Helicobacter pylori is one of the most potential and successful human pathogen which colonizes atleast 50% of world population. One of the important characteristics of this pathogen is the degree of allelic diversity and genetic variability which helps it to adapt and colonize. Phase variation is one of the mechanisms used by Helicobacter pylori to generate variation, where presence of homopolymeric nucleotide or dinucleotide repeats in an ORF make it prone to frequent length changes as a consequence of slipped strand mispairing mediated mutagenesis. An important feature of H. pylori biology is the presence of a large number of Restriction-Modification (R-M) systems in its genome. Till date, seven strains have been completely sequenced and each have more than 20 R-M systems. The presence of homopolymeric nucleotide or dinucleotide repeats in many of R-M systems make them an interesting subject for investigation. Here, we show that hp0051 which codes for a C5 cytosine methyltransferase from H. pylori is a hypermutable gene, which undergoes random mutations. In addition it exhibits phase variation due to presence of a dinucleotide (AG) repeat which results in a truncated protein. hp0051 homologs were amplified and sequenced from different clinical isolates of H. pylori. Sequence analysis showed that hp0051 homologs from 23 clinical isolates are different from each other suggesting a hypervariable nature of the sequence. It was observed that when over expressed in E. coli hp0051 undergoes random mutations. These mutations give rise to different variants of HP0051 with different biochemical properties. Different variants of HP0051 were biochemically characterized. All variants recognize 5´-CCTC-3´ and methylate the first cytosine. A few of the isoforms exhibit degeneracy in the recognition site as they recognize 5´- CNCC-3´ (N being any nucleotide) and methylates third cytosine. Molecular modelling studies suggest that HP0051 has two domains, one large domain having catalytic and AdoMet binding motifs and small domain having target recognition domain. DNA sequencing, peptide finger mapping, MALDI MS-MS and CD have been used to establish the differences between the different isoforms of HP0051. Interestingly when a mutant protein which lacks methylation activity was expressed in E.coli random mutations were not observed. To understand the role of methylation in the occurrence of random mutations, microarray analysis was done. Microarray analysis have shown that the overexpression of HP0051 results in the down regulation of deoxyadenine methyltransferase (dam) in E.coli. Microarray data were further authenticated by RT PCR analysis. dam plays a vital role in mismatch repair pathway and down regulation of dam results in enhanced mutation rates. A large number of clinical isolates were analysed for the presence of hp0051 and hp0051 was found to be present in 83% of strains obtained from patients compared to 25 % of strains from healthy volunteers. Single colonies obtained from the same patient were analysed and it was found that variation in hp0051 exists within a patient also. Deletion of an orphan C5 cytosine methyltransferase, hp0051 in H. pylori strains 26695, SS1 and 98.4 has a significant effect on the expression of number of genes belonging to motility, adhesion and virulence. 98.4∆hp0051 mutant strain has a different LPS profile and is able to induce high IL-8 production compared to wild-type. H. pylori strain 26695∆hp0051 is more motile than the wild- type. hp0051 from strain 26695 is able to complement mutant SS1 and 98.4 strains. This study highlights the possible significance of cytosine methylation in the physiology of H. pylori. hp0050 is a N6 DNA adenine methyltransferase which overlaps with the hp0051 ORF .hp0050 was cloned, over expressed and purified to near homogeneity. It recognizes the sequence 5´GRRG 3´ (where R is A or G) and most intriguingly methylates both adenines when R is A (5´GAAG 3´). Kinetic analysis suggest a non processive (repeated hit) mechanism of methylation in which HP0050 methyltransferase methylates one adenine at a time in sequence 5´GAAG 3´. Interestingly, HP0050 homologs from two clinical strains PG227 and 128 methylate only 5´GAGG 3´ compared to 5´GRRG 3´ in strain 26695. HP0050 MTase is highly conserved as it is present in more than 90% of strains. Inactivation of hp0050 in strain PG227 resulted in poor growth suggesting its important role in the physiology of Helicobacter pylori. Collectively, these findings provide impetus for exploring the role(s) of this conserved DNA methyltransferase in the cellular processes of Helicobacter pylori. In one of the clinical isolate it was found that hp0051 and hp0050 can code for a single polypeptide due to an insertion mutation. This mutant ( hp0050 and hp0051 fusion ) was cloned, overexpressed and purified. It was found that fusion protein is able to methylate both adenine and cytosine in the cognate sequence. Similarly, hp1369 - hp1370 is a phase variable type III MTase and it belongs to ɛ group of MTases based on the arrangement of motifs. It has a poly G repeat in its ORF and any change in the number of repeats can result in a functional (full length) or non functional (truncated) protein. Within strain 26695, it has 10 G repeat which results in a truncated protein. Addition of a single nucleotide by site directed mutagenesis in the repeat results in a full length functional protein. HP1369_HP1370 fusion protein recognizes and methylates 5´ TCAGC 3´. DNA methyltransferases are known to play a critical role in gene regulation, cell cycle regulation and pathogenesity in a number of pathogens. H. pylori genome is rich in DNA methyltransferases and this study shows that these methyltransferases exhibit unique features like phase - variation and polymorphism .We propose that high degree of variation that exists in these methyltransferases could play a vital role in enhancing the ability of H. pylori to adapt its host.

Peu étudiée et méconnue, initialement décrite au début du XXe siècle, Helicobacter pylori fut redécouverte en 1982 par deux chercheurs australiens, JR Warren et BJ Marshall. Ils soutinrent que la plupart des ulcères gastro-duodénaux étaient causés par cette bactérie, et non par le stress ou la nourriture épicée, comme pensé auparavant. Cette découverte révolutionna le monde de la gastroentérologie et leur valut le prix Nobel de physiologie et de médecine 2005. Environ la moitié de la population mondiale est colonisée par H. pylori au niveau de l'estomac. Dans 10 à 20% des cas, l'infection peut évoluer vers un ulcère gastro-duodénal et dans certains cas vers une transformation maligne. Cette infection se soigne classiquement à l'aide d'une trithérapie associant 2 antibiotiques à un inhibiteur de la pompe à protons pour neutraliser l'acidité gastrique.<p>Notre travail de recherche a consisté à analyser la proportion de patients infectés par H. pylori dans une cohorte de plus de 22.000 patients, issus de divers groupes ethniques, vivant en Belgique. Ces souches de H. pylori, isolées dans notre laboratoire, à partir des biopsies gastriques, ont aussi servi à une étude pour suivre l'évolution de la résistance aux antibiotiques ces 20 dernières années afin de proposer des améliorations de la prise en charge thérapeutique de l'infection à H. pylori en Belgique. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Reaction of BiPh3 or Bi(OtBu)3 with benzohydroxamic acid (H2-BHA) results in formation of novel mono- and di-anionic hydroxamato complexes; [Bi2(BHA)3]∞1, [Bi(H-BHA)3] 2, [Bi(BHA)(H-BHA)] 3, all of which display nM activity against Helicobacter pylori. Subsequent dissolution of [Bi2(BHA)3]∞ in DMSO/toluene results in hydrolysis to the first structurally authenticated {Bi34} oxido-cluster [Bi34O22(BHA)22(H-BHA)14(DMSO)6] 4. / Dieser Beitrag ist aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Diss. Linköping : Univ., 2003.

published_or_final_version / abstract / Medicine / Doctoral / Doctor of Philosophy

published_or_final_version / Chemistry / Doctoral / Doctor of Philosophy

RESUME DE LA THESE Le rôle majeur de l’Helicobacter pylori dans l’étiopathogénie des maladies gastroduodénales (gastrite, ulcère gastrique et duodénal, lymphome gastrique) est bien établi aujourd’hui. L’OMS l’a reconnue comme jouant un rôle important dans la survenue des lésions cancéreuses gastriques. La prévalence de l’infection à H. pylori varie selon les pays de 20% à 90% avec des taux supérieurs à 60% dans les pays en développement, dont le Bénin. Les méthodes usuelles de diagnostic sont soit invasives nécessitant une endoscopie gastrique avec biopsies (test rapide à l’urée, histologie, culture et PCR), soit non-invasives (test respiratoire à l’urée marquée au carbone, sérologie, et détection de l’antigène dans les selles). La trithérapie associant un inhibiteur de la pompe à protons (IPP) et deux antibiotiques choisis parmi l’amoxicilline, la clarithromycine et le métronidazole est recommandée pour son traitement. La survenue de résistance des souches H. pylori aux différents antibiotiques devient une cause majeure de l’échec des régimes d’éradication. Afin d’évaluer l’applicabilité et l’efficacité des régimes thérapeutiques recommandés en pratique courante, et à partir d’une étude de cohorte prospective, nous avons étudié la prévalence de l’infection à H. pylori chez les patients consultant à la clinique de Gastroentérologie de l’hôpital universitaire Erasme à Bruxelles, déterminé son taux de résistance primaire aux antibiotiques, et évalué le taux d’éradication d’H. pylori par la trithérapie. Nous avons aussi évalué la performance du test de détection de l’antigène d’H. pylori dans les selles pour le diagnostic chez l’adulte (avant traitement) comparé avec les méthodes de référence (culture, histologie), également dans le contrôle de l’éradication. Au Bénin, nous avons évalué à partir d’une étude transversale prospective, la prévalence de l’infection à H. pylori dans une population en milieu urbain et rural. Nous avons déterminé la distribution par famille des sujets infectés, ainsi que l’influence des variables démographiques individuelles, et les caractéristiques socio-économiques familiales sur le risque de l’infection. La prévalence de résistance primaire à la clarithromycine et au métronidazole fut observée respectivement dans 3% et 31% des souches isolées. Aucune résistance primaire à l’amoxicilline et à la tétracycline n’a été observée. Les analyses en intention de traiter, ont montré que H. pylori a été éradiqué chez 80% des patients inclus dans l’étude thérapeutique. Le taux d’échec d’éradication fut de 20%. Comparé au 14C-TRU, le test HpSA avait une sensibilité de 100%, une spécificité de 91%, VPP de 69%, VPN de 100%. De même, la sensibilité du test HpSA par rapport aux deux méthodes usuelles (culture et histologie) est de 96.5% pour une spécificité de 91.2%, une VPP de 90.3% et une VPN de 96.8%. Au Bénin, la prévalence de H. pylori était de 75.4% en ville et de 72.3% dans le village (p = 0.459). Aucune association n’a été observée avec l’âge, le sexe, le niveau d’instruction, la taille du ménage, l’activité économique ou le mode d’approvisionnement en eau potable. Le taux d’infection était plus élevé chez les enfants dont les parents étaient infectés et chez ceux ayant une mère H. pylori positive (p < 0.001). L’analyse multivariée par régression logistique a montré que la densité d’occupation des dortoirs [OR (95%) = 9.82 (4.13-23.31)] p < 0.001), et le statut des mères dans le ménage ([OR (95%) = 3.85 (1.53-9.67)] p < 0.001) étaient les prédicteurs indépendants de l’infection par H. pylori. Le risque de l’infection chez les enfants était 13 fois plus élevé quand les deux parents sont simultanément positifs OR (95% CI) = 13.6 (3.63-51.22), il l’était respectivement de 5.3 (1.52-18.45); 2.7 (0.47-15.44), quand la mère et le père sont positifs p < 0.001. Aussi le risque d’infection à H. pylori comparé aux enfants qui dorment seul dans leur chambre, était élevé pour ceux qui dorment avec un ou deux personnes OR (95% CI) = 5.2 (1.08-25.16), p < 0.05, et plus élevé chez les enfants qui dorment à 4 ou plus OR (95% CI) = 16.6 (2.66-103.44), p < 0.005, comparé à ceux qui dorme seuls. Donc, le contact avec des personnes infectées au sein de la famille et la vie en promiscuité, étaient associés avec un risque d’infection plus élevé indiquant une transmission intrafamiliale de l’infection par H. pylori. En conclusion, nos résultats montrent une séroprévalence encore élevée de l’infection à H. pylori dans la population béninoise. Une surveillance de l’épidémiologie accompagnée de mesures de prévention ciblées sur les facteurs potentiels de risque de l’infection doit être poursuivie. La validation du test de détection de l’antigène dans les selles avant traitement et dans le contrôle de l’éradication de la bactérie pour le suivi thérapeutique des patients infectés, est une alternative intéressante notamment au Bénin. Le taux de résistance primaire pour le métronidazole est actuellement stable en Belgique, alors que la prévalence de la résistance à la clarithromycine mérite d’être précisée par d’autres études multicentriques. La trithérapie classique à base d’inhibiteur de la pompe à protons–amoxicilline-clarithromycine reste recommandable en première intention. La surveillance épidémiologique de l’infection basée sur la prévalence locale des souches clarithro-résistantes et métronidazole-résistantes devrait être poursuivie. SUMMARY OF THE THESIS The major role of H. pylori in the etiopathogeny of various gastroduodenal diseases (gastritis, gastric and duodenal ulcers, gastric lymphoma) is well established today. The World Health Organization concluded that H. pylori plays a causal role in the chain of events leading to cancer of the stomach. The prevalence of H. pylori infection varies by country from 20% to 90%, with higher prevalence rates over 60% observed in developing countries, including Bénin. The usual methods allowing the diagnosis of the gastric infection by H. pylori are either invasive, requiring a gastric endoscopy and biopsies (fast urease test, anatomopathological examination, culture and PCR), or noninvasive (breath test with 13C or 14C marked urea, serology and stool antigen detection). Triple therapy associating a proton pump inhibitor (PPI) with two antibiotics, chosen between amoxicillin, clarithromycin and metronidazole, is currently recommended. Resistance of H. pylori strains to antibiotics becomes a major determinant in the failure of eradication of regimens. To evaluate the applicability and efficacy of the therapeutic recommendations in our pratice, based on a prospective study, we studied the prevalence of H. pylori infection in the outpatient population of the Gastroenterology clinic at the Erasme University hospital in Brussels, determined its rate of primary resistance to antimicrobial agents and evaluated the rate of eradication of H. pylori by triple therapy. We also evaluated the performance of a stool antigen detection test for the diagnosis of H. pylori infection in adults (before treatment) compared with reference methods (culture and histology) as well as in control of eradication. In Benin, we evaluated by a cross-sectional study the prevalence of the infection with H. pylori in the population living in urban and rural environment. We determined the family distribution of infected subjects as well as the influence of individual demographic variables and of the socio-economic family characteristics on the risk of infection. In Brussels, primary resistance to clarithromycin and metronidazole was observed in 3% and 31% of the isolates, respectively. No primary resistance to amoxicillin and tetracycline was observed. By intention to treat analysis, H. pylori was eradicated in 80% of patients included in the therapeutic study. The rate of eradication failure was 20%. In comparison with 14C-Urea breath test, the H. pylori Stool Antigen test showed a sensitivity of 100%, a specificity of 91 %, PPV of 69%, and NPV of 100%. Compared to the reference methods (culture and histology), the HpSA test had a sensitivity of 96.5% and a specificity of 91.2%. PPV of 90.3% and NPV of 96.8%. In Benin, the prevalence of H. pylori antibodies was 75.4% in town and 72.3% in the village (P= 0.459). No association was found between infection and age, sex, education level, size of the household, economic activity or source of drinking water. The infection rate was higher in children of parents who were both infected and also in those whose mother was infected (p < 0.001). By logistic regression analysis, the density of occupation of dormitories (more than three persons sharing dormitory, [OR (95%) = 9.82 (4.13-23.31)] p < 0.001), and mother status within the household ( [OR (95%) = 3.85 (1.53-9.67) ] p < 0.001), were independent predictors for H. pylori infection. The risk of H. pylori infection in children was 13 times higher when the two parents were simultaneously positive: OR (95% CI) = 13.6 (3.63-51.22) and it was respectively of 5.3 (1.52-18.45); 2.7 (0.47-15.44), when mother and father were positive p < 0.001. H. pylori infection risk in children was higher for a sharing a dormitory with one or two persons, OR (95% CI) = 5.2 (1.08-25.16), p < 0.05 and was even higher if a dormitory of 4 persons or more, OR (95% CI) = 16.6 (2.66-103.44), p < 0.005 as compared to sleeping alone. Family contact with infected persons and crowded living conditions were associated with increased risk of infection consistent with intrafamilial H. pylori transmission. In conclusion, our results confirm a still high H. pylori seroprevalence in population in Benin. An epidemiolgic survey with prevention mesures targeted on potential risk predictors should be going on. Validation of antigen detection test in patients stools before treatment and for eradication control could be an interested alternative, notably in Benin. Primary resistance rate on metronidazole is stable today in Belgium, though the resistance prevalence on clarithromycin should be determined by other multicentric studies. Standard triple therapy by (PPI)-amoxicillin-clarithromycin is still recommended in first intention to treat. Epidemiological survey of infection based on local prevalence of claritromycin-resistant and metronidazole-resistant strains should be continued.

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Objetivo: Determinar la prevalencia de Helicobacter pylori en pacientes sintomáticos de consulta externa en la Red Rebagliati (EsSalud) en el período 2010-2013. Materiales y métodos: Estudio observacional, transversal y analítico. Se revisaron los registros de pacientes ambulatorios con la prueba en aliento con urea-13C diagnóstica de Helicobacter pylori en el período 2010-2013. Resultados: De los 1711 pacientes, la prevalencia global de Helicobacter pylori fue 45,5% (IC 95%: 43,17- 47,89), siendo mayor en mujeres que en varones (47,1% vs. 42,1%, p=0,056). Hubo diferencias significativas en la edad entre infectados y no infectados (44 vs. 39, p<0,05), con asociación entre la edad y presencia de Helicobacter pylori (p<0,001). La prevalencia estimada en la población pediátrica fue 36,3% y se encontró resultado positivo en 201 (51,1%) mujeres en edad fértil. La mayoría (43,9%) procedían del sector financiero de la ciudad. Conclusiones: La prevalencia de Helicobacter pylori en la población de estudio fue similar en ambos sexos y tuvo relación con la edad. El nivel socioeconómico medio de Lima mantiene la prevalencia de Helicobacter pylori reportada en los últimos años.

El presente trabajo de investigación ha sido concebido ,en primer lugar ,para despertar la conciencia preventiva de salud en las autoridades del Hospital Hipólito Unanue y de la población que este atiende, dándoles a conocer mediante sus resultados ,el estado actual que presenta la enfermedad ácido péptica de la mucosa gástrica en la población atendida en este hospital y su relación con la presencia infectante del germen denominado: Helicobacter pílori lo cual por su magnitud puede ser considerado un problema de salud pública de tipo endémico ,en nuestro medio . De otro lado creo justificada la realización de este trabajo en el hecho de que una réplica de los estudios ya realizados, sobre esta materia ,no se ha hecho en nuestro hospital desde el punto de vista antomopatológico y contando además con una alta casuistica estudiada en nuestro laboratorio espero poder contribuir a ampliar y esclarecer un poco mas los conocimientos ya logrados en otros ámbitos de estudio.