Ce travail de thèse porte sur l’étude de l’effet du traitement par champs électriques pulsés (CEP) sur l’amélioration de la congélation des tissus végétaux. Pour l’ensemble de notre étude, nous avons démontré que l’effet des champs électriques pulsés est complexe. Le prétraitement entraîne une électroperméabilisation des membranes. Les analyses calorimétriques ont mis en évidence que l’électroperméabilisation conduit à une augmentation de la teneur en eau liée. Les transferts de matière entre les milieux intra et extracellulaires sont intensifiés. Cela conduit à une modification dynamique de la composition des deux compartiments au cours de la congélation. En effet, les essais réalisés sur le cryo-pressage assisté par CEP démontrent que les températures de fusion sont plus basses et que le jus récupéré est beaucoup plus concentré. Il a été constaté que le temps de congélation d’un échantillon soumis préalablement à un prétraitement par champs électriques pulsés est sensiblement plus court que celui d’un échantillon sans prétraitement. D’autre part, l’électroperméabilisation facilite les transferts de matière avec le milieu extérieur. Le prétraitement par CEP accélère notamment l’imprégnation des tissus végétaux par des cryoprotectants, l’évaporation de l’eau libre et la sublimation de l’eau congelée. Finalement, le prétraitement par champs électriques pulsés induit des modifications de la structure des échantillons, de leur composition et influence favorablement les transferts couplés de masse et d’énergie. / This work is focused on the study of the effects of pulsed electric fields (PEF) on the improvement of plant tissues freezing. These studies have demonstrated that the effects of the PEF are rather complex. The PEF treatment results in membrane electro-permeabilization. Calorimetric analyses showed that the electro-permeabilization leads to an increase in bound water content. It also results in acceleration of mass transfer processes between intra- and extracellular parts of a tissue. The dynamic modification of the composition of these two parts during the freezing was observed. Experimental tests using the PEF-assisted cryo-pressing demonstrated that the melting temperatures were lower and that the extracted juice was much more concentrated as compared to untreated tissues. Moreover, the PEF-treatment allowed significant decreasing of freezing time. Furthermore, the electro-permeabilization facilitates the mass transfer with the external medium. The PEF treatment accelerates the impregnation of plant tissues by cryoprotectants, evaporation of free water and sublimation of frozen water. Finally, the treatment by PEF induces changes in the structure of the samples, their composition and positively influences both the mass and energy transfers.

Multielectron bubbles (MEBs) are micron sized cavities in liquid helium that contain electrons confined within a nanometer thick layer on the inner surface of a bubble. These objects present a rich platform to study the behavior of a two dimensional electron gas (2DES) on a curved surface. Most crucially, the surface electron densities in MEBs can vary over a wide range, making it a suitable candidate for studying classical Wigner crystallization and quantum melting in a single system. So far, there has been only limited experimental study of MEBs, with most of the previous investigation transient in nature. As we discuss in our presentation, we have built a cryogenic system for performing transport and optical measurements of MEBs down to 1.3 K. We have developed a new technique of generating MEBs, and trapping them using two different methods. In the first method, we trapped MEBs using a Paul trap for more than hundreds of milliseconds. This allows the MEBs to be further manipulated with buoyant and electric forces, such as to obtain reliable measurements of their physical properties. As we observe experimentally, the surface charge density of a single MEB can vary by orders of magnitude during the course of one measurement, thereby covering a previously unexplored section of the 2DES phase diagram. In the second method, we trapped MEBs using a dielectric coated metal electrode over many seconds. This also allowed the properties of MEBs to be measured in a non-destructive manner. Since MEBs are charged bubbles, their motion can be controlled by electric fields, which allowed us to measure the drag of MEBs as a function of Reynolds number by analysing the trajectories. Due to the low viscosity and surface tension of helium compared to other liquids, these measurements could be performed at Morton Numbers that have never been explored. We also show that how the shape of a single MEB evolves from spherical to ellipsoidal as their speeds vary. During the course of experiments, we observed number of interesting phenomena, such as coalescence of similarly charged bubbles, as well as their splitting into secondary bubbles at high speeds. Most interestingly, we have imaged their dynamics in the presence of static, as well as oscillating electric fields, which may provide insight into the phase of the electronic system present inside the bubbles.

Tesis por compendio / [ES] Generalmente, se utilizan tratamientos térmicos para la esterilización de emulsiones. Sin embargo, el calentamiento ha demostrado inducir la hidrólisis de lípidos y lecitina. En este sentido, las tecnologías no térmicas están surgiendo en la industria para alcanzar la estabilidad microbiana evitando la pérdida de calidad relacionada con el calor. El CO2 supercrítico (SC-CO2) y los campos eléctricos pulsados (PEF) son tecnologías no térmicas para la inactivación microbiana. Sin embargo, estas técnicas en ocasiones requieren altas intensidades o tiempos de tratamiento largos para garantizar la seguridad del producto. La literatura ha demostrado la capacidad de los ultrasonidos de alta potencia (HPU) para intensificar fenómenos de transferencia de masa y calor. Por lo tanto, su aplicación a tecnologías no térmicas podría ser un enfoque interesante para mejorar la efectividad de la inactivación microbiana. En este contexto, el objetivo fue evaluar el efecto de los tratamientos SC-CO2, PEF y HPU, aplicados de forma individual y combinada, sobre la inactivación de diferentes microorganismos en emulsiones. Para ello, por un lado, se estudió el efecto de la aplicación de HPU a los tratamientos SC-CO2 sobre diferentes tipos de microorganismos y sobre medios con diferente contenido en aceite. Por otro lado, se evaluó el efecto de los tratamientos PEF y HPU individuales y combinados sobre diferentes microorganismos Los resultados mostraron que, en general, la aplicación de HPU intensificó la capacidad de inactivación de SC-CO2. Los HPU probablemente facilitaron la solubilidad del CO2 en el medio y provocaron daños en las células. En este sentido, el análisis microscópico de las células inactivadas reveló importantes cambios morfológicos, incluyendo paredes celulares dañadas y pérdida del contenido citoplasmático. En cambio, los HPU no mejoraron la inactivación de SC-CO2 de las esporas de A. niger en emulsión. El aumento de la presión llevó a una mayor inactivación, a excepción de E. coli en agua, donde no se encontró efecto de la presión. Sin embargo, las presiones por encima de 350 bar no parecen ejercer ninguna inactivación adicional. El aumento de temperatura tuvo un efecto significativo para todos los tratamientos y microorganismos. En cuanto al efecto del medio, se sabe que la presencia de aceite protege a los microorganismos, como se observó en la inactivación de bacterias SC-CO2 en agua y en emulsiones con diferente contenido en aceite. Sin embargo, la aplicación de HPU enmascaró el efecto protector que ejerce el aceite en las emulsiones. En cambio, para las esporas de A. niger no se encontró efecto del medio sobre la efectividad de los tratamientos. En relación al efecto de los tratamientos de SC-CO2 + HPU sobre la calidad de las emulsiones, se encontró un efecto leve de las condiciones del proceso y mediante la selección de condiciones adecuadas de SC-CO2 + HPU, se pudieron obtener cambios mínimos en la calidad de las emulsiones y una inactivación satisfactoria de todos los microorganismos, excepto para las esporas de G. stearothermophilus. Con respecto a los tratamientos de PEF y HPU, no se logró la inactivación completa de las emulsiones con los tratamientos individuales. Sin embargo, cuando el PEF (152,3-176,3 kJ / kg) fue seguido de HPU (3 min), se obtuvieron niveles de inactivación de 8,2, 6,6 y 1,0 ciclos-log para E. coli, A. niger y B. pumilus. Además, la inactivación lograda por el tratamiento con PEF-HPU fue mayor que la de la suma de los tratamientos individuales para todos los microorganismos. Por el contrario, la inactivación lograda por el tratamiento HPU-PEF fue menor que la de la suma de los tratamientos individuales. Por lo tanto, la secuencia más eficaz fue aquella en la que el PEF fue seguido de los HPU. Se puede concluir que, la combinación de HPU con SC-CO2 o PEF generalmente mejoró la inactivación microbiana. En consecuencia, se podrían utili / [CA] Generalment, s'utilitzen tractaments tèrmics per a l'esterilització d'emulsions. No obstant això, el calfament ha demostrat induir la hidròlisi de lípids i lecitina. En aquest sentit, les tecnologies no tèrmiques estan sorgint en la indústria per a aconseguir l'estabilitat microbiana evitant la pèrdua de qualitat relacionada amb la calor. El CO¿ supercrític (SC-CO¿) i els camps elèctrics premuts (PEF) són tecnologies no tèrmiques per a la inactivació microbiana. No obstant això, aquestes tècniques a vegades requereixen altes intensitats o temps de tractament llargs per a garantir la seguretat del producte. La literatura ha demostrat la capacitat dels ultrasons d'alta potència (HPU) per a intensificar fenòmens de transferència de massa i calor. Per tant, la seua aplicació a tecnologies no tèrmiques podria ser un enfocament interessant per a millorar l'efectivitat de la inactivació microbiana. En aquest context, l'objectiu va ser avaluar l'efecte dels tractaments SC-CO¿, PEF i HPU, aplicats de manera individual i combinada, sobre la inactivació de diferents microorganismes en emulsions. Per a això, d'una banda, es va estudiar l'efecte de l'aplicació de HPU als tractaments SC-CO¿ sobre diferents tipus de microorganismes i sobre mitjans amb diferent contingut en oli. D'altra banda, es va avaluar l'efecte dels tractaments PEF i HPU individuals i combinats sobre diferents microorganismes Els resultats van mostrar que, en general, l'aplicació de HPU va intensificar la capacitat d'inactivació de SC-CO2. Els HPU probablement van facilitar la solubilitat del CO¿ en el mitjà i van provocar danys en les cèl·lules. En aquest sentit, l'anàlisi microscòpica de les cèl·lules inactivades va revelar importants canvis morfològics, incloent parets cel·lulars danyades i pèrdua del contingut citoplasmàtic. En canvi, els HPU no van millorar la inactivació de SC-CO2 de les espores de A. niger en emulsió. L'augment de la pressió va portar a una major inactivació, a excepció d'E. coli en aigua, on no es va trobar efecte de la pressió. No obstant això, les pressions per damunt de 350 bar no semblen exercir cap inactivació addicional. L'augment de temperatura va tindre un efecte significatiu per a tots els tractaments i microorganismes. Quant a l'efecte del medi, se sap que la presència d'oli protegeix els microorganismes, com es va observar en la inactivació de bacteris SC-CO¿ en aigua i en emulsions amb diferent contingut en oli. No obstant això, l'aplicació de HPU va emmascarar l'efecte protector que exerceix l'oli en les emulsions. En canvi, per a les espores de A. niger no es va trobar efecte del medi sobre l'efectivitat dels tractaments. En relació a aquest efecte dels tractaments de SC-CO2 + HPU sobre la qualitat de les emulsions, es va trobar un efecte lleu de les condicions del procés i mitjançant la selecció de condicions adequades de SC-CO2 + HPU, es van poder obtindre canvis mínims en la qualitat de les emulsions i una inactivació satisfactòria de tots els microorganismes, excepte per a les espores de G. stearothermophilus. Respecte als tractaments de PEF i HPU, no es va aconseguir la inactivació completa de les emulsions amb els tractaments individuals. No obstant això, quan el PEF (152,3-176,3 kJ / kg) va ser seguit de HPU (3 min), es van obtindre nivells d'inactivació de 8,2, 6,6 i 1,0 cicles- log per a E. coli, A. niger i B. pumilus. A més, la inactivació reeixida pel tractament amb PEF- HPU va ser major que la de la suma dels tractaments individuals per a tots els microorganismes. Per contra, la inactivació reeixida pel tractament HPU- PEF va ser menor que la de la suma dels tractaments individuals. Per tant, la seqüència més eficaç va ser aquella en la qual el PEF va ser seguit dels HPU. Es pot concloure que, la combinació de HPU amb SC-CO¿ o PEF generalment va millorar la inactivació microbiana. En conseqüència, es podrien utilitzar temps de / [EN] Thermal treatments are generally used for the sterilization of emulsions. However, heating has demonstrated its ability to induce the hydrolysis of lipids and lecithin. In this sense, non-thermal technologies are emerging in the industry with the aim of achieving microbial stability while avoiding the loss of quality related to heat. Supercritical carbon dioxide (SC-CO2) and pulsed electric fields (PEF) are non-thermal technologies for microbial inactivation. However, these techniques have demonstrated to require high treatment intensities or long treatment times to guarantee the product's safety. Therefore, there is still room for the improvement in the use of these technologies. Literature has illustrated the capacity of high power ultrasound (HPU) for the intensification of mass and/or heat transfer phenomena. Therefore, its application to non-thermal technologies could be an interesting approach to enhance the microbial inactivation effectiveness. In this context, the objective was to evaluate the effect of SC-CO2, PEF and HPU treatments, applied in individual and combined form, on the inactivation of different microorganisms in emulsions. In order to achieve this goal, on the one hand, the influence of the implementation of HPU to the SC-CO2 treatments was studied on different types of microorganisms and on media with different oil content. On the other hand, the effect of the individual and combined PEF and HPU treatments was assessed on different microorganisms. Results showed that, generally, the application of HPU intensified the inactivation capacity of SC-CO2. HPU probably enhanced the solubilization of CO2 into the medium and provoked damages in the cells. In this regard, the microscopy analysis of the inactivated cells revealed important morphological changes, including damaged cell walls and an important loss of the cytoplasmic content. Nevertheless, HPU did not improved the SC-CO2 inactivation of A. niger spores in emulsion. The increase of the pressure led to a higher inactivation, except for E. coli in water, where no effect of pressure was found. However, pressures above 350 bar did not seem to exert any additional inactivation. The increase of the temperature had a significant effect for all treatments and microorganisms. Regarding the effect of the medium, the presence of oil is known to protect microorganisms, as was observed in the SC-CO2 inactivation of bacteria in water and in emulsions with different oil content. However, the application of HPU masked the protective effect exerted by the oil in the emulsions. On the contrary, for A. niger spores no effect of the media was found on the effectiveness of the treatments In relation to the effect of the SC-CO2 + HPU treatments on the quality of the treated emulsions, only a mild effect of the process conditions was found and by the selection of suitable SC-CO2 + HPU conditions, minimal changes on the quality of the emulsions and a satisfactory inactivation for all the microorganisms, except for G. stearothermophilus spores, can be obtained. Regarding PEF and HPU treatments, the complete inactivation in the emulsions was not achieved with the individual treatments. However, when PEF (152.3-176.3 kJ/kg) was followed by HPU (3 min), inactivation levels of 8.2, 6.6 and 1.0 log-cycles were obtained for E. coli, A. niger and B. pumilus, respectively. Moreover, the inactivation achieved by the PEF-HPU treatment was higher than the sum of the individual treatments for all microorganisms. On the contrary, the inactivation achieved by HPU-PEF treatment was lower than that of the sum of the individual treatments. Thus, the most effective sequence for the combined treatment was the one in which PEF was followed by HPU. It can be concluded that, the combination of HPU with SC-CO2 or PEF generally improved the microbial inactivation. Consequently, reasonable processing times and mild process conditions could be used. / Gómez Gómez, Á. (2021). Pasteurization of Lipid Emulsions with Supercritical CO2 and High Power Ultrasound [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/175486 / TESIS / Compendio

L'utilisation de champs électriques pulsés (PEF) dans les secteurs de la médecine et de la biotechnologie est devenue de plus en plus courante au cours des dernières décennies. La recherche a montré qu'en ajustant la durée du PEF, nous pouvons prédire quels effets seront observés. Alors que les PEF dans la gamme micro - milliseconde ont été utilisés pour perméabiliser la membrane cellulaire et améliorer l'absorption de médicament ou de protéine, le PEF nanoseconde (nsPEF) a démontré des effets uniques sur les organites intracellulaires. Les deux PEF et nsPEF ont démontré un potentiel thérapeutique pour une variété de pathologies humaines, y compris le traitement du cancer. Utilisant l'imagerie des cellules vivantes, cette thèse a étudié in vitro les effets de champs pulsés d'une durée de 10 ns à 10 ms sur des lignées cancéreuses (U87 glioblastome multiforme) et non cancéreuses (neurones hippocampes de souris (HT22) et cellules ovariennes du hamster chinois (CHO)). Des résultats publiés antérieurement ont démontré que les cellules cancéreuses sont plus sensibles aux champs électriques que les cellules saines. Nos résultats sont en accord avec ces résultats, dans la mesure où les cellules U87 ont subi une dépolarisation significativement plus importante de leur potentiel transmembranaire après une seule impulsion électrique à toutes les durées. Dans un ensemble d'expériences parallèles, malgré des seuils de champ électrique similaires pour la perméabilisation membranaire, les cellules U87 ont démontré une absorption significativement améliorée de YO-PRO par rapport aux autres lignées cellulaires. Bien que les cellules U87 aient subi le plus grand changement dans la dépolarisation membranaire et la perméabilisation membranaire, elles ont également montré la constante de rescellement de la membrane la plus rapide, qui était environ 30 secondes plus rapide que les autres lignées cellulaires. Pour élucider certains des mécanismes sous-jacents par lesquels les cellules U87 répondent aux champs électriques, une série d'expériences a examiné le rôle des canaux ioniques transmembranaires. Plusieurs études récentes ont rapporté que les PEF peuvent agir directement sur les canaux ioniques voltage-dépendants. En utilisant divers modulateurs de canaux ioniques pharmacologiques spécifiques et à action large, nous avons démontré que nous pouvions presque entièrement inhiber la dépolarisation membranaire induite par le champ électrique dans les cellules U87 en bloquant certains canaux cationiques. Ces résultats étaient assez spécifiques, tels que le canal de potassium de grande conductance (BK), les canaux calciques de type L et T, et le canal cationique non spécifique, TRPM8, étaient capables d'inhiber la dépolarisation tandis que le blocage d'autres canaux ioniques ne produisait aucun changement significatif. . Les travaux de cette thèse ont montré que la lignée cellulaire maligne U87 présentait une plus grande sensibilité aux champs électriques allant de 10 ns à 10 ms par rapport aux lignées cellulaires non cancéreuses étudiées. Des améliorations potentielles aux protocoles de traitement actuels ont été proposées sur la base des résultats présentés ici. / The use of pulsed electric fields (PEF) in medical and biotechnology sectors has become increasingly prevalent over the last few decades. Research has shown that by adjusting the duration of the PEF we can predict what effects will be observed. Whereas PEF in the micro-to-millisecond range have been used to permeabilize the cell membrane and enhance drug or protein uptake, nanosecond PEF (nsPEF) have demonstrated unique effects on intracellular organelles. Both PEF and nsPEF have demonstrated therapeutic potential for a variety of human pathologies, including the treatment of cancer. Using live-cell imaging, this thesis investigated, in vitro, the effects of pulsed fields ranging in duration from 10 ns to 10 ms on cancerous (U87 glioblastoma multiforme) and non-cancerous cell lines (mouse hippocampal neurons (HT22) and Chinese hamster ovary (CHO) cells). Previously published results have demonstrated that cancerous cells have a greater sensitivity to applied electric fields than healthy cells do. Our results are in agreement with these findings, insofar as the U87 cells underwent a significantly greater depolarization of their transmembrane potential following a single electric pulse at all durations. In a parallel set of experiments, despite having similar electric field thresholds for membrane permeabilization, the U87 cells demonstrated significantly enhanced YO-PRO uptake compared to the other cells lines. Although U87 cells underwent the greatest change in both membrane depolarization and membrane permeabilization, they also showed the fastest membrane resealing constant, which was approximately 30 seconds faster than other cell lines. To elucidate some of the underlying mechanisms by which U87 cells respond to electric fields, a series of experiments looked at the role of transmembrane ion channels. Several recent studies have reported that PEFs can act directly on voltage-gated ion channels. Using a variety of specific and broad acting pharmacological ion channel modulators, we demonstrated that we could almost entirely inhibit the electric field-induced membrane depolarization in U87 cells by blocking certain cationic channels. These results were quite specific, such that the big conductance potassium (BK) channel, L- and T-type calcium channels, and the non-specific cationic channel, TRPM8, were able to inhibit depolarization while blocking other ion channels produced no significant change. The work in this thesis showed that the malignant U87 cell line showed a greater sensitivity to electric fields from ranging from 10 ns – 10 ms when compared to the non-cancerous cell lines that were investigated. Potential improvements to current treatment protocols have been proposed based on the findings presented herein.

<p>Modeling microbial inactivation has a great influence on the optimization, control and design of food processes. In the area of food safety, modeling is a valuable tool for characterizing survival curves and for supporting food safety decisions. The modeling of microbial behavior is based on the premise that the response of the microbial population to the environment factors is reproducible. And that from the past, it is possible to predict how these microorganisms would respond in other similar environments. Thus, the use of mathematical models has become an attractive and relevant tool in the food industry.</p> <p>This research provides tools to relate the inactivation of microorganisms of public health importance with processing conditions used in nonisothermal and non-thermal food processing technologies. Current models employ simple approaches that do not capture the realistic behavior of microbial inactivation. This oversight brings a number of fundamental and practical issues, such as excessive or insufficient processing, which can result in quality problems (when foods are over-processed) or safety problems (when foods are under-processed). Given these issues, there is an urgent need to develop reliable models that accurately describe the inactivation of dangerous microbial cells under more realistic processing conditions and that take into account the variability on microbial population, for instance their resistance to lethal agents. To address this urgency, this dissertation focused on mathematical models, combined mathematical tools with microbiological science to develop models that, by resembling realistic and practical processing conditions, can provide a better estimation of the efficacy of food processes. The objective of the approach is to relate the processing conditions to microbial inactivation. The development of the modeling approach went through all the phases of a modeling cycle from planning, data collection, formulation of the model approach according to the data analysis, and validation of the model under different conditions than those that the approach was developed.</p> <p>A non-linear ordinary differential equation was used to describe the inactivation curves with the hypothesis that the momentary inactivation rate is not constant and depends on the instantaneous processing conditions. The inactivation rate was related to key process parameters to describe the inactivation kinetics under more realistic processing conditions. From the solution of the non-linear ordinary differential equation and the optimization algorithm, safety inferences in the microbial response can be retrieved, such as the critical lethal variable that increases microbial inactivation. For example, for nonisothermal processes such as microwave heating, time-temperature profiles were modeled and incorporated into the inactivation rate equation. The critical temperature required to increase the microbial inactivation was obtained from the optimization analysis. For non-thermal processes, such as cold plasma, the time-varying concentration of reactive gas species was incorporated into the inactivation rate equation. The approach allowed the estimation of the critical gas concentration above which microbial inactivation becomes effective. For Pulsed Electric Fields (PEF), the energy density is the integral parameter that groups the wide range of parameters of the PEF process, such as the electric field strength, the treatment time and the electrical conductivity of the sample. The literature has shown that all of these parameters impact microbial inactivation. It has been hyphothesized that the inactivation rate is a function of the energy density and that above a threshold value significant microbial inactivation begins. </p> <p>The differential equation was solved numerically using the Runge-Kutta method (<i>ode45</i> in MATLAB ®). The<i> lsqcurvefit</i> function in MATLAB ® estimated the kinetic parameters. The approach to model microbial inactivation, whether when samples were subjected to nonisothermal or to non-thermal food processes, was validated using data published in the literature and/or in other samples and treatment conditions. The modeling approaches developed by this dissertation are expected to assist the food industry in the development and validation process to achieve the level of microbial reduction required by regulatory agencies. In addition, it is expected to assist the food industry in managing food safety systems through support food safety decision-making, such as the designation of the minimal critical parameter that may increase microbial inactivation. Finally, this dissertation will contribute in depth to the field of food safety and engineering, with the ultimate outcome of having a broad and highly positive impact on human health by ensuring the consumption of safe food products.</p>

Les impulsions de champ électrique nanoseconde de forte intensité (nsPEF) ont été proposées pour le traitement du cancer avec des effets secondaires minimes et peu susceptibles de conduire à une résistance de la tumeur au traitement. Le glioblastome multiforme (GBM) est un cancer du cerveau incurable montrant une résistance aux traitements actuels tels que la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie. Dans cette thèse, l'imagerie des cellules vivantes est utilisée pour étudier in vitro les effets de nsPEF sur une lignée de cellules de glioblastome humain (U87-MG), et pour évaluer la pertinence de l'utilisation des nsPEF en tant que nouveau traitement pour le GBM. En accord avec les résultats publiés précédemment, nous montrons que les cellules U87-MG répondent aux nsPEF avec une poration de la membrane plasmique, une augmentation rapide du calcium intracellulaire et une perte progressive du potentiel de membrane mitochondriale. De nouveaux résultats montrent que 100 impulsions de 10 ns délivrées à 44 kV/cm perturbent la dynamique de croissance des microtubules indépendamment du calcium et du gonflement, ces derniers étant connus pour provoquer la dépolymérisation des microtubules. La microscopie à super-résolution nous a permis de visualiser les flexions et ruptures de microtubules après l'application nsPEF suggérant un effet plus direct des impulsions. L'étude des nsPEF sur le calcium a également été menée via des indicateurs de calcium génétiquement encodés (GECIs) qui permettent une comparaison entre les GECIs et les indicateurs chimiques couramment utilisés. En utilisant le GECI GCaMP, le potentiel d'expression des GECIs dans des endroits subcellulaires spécifiques a permis de mettre en évidence une onde de calcium induite par l'application des nsPEF, grâce à une forme de GCaMP fixée à la membrane plasmatique. Ce phénomène, qui n'est pas habituel avec des indicateurs chimiques cytosoliques classiques en raison de la diffusion, permet de confirmer l'origine extracellulaire des pics de calcium post nsPEF. Cette thèse démontre que les nsPEF appliqués à des cellules U87-MG induisent plusieurs effets cellulaires majeurs et potentiellement destructeurs. La perturbation du réseau de microtubules par les nsPEF pourrait éventuellement être exploitée comme un antimitotique, administré localement, pour le traitement de GBM, avec des effets secondaires systémiques réduits et une faible résistance au traitement. / High powered, nanosecond duration pulsed electric fields (nsPEF) have been proposed as a minimal side-effect, electrical cancer therapy that is unlikely to result in tumour resistance. Glioblastoma multiforme (GBM) is an incurable brain cancer showing resistance to current treatments such as surgery, radiotherapy and chemotherapy. This thesis uses live-cell imaging to look in vitro at the effects of nsPEF on a human glioblastoma cell line (U87-MG) in a first step towards assessing its suitability as a novel treatment for GBM. In agreement with previously published results we show that U87-MG cells respond to nsPEF with plasma membrane poration, a rapid increase in intracellular calcium and a gradual loss of mitochondrial membrane potential. We present novel results showing that 100, 10 ns pulses delivered at 44 kV/cm disrupt microtubule growth dynamics in a way that is independent of calcium and swelling, both of which are known to cause microtubule depolymerisation. Super-resolution microscopy allowed us to visualise microtubules bending and breaking following nsPEF application suggesting a more direct effect of the pulse. We look also at the application of genetically encoded calcium indicators (GECIs) to nsPEF calcium studies making a comparison between GECIs and commonly used chemical indicators. Using the GECI GCaMP, we show the advantages of being able to express GECIs in specific subcellular locations by visualising an nsPEF induced calcium wave with a plasma membrane bound form of GCaMP. This event, which is not evident with classic cytosolic chemical indicators due to diffusion, helps confirm the extracellular origin of the post-nsPEF calcium spike. The work in this thesis demonstrates that nsPEF causes several major, and possibly destructive, cellular events when applied to U87-MG cells. The disruption of the microtubule network by nsPEF could potentially be exploited as a locally administered antimitotic, for GBM treatment, with reduced systemic side effects and lower occurrences of resistance.

Ce travail de thèse concerne l’utilisation des électrotechnologies pour une valorisation optimisée de la betterave à sucre conformément au concept de bioraffinerie. Les électro-technologies appliquées sont les champs électriques pulsés (CEP) et les décharges électriques de haute tension (DEHT). L’étude s’attache d’une part à l’optimisation d’un procédé alternatif pour l’extraction du sucre par pressage alcalin à froid assisté par CEP. D’autre part, elle propose des nouvelles voies pour la valorisation de deux coproduits de l’industrie betteravière qui sont les radicelles et la pulpe de betterave. Dans la première partie, le traitement électrique par CEP couplé au chaulage permet une meilleure désintégration du tissu betteravier. Il permet d’accélérer les cinétiques du pressage, d’améliorer le rendement ainsi que la qualité du jus et d’alléger la procédure de purification en aval de l’extraction. Une étude paramétrique d’optimisation a permis d’identifier le meilleur itinéraire d’application de ce nouveau procédé d’extraction. Les cossettes fraîches de betterave sont prétraitées par CEP à 600 V/cm pour 10 ms (Q = 2,7 Wh/kg). Les cossettes électroporées sont ensuite pressées à froid pour extraire 75 % du jus. Les cossettes pressées subissent un pressage alcalin avec 10 % du lait de chaux. Afin d’extraire le sucre résiduel dans le gâteau de pressage obtenu, deux étapes de pressage supplémentaires avec une étape intermédiaire d’hydratation sont nécessaires. Ce procédé optimisé permet de bien épuiser les cossettes en sucre (perte en sucre de 0,23 % et matière sèche de pulpes de 39 %) pendant une courte durée d’extraction (30 min) avec un faible soutirage (108 %) par rapport au procédé de diffusion. Il permet ainsi des économies significatives de matière et d’énergie surtout pour les étapes d’extraction du jus et de séchage de pulpes. Par rapport au procédé conventionnel, le gain énergétique s’élève à 91,96 × 106 kWh pour une usine traitant 10 000 t/j de betteraves pendant une campagne de 110 jours. De plus, le procédé proposé permet de simplifier la procédure de purification et de réduire de 50 à 60 % la quantité de chaux utilisée. Dans la deuxième partie de cette étude, deux procédés de transformation ont été proposés et optimisés à l’échelle laboratoire pour la valorisation des radicelles et de la pulpe de betterave à sucre. Les radicelles ont été utilisées pour produire du bioéthanol. Le jus brut de radicelles a été extrait par pressage à froid assisté par CEP. La production du bioéthanol a été achevée par fermentation alcoolique. Le prétraitement par CEP (450 V/cm, 10 ms) a permis d’accélérer la cinétique de pressage, d’augmenter le rendement en solutés (79,85 % vs. 16,8 %) et d’obtenir un jus plus concentré (10 % vs. 5,2 %). Le procédé optimisé permet de produire environ 41,75 L de bioéthanol par tonne de radicelles lorsque l’on applique un prétraitement par CEP contre seulement 8,2 L de bioéthanol sans prétraitement électrique confirmant ainsi le potentiel de ce nouveau schéma de valorisation. La pulpe de betterave déshydratée ayant une matière sèche de 92,8 % a été utilisée pour l’extraction de pectines. L’étude réalisée a montré que l’application d’un prétraitement par DEHT permet d’intensifier l’extraction des pectines. Le gain relatif de rendement en pectines est de 25,3 % pour une énergie consommée de 76,2 kJ/kg. Le schéma de bioraffinage proposé pourra aider au maintien de la filière betteravière en France après la suppression de système de quotas sucriers dans l’Union européen qui entrera en vigueur le 1er octobre 2017. / This work discusses the use of electrotechnologies for an optimized valorization of sugar beet according to the concept of biorefinery. The applied electrotechnologies are pulsed electric fields (PEF) and high-voltage electrical discharges (HVED). The study firstly aims at optimizing an alternative method for sugar extraction by PEF assisted cold alkaline pressing. On the other hand, it proposes new ways for valorizing two by-products of sugar beet industry, which are sugar beet tails and pulps. In the first part, PEF treatment combined with liming leads to a better disintegration of beet tissue. It permits accelerating of pressing kinetics, improvement of juice yield and quality, and reduction of subsequent purification procedure. A parametric optimization study identified the best application itinerary of the proposed extraction process. Fresh sugar beet cossettes are pretreated by PEF at 600 V/cm for 10 ms (Q = 2.7 Wh/kg). The electroporated cossettes are then pressed to extract 75% of intracellular juice. Compressed cossettes are subjected to an alkaline pressing with 10% lime milk. In order to extract the residual sucrose in the obtained press-cake, two additional steps of pressing with an intermediate hydration are required. This optimized process allows well exhausting the sugar cossettes (sugar loss of 0.23% and pulp dry matter of 39%) for a short extraction (30 min) and with low draft (108%) compared to diffusion method. Thus, it allows substantial saving in materials and energy especially for juice extraction and pulp drying. Compared to the conventional method, the energy saving amounted to 91.96 × 106 kWh for a sugar beet factory treating 10 000 tons per day for a campaign of 110 days. In addition, the proposed method simplifies the purification procedure of raw juice and reduces the used amount of lime from 50 to 60%. In the second part of this study, two processing methods were proposed and optimized at lab-scale for valorization of sugar beet tails and pulps. Sugar beet tails were used to produce bioethanol. Raw juice of beet tails was extracted by PEF assisted cold pressing. Bioethanol production was then done by alcoholic fermentation. Pretreatment of beet tails with PEF (450 V/cm, 10 ms) permits accelerating the pressing kinetics, increasing the yield of solutes (79.85% vs. 16.8%), and leads to a more concentrated juice (10% vs. 5.2%). The optimized process permits the production of about 41.75 L of bioethanol per ton of beet tails when PEF pretreatment is applied against only 8.2 L of bioethanol without PEF confirming the potential of this new valorization scheme. Dried beet pulp having a dry matter of 92.8% was used for pectin recovery. The present study showed that the application of HVED pretreatment leads to intensify pectin extraction. The relative gain of pectin yield is 25.3% with an energy consumption of 76.2 kJ/kg. The proposed biorefinery scheme could protect the sugar beet industry in France after the suppression of the sugar quota system in the European Union, which will take effect on 1st October 2017.

Ce travail de thèse concerne l'étude et l'évaluation de l'extraction et de la séparation de molécules d'intérêt à partir des résidus de colza. L'impact des différents traitements (broyage, champs électriques pulsés, décharges électriques de hautes tensions et ultrasons) sur l'amélioration de l'extraction des polyphénols et des protéines à partir des tiges de colza a été comparé. Ces traitements permettent d'endommager les membranes et/ou parois cellulaires de manière mécanique, électrique ou acoustique, facilitant ainsi la libération des composés intracellulaires vers le milieu extérieur. La cinétique d'extraction, le rendement en polyphenols totaux et en protéines et la consommation énergétique sont principalement étudiés. De plus, l'efficacité des traitements étudiés pour l'extraction des polyphénols et protéines, en fonction du degré de maturité de la plante a été étudiée. Les méthodes testées pour la séparation des extractibles (polyphénols et protéines) concernent la coagulation, la filtration membranaire ainsi que le couplage de ces deux méthodes afin de réduire la consommation de solvants organiques et la rétention des polyphénols au cours de séparation. La séparation des extractibles a été évaluée par le biais de l'analyse de pureté et du taux de rétention. Enfin, des effets positifs du traitement électrique sur l'étape de séparation des extractibles tels que l'augmentation du flux du perméat et la diminution du colmatage ont été remarqués. / This thesis work concerns the study and the evaluation of the extraction and the separation of valuable compounds from rapeseed residues. The impact of different treatments (grinding, pulsed electric fields, high voltage electrical discharges and ultrasound) on the enhancement of the extraction of polyphenols and proteins from rapeseed stems was compared. These treatments can damage cell membranes and 1 or cell walls mechanically, electrically or acoustically, thus facilitating the release of intracellular compounds to the surroundings. The extraction kinetics, yield of total polyphenols and proteins and energy consumption were mainly studied. In addition, influences of plant maturity on the efficiency of studied treatments for the extraction of polyphenols and proteins have been studied. The methods tested for the separation of extractives (polyphenols and proteins) include coagulation, membrane filtration and the combination of these two methods in order to reduce the consumption of organic solvents and the retention ofpolyphenols during separation. The separation of extractives was evaluated by means of analysis of purity and relative removal. Finally, positive effects of electrical treatment on the extractive separation step such as the increase ofpermeate flux and the decrease of membrane fouling have been observed.

Ce travail de doctorat traite l’optimisation des méthodes d’extraction des composés phénoliques à partir des sous-produits de la viticulture et de la viniculture, à savoir les sarments de vigne et les marcs de raisins. Plusieurs technologies innovantes sont appliquées et comparées : l’extraction accélérée par solvant (EAS), les décharges électriques de haute-tension (DEHT), les ultrasons (US) et les champs électriques pulsés (CEP). Les extractions solide-liquide faites sur les sarments ont montré que, parmi les solvants étudiés, l’eau est le moins efficace. L’ajout de la β-cyclodextrine dans l’eau améliore le procédé d’extraction mais est moins efficace que les mélanges hydroéthanoliques. L’extraction en milieu alcalin donne le meilleur rendement en composés phénoliques. L’intensification de l’extraction des composés phénoliques des sarments est possible grâce aux nouvelles technologies d’extraction. L’efficacité des méthodes testées est la moindre avec les US, moyenne avec les CEP pour atteindre le meilleur rendement phénolique avec les DEHT. La filtrabilité de ces extraits est d’autant plus lente que leur composition est complexe. L’ultrafiltration membranaire permet une très bonne purification et concentration des composés phénoliques. L’étude des mécanismes d’action des DEHT a permis d’identifier les phénomènes favorisant l’extraction des composés phénoliques à partir des sarments. Un effet mécanique des DEHT, capable de fragmenter les sarments, est en majorité responsable de cette amélioration. Le procédé énergivore du broyage pourra alors être omis. Un effet électrique contribuant également à l’intensification du procédé d’extraction est démontré. La formation de peroxyde d’hydrogène durant le traitement par DEHT est quantifiée mais ne semble pas altérer les composés phénoliques qui sont des molécules à capacité antiradicalaire élevée. Quant aux études portées sur les marcs de raisins, la variation simultanée de plusieurs paramètres opératoires a permis l’optimisation de l’extraction aqueuse et hydroéthanolique des composés phénoliques en ayant recours à la méthodologie de surface de réponse (MSR). Le passage d’un milieu aqueux à un milieu hydroéthanolique a permis d’améliorer nettement le procédé d’extraction solide-liquide des composés phénoliques et l’utilisation de l’EAS a permis l’augmentation du rendement en composés phénoliques jusqu’à trois fois par rapport à l’optimum obtenu en milieu hydroéthanolique. / This study deals with the optimization of the extraction methods of phenolic compounds from viticulture and viniculture by-products, namely vine shoots and grape pomace. Several innovative technologies were tested and compared: high voltage electrical discharges (HVED), accelerated solvent extraction (ASE), ultrasounds (US) and pulsed electric fields (PEF). The solid-liquid extraction conducted on vine shoots showed that, amongst the studied solvents, water is the least effective. The addition of the β-cyclodextrin to water improves the extraction process but remains less effective than that with hydroethanolic mixtures. The extraction in alkaline medium gives the highest phenolic compound extraction yields. The intensification of phenolic compound extraction from vine shoots was possible thanks to new extraction technologies. The effectiveness of the tested methods was the least with US, followed by PEF to accomplish the highest phenolic yield with HVED. The filterability of the extracts was slower when their composition was complex, and the membrane technology allowed a good purification and concentration of phenolic compounds. The reason behind the high effectiveness of HVED was investigated. The action mechanisms of HVED were studied in details. A mechanical effect of HVED provoked vine shoots fragmentation and particle size reduction. This was the main phenomenon responsible for the intensification of the extraction process. It also suggested that a grinding pretreatment would not be necessary prior to HVED, which considerably diminishes the energy input of the overall process. The presence of a non-mechanical effect and its contribution in the efficiency of HVED were also shown. The formation of hydrogen peroxide during the treatment was observed. However it did not seem to alter vine shoot phenolic compounds since these demonstrated a high radical scavenging capacity. As for the studies conducted on grape pomace, the simultaneous variation of several operating parameters allowed the aqueous and hydroethanolic optimization of phenolic compound extraction from these byproducts by response surface methodology (RSM). The passage from an aqueous to a hydroethanolic medium clearly improved the solid-liquid extraction of phenolic compounds from grape pomace. The use of ASE further increased the phenolic compound yield up to three times as compared to the optimum obtained with a hydroethanolic solvent.

Ce travail de recherche porte sur l’intensification de l’extraction des polyphénols à partir des écorces de chêne pédonculé et d’épicéa commun par des technologies innovantes : les champs électriques pulsés (CEP), les ultrasons (US) et les micro-ondes (MO). Ces prétraitements permettent l’amélioration de l’extraction par endommagement des membranes et/ou parois cellulaires. L’effet de chacune de ces techniques (CEP, US et MO) sur l’extraction des polyphénols a été mis en évidence à travers une étude d’optimisation quantitative et qualitative : suivi du rendement des polyphénols, de l’activité antioxydante et caractérisation chimiques des composés extraits.Une étude comparative des prétraitements (CEP, US et MO) couplés à une diffusion en milieu hydro-alcoolique alcalin, a permis de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors d’un traitement d’un tissu fibreux. L’étude a prouvé que l’efficacité du procédé est indépendante de la famille d’arbre à laquelle appartiennent les écorces (résineux ou feuillus). De plus, pour valoriser les écorces de bois, l’application d’un prétraitement par CEP (20 kV/cm, 200 impulsions, 3,2 kJ/g bois) suivi d’une diffusion semble être une alternative aux ultrasons, micro-ondes et à l’extraction avec des écorces préalablement broyées. En effet, grâce à l’action électrique et mécanique des CEP, ce prétraitement permet d’obtenir un extrait riche en polyphénols (10,5 g EAG/100g MS pour l’épicéa soit 83 % d’efficacité et 5 g EAG/100g MS pour le chêne soit 82 % d’efficacité). / This research work focuses on the intensification of polyphenols extraction from Quercus robur and Norway spruce barks using innovative technologies : pulsed electric field (PEF), ultrasound assisted extraction (UAE) and microwave assisted extraction (MAE). These pre-treatments enhance the release of intracellular compounds by damaging the membrane and/or cell wall. The effect of each of these technologies (PEF, UAE and MAE) on polyphenols extraction has been highlighted in a quantitative and qualitative optimization analysis by evaluating the polyphenols concentration, antioxidant activity and by the chemical characterization of the extracted compounds.A comparative study of pre-treatments (PEF, UAE and MAE) coupled with an extraction step in an alkaline hydro-alcoholic medium allowed us to better understand the involved phenomena. The induced process efficiency is independent of the tree family to which the bark belongs (coniferous and hardwood). For bark valorization, the application of PEF treatment (20 kV/cm, 200 pulses, 3.2 kJ/g bark) followed by a diffusion step seems to be an alternative to ultrasound and microwave assisted extractions and to the extraction from grinded barks. In fact, the electrical and mechanical effect of PEF treatment allow to obtain an extract rich in polyphenols (10.5 g GAE/100g DM and an efficiency of 83 % for Norway spruce and 5 g GAE /100g DM and an efficiency of 82 % for Quercus robur bark).