Doenças como malária, esquistossomose, filaríase linfática, dengue, leishmaniose e mal de Chagas são endêmicas em países tropicais. Referente ao período entre 1975 e 2004, apenas 1% dos 1.556 novos fármacos registrados foi destinado ao tratamento destas doenças. Somente a doença de Chagas possui aproximadamente 18 milhões de casos em todo mundo. Até o momento, a quimioterapia para o tratamento dessa antropozoonose constitui-se basicamente de dois fármacos, o nifurtimox, proscrito no Brasil, e o benznidazol. Estes fármacos, além de apresentarem vários efeitos colaterais, são pouco eficazes, o que dificulta a adesão dos pacientes ao tratamento. Diante da necessidade imediata de novos fármacos para o combate de tripanossomíase americana, estratégias de modificação molecular têm se mostrado como ferramenta promissora para obtenção de novos fármacos, geralmente inspirados na estrutura molecular de fármacos já conhecidos. A estratégia de modificação molecular permite aumentar as chances de sucesso no processo de descoberta de novos fármacos, reduzindo tempo e custo da pesquisa. Este trabalho teve como objetivo o planejamento, a síntese e a avaliação da atividade anti-T. cruzi e a identificação das propriedades físico-químicas que são responsáveis por modular a atividade anti-T. cruzi da série dos 2-[5-nitrotiofeno- 2-il]-3-acetil-5-[4-fenil-substituído]-2,3-diidro-1,3,4-oxadiazolinas, compostos com estrutura análoga à nifuroxazida, fármaco antimicrobiano que também apresenta atividade antiparasitária. O planejamento da série de compostos estudados foi realizado com base no diagrama de Craig. A obtenção dos derivados 1,3,4-oxadiazolínicos foi realizada em quatro etapas sintéticas: esterificação, amonólise, obtenção da base de Schiff e ciclização oxidativa. As estruturas planejadas foram confirmadas por RMN 1H e RMN 13C, enquanto a pureza foi avaliada pela faixa de fusão e de análise elementar de CHN. A atividade antiparasitária dos compostos foi determinada frente à cepa Y da forma epimastigota do T. cruzi e a concentração de parasitas foi quantificada através da absorbância em espectrofotômetro UV/Vis (λ = 580 nm). Os quinze compostos da série foram avaliados em 6 diferentes concentrações (3,75; 5; 7,5 ; 10; 15; 20 µM), sendo que somente o etoxi-derivado não foi mais ativo que o fármaco padrão, o benznidazol. Entre os compostos analisados identificaram-se o mais e o menos ativo da série, respectivamente: o 2-[5-nitro-tiofeno-2-il]-3-acetil-5-[4 fenil-acetoxi]-2,3-diidro-1,3,4-oxadiazolinas (IC50=7,91 µM) e o 2-[5-nitrotiofeno-2-il]-3-acetil-5-[4 fenil-etoxi]-2,3-diidro-1,3,4-oxadiazolinas ((IC50=26,60 µM). Através de estudos de QSAR-2D, a atividade anti-T. cruzi foi correlacionada com descritores físico-químicos, como a hidrofobicidade, os efeitos eletrônicos e o volume molecular. Com a aplicação de modelos matemáticos, ficou evidenciado que a atividade anti-T. cruzi desta série de compostos sofre notável influência da hidrofobicidade e dos efeitos eletrônico de ressonância, o que permite a continuidade deste trabalho através da variação planejada destas propriedades, visando identificar o análogo mais potente da série de compostos estudados. / Diseases like malaria, schistosomiasis, lymphatic filariasis, dengue, leishmaniasis and Chagas\'disease are endemic in tropical countries. From 1975 to 2004, only 1% of 1.556 new drugs were registered for the treatment of these diseases. Chagas disease itself has approximately 18 million of cases worldwide, and the chemotherapy for the treatment of this anthropozoonosis consists basically of two drugs, nifurtimox, which is prohibited in Brazil, and benznidazole. These drugs have various side effects and can also be ineffective, making patients give up the treatment. Given the immediate need for new drugs to treat american trypanosomiasis, molecular modification strategies have been shown as a promising tool for obtaining new drugs, often inspired by the molecular structure of known drugs. The strategy of molecular modification will increase the chances of success in the discovery process of new drugs, reducing the time and the costs of research. Given the situation above described, this work aims to design synthesis and evaluate the anti-Trypanosoma cruzi activity of new drugs as well as identification physicochemical properties that are responsible for modulating the anti-T. cruzi activity. Series of 2-[5-nitro-thiofen-2-yl]-3-acetyl-5-[4-phenyl-substituted]-2,3-dihydro-1,3,4-oxadiazolines, compounds with similar structure to nifuroxazide, an antimicrobial drug that also has antiparasitic activity. The planning of the series of compounds was carried out based on the Craig diagram. The obtainment of the1,3,4-oxadiazolinics derivatives was performed with four synthetic steps, as follows: esterification, ammonolysis, obtention of the Schiff base and oxidative cyclization. The designed structures were confirmed by 1H and 13C NMR and purity was assessed by melting point and elemental analysis of CHN. The antiparasitic activity of compounds was determined against the Y strain of T. cruzi in the epimastigote form and the concentration of parasites was quantified by absorbance in a spectrophotometer UV / Vis (λ = 580 nm). The fifteen compounds obtained were evaluated in six different concentrations (3.75, 5, 7.5, 10, 15, 20 µM), and only the ethoxy-derivative was less active than the standard drug, benznidazole. The 2-[5-nitrothiofen- 2-yl]-3-acetyl-5-[4-acetoxyphenyl]-2,3-dihydro-1,3,4-oxadiazolines (IC50=7.91µM) and of 2-[5-nitro-thiofen-2-yl]-3-acetyl-5-[4-etoxyphenyl]-2,3-dihydro-1,3,4-oxadiazolines (IC50=26.60 µM) derivatives were identified as the most and the least active of the series, respectively. Through 2D-QSAR studies, the anti-T. cruzi activity was correlated with physicochemical descriptors such as hydrophobicity, molecular volume and electronic effects. Applying mathematical models, it became evident that the activity of anti-T. cruzi activity in this series of compounds undergoes remarkable influence of hydrophobicity and electronic effects of resonance, which allows the continuity of the work planned by varying these properties to identify the most potent analogue among the series of compounds studied.

A Doença de Chagas, causada pelo parasito tripanossomatídeo Trypanosoma cruzi, é endêmica e se distribuí por toda América Latina. É uma das parasitoses mais negligenciadas pela indústria farmacêutica e os únicos fármacos disponíveis para seu tratamento foram introduzidos há décadas. Infelizmente, eles são ineficientes e apresentam sérios efeitos colaterais. Esse panorama mostra a necessidade do desenvolvimento de novos fármacos para a quimioterapia contra a doença de Chagas. As enzimas pertencentes a vias metabólicas essenciais para a sobrevivência do parasito tais como a via glicolítica e a de síntese de novo de nucleotídeos de pirimidinas, têm sido propostas como alvos interessantes no planejamento novos fármacos para o tratamento da doença de Chagas. Neste trabalho, as enzimas Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (TcGAPDH) e a Diidroorotato desidrogenase (TcDHODH) de Trypanosoma cruzi foram estudadas como alvos para o planejamento de inibidores enzimáticos com propriedades físico-químicas e características estruturais similares à de compostos-líderes. Para isso, foram utilizados métodos e ferramentas de Quiminformática tanto baseadas nas estruturas dos ligantes (LBVS) quanto dos receptores (SBVS). Para a identificação e seleção de potenciais inibidores da enzima GAPDH, uma coleção virtual obtida do banco de dados ZINC, contendo aproximadamente 2,5 milhões de compostos, foi avaliada através de vários filtros de seleção com o objetivo de priorizar aqueles compostos mais interessantes do ponto de vista estrutural, de propriedades físico-químicas e farmacocinéticas. A aplicação desses filtros originou uma subcoleção de aproximadamente 450 mil estruturas que foram avaliadas segundo a complementaridade de interações com a estrutura da enzima através de métodos de docagem molecular. Com base nestes resultados, doze compostos que se mostraram promissores foram selecionados e adquiridos comercialmente para serem testadas in vitro contra a enzima TcGAPDH. Dos doze compostos testados, três exibiram afinidade (Ki) pela enzima em concentrações inferiores a 80 μM, Além disso, esses compostos também são caracterizados pelo baixo peso molecular (274 a 330 g mol-1) e no máximo 24 átomos diferentes do hidrogênio e, como consequência, apresentam eficiências do ligante entre 0,24 e 0,34 Kcal mol-1 átomo-1, o que os tornam ótimos candidatos à otimização molecular visando aumento da afinidade pelo alvo. Para a busca de inibidores da enzima TcDHODH, primeiramente foi realizada uma busca por cavidades na estrutura 3D do alvo para a identificação de regiões distintas do sítio catalítico e passíveis de serem exploradas no planejamento de ligantes. Através desta análise foi possível o estabelecimento de quatro novas regiões com forma, volume e localizações adequadas para acomodar pequenas moléculas capazes de modular a atividade da TcDHODH. Uma destas regiões, chamada S2, localizada sob a alça β4-αA e no canal de acesso dos substratos ao sítio ativo, foi escolhida para o planejamento baseado na estrutura do alvo. As estruturas de aproximadamente cem compostos derivados de pirimidinas, substituídos em posições estrategicamente definidas e selecionados através de buscas por subestruturas, foram docadas no sítio de interesse e nove compostos adquiridos e testados in vitro contra a enzima com o objetivo de validar as hipóteses estabelecidas inicialmente. Destes, cinco compostos mostraram potências (IC50) superiores à do produto de reação (inferior a 150 μM), Os resultados encontrados validaram as hipóteses geradas na primeira etapa e foram usados para direcionar a seleção de outras quinze novas moléculas através de um protocolo de docagem molecular com ajuste induzido. A avaliação in vitro desses compostos contra a enzima TcDHODH resultou na identificação de outros 11 compostos ativos, dos quais o mais potente exibiu afinidade pela enzima em concentração igual a 124 nM. Este composto possui eficiência do ligante igual a 0,56 Kcal mol-1 átomo-1 e pode ser considerado um fragmento molecular com excelentes características do ponto de vista do potencial para futuro desenvolvimento como agente terapêutico. Os resultados encontrados também evidenciaram a importância de determinadas características estruturais impressas nos inibidores da TcDHODH para a complementaridade com o novo sítio de interação identificado. Assim, novos compostos foram propostos para otimização molecular com o objetivo de melhorar afinidade e aumentar a diversidade de classes e, deste modo, ampliar o espectro de perfis farmacocinéticos para posteriores ensaios celulares e in vivo, Através da realização deste trabalho foi possível validar as estratégias adotadas na utilização dos métodos computacionais e também as hipóteses construídas a partir da aplicação dos mesmos. A taxa de acerto (TA) alcançada foi superior a 30% no planejamento de inibidores para ambos os alvos, ou seja, muito superiores às encontradas em experimentos de ensaio em massa. Deste modo, este estudo contribuiu com a proposição de novos esqueletos moleculares que podem ser usados como compostos-líderes no desenvolvimento de novos agentes tripanocidas focando nas enzimas TcGAPDH e TcDHODH como alvos. / Chagas\' disease, an endemic illness widely distributed throughout Latin America, is caused by the protozoa parasite Trypanosoma cruzi. It is one of the tropical diseases that are among the most neglected by the pharmaceutical industry, for which available treatments were launched more than 30 years ago. In addition, these drugs are ineffective and cause severe side effects to patients. This panorama shows the need for the development of new and more effective chemotherapeutic agents for the treatment of the disease. Enzymes belonging to metabolic pathways that are essential for the parasite survival such as the glycolysis and pyrimidine nucleotide biosynthesis have been proposed as attractive targets for the design of new drugs for the treatment of Chagas disease. In this work, the enzymes Gyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (TcGAPDH) and the Dihydroorotate dehydrogenase (TcDHODH) from Trypanosoma cruzi were studied as targets for the design of inhibitors with physicochemical properties and structural characteristics similar to lead-compounds. Methods in Cheminformatics within the Ligand- and Structure-based Virtual Screening (LBVS and SBVS, respectively) approaches were thoroughly employed as tools to identify new hits. For the selection and identification of potential inhibitors of the GAPDH enzyme, a compound database containing nearly 2.5 million of small molecules retrievable from ZINC was evaluated through several molecular filters aiming at prioritizing those compounds more interesting from the point of view of their structures, physicochemical and predicted ADME/Tox properties. The application of Filter originated a subcollection of approximately 450 thousand structures that were then scored according to their complementary interactions with the 3D structure of the enzyme through molecular docking. Based on docking results, twelve compounds that showed to be promising ligands were selected and commercially acquired for in vitro assays against the TcGAPDH. Of the twelve compounds evaluated in vitro, three exhibited affinity constants (Ki) at concentrations lower than 80 μM. Furthermore, the selected compounds are also characterized by the low molecular weight (274 to 330 g mol-1) and a maximum of non-hydrogen atom count of 24, as a result, they have Ligand Efficiencies between 0,24 and 0,34 Kcal mol-1 átomo-1, what grant them great potential as candidates for molecular optimization and potency improvement. For the search of TcDHODH inhibitors, cavities in the 3D structure of the target for the identification of areas apart from catalytic site but likely to be explored in the design of ligands were selected a priori. This resulted in four new regions with appropriate shape, volume and locations to accommodate small molecules capable of modulating the activity of TcDHODH. One of the areas, called S2 site, is located under the α4 - βA loop and in the access channel of the substrate to the active site and was chosen to be explored in the SBDD studies. Approximately one hundred of pyrimidine derivatives containing strategically defined posítions for molecular substitution were retrieved from commercially available compounds database through substructure searching and docked into the previously defined site. Based on the docking results nine compounds were selected, purchased and assayed in vitro against the enzyme with the objective of validating the hypothesis. Of these, five compounds showed potencies (IC50) better than that exhibited by the product of the reaction (values lower than 150 μM). Thus, the results found validated the hypotheses generated in the first stage of the designing and they were used to drive the selection of other fifteen new molecules through induced fit molecular docking protocol. The in vitro evaluation of those compounds against the TcDHODH enzyme resulted in the identification of other eleven ligands, of which the most potent exhibited affinity for enzyme at the concentration of 124 nM. This molecule has a Ligand Efficiency of 0.56 Kcal mol-1 atom-1 and can be considered a fragment-like compound with excellent characteristics from the point of view of its potential for future development as therapeutic agent. The results found also evidenced the importance of certain structural characteristics in the inhibitor of TcDHODH for the complementarily with the new identified site of interaction. Thus, new compounds were proposed for potency and class diversity improvement. By doing so we hope to enlarge ADME profile spectrum for further cellular and in vivo assays. Through the success of this work, it was possible to validate the strategies adopted in the use of computational methods and also the hypotheses built from the application of that. The success rate (TA) obtained was higher than 30% in the design of ligands for both studied targets, which is much better than that usually found along High Throughput Screening assays. Thus, this study contributed with the proposítion of new molecular scaffolds that can be used as lead compounds in the development of new tripanocidal agents having as targets the enzymes TcGAPDH or TcDHODH.

Cancer is a disease that kills the world and it is estimated that in 2030 the incidence of this disease in the world reach 21.4 million new cases with 13.2 million deaths. Due to the resistance, non-selectivity and high cytotoxicity, many of the current drugs produce side effects such as bone marrow depression, sterility, risk of non-lymphocytic leukemia, among others. Thus it is necessary to the development of new anticancer drugs that have less harmful effects. Thus, six new compounds were synthesized, four acridínicos derivative, a derivative of bis (cloroetila) and palladium (II) complex acridínico, whose acronyms, respectively (Acri)2N, AcriPro, ACDMA, ACBr2MAN, (Most)2N and ACDMAPd. All these compounds derived from Schiff base had satisfactory yields and characterized by NMR techniques (1H, 13C, COSY, J solved) spectroscopy in the infrared, mass spectrometry and elemental analysis. The strains used human tumor cells were HT-29 (human colon cancer), MCF-7 (human breast cancer), Hep-2 (human larynx carcinoma), NCI-H292 (carcinoma human pulmonary mucoepidermoid) and HL -60 (acute promyelocytic leukemia) and derivatives AcriPro, ACDMA, (Most)2N and ACDMAPd showed the best results of IC50 for the HL-60 cells. / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O câncer é uma das doenças que mais mata no mundo e estima-se que em 2030 a incidência no mundo desta doença alcance 21,4 milhões de novos casos com 13,2 milhões de mortes. Devido à resistência, a não seletividade e a alta citotoxicidade, grande parte dos fármacos atuais produzem efeitos indesejáveis tais como: depressão na medula óssea, esterilidade, risco de leucemia não linfocítica, entre outros. Desta forma faz-se necessário o desenvolvimento de novos fármacos antitumorais que possuam menos efeitos agressivos. Assim, foram sintetizados seis novos compostos, sendo quatro derivados acridínicos, um derivado bis(cloroetila) e um complexo de paládio(II) acridínico, que tem como acrônimos, respectivamente, (Acri)2N, AcriPro, ACDMA, ACBr2MAN, (Most)2N e ACDMAPd. Todos esses compostos derivados de base de Schiff tiveram rendimentos satisfatórios e foram caracterizados pelas técnicas de RMN (1H, 13C, COSY, J resolvido), espectroscopia na região do infravermelho, espectrometria de massas e Análise Elementar. As linhagens de células tumorais humanas utilizadas foram HT-29 (câncer de cólon humano), MCF-7 (câncer de mama humano), HEp-2 (carcinoma de laringe humana), NCI-H292 (carcinoma mucoepidermoide de pulmão humano) e HL-60 (leucemia promielocitica aguda) e os derivados AcriPro, ACDMA, ACDMAPd e (Most)2N apresentaram os melhores resultados de CI50 para a células HL-60.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-09-13T11:59:49Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 7758959 bytes, checksum: db745d41b196978192ebc789e25f442b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-13T11:59:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 7758959 bytes, checksum: db745d41b196978192ebc789e25f442b (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / The use of plants for medicinal purposes is one of the oldest forms of medical practice of mankind, emphasizing the alkaloids because they present rich structural and pharmacological properties extensive variety. The drug design is aided by computer based strategies based on linkers or target. When developing new compounds, the structure-based techniques, such as docking, can be applied to study of certain receptor and its corresponding ligand, evaluating bindingprotein interactions. Whereas in the ligand-based methods, a database of known ligands is used, looking for ways to evaluate parameters (molecular descriptors) that can assist in the development of compounds with higher power. This study aimed to perform in silico studies to investigate drug-target interactions with alkaloids derived from natural products and their analogues with relevant pharmacological activity. Different molecular descriptors and methodologies were used in the studies developed. In chapter 2, the interaction of alkaloid bisindolic caulerpine (CLP) was evaluated with the enzyme involved in Alzheimer's disease (AD) monoamine oxidase B (MAO-B), and a database with 109 analogs. It was possible to observe a chemical parameter of inhibition of PLC analogues where the replacement of the radicals must be asymmetric with different polarity. The studies based on the linker and the structure associated with the classification drug-like chemical skeleton suggest that the PLC has potential use in the treatment of AD. In chapter 3, 8 alkaloids isolated Cissampelos sympodialis and 101 derivatives, had their inhibitory potential against enzyme (BACE, GSK-3β and MAO-A) involved in degenerative diseases assessed by in silico methods. consensual analysis showed affinity alkaloids bisbenzilisoquinolinics by BACE, incluindos the roraimine natural alkaloids and simpodialine-β-N-oxide, supporting interest in investigating this skeleton as an antagonist of this enzyme. In Chapter 4 we evaluated the multi-target potential of 148 aphorphinics alkaloids Annonaceae against Leishmania donovani. Six were selected enzymes of this neglected disease for theoretical study, which was associated with experimental four alkaloids available data and integrating the bank, which had pIC50 value inferior to 5.26. The xyloguyelline alkaloid was named as a potential multi-agent target, demonstrating activity against 5 of 6 enzymes evaluated, likely to activity of over 60%. fragment descriptors were used to create model-based binder in a parallel approach with molecular docking to predict the cytotoxic and against topoisomerase II activity azaphenantrene alkaloids in chapter 5. The cytotoxic activity of this skeleton alkaloids are well described in the literature, molecules having activity against several tumor cell lines. The IMB 6 analog and 23 IMB showed interesting activity and selectivity, with MolDock energy similar to liriodenine composed characterized by potent anti-tumor action, but with high toxicity. Important structural information is provided by spectroscopy nuclear magnetic resonance (NMR), and Chapter 6 aimed to discuss the importance of this technique for generating molecular descriptors. Studies that applied successfully in drug design NMR descriptors assisted by computer are described and several QSAR and QSPR having as support data chemical shifts. / A utilização de plantas com fins medicinais é uma das mais antigas formas de prática medicinal da humanidade, enfatizando os alcaloides, por apresentarem rica variedade estrutural e extensa propriedade farmacológica. O desenho de drogas auxiliado pelo computador é fundamentado em estratégias baseadas nos ligantes ou no alvo. No desenvolvimento de novos compostos, técnicas baseadas na estrutura, como o docking, podem ser aplicadas no estudo de um determinado receptor e seu respectivo ligante, avaliando as interações ligante-proteína. Ao passo que nos métodos baseados no ligante, um banco de ligantes conhecidos é utilizado, buscando modos de avaliar parâmetros (descritores moleculares) que possam auxiliar no desenvolvimento de compostos com maior potência. Este estudo teve como objetivo realizar estudos in silico para investigar interações fármaco-alvo com alcaloides oriundos de produtos naturais, e respectivos análogos, com relevante atividade farmacológica. Diferentes descritores moleculares e metodologias foram utilizadas nos estudos desenvolvidos. No capítulo 2, foi avaliado a interação do alcaloide bisindolico caulerpina (CLP) com a enzima envolvida na doença de Alzheimer (DA) monoamina oxidase B (MAO-B), além de um banco com 109 análogos. Foi possível observar um parâmetro químico de inibição dos análogos da CLP, onde a substituição dos radicais deve ser assimétrica com polaridade distinta. Os estudos dos baseados no ligante e na estrutura, associado à classificação drug-like, sugerem que o esqueleto químico da CLP tem potencial uso no tratamento da DA. No capítulo 3, 8 alcaloides isolados de Cissampelos sympodialis e 101 derivados, tiveram seu potencial inibitório contra enzimas (BACE, GSK-3β e MAO-A) envolvidas em doenças degenerativas avaliado por metodologias in silico. Análise consensual demonstrou afinidade de alcaloides bisbenzilisoquinolínicos pela BACE, incluindos os alcaloides naturais roraimina e simpodialina- β-N-oxide, suportando interesse em investigar este esqueleto como antagonista desta enzima. No capítulo 4 foi avaliado o potencial multi-target de 148 alcaloides aporfinicos de Annonaceae contra Leishmania donovani. Foram utilizadas seis enzimas desta doença negligenciada para o estudo teórico, que foi associado com dados experimentais de quatro alcaloides disponíveis e que integram o banco, que apresentaram valor pIC50 inferior a 5.26. O alcaloide xyloguyellina foi apontado como potencial agente multitarget, demonstrando atividade contra 5 das 6 enzimas avaliadas, com probabilidade de atividade superior a 60%. Descritores de fragmento foram utilizados para criar modelo baseado no ligante em uma abordagem paralela com docking molecular, para predizer a atividade citotóxica e contra topoisomerase II de azafenantreno alcaloides, no capítulo 5. A atividade citotóxica deste esqueleto de alcaloides está bem descrita na literatura, com diversas moléculas apresentando atividade contra linhagens de células tumorais. Os análogos IMB 6 e IMB 23 apresentaram interessante atividade e com seletividade, apresentando energia MolDock similar à liriodenina, composto caracterizado por potente ação antitumoral, porém com elevada toxicidade. Importantes informações estruturais são fornecidas pela espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), sendo o capítulo 6 destinado a discorrer sobre a importância desta técnica para geração de descritores moleculares. Estudos que aplicaram com sucesso descritores RMN em design de drogas assistida pelo computador encontram-se descritos, além de diversos estudos de QSAR e QSPR tendo como amparo dados de deslocamentos químicos.

Os receptores dos hormônios da tireóide (TRs) são fatores de transcrição envolvidos na diferenciação celular, metabolismo e funções fisiológicas da maioria dos tecidos. Muitos estudos mostram que diversos efeitos farmacológicos mediados pelos TRs podem ser benéficos na farmacoterapia, especialmente aqueles mediados pelo TR que podem ser úteis em condições médicas importantes como obesidade, hipercolesterolemia e diabetes. Além disso, a descoberta que o TR é a isoforma predominante no coração, mediando a maioria dos efeitos cardiovasculares prejudiciais, estimulou a pesquisa por ligantes seletivos para o TR que poderiam ser utilizados em quadros clínicos importantes com perfil de segurança aceitável. Foi realizado um estudo das relações quantitativas entre a estrutura e atividade (QSAR) de um conjunto de compostos com atividade biológica descrita para TR e TR, que gerou modelos de Holograma QSAR com elevada consistência interna e externa, apresentando bom poder de correlação e predição das propriedades biológicas. Também foi realizado um minucioso estudo de triagem virtual, que propiciou a seleção de 7 compostos que foram adquiridos para terem suas atividades biológicas avaliadas. Ensaios de transfecção e gene repórter foram estabelecidos e utilizados na avaliação da atividade biológica dos compostos selecionados pelo ensaio virtual. Finalmente, um ensaio utilizando ressonância plasmônica de superfície (SPR) foi desenvolvido e utilizado para avaliar a atividade agonista desses compostos, e que pode ser útil para avaliar a atividade de novos ligantes. A técnica de SPR também foi empregada em um cuidadoso estudo da interação do TR com seus correguladores, que incluiu estudos cinéticos e termodinâmicos, propiciando a determinação das taxas cinéticas e parâmetros termodinâmicos para a interação do complexo TR-T3 com peptídeos derivados de dois de seus correguladores. Os resultados obtidos são relevantes e devem ser considerados no planejamento de futuros experimentos utilizando o LBD de TR e agonistas. / The thyroid hormone receptors (TRs) are transcriptional factors involved in cell differentiation, development, metabolism and physiological function of most tissues. Many lines of evidence show that several pharmacological actions of TRs might be beneficial in medical therapy, specially those mediated by TR that target important medical conditions like obesity, hypercholesterolemia and diabetes. Additionally, the findings that TR is the predominant isoform in the heart and mediates most of the TRs deleterious cardiovascular effects, stimulated the research for selective TR ligands which could address important medical needs with an acceptable safety profile. In this PhD thesis, studies of the quantitative structure-activity relationships (QSAR) of a dataset of compounds with reported biologic activity for both TR and TR were performed, and statistically significant Hologram QSAR models with good predictive ability for untested compounds were created. In parallel, a careful virtual screening procedure was executed, leading to the selection of 7 compounds which were purchased for the evaluation of their biological activities. Cell transfection and reporter gene assays were developed, validated and used to evaluate the biological activities of these compounds. Finally, a surface plasmon resonance (SPR) assay was developed and used to assess the agonistic activity of these compounds. The SPR technique was also employed in a careful study of the interaction between the ligand binding domain of TR and peptides derived from its coregulators, which included the determination of the kinetic and thermodynamic parameters for this interaction. The results suggest that flexibility plays an important role in the interaction between the receptor and its coregulators, and point out important aspects of experimental design that should be addressed when using TR LBD and its agonists. Furthermore, the methodology described here may be useful for the identification of new TR ligands.

A doença de Chagas, causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, é uma doença tropical que enseja morte/morbidade de milhões de pessoas na América Latina. Por processos migratórios, vem-se estendendo ao sul dos Estados Unidos, Canadá, Europa, Austrália e Japão. Essa doença tem sido considerada super-negligenciada pela indústria farmacêutica, já que os dois fármacos disponíveis para o seu tratamento foram introduzidos há mais de quarenta anos e apresentam baixa eficácia com vários efeitos colaterais severos. Mais recentemente, a Organização Mundial da Saúde considerou a doença de Chagas, dentre outras, como a doença da pobreza! Com esse cenário completamente desfavorável aos portadores da doença, é necessária a descoberta, desenvolvimento e introdução de novos fármacos para o tratamento eficiente e seguro da doença de Chagas. <br />Dentro desse contexto, este trabalho representa uma importante contribuição para o entendimento das razões moleculares da ação farmacológica de substâncias químicas bioativas de interesse à farmacoterapia da doença de Chagas. Ao nível molecular, a enzima pertencente à via de síntese de novo de nucleotídeos de pirimidinas, diidroorotato desidrogenase do Trypanosoma cruzi (TcDHODH), é um alvo promissor para a descoberta e desenvolvimento de candidatos a fármacos de interesse para o tratamento da doença de Chagas. <br />Os conceitos e ferramentas da química medicinal computacional, tais como os ensaios virtuais in silico, foram usados para a identificação de inibidores da TcDHODH. Vinte e seis substâncias inéditas como inibidores da TcDHODH foram adquiridos comercialmente e avaliados experimentalmente através da Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) para a determinação do mecanismo de inibição e da constante cinética de afinidade (Kiapp). <br />Na etapa de docagem molecular, o objetivo era identificar moléculas que apresentassem uma boa afinidade pelo sítio ativo da enzima TcDHODH. A primeira série de ligantes selecionados dos métodos in silico, apresentou inibição enzimática na concentração de micromolar com eficiência média de ligante de 0,50 kcal mol-1 átomo-1. Devido à baixa massa molecular (aproximadamente 200 kDa) e a alta eficiência de ligante, essa série foi considerada como constituída de excelentes substâncias com elevado poder de reconhecimento biomolecular. Por isso, foram caracterizadas como substâncias passíveis de otimização no processo do-ligante-para-substância matriz. <br />As enzimas TcDHODH e DHODH de Leishmania major (LmDHODH) têm sítios ativos com elevado grau de similaridade. Portanto, usando a enzima LmDHODH como padrão de substituição da TcDHODH é possível fazer a descrição do modo de interação do co-complexo TcDHODH-inibidor. O modo de ação descrito através da resolução da estrutura cristalográfica de raios-X, além de validar ortogonalmente os resultados cinéticos obtidos por ITC - que identificou as substâncias como inibidores competitivos (por interação direta no sítio ativo da enzima TcDHODH), geraram hipóteses farmacofóricas para a busca de novas moléculas (chamadas de segunda geração), agora com padrão superior de reconhecimento molecular do sítio da TcDHODH. Para validar complementarmente a hipótese, foi demonstrado que os inibidores da TcDHODH inibem, similarmente, a LmDHODH. <br />Uma análise cuidadosa da estrutura tridimensional da enzima TcDHODH, demostrou a possibilidade de ocupação do sítio S2 que se estende além da região do sítio catalítico S1, permitindo assim o aumento da afinidade biomolecular com os inibidores. Além disso, o sítio S2 não é encontrado na estrutura da proteína de humanos (HsDHODH), podendo ser uma região passível de seletividade frente à enzima TcDHODH. <br />O emprego adequado dessa hipótese resultou na otimização dos ligantes identificados previamente para substâncias mais potentes que inibiram a enzima de forma competitiva em relação ao substrato diidroorotato (DHO) em valores Kiapp de 121 &plusmn; 14 nM e 190 &plusmn; 10 nM. <br />A técnica de ITC foi fundamental no processo de descoberta de inibidores enzimáticos, pois se mostrou extremamente susceptível à determinação da interação intermolecular enzima-inibidor, permitindo acompanhar a cinética da reação e obter os valores da constante de afinidade de maneira precisa e acurada. Com isso, a taxa de acerto obtida nesta tese foi de 46%, considerando-se apenas as substâncias com valores de Ki app < 100 &micro;M. Esse é um número favoravelmente apreciável, já que na literatura ele gira em torno de 1-10% quando o planejamento in silico é realizado, quando comparado às taxas de acerto dos métodos de ensaio em larga escala (HTS), entre 0-2 %, os resultados alcançados neste trabalho são ainda mais significativos. <br />Além disso, as substâncias químicas selecionadas através da integração de métodos in silico e biocalorimétricos apresentam elevado grau de complexidade no processo biomolecular de interação enzima-ligante, que permite classificá-las para as fases seguintes da gênese planejada de fármacos. / American trypanosomiasis or Chagas disease, caused by the haemoflagellate Trypanosoma cruzi, is a tropical disease that affects millions of people in Latin America. Epidemiology of Chagas disease in non-endemic countries is attained by immigration as the disease also affects people in the United States, Canada, Europe, Australia and Japan. However, the United States are not to be written off as an area of nonendemicity for Chagas disease like Europe or Asia because the southern states have enzootic T. cruzi transmission that involves triatomine species and hosts such as raccoons, opossums, and domestic dogs. Even though, this disease has been considered as a super-neglected from the big Pharma Industry viewpoint since the only available drugs for its treatment were introduced in the market more than forty years ago and worsen is that they have low efficacy and cause various severe side effects. <br />Although the current clinical scenario is of course discouraging and is far from being even a soothing treatment for those who suffer from the disease, it prompt ones to set efforts towards the need of discovering and developing new efficacious and safe drugs to treat Chagas disease. <br />Our research group covers the concept of enzymes acting as targets for the action of drugs. Once T. cruzi has many druggable targets, the dihydroorotate dehydrogenase enzyme (TcDHODH) that belongs to the de novo pyrimidine nucleotide synthetic pathway has been chosen for the search of new inhibitors that may be of use in the treatment of Chagas disease. To accomplish with this and considering that inhibitors are molecules that decrease enzyme activity leading to parasite death, we used the concepts and tools of modern computational medicinal chemistry such as in silico screening of small molecules that bind to the active site of the TcDHODH. <br />After a thoroughly program of virtually screening thousands of compounds, 26 were purchased from commercially available sources and experimentally assayed against the TcDHODH using Isothermal Titration Calorimetry (ITC) in order to determine the mechanism of inhibition and the kinetic affinity constant (Kiapp). <br />The first series of inhibitors selected from our in silico strategy were evaluated by ITC to yield compounds that inhibited the TcDHODH in the micromolar concentration range with an average of 0.50 kcal mol-1 atom-1 ligand efficiency (LE). Because the assayed compounds have low molecular weight (ca. 200 kDa) and high LE, which bring them to the specific bimolecular pattern recognition all of them were considered good inhibitors capable of being selected to enter the hit-to-lead optimization process. <br />The detailed description of the ligand-enzyme mode of binding (MOB) is thoroughly accomplished by solving the X ray crystal structure of the surrogate Leishmania major DHODH enzyme (LmDHODH), which has a high degree of similarity with the enzyme TcDHODH. The MOB credited to be in the active site of the TcDHODH orthogonally validated the ITC kinetic experimental data obtained for all ligands as competitive inhibitors that interact at the active site of the TcDHODH and helped to generate pharmacophoric hypotheses for the search of new second generation molecules acting against the enzyme TcDHODH.  Analyzing the 3D structure of the TcDHODH along with its surrogate LmDHODH, we envisaged the possibility of compounds to extend their side chain beyond the region of the catalytic site (called S1), and interacting in a region called S2, so to increase binding affinity. Moreover, the TcDHODH S2 site that is not found in the 3D protein structure of humans (HsDHODH) is likely to offer new insights for the search of inhibitors whose binding to this S2 site can pave the roads towards the needed structural basis for selective inhibition of TcDHODH. <br />The most potent compounds inhibited the enzyme competitively with respect to the substrate dihydroorotate (DHO) at Kiapp values of 121 &plusmn; 14 nM and 190 &plusmn; 10 nM, which constitutes high affinity TcDHODH inhibitors. The ITC technique was pivotal to this process of enzyme inhibitors discovery, because it proved to be extremely sensitive thus allowing to monitor the kinetics of the reaction and to obtain precise and accurate values of affinity constants. <br />The hit rate obtained in this work, considering only those compounds with Kiapp < 100 &micro;M, was 46%. This is a really high number, since literature values range from 1 to 10% when the planning new inhibitors via in silico methods when compared to the success rates obtained by the methods of testing on large scales (HTS), 0-2 %, the results achieved in this work are even more significant. Moreover, the compounds selected through the integration of in silico and calorimetric methods showed a high degree of complexity in the process of bimolecular enzyme-ligand recognition, which allows to pass them to the next phase of the drug design process.

A doença de Chagas, causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, é uma doença tropical que enseja morte/morbidade de milhões de pessoas na América Latina. Por processos migratórios, vem-se estendendo ao sul dos Estados Unidos, Canadá, Europa, Austrália e Japão. Essa doença tem sido considerada super-negligenciada pela indústria farmacêutica, já que os dois fármacos disponíveis para o seu tratamento foram introduzidos há mais de quarenta anos e apresentam baixa eficácia com vários efeitos colaterais severos. Mais recentemente, a Organização Mundial da Saúde considerou a doença de Chagas, dentre outras, como a doença da pobreza! Com esse cenário completamente desfavorável aos portadores da doença, é necessária a descoberta, desenvolvimento e introdução de novos fármacos para o tratamento eficiente e seguro da doença de Chagas. <br />Dentro desse contexto, este trabalho representa uma importante contribuição para o entendimento das razões moleculares da ação farmacológica de substâncias químicas bioativas de interesse à farmacoterapia da doença de Chagas. Ao nível molecular, a enzima pertencente à via de síntese de novo de nucleotídeos de pirimidinas, diidroorotato desidrogenase do Trypanosoma cruzi (TcDHODH), é um alvo promissor para a descoberta e desenvolvimento de candidatos a fármacos de interesse para o tratamento da doença de Chagas. <br />Os conceitos e ferramentas da química medicinal computacional, tais como os ensaios virtuais in silico, foram usados para a identificação de inibidores da TcDHODH. Vinte e seis substâncias inéditas como inibidores da TcDHODH foram adquiridos comercialmente e avaliados experimentalmente através da Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) para a determinação do mecanismo de inibição e da constante cinética de afinidade (Kiapp). <br />Na etapa de docagem molecular, o objetivo era identificar moléculas que apresentassem uma boa afinidade pelo sítio ativo da enzima TcDHODH. A primeira série de ligantes selecionados dos métodos in silico, apresentou inibição enzimática na concentração de micromolar com eficiência média de ligante de 0,50 kcal mol-1 átomo-1. Devido à baixa massa molecular (aproximadamente 200 kDa) e a alta eficiência de ligante, essa série foi considerada como constituída de excelentes substâncias com elevado poder de reconhecimento biomolecular. Por isso, foram caracterizadas como substâncias passíveis de otimização no processo do-ligante-para-substância matriz. <br />As enzimas TcDHODH e DHODH de Leishmania major (LmDHODH) têm sítios ativos com elevado grau de similaridade. Portanto, usando a enzima LmDHODH como padrão de substituição da TcDHODH é possível fazer a descrição do modo de interação do co-complexo TcDHODH-inibidor. O modo de ação descrito através da resolução da estrutura cristalográfica de raios-X, além de validar ortogonalmente os resultados cinéticos obtidos por ITC - que identificou as substâncias como inibidores competitivos (por interação direta no sítio ativo da enzima TcDHODH), geraram hipóteses farmacofóricas para a busca de novas moléculas (chamadas de segunda geração), agora com padrão superior de reconhecimento molecular do sítio da TcDHODH. Para validar complementarmente a hipótese, foi demonstrado que os inibidores da TcDHODH inibem, similarmente, a LmDHODH. <br />Uma análise cuidadosa da estrutura tridimensional da enzima TcDHODH, demostrou a possibilidade de ocupação do sítio S2 que se estende além da região do sítio catalítico S1, permitindo assim o aumento da afinidade biomolecular com os inibidores. Além disso, o sítio S2 não é encontrado na estrutura da proteína de humanos (HsDHODH), podendo ser uma região passível de seletividade frente à enzima TcDHODH. <br />O emprego adequado dessa hipótese resultou na otimização dos ligantes identificados previamente para substâncias mais potentes que inibiram a enzima de forma competitiva em relação ao substrato diidroorotato (DHO) em valores Kiapp de 121 &plusmn; 14 nM e 190 &plusmn; 10 nM. <br />A técnica de ITC foi fundamental no processo de descoberta de inibidores enzimáticos, pois se mostrou extremamente susceptível à determinação da interação intermolecular enzima-inibidor, permitindo acompanhar a cinética da reação e obter os valores da constante de afinidade de maneira precisa e acurada. Com isso, a taxa de acerto obtida nesta tese foi de 46%, considerando-se apenas as substâncias com valores de Ki app < 100 &micro;M. Esse é um número favoravelmente apreciável, já que na literatura ele gira em torno de 1-10% quando o planejamento in silico é realizado, quando comparado às taxas de acerto dos métodos de ensaio em larga escala (HTS), entre 0-2 %, os resultados alcançados neste trabalho são ainda mais significativos. <br />Além disso, as substâncias químicas selecionadas através da integração de métodos in silico e biocalorimétricos apresentam elevado grau de complexidade no processo biomolecular de interação enzima-ligante, que permite classificá-las para as fases seguintes da gênese planejada de fármacos. / American trypanosomiasis or Chagas disease, caused by the haemoflagellate Trypanosoma cruzi, is a tropical disease that affects millions of people in Latin America. Epidemiology of Chagas disease in non-endemic countries is attained by immigration as the disease also affects people in the United States, Canada, Europe, Australia and Japan. However, the United States are not to be written off as an area of nonendemicity for Chagas disease like Europe or Asia because the southern states have enzootic T. cruzi transmission that involves triatomine species and hosts such as raccoons, opossums, and domestic dogs. Even though, this disease has been considered as a super-neglected from the big Pharma Industry viewpoint since the only available drugs for its treatment were introduced in the market more than forty years ago and worsen is that they have low efficacy and cause various severe side effects. <br />Although the current clinical scenario is of course discouraging and is far from being even a soothing treatment for those who suffer from the disease, it prompt ones to set efforts towards the need of discovering and developing new efficacious and safe drugs to treat Chagas disease. <br />Our research group covers the concept of enzymes acting as targets for the action of drugs. Once T. cruzi has many druggable targets, the dihydroorotate dehydrogenase enzyme (TcDHODH) that belongs to the de novo pyrimidine nucleotide synthetic pathway has been chosen for the search of new inhibitors that may be of use in the treatment of Chagas disease. To accomplish with this and considering that inhibitors are molecules that decrease enzyme activity leading to parasite death, we used the concepts and tools of modern computational medicinal chemistry such as in silico screening of small molecules that bind to the active site of the TcDHODH. <br />After a thoroughly program of virtually screening thousands of compounds, 26 were purchased from commercially available sources and experimentally assayed against the TcDHODH using Isothermal Titration Calorimetry (ITC) in order to determine the mechanism of inhibition and the kinetic affinity constant (Kiapp). <br />The first series of inhibitors selected from our in silico strategy were evaluated by ITC to yield compounds that inhibited the TcDHODH in the micromolar concentration range with an average of 0.50 kcal mol-1 atom-1 ligand efficiency (LE). Because the assayed compounds have low molecular weight (ca. 200 kDa) and high LE, which bring them to the specific bimolecular pattern recognition all of them were considered good inhibitors capable of being selected to enter the hit-to-lead optimization process. <br />The detailed description of the ligand-enzyme mode of binding (MOB) is thoroughly accomplished by solving the X ray crystal structure of the surrogate Leishmania major DHODH enzyme (LmDHODH), which has a high degree of similarity with the enzyme TcDHODH. The MOB credited to be in the active site of the TcDHODH orthogonally validated the ITC kinetic experimental data obtained for all ligands as competitive inhibitors that interact at the active site of the TcDHODH and helped to generate pharmacophoric hypotheses for the search of new second generation molecules acting against the enzyme TcDHODH.  Analyzing the 3D structure of the TcDHODH along with its surrogate LmDHODH, we envisaged the possibility of compounds to extend their side chain beyond the region of the catalytic site (called S1), and interacting in a region called S2, so to increase binding affinity. Moreover, the TcDHODH S2 site that is not found in the 3D protein structure of humans (HsDHODH) is likely to offer new insights for the search of inhibitors whose binding to this S2 site can pave the roads towards the needed structural basis for selective inhibition of TcDHODH. <br />The most potent compounds inhibited the enzyme competitively with respect to the substrate dihydroorotate (DHO) at Kiapp values of 121 &plusmn; 14 nM and 190 &plusmn; 10 nM, which constitutes high affinity TcDHODH inhibitors. The ITC technique was pivotal to this process of enzyme inhibitors discovery, because it proved to be extremely sensitive thus allowing to monitor the kinetics of the reaction and to obtain precise and accurate values of affinity constants. <br />The hit rate obtained in this work, considering only those compounds with Kiapp < 100 &micro;M, was 46%. This is a really high number, since literature values range from 1 to 10% when the planning new inhibitors via in silico methods when compared to the success rates obtained by the methods of testing on large scales (HTS), 0-2 %, the results achieved in this work are even more significant. Moreover, the compounds selected through the integration of in silico and calorimetric methods showed a high degree of complexity in the process of bimolecular enzyme-ligand recognition, which allows to pass them to the next phase of the drug design process.