to the cAMP level. By contrast, the inhibition of EPAC1, prevented DNA/TopIIβ complexes, decreased Dox-induced DNA damages, loss of mitochondrial membrane potential, apoptosis and finally cardiomyocyte death. Mitochondrial biogenesis and respiratory chain activity operated normally when EPAC1 was inhibited. These results were confirmed in vivo since Dox-induced cardiotoxicity was prevented in EPAC1 KO mice as evidenced by unaltered cardiac function (no DCM) at 15 weeks post-treatment. Interestingly, the protection conferred by EPAC1 inhibition was not transferred in human cancer cell lines treated by Dox. Inhibition of EPAC1 could thus be a valuable therapeutic strategy to limit Dox-induced cardiomyopathy during cancer chemotherapy.

Les interactions lumière-matière dans les mileux moléculaires et bio-moléculaires peuvent mener à des processus complexes où les polarisations des champs optiques se couplent aux assemblages de dipoles de transitions moléculaires. La manipulation des polarisations des champs optiques en microscopie de uorescence peut en particulier donner accès à des modi cations nes d'arrangements moléculaires. Dans ce travail de thèse nous introduisons une méthode basée sur la variation continue d'un état de polarisation d'excitation complémentée par une analyse polarisée, appliquée à la microscopie de uorescence multi-photons. La uorescence à deux photons polarimétrique permet d'accéder à une information statique quantitative sur la forme et l'orientation de la distribution orientationnelle moléculaire dans des membranes lipidiques articielles, dans des cellules ou sur des composés molécluaires co-cristallins qui peuvent être fortement hétérogènes. La uorescence à trois photons polarimétrique apporte de plus un diagnostique de cristallinité dans des cristaux de protéines, avec une forte sensibilité à leur structure et symétrie. L'implémentation expérimentale de cette technique requiert de quantier les distortions de polarisation provenant du montage expérimental et de l'échantillon lui-même, qui sont nement analysés.

Les propriétés insecticides du Bacillus thuringiensis, découvert par ShigentaneIshiwatari, ont été utilisées pendant des décennies comme biopesticides et cette utilisation a augmenté rapidement en raison de préoccupations au sujet des effets environnementaux négatifs des pesticides chimiques. Actuellement, la toxine Bt dans la forme de biopesticides et des plantes transgéniques Bt peut compléter ou remplacer les pesticides chimiques. Il y a peu d’indication que la toxine Bt a un effet nocif pour l'environnement ou la santé humaine. Néanmoins, il ya des préoccupations que les cultures transgéniques commerciales peuvent avoir des effets néfastes sur l'environnement. Après son introduction dans le sol l'exsudation racinaire et la dégradation des résidus végétaux, la toxine Bt interagit avec les particules de sol. Les interactions de la toxine Bt avec des particules de sol influencent sa mobilité, sa biodisponibilité, sa persistance et sa toxicité.Dans cette étude, nous visons à établir l'importance relative des facteurs biologiques et physico-chimiques dans la détermination de la dynamique des protéines Cry détectables dans les sols, de clarifier si la protéine adsorbée conserve ses propriétés insecticides et d'identifier les propriétés du sol qui déterminent le devenir des protéines Cry dans le sol. Les résultats montrent que les protéines Cry ont une forte affinité sur la surface du sol. Cependant, il y avait peu de relation entre l'affinité pour le sol ou le rendement d'extraction et les propriétés du sol, y compris la teneur en argile, teneur en carbone organique et le pH du sol. Il y avait peu de rapport entre l'affinité et le rendement d'extraction. Les protéines diffèrent à la fois dans leur affinité pour les sols et leurs rendements d'extraction.Une évaluation du rôle du sol et des facteurs environnementaux dans le sort des protéines Cry de la formulation de biopesticides commerciale a montré un déclin rapide de la protéine Cry détectable soumise aux rayons du soleil sous la condition de laboratoire, alors que peu d'effet a été observé dans des conditions de terrain. La demi-vie des protéines dans le sol dans des conditions naturelles était d'environ 1 semaine. Des effets de la température forts ont été observés, mais ils diffèrent pour les biopesticides et la protéine purifiée, indiquant différentes étapes limitantes. Pour le biopesticide, la baisse observée était ralenties par des facteurs biologiques, y compris éventuellement sporulation. En revanche pour des protéines purifiées, augmentation de la température améliorée des changements conformationnels de la protéine adsorbée du sol, conduisant à une fixation et, par conséquent diminué efficacité d'extraction qui a diminué avec le temps. En outre, l'étude de la persistance de diverses protéines Cry dans les sols contrastés a été réalisée par immuno-détection et dosage biologique a montré que la toxine extractible diminue avec incubation allant jusqu'à quatre semaines. L'activité insecticide était toujours maintenue à l'état adsorbé, mais a disparue après deux semaines d'incubation à 25°C. La baisse de la protéine extractible et la toxicité était beaucoup plus faible à 4°C à 25°C. La stérilisation du sol n'a pas eu d'effet significatif sur la persistance de la toxine Cry indiquant que le déclin observé était provoqué par la fixation en fonction du temps de la protéine adsorbée ce qui diminue la quantité de toxine Cry extractable, la dégradation de la protéine par l’activité microbienne jouant un rôle plus mineur.L’exposition des insectes aux protéines Cry sous la forme adsorbé pourrait avoir un impact significatif sur les insectes cibles et même les insectes non cibles, et devrait être plus étudiée afin de déterminer son impact potentiel. / The insecticidal properties of Bacillus thuringiensis, discovered by Shigentane Ishiwatari, have been used for decades as biopesticides and this use has been increasing rapidly because of concerns about the negative environmental effects of chemical pesticides. Currently, Bt toxin in the form of both biopesticides and Bt transgenic plantsmay supplement or replace chemical pesticide. There is little evidence to demonstrate that Bt toxin has any harmful effect to the environment or to human health. Nevertheless, there are concerns that commercial transgenic crops may have harmful impacts on the environment. After release into soil via root exudation and breakdown of plant residues, Bt toxin interacts with soil particles. The interactions of Bt toxin with soil particles influence its mobility, its bioavailability, its persistence and its toxicity. In this study, we aim to establish the relative importance of biological and physicochemical factors in the determination of the dynamics of detectable Cry proteins in soils, to clarify if adsorbed protein maintains its insecticidal properties and to identify the soil properties that determine the fate of Cry proteins in soil. The results show that Cry proteins have strong affinity on soil surface. However, there was little relationship between affinity for soil or the extraction yield and soil properties including clay content, organic carbon content and soil pH. There was little relationship between the affinity and the extraction yield. The proteins differ in both their affinity for soil and their extraction yields.An assessment of role of soil and environmental factors in the fate of Cry protein from commercial biopesticide formulation showed a rapid decline of detectable Cry protein subjected to direct sunlight under the laboratory condition, whereas, little effect was observed under field conditions. The half-life of proteins in soil under natural conditions was about one week. Strong temperature effects were observed, but theydiffered for biopesticide and purified protein, indicating different limiting steps. For biopesticide, the observed decline was due to biological factors, possibly including sporulation. In contrast for purified proteins, increased temperature enhanced conformationalchanges of the soil-adsorbed protein, leading to fixation and hence extraction efficiency decreased that decreased with time. Moreover, the study of persistence of various Cry proteins in contrasting soils was carried out by immuno-detection and bioassay showed that extractable toxin decreased with incubation of up to four weeks. Insecticidal activity was still retained in the adsorbed state, but lost after two weeks of incubation at 25°C. The decline in extractable protein and toxicity was much lower at 4°C than 25°C. There was no significant effect of soil sterilization to persistence of Cry toxin indicating that decrease in detectable Cry toxin in soil may be time-dependent fixation of adsorbed protein as well as decreasing solubilization in larva midgut, but not microbial breakdown.Exposition to Cry in the adsorbed form could have a significant impact on target and even non target insects and should be investigation to determine the potential impact.

Un pontage ADN-protéine se forme lorsqu'une protéine se lie de façon covalente à l'ADN, ce qui a pour conséquence de bloquer certains processus biologiques tels que la réplication, la transcription, la réparation ou la recombinaison. Ces travaux de thèse consistent en l'étude des pontages se produisant lors d'une oxydation à un électron de l'ADN. La guanine possède le potentiel d'ionisation le plus bas parmi les composants de l'ADN; elle est donc facilement oxydée pour former un radical cation, lui-même impliqué dans la formation de nombreuses lésions oxydatives. Des travaux antérieurs ont permis de mettre en évidence la formation d'un adduit entre la guanine et la lysine, résultant de l'oxydation à un électron d'un oligonucléotide TGT en présence d'un peptide trilysine. Le mécanisme de cette réaction est une addition nucléophile de l'acide aminé central par le groupement amine ε, en position C8 du radical cation de la guanine. L'objectif de cette thèse a été de caractériser l'adduit guanine-lysine, de le quantifier dans l'ADN isolé puis dans l'ADN cellulaire, et d'étudier son implication dans la formation des pontages ADN-protéines. Différentes espèces nucléophiles sont capables de s'additionner sur le radical cation de la guanine. Nous nous sommes intéressés au cas des polyamines endogènes, qui sont des cations organiques présents en particulier dans le noyau des cellules. Ces molécules interviennent dans la stabilisation et la condensation de l'ADN, mais elles participent également à de nombreux processus cellulaires. Le lien entre polyamines et cancer a été largement décrit. Cependant le mécanisme par lequel la perturbation de leur métabolisme est impliquée dans le processus cancérogenèse reste à ce jour peu connu.Dans un premier temps, ces lésions ont été synthétisées chimiquement, sous la forme de nucléosides modifiés, afin de les caractériser. Par la suite des méthodes de quantification de ces dommages par chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem ont été développées. Ces méthodes analytiques nous ont permis de démontrer que les adduits guanine-lysine et guanine-polyamines pouvaient se former dans l'ADN isolé suite à une oxydation à un électron. Des pontages entre guanine et lysine ont été mis en évidence dans l'ADN extrait de cellules THP1 irradiées par impulsions laser à 266 nm. Nous avons ensuite développé différents modèles de pontages entre un peptide et un oligonucléotide, afin d'étudier la structure chimique du pontage, et de déterminer si celui-ci pouvait se produire entre la guanine et la lysine. Des adduits guanine-polyamines ont également été détectés dans de l'ADN extrait de spermatozoïdes. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives dans la compréhension du rôle physiologique des polyamines ainsi que de leur implication dans la fertilité masculine. / A DNA-protein crosslink (DPC) occurs when a protein becomes covalently bound to DNA. This kind of lesions seems to affect several metabolic processes, including DNA replication, transcription, repair and recombination. This PhD work deals with crosslinks which are formed through a one-electron oxidation of DNA. Guanine exhibits the lowest ionization potential among DNA components, therefore it is readily oxidized leading to the formation of a radical cation, which is involved in the formation of numerous oxidative DNA lesions. In a previous study, a crosslink between guanine moiety and a lysine residue, generated subsequently to a one electron oxidation of a TGT oligonucleotide in the presence of a trilysine peptide, has been described. The mechanism of formation of this adduct relies on the nucleophylic addition of the ε amino group of lysine onto the C8 position of the guanine radical cation. The aim of the present work was to characterize the guanine-lysine adduct and to quantify this lesion in isolated DNA and then in cellular DNA, and to investigate their implication in DNA-protein crosslinks. Several nucleophylic species are able to react with the guanine radical cation. We focused on polyamines, which are organic cations localized in the nucleus of cells at millimolar concentration ranges. These molecules are involved in stabilization and condensation of DNA, and participate also in numerous cellular processes. The relation between polyamine and cancer has been widely described. The mechanism by which dysregulation in their metabolism is related to carcinogenesis is still unknown.In the first part of this project, we focused on the synthesis and the characterization of these lesions as modified nucleosides. Subsequently, we have developed and optimized methods of quantification of these damages, using HPLC coupled with tandem mass spectrometry. Thanks to these analytical methods, we have demonstrated that guanine-lysine and guanine-polyamines adducts could be formed in isolated DNA following a one electron oxidation. Crosslinks between guanine and lysine have been highlighted in DNA extracted from THP1 cells exposed to laser pulses at 266 nm. We have then developed several crosslinks models between a peptide and an oligonucleotide, in order to investigate the chemical structure of the crosslink and determine whether it could occur between guanine and lysine. Guanine-polyamines adducts have also been detected in DNA extracted from sperm cells. These results open new prospects in the understanding of the physiological role of polyamines as well as their involvement in male fertility.