A Doença de Chagas, causada pelo parasita Trypanosoma cruzi, atinge cerca de um quarto da população da América Latina. Os fármacos disponíveis para o tratamento desta doença são inapropriados, apresentam baixa eficácia e sérios efeitos colaterais que limitam o seu uso. Esse grave panorama torna urgente a descoberta de novos agentes quimioterápicos para o tratamento seguro e eficaz da doença. A via glicolítica é principal forma de obtenção de energia de tripanosomatídeos. Um alvo molecular atrativo desta via bioquímica que desempenha papel essencial no controle do fluxo glicolítico do Trypanosoma cruzi, a enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), foi selecionada neste trabalho de Tese para estudos em biologia estrutural e química medicinal visando à identificação e planejamento de novos inibidores enzimáticos. Neste contexto, triagens biológicas resultaram na identificação de compostos de origem natural e sintética com atividade inibitória in vitro frente à GAPDH de T. cruzi, ampliando a diversidade química de moduladores seletivos deste alvo. Estudos cinéticos e estruturais demonstraram o comportamento não cooperativo entre os sítios ativos da enzima GAPDH de T. cruzi em relação à interação com o cofator NAD+, fornecendo importantes evidências mecanísticas e estruturais para uma melhor compreensão das bases moleculares envolvidas no processo de reconhecimento molecular. Os estudos das relações quantitativas entre a estrutura e atividade (QSAR 2D e QSAR 3D) resultaram na geração de modelos com elevada consistência estatística interna e externa, além de alto poder preditivo da propriedade-alvo. Além disso, estudos de modelagem molecular e de QSAR 3D revelaram aspectos estruturais relevantes para o planejamento de inibidores seletivos da enzima GAPDH de tripanosomatídeos. Por fim, uma estratégia de triagem virtual baseado na estrutura do receptor foi empregada para a identificação de novos inibidores da GAPDH de T. cruzi, consistindo, entre outros, na aplicação de filtros hierárquicos sucessivos envolvendo restrições farmacofóricas e estudos de docagem molecular que resultaram na seleção de 35 candidatos a inibidores da enzima-alvo. Os trabalhos integrando estudos em química medicinal e biologia estrutural apresentados nessa Tese de Doutorado significam importantes contribuições no desenvolvimento de bases científicas sólidas para o planejamento de novos inibidores potentes e seletivos da enzima GAPDH de T. cruzi, um alvo molecular de alta prioridade em nosso grupo de pesquisa. / Parasitic diseases are the foremost threat to human health and welfare around the world. Chagas\' disease (also called American trypanosomiasis) is a tropical parasitic disease which occurs in Latin America, particularly in South America. The currently available drugs for this parasitic disease have severe limitations, including poor efficacy and high toxicity. The crucial dependence of trypanosomatids on glycolysis as a source of energy makes the glycolytic enzymes promising targets for drug design. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) from Trypanosoma cruzi, a key enzyme in the glycolytic cascade, has been selected as an attractive drug target in this PhD Thesis work for studies in structural biology and medicinal chemistry for the identification and design of new enzyme inhibitors. In this context, compounds from both natural and synthetic sources with in vitro inhibitory activity against T. cruzi GAPDH were identified by screening assays, improving the chemical diversity of selective modulators of the target. Kinetic and structural studies have demonstrated the non-cooperative behavior between the T. cruzi active sites in the interaction with the NAD+ cofactor, shedding some light on the mechanistic and structural determinants underlying the biochemical recognition phenomenon. Quantitative structure-activity relationships (2D QSAR 2D and 3D QSAR) were successfully created, resulting in statistically significant models with good predictive ability for untested compounds. In addition, molecular modeling and 3D QSAR studies highlighted important structural aspects to assist the design of novel trypanosomatid GAPDH inhibitors. Finally, a structure-based virtual screening approach was employed for the identification of novel inhibitors of T. cruzi GAPDH, consisting of several consecutive hierarchical, fast pharmacophore matching and molecular docking, which afforded 35 inhibitor candidates for the target enzyme. The integration of structural biology and medicinal chemistry studies presented in this PhD Thesis are important contributions in the development of strong scientific basis for the design of new selective and potent inhibitors of GAPDH from T. cruzi, a molecular target of highest priority in our research group.

O Projeto Genoma Humano do Câncer (PGHC), financiado pela FAPESP e pelo Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o câncer, buscou identificar os genes expressos nos tipos mais comuns de câncer no Brasil. Tal projeto conseguiu identificar aproximadamente um milhão de sequências de genes de tumores frequentes no Brasil. A contribuição brasileira foi maior para tumores de cabeça e pescoço, mama e cólon. Uma das iniciativas mais recentes e estimuladas pelo PGHC é o projeto Genoma Clínico, o qual visa desenvolver novas formas de diagnóstico e tratamento do câncer através do estudo de genes expressos. A partir da análise molecular de tecidos saudáveis e neoplásicos em diferentes estágios, é possível identificar marcadores de prognóstico, permitindo escolhas de terapias mais adequadas e eficientes. A proteína MARK3 foi identificada como um desses marcadores, em neoplasias de tecidos de cabeça e pescoço, sendo o objetivo deste estudo a aplicação de técnicas de bioinformática e modelagem molecular no planejamento baseado em estrutura de candidatos a fármacos antineoplásicos que bloqueiem a atividade da proteína MARK3. Após screening virtual em bases de dados de compostos (1.000.000 aproximadamente) com propriedades drug-like, 20 compostos com potencial de inibidor da MARK3 foram selecionados. Os modos de ligação para cada um dos mesmos no sítio ligante da proteína MARK3 foram sugeridos por simulações de docking e apresentaram um bom encaixe espacial com os sítios receptores virtuais calculados pelos campos de interação molecular (MIF). Simulações de dinâmica molecular foram realizadas com o intuito de avaliar a estabilidade dos compostos selecionados, que também foram avaliados quanto à presença de grupamentos toxicofóricos em sua estrutura. / The Brazilian Project Genoma Câncer (PGHC) supported by FAPESP and the Ludwig Institute for Cancer Research, intended to identify the genes involved in the most common cases of cancer in Brazil. In this project about a million of gene sequences were identified. The major contribution was made in breast, colorectal and head and neck cancers. The results obtained stimulated the creation of another project, called Genoma Clínico, which intend to develop new trends in treatments and diagnosis of cancer based on the study of expressed genes. Analyzing healthy and neoplasic tissues in different stages, it is possible to identify molecular markers related to the prognosis of cancer, allowing the use of more efficient therapies. The MARK3 protein was identified as a molecular marker in head and neck cancer, where the objective of this work lies in the application of bioinformatics and molecular modeling strategies by structure-based drug design to identify potential antineoplasic drug candicates that could act against MARK3 protein. After the virtual screening simulations performed with drug-like compound databases, containing approximately 1.000.000 compounds, 20 were selected as potential ligands of MARK3 protein. The binding modes suggested for these compounds, by docking simulations, presented a good spatial fit when compared with the virtual receptor sites calculated by molecular interaction fields (MIF). Molecular dynamics simulations were performed in order to evaluate de stability of the binding modes suggested. The potential ligands were also evaluated to identify toxicophoric features in its chemical structures.

Os processos farmacocinéticos de absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME), têm sido identificados como as principais causas do insucesso de candidatos a fármacos em estágios avançados de desenvolvimento clínico. As metodologias modernas de modelagem in silico de propriedades farmacocinéticas estão integradas ao processo de planejamento de fármacos, sendo de extremo valor na identificação e seleção de novas entidades químicas candidatas a fármacos. Esta área emergente está atraindo grande atenção da indústria farmacêutica mundial, que tem integrado a otimização de múltiplas propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéticas em todos os estágios de projetos de pesquisa e desenvolvimento (P&D). As propriedades farmacocinéticas podem ser estudadas através do uso de métodos in silico como o estudo das relações quantitativas entre a estrutura e atividade (QSAR), ou estrutura e propriedade (QSPR), entre outros. O trabalho desenvolvido nesta tese de doutorado teve como importante objetivo estudar as relações quantitativas entre a estrutura química e propriedades farmacocinéticas como absorção intestinal, metabolismo de primeira passagem mediado pelo CYP, permeabilidade da barreira hematoencefálica, bem como eventos de extremo interesse que as influenciem como a inibição da glicoproteína-P e solubilidade aquosa. Para a realização deste trabalho, conjuntos padrões de dados foram organizados para as propriedades farmacocinéticas contendo a informação qualificada sobre a estrutura química e a propriedade alvo correspondente. Os conjuntos de dados criados formaram as bases científicas para o desenvolvimento dos modelos preditivos empregando o método holograma QSAR (HQSAR). Os modelos finais de HQSAR gerados neste trabalho possuem elevada consistência interna e externa, apresentando bom poder de correlação e predição das propriedades alvo. Os modelos desenvolvidos, assim como os dados farmacocinéticos coletados, foram disponibilizados para acesso livre através da internet na base de dados PK/DB (www.pkdb.ifsc.usp.br). Devido à simplicidade, robustez e consistência, estes modelos são guias úteis em Química Medicinal nos estágios iniciais do processo de descoberta e desenvolvimento de fármacos. / The pharmacokinetic (PK) processes of absorption, distribution, metabolism and excretion (ADME), have been identified as one of the major causes of new chemical entities (NCEs) failure in early clinical trials. In silico models are receiving increased attention in recent years from the pharmaceutical industry, which is integrating a paradigm of multiple pharmacodynamic and pharmacokinetic properties optimization for the development of NCEs. ADME properties can be studied by in silico methods, such as quantitative structure-activity relationships (QSAR) or structure-property (QSPR), among other methodologies. The main goal of this PhD thesis was to study the quantitative relationships between chemical structure and pharmacokinetic properties, such as intestinal absorption, CYP mediated first pass metabolism, blood brain barrier permeability, as well as other important events that have influence on these PK properties, such as P-glycoprotein inhibition and water solubility. In the present work, standard data sets were organized encompassing the structural information and corresponding pharmacokinetic data. The standard data sets established the scientific basis for the development of predictive models using the hologram QSAR (HQSAR) method. The final HQSAR models possess high internal and external consistency with good correlative and predictive power for endpoint PK properties. All in silico models generated and standard data sets are freely available on the internet through the Database for Pharmacokinetic Properties (PK/DB - www.pkdb.ifsc.usp.br). Due to the simplicity, robustness and effectiveness, these models are useful guides in Medicinal Chemistry in the early stages of the drug discovery and development process.

Câncer é a proliferação descontrolada de células anormais do organismo. As células cancerosas podem se transferir para outras partes do corpo onde passam a crescer e substituir o tecido sadio, num processo conhecido como metástase. De um total de 58 milhões de mortes ocorridas no mundo em 2007, o câncer foi responsável por 7,6 milhões. O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais freqüente no mundo, sendo o mais comum entre as mulheres. A cada ano, cerca de 20% dos novos casos de câncer em mulheres são de mama. No que diz respeito a valores absolutos, o câncer de próstata é o sexto tipo de câncer mais comum no mundo e o mais prevalente em homens, representando cerca de 10% do total. As principais formas de tratamento são a cirurgia, quimioterapia, radioterapia, hormonioterapia, imunoterapia e as terapias-alvo. Os tratamentos quimioterápicos e radioterápicos, principalmente, possuem baixa seletividade em sua ação frente a células malignas e benignas. O presente trabalho de dissertação tem como objetivo o desenvolvimento de testes in vitro, como o wound healing e o de migração, empregando células de adenocarcinoma mamário humano (MDA-MB-231) e de câncer de próstata humano (DU-145), além da triagem biológica de compostos químicos visando à identificação de novos candidatos a inibidores do processo de migração celular (metástase). Os protocolos experimentais foram estabelecidos e padronizados com sucesso, fornecendo resultados reprodutíveis, confiáveis e validados. Após extensivas triagens biológicas, duas classes de candidatos a inibidores foram identificadas. / Cancer is an abnormal proliferation of cells from an organ or tissue. The cancer cells may spread from one organ or part to another non-adjacent organ or part in a process called metastasis. In 2007, cancer was responsible for 7.6 million out of the 58 million deaths occurred in the World. Breast Cancer is the second leading cause of cancer death in the World, and the most frequent in women. Each year, over 20% of the new cases of cancer in women are breast cancer. In absolute values, prostate cancer is the sixth type of cancer more common in the World and the most prevalent in the men, representing about 10% of the total. There are a number of different methods used to treat cancer, including surgery, radiation and chemotherapy. Chemotherapy and radiotherapy treatments show low effectiveness and selectivity towards malignant and benign cells. The objective of the present dissertation work is to develop in vitro assays, such as wound healing and cell migration employing MDA-MD-231 breast cancer cells and DU-145 prostate cancer cells, as well as perform biological screening of chemical compounds in order to identify selective inhibitors of tumor metastasis as novel lead candidates for further development. The experimental protocols have been successfully implemented providing reproducible and reliable results. After extensive biological investigations, two inhibitor candidate classes have been identified.

Câncer é a denominação de um conjunto de mais de cem doenças causadas pelo crescimento e multiplicação desordenados de células anormais capazes de invadir e se disseminar por diversos tecidos e órgãos. É considerado um problema de saúde mundial, sendo uma das maiores causas de morte. Dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) indicam que 15% das mortes no mundo serão causadas por câncer em 2015. No Brasil, o Instituto Nacional do Câncer (INCA) estima 580 mil novos casos da doença para 2014. Apesar da vasta quimioterapia disponível, os tratamentos possuem alta toxicidade e estão sujeitos à resistência. Nesse contexto, a presente dissertação de mestrado tem como foco principal a identificação e caracterização de novos compostos com propriedades anticâncer. Os estudos foram realizados com base em dois alvos principais. O primeiro foi a proteína tubulina, um alvo anticâncer validado que é modulado por moléculas importantes como o taxol, a vimblastina e a colchicina. O segundo alvo foi a migração celular, característica relacionada ao processo de metástase, que é responsável por 90% das mortes por câncer. Uma série de acridinonas sintéticas foi avaliada in silico frente à proteína tubulina empregando métodos de modelagem molecular. Para tanto, fez-se uso de estruturas cristalográficas da proteína disponíveis no PDB (Protein Data Bank). Os resultados das análises de docagem molecular indicaram que as moléculas poderiam interagir com o sítio da colchicina e, dessa forma, atuariam como inibidoras da polimerização dos microtúbulos. Ensaios wound healing e em câmara de Boyden permitiram a identificação de quatro compostos com potente efeito de inibição da migração celular (valores de IC50 variando entre 0,294 e 1,7 μM) em uma linhagem metastática (MDA-MB-231). Estes compostos foram submetidos a ensaios de citotoxicidade frente à mesma linhagem tumoral e também apresentaram boa potência, com valores de IC50 variando entre 0,110 e 3 μM. Além disso, ensaios de citotoxicidade em células saudáveis mostraram que estes compostos inviabilizaram seletivamente células tumorais. Para a validação dos estudos in silico, ensaios de polimerização da tubulina foram conduzidos. Os resultados mostraram que as quatro moléculas ativas nos ensaios celulares atuam como inibidores de polimerização dos microtúbulos, com valores de IC50 variando entre 0,9 e 13 μM. Estudos das relações entre a estrutura e atividade (SAR) revelaram alguns aspectos interessantes nesta série de acridinonas, como, por exemplo, a perda de atividade, que se deu tanto nos ensaios celulares quanto nos ensaios bioquímicos, causada pela substituição de um grupo nitro da posição meta- por para- em duas moléculas da série. A progressão do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo e os resultados mostraram que os compostos estudados são capazes de interromper o ciclo celular entre as fases G2 e M. A citometria fluxo também permitiu verificar a indução da apoptose celular devida à ação das moléculas. Em resumo, este trabalho possibilitou a identificação e caracterização de quatro compostos com propriedades antitumorais promissoras que serão utilizados como compostos líderes para posterior desenvolvimento como agentes anticâncer. / Cancer is a set of diseases with high diversity and aggressiveness. It is one of the major causes of death according to the World Health Organization (WHO), being responsible for 15% of worldwide deaths in 2015. In Brazil, the National Institute of Cancer (INCA) estimates 580,000 new cases of cancer for the year of 2014. Despite the vast availability of cancer chemotherapy, the treatments cause high toxic effects and are liable to resistance. In this context, the main goal of the present master\'s dissertation is the identification and the characterization of new compounds having anticancer properties. These studies were conducted based on two main targets. The first one was the protein tubulin, a validated anticancer target that is modulated by important molecules such as taxol, vinblastine and colchicine. The second target was the cellular migration, a feature related to the metastasis process, which causes 90% of the cancer deaths. A series of synthetic acridinones was studied in silico employing molecular modeling methods. For this, crystallographic structures of tubulin were collected from PDB (Protein Data Bank). The docking results indicated that the molecules could interact with the colchicine site and, thereby, could act as tubulin polymerization inhibitors. The series was assessed by the wound healing and Boyden chamber\'s assays using the metastatic cell line MDA-MB-231. In these assays, four compounds were identified as good inhibitors of cellular migration (IC50 values varying between 0.294 and 1.7 μM). These compounds were evaluated in cytotoxicity assays using the same cell line and presented good potency, with IC50 values varying between 0.110 and 3 μM. Furthermore, cytotoxicity assays using a healthy cell line showed that these compounds act selectively in tumor cells. For the validation of the in silico studies, tubulin polymerization assays were conducted. The results showed that the four active molecules in the cellular assays act as tubulin polymerization inhibitors, with IC50 values varying between 0.9 and 13 μM. Structure-activity relationship (SAR) studies revealed interesting structural aspects in this series of acridinones, for instance, the exchange of the nitro group substituent from the meta- to the para- position in two molecules of the series led to a lack of activity in both cellular and biochemical assays. The cell cycle progression was evaluated by flow cytometry, and the results showed that the four compounds are capable of arrest cells in the G2/M phase. Moreover, the apoptosis induction was verified using flow cytometry. In summary, this work provided the identification and characterization of four new compounds with promising antitumor properties. These molecules will be used as lead compounds for further development as anticancer agents.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3984.pdf: 5210266 bytes, checksum: 616ad660a40f39350e3ca136cfa1271a (MD5) Previous issue date: 2011-06-20 / Universidade Federal de Sao Carlos / The present work describes the syntheses and characterization of complexes of general formula [Ru(AA)(P-P)(N-N)]PF6 where AA = aminoacids (Gly, Ala, Val, Met, Tyr, Trp, Leu, Arg, Ser, Lys, His); P-P = 1,4- bis(diphenylphosphino)butane and 1,3-bis(diphenylphosphino)propane; N-N= 1,10- phenanthroline, 4,4 -dimethyl-2,2 -bipyridine, 5,5 -dimethyl-2,2 -bipyridine e 4,4 - methoxy-2-2'-bipy. The complexes were evaluated against cell lines MDA-MB-231, MCF-7 (breast tumor cells), DU-145 (prostate tumor cells) and in FGH and V79 (fibroblasts, normal cells), HeLa (colon tumor cells), as well as antimicrobial tests (tuberculosis) and antiparasite (malaria (CW-2 chloroquine resistant) and Chagas disease (Y-form) ). By analytical techniques such as elemental analysis, UV-vis and infrared spectroscopies and nuclear magnetic resonance (31P{1H}, 13C{1H} and 1H), it was possible to confirm the proposed structures for the synthesized compounds. By the 31P{1H}, 13C and 1H NMR spectra, it was suggested the presence of isomers, these data combined with the X-ray structure analysis of the [Ru(LLeu)( dppb)(bipy)]PF6, allowed us to conclude that those isomers are diastereoisomers. The cyclic voltammograms of all the complexes are similar with the first anodic wave around 1.1 V being attributed to the oxidation RuII→RuIII, and the second anodic wave, in 1.2 V, is attributed to the oxidation of the COO- group of the aminoacid ligands. In the IR spectra of the complexes, characteristic stretching bands of the group NH2 and COO- were observed, which are found shifted to higher frequencies when compared to the free aminoacid. The complexes here studied presented promising results against diseases evaluated. The values of the IC50 for some of the compounds showed 31,5-fold lower than the cisplatin. The antimycobacterial tests were satisfactory, since the complexes showed lower MIC values than some drugs actually used in the tuberculosis treatment. Considering the antiparasitic tests, low IC50 values were also observed. / Neste trabalho obtiveram-se complexos de fórmula geral [Ru(AA)(PP)( N-N)]PF6 onde AA = aminoácidos (Gly, Ala, Val, Met, Tyr, Trp, Leu, Arg, Ser, Lys, His); P-P = 1,4-bis(difenilfosfina)butano e 1,3-bis(difenilfosfina)propano; N-N= 1,10- fenantrolina, 4,4 -dimetil-2,2 -bipiridina, 5,5 -dimetil-2,2 -bipiridina e 4,4 -metoxi-2-2'- bipy, os quais foram avaliados frente as linhagens de células do tipo MDA-MB-231, MCF-7 (células tumorais de mama), DU-145 (células tumorais de próstata), HeLa (células tumorais de câncer de colo de útero) e em FGH e V79 ((linhagem celular não tumoral, fibroblastos), além de testes para avaliação antimicrobacteriana (tuberculose) e antiparasitária (malária (CW-2 resistente a cloroquina) e doença de Chagas (Cepas-Y) ). Através das técnicas de análise elementar, espectroscopia de absorção na região do ultravioleta visível e infravermelho e ressonância magnética nuclear de 31P{1H}, 13C{1H}, 1H foi possível confirmar as estruturas propostas para os compostos sintetizados. Através dos espectros de RMN de 31P{1H}, 13C{1H}, 1H sugeriu-se a presença de isômeros, estes dados, junto à determinação da estrutura de raios X do [Ru(Leu)(dppb)(bipy)]PF6 permitiram concluir que esses isômeros são diastereoisômeros. Nos voltamogramas cíclicos dos complexos, a primeira onda anódica, em torno de 1,1 V é atribuída ao RuII→RuIII, e a segunda onda anódica, em 1,2 V, é atribuída à oxidação do grupo COO- do aminoácido. No espectro de IV dos complexos, existem estiramentos das bandas do grupo NH2 e do COO-, característicos dos aminoácidos. Esses estiramentos deslocaram-se para frequências mais altas quando comparados com os mesmos estiramentos dos ligantes livres. Os complexos aqui estudados apresentaram resultados promissores frente às doenças avaliadas. Os valores de IC50 para alguns dos compostos obtidos foram 31,5 vezes menores que do cisplatina. Os testes de atividade antimicobactericida foram satisfatórios, pois os complexos apresentaram valores de MIC mais baixos que alguns fármacos usados atualmente no tratamento da tuberculose. Quanto aos testes antiparasitários baixos valores IC50 foram observados.

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Cruzain is the major Trypanosoma cruzi cysteine protease, the causative agent of the disease, and is a validated therapeutic target for the discovery of new trypanocidal agents. Our group has identified a cruzain inhibitor with fragment characteristics - [5- (2-chlorophenyl) -1,3,4- oxadiazol-2-yl] acetic acid (Neq0147) and its mode of interaction was validated by determining orthogonally its crystal structure. However, interactions of this inhibitor were not yet appropriately optimized. Therefore, this study aimed to optimize the interactions of Neq0147 to identify new fragments as non-peptide cruzain inhibitors, which was carried out through a structure-activity relationship study (SAR). Molecular modifications have been made based on Neq0147, wherein initially carboxylate was replaced by a nitrile to increase the affinity of the inhibitor and to act as an anchor to explore other modifications. Then it was made the replacement of the 1,3,4-oxadiazole ring for others heterocyclic five-membered rings, with the intention to explore interactions with Asp161 and Gly65. The position of the chlorine atom on the aromatic ring was also varied to explore interactions with amino acids in the S2 subsite. The compounds were tested against cruzain to determine its inhibition constant. From the SAR study it can be concluded that the change that generated higher affinity gain was the replacement of the carboxylate group by nitrile. It can also be seen that the presence of chlorine is essential for the fragments activity, which preferably should be present in the ortho or para positions. Among the evaluated inhibitors one fragment, Neq0617, has an affinity 14 times greater than the original fragment. Moreover, various inhibitors similar to fragments with high affinity and interaction efficiency have been identified, therefore these inhibitors are potential candidates for optimization. / Os fármacos disponíveis para o tratamento da doença de Chagas não são eficazes, portanto é necessário o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. A cruzaína é a principal cisteínoprotease do Trypanosoma cruzi, agente causador da doença, e é um alvo terapêutico validado para a descoberta de novos agentes tripanossomicidas. Nosso grupo identificou um inibidor de cruzaína com características de fragmento, o ácido [5- (2- clorofenil) -1,3,4-oxadiazol-2-il] acético (Neq0147), e seu modo de ligação foi validado ortogonalmente através da determinação de sua estrutura cristalográfica. No entanto, as interações deste inibidor ainda não estavam otimizadas de maneira adequada. Então este trabalho teve como objetivo a otimização das interações do Neq0147 para identificação de novos fragmentos como inibidores não peptidícos da cruzaína, que foi realizado através de um estudo de relação estrutura-atividade (SAR). Modificações moleculares foram feitas baseadas no Neq0147, sendo que inicialmente o carboxilato foi substituído por uma nitrila para aumentar a afinidade do inibidor e atuar como âncora para explorar outras modificações. Em seguida, foi feita a substituição do anel 1,3,4- oxadiazol por outros anéis heterocíclicos de cinco membros, com a intenção de explorar interações com o Asp161 e a Gly65. A posição do átomo de cloro no anel aromático também foi variada para explorar interações com aminoácidos presentes no subsítio S2. Os compostos foram testados contra a cruzaína para a determinação da sua constante de inibição (Ki). A partir do estudo de SAR, pode-se concluir que a modificação que gerou maior ganho de afinidade foi à substituição do grupo carboxilato pela nitrila. Também pode-se observar que a presença do átomo de cloro é essencial para a atividade dos fragmentos, sendo que preferencialmente deve estar presente nas posições orto ou para. Entre os inibidores avaliados um fragmento, Neq0617, teve uma afinidade 14 vezes maior do que a do fragmento inicial. Além disso, vários inibidores similares a fragmentos com alta afinidade e eficiência de interação foram identificados, portanto estes inibidores são potencias candidatos para otimização.

O planejamento de moduladores da dinâmica dos microtúbulos, a partir da ligação à αβ-tubulina, constitui importante estratégia para a terapia do câncer. Os efeitos de inibição da polimerização da tubulina ou de estabilização dos microtúbulos são promovidos pela interação de compostos em cavidades específicas da proteína alvo. A interferência com a dinâmica dos microtúbulos nas células em rápida multiplicação provoca o bloqueio do ciclo celular, disparando sinais bioquímicos que culminam em apoptose. Os taxanos são os agentes antimitóticos mais importantes dentre os estabilizadores de microtúbulos, ao passo que os alcalóides da vinca e a colchicina são membros representativos dos inibidores da polimerização. Entretanto, o aparecimento de resistência, baixa biodisponibilidade e reações adversas graves são fatores que têm impulsionado a pesquisa por novos agentes anticâncer. Dentre os ligantes identificados recentemente para o sítio do taxol, o discodermolídeo e a dictiostatina, produtos naturais de origem marinha, são potentes estabilizadores de microtúbulos que apresentam maior solubilidade que o taxol e atividade contra células de câncer resistentes aos taxanos. Por essa razão, o modo de ligação desses compostos à cavidade de interação da β-tubulina tem sido objeto de investigação. Modelos preditivos de HQSAR foram desenvolvidos para derivados sintéticos do discodermolídeo e utilizados em conjunto com estudos baseados na estrutura do receptor, em concordância com evidências experimentais, para a proposição de modelos de interação para os análogos na cavidade do taxol. Os modelos de conformação bioativa foram utilizados no alinhamento estrutural do conjunto de dados para estudos de QSAR 3D CoMFA e comparação com o alinhamento baseado nas estruturas minimizadas dos ligantes. A caracterização de padrões de reconhecimento molecular foi útil para a proposição de um modelo farmacofórico baseado nas estruturas dos produtos naturais estabilizadores de microtúbulos. Um modelo farmacofórico simplificado foi integrado ao processo de triagem virtual consistindo na aplicação de filtros hierárquicos sucessivos para a identificação de novos estabilizadores de microtúbulos. Caseobliquinas foram ensaiadas como estabilizadoras de microtúbulos, enquanto que intermediários sintéticos da dictiostatina foram avaliados quanto aos seus efeitos na polimerização da tubulina. Nos últimos anos, tem sido intensificada a busca por novos ligantes do sítio da colchicina, dentre os quais os indóis estão entre os mais relevantes. Para quatro conjuntos de dados totalizando 170 derivados de indóis, modelos de HQSAR foram desenvolvidos para a avaliação virtual de uma base de dados. Estudos de QSAR 3D CoMFA e CoMSIA baseados nos farmacóforos foram comparados para 3 conjuntos de dados. Os resultados sugerem que o núcleo indólico pode interagir de maneiras diferentes na cavidade de interação da proteína. Chalconas do tipo 1, inspiradas em ligantes clássicos do sítio da colchicina, foram avaliadas em ensaios celulares e de polimerização da tubulina, levando a síntese e avaliação de uma nova série de chalconas com propriedade antiproliferativa significativa. Por outro lado, derivados de N-acil-hidrazonas apresentaram atividade antimitótica semelhante à colchicina, enquanto as tiosemicarbazonas citotóxicas não interagiram diretamente com a tubulina. / Inhibition of microtubule function is one of the most important approaches to anticancer therapy. Two main effects can be elicited by tubulin/microtubule-interactive agents: inhibition of tubulin assembly or microtubule stabilization. Interference with either the assembly or disassembly of microtubules within the mitotic spindle in rapidly dividing cells disrupts the normal process of cell division and provokes chemical signals that induce apoptosis. On one hand, taxanes are the most prominent among the microtubule-stabilizing antimitotic agents, while on the other hand, colchicine and the vinca alkaloids are representative members of the tubulin polymerization inhibitors. However, due to poor pharmacokinetic properties, high toxicity and resistance, their clinical utility has been limited, generating new opportunities for the development of novel anticancer agents. In recent years, structurally diverse taxoid-site ligands have been identified, including the potent microtubule-stabilizers discodermolide and dictyostatin. These marine sponge-derived natural products have higher water solubility than taxol and exhibit activity against taxane-resistant cell lines. Therefore, the elucidation of their binding modes is important in drug design. Predictive conformation-independent hologram QSAR models were developed for a series of synthetic discodermolide analogs as antiproliferative agents. Receptor-based studies were integrated with molecular recognition patterns, in agreement with experimental evidences, leading to ligand-binding conformations for discodermolide analogs in the taxol-site. The bioactive conformation models were used to the structural alignment of the data set for the development of 3D QSAR CoMFA models, and for comparison with the models constructed with the rigid-body alignment based on minimized structures of the ligands. A set of structural features related to the interaction with the taxol cavity was identified and the molecular recognition patterns were employed to the construction of pharmacophore models based on the microtubule-stabilizing natural products. A final simplified pharmacophore model was integrated in a virtual screening procedure consisting of consecutive hierarchical filters targeting the identification of novel microtubule-stabilizers. Caseobliquins were screened as microtubule-stabilizers, while intermediates for the synthesis of dictyostatin were evaluated by their effects on tubulin assembly. Recently, the search for more simple anti-tubulin agents has renewed the interest in the development of colchicine analogs, often discarded for their high toxicity. Considering the structurally diverse ligands of the colchicine site, the indole derivatives are among the most important ones. Hologram QSAR models were developed for four data sets consisting of 170 indole derivatives, and used to evaluate a data set of commercially available compounds. Pharmacophore-based 3D QSAR CoMFA and CoMSIA models were constructed and compared to three of the individual data sets. The results indicated that the indole nucleus bind to the protein cavity in different ways. Type 1 chalcones, designed based on classical colchicine site ligands, have been screened for their anti-proliferative activity and tubulin assembly inhibition, leading to the synthesis and assessment of a novel series of chalcone analogs with substantial antiproliferative properties. Some N-acylhydrazone derivatives behaved as mitotic arresters in a way similar to that of colchicine, while cytotoxic thiosemicarbazones did not exhibit tubulin-interacting properties.

A doença de Chagas, uma infecção parasitária amplamente distribuída na América Latina, é um problema grave de saúde pública com consequências devastadoras em termos de morbidade e mortalidade humana. O arsenal terapêutico contra a doença é bastante limitado e insuficiente em todos os aspectos clínicos. Visando o desenvolvimento de novos agentes antichagásicos, várias proteínas do parasita têm sido exploradas como alvos terapêuticos. Neste contexto, a enzima cruzaína, uma cisteíno protease envolvida nos estágios de desenvolvimento e diferenciação do Trypanosoma cruzi, foi selecionada para os nossos estudos, visando a identificação de inibidores através do uso do método de planejamento de fármacos baseado na estrutura do receptor (SBDD, do inglês, structure-based drug design). Esta metodologia engloba uma diversidade de estratégias, empregando estruturas cristalográficas de proteínas alvo, disponíveis usualmente no Protein Data Bank (PDB). Entre as técnicas modernas utilizadas no SBDD, destaca-se a triagem virtual baseada na estrutura do receptor (SBVS, do inglês, structure-based virtual screening), que possibilita a seleção de novos candidatos a ligantes de proteínas alvo, a partir de grandes bases de dados de compostos. No presente trabalho de dissertação, a seleção de 19 estruturas da enzima cruzaína, em complexo com ligantes, permitiu a aplicação de métodos de SBDD. Um conjunto com cerca de 3,4 milhões de compostos, com característica líder-similar (do inglês, lead-like), e outro conjunto com aproximadamente 450.000 compostos, com característica fragmento-similar (do inglês, fragment-like), foram coletados da base de dados ZINC. O programa DOCK 3.5.54 foi empregado na triagem virtual das bases de dados utilizando-se a estrutura cristalográfica PDB ID: 3KKU. Um subconjunto com 35.000 moléculas foi selecionado para estudos posteriores com os programas GOLD e Surflex. As 500 melhores moléculas selecionadas por cada um dos programas foram analisadas visualmente considerando-se diversas características estruturais dos subsítios da enzima cruzaína e dos ligantes (e.g., complementaridade molecular, flexibilidade, lipofilia do subsítio S2, presença de doadores e aceptores de hidrogênio entre os subsítios S2 e S1). Desta forma, um conjunto final de 18 compostos foi priorizado para os ensaios bioquímicos frente a enzima cruzaína. Destes 18 compostos, 6 apresentaram atividade inibitória frente a cruzaína, com destaque para os 2 mais promissores, com valores de IC50 (concentração de inibidor necessária para reduzir em 50% a atividade enzimática) de 20 µM e 580 nM. O inibidor mais potente da série foi selecionado da base fragmento-similar e apresentou um valor de eficiência do ligante (EL) de 0,53 kcal/mol/átomo, considerado significativo para otimização em química medicinal. A integração de técnicas computacionais e experimentais permitiu a descoberta de ligantes com inovação estrutural, abrindo novas perspectivas para o planejamento de inibidores mais potentes e seletivos da enzima cruzaína de T. cruzi. / Chagas disease, a parasitic infection widely distributed in Latin America, is a serious public health problem with devastating consequences in terms of human morbidity and mortality. The therapeutic arsenal against the disease is very limited and insufficient in all clinical aspects. This has led to a new paradigm for the discovery of new agents that act on specific enzymes or metabolic pathways. The enzyme cruzain, a cysteine protease essential for the survival of the parasite Trypanosoma cruzi, has been selected in this work as an attractive target for the development of new inhibitors through the use of structure-based drug design (SBDD). This approach brings together a diversity of strategies, which employs crystal structures of target proteins, usually available in the Protein Data Bank (PDB). Structure-based virtual screening (SBVS), one of the most important techniques used in SBDD, allows the selection of new ligands of target proteins from large libraries of compounds. In this work, 19 crystal structures of the cruzain enzyme, in complex with ligands, allowed the application of SBDD methods. A data set of about 3.4 million compounds, with lead-like characteristics, and a second data set, with approximately 450,000 compounds, with fragment-like characteristics, were collected from the ZINC data base. The docking program DOCK 3.5.54 was employed in the virtual screening of the data sets using the crystal structure PDB ID: 3KKU. A subset of 35,000 compounds was selected for further studies with the programs GOLD and Surflex. The 500 top ranked molecules for each of the programs were visually inspected considering a number of structural characteristics of the subsites of the cruzain enzyme, as well as of the ligands (e.g., molecular complementarity, flexibility, the hydrophobic S2 subsite, and the presence of hydrogen donors and acceptors between the subsites S2 and S1). Thus, a final subset of 18 compounds was prioritized for the biochemical assays against the cruzain enzyme. Six out of 18 compounds exhibited enzyme inhibition, with the most two promising inhibitors having IC50 values (IC50 refers to the concentration of compound required for 50% inhibition of cruzain) of 20 µM e 580 nM. The most potent inhibitor of the series was selected from the fragment-like data set and showed a ligand efficiency of 0,53 kcal/mol/atom, which is considered significant in drug design. The integration of computational and experimental approaches allowed the discovery of compounds with innovative structures, providing new perspectives for the design of inhibitors of T.cruzi cruzain having increased potency and selectivity.

A Doença de Chagas, causada pelo parasita Trypanosoma cruzi, atinge cerca de um quarto da população da América Latina. Os fármacos disponíveis para o tratamento desta doença são inapropriados, apresentam baixa eficácia e sérios efeitos colaterais que limitam o seu uso. Esse grave panorama torna urgente a descoberta de novos agentes quimioterápicos para o tratamento seguro e eficaz da doença. A via glicolítica é principal forma de obtenção de energia de tripanosomatídeos. Um alvo molecular atrativo desta via bioquímica que desempenha papel essencial no controle do fluxo glicolítico do Trypanosoma cruzi, a enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), foi selecionada neste trabalho de Tese para estudos em biologia estrutural e química medicinal visando à identificação e planejamento de novos inibidores enzimáticos. Neste contexto, triagens biológicas resultaram na identificação de compostos de origem natural e sintética com atividade inibitória in vitro frente à GAPDH de T. cruzi, ampliando a diversidade química de moduladores seletivos deste alvo. Estudos cinéticos e estruturais demonstraram o comportamento não cooperativo entre os sítios ativos da enzima GAPDH de T. cruzi em relação à interação com o cofator NAD+, fornecendo importantes evidências mecanísticas e estruturais para uma melhor compreensão das bases moleculares envolvidas no processo de reconhecimento molecular. Os estudos das relações quantitativas entre a estrutura e atividade (QSAR 2D e QSAR 3D) resultaram na geração de modelos com elevada consistência estatística interna e externa, além de alto poder preditivo da propriedade-alvo. Além disso, estudos de modelagem molecular e de QSAR 3D revelaram aspectos estruturais relevantes para o planejamento de inibidores seletivos da enzima GAPDH de tripanosomatídeos. Por fim, uma estratégia de triagem virtual baseado na estrutura do receptor foi empregada para a identificação de novos inibidores da GAPDH de T. cruzi, consistindo, entre outros, na aplicação de filtros hierárquicos sucessivos envolvendo restrições farmacofóricas e estudos de docagem molecular que resultaram na seleção de 35 candidatos a inibidores da enzima-alvo. Os trabalhos integrando estudos em química medicinal e biologia estrutural apresentados nessa Tese de Doutorado significam importantes contribuições no desenvolvimento de bases científicas sólidas para o planejamento de novos inibidores potentes e seletivos da enzima GAPDH de T. cruzi, um alvo molecular de alta prioridade em nosso grupo de pesquisa. / Parasitic diseases are the foremost threat to human health and welfare around the world. Chagas\' disease (also called American trypanosomiasis) is a tropical parasitic disease which occurs in Latin America, particularly in South America. The currently available drugs for this parasitic disease have severe limitations, including poor efficacy and high toxicity. The crucial dependence of trypanosomatids on glycolysis as a source of energy makes the glycolytic enzymes promising targets for drug design. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) from Trypanosoma cruzi, a key enzyme in the glycolytic cascade, has been selected as an attractive drug target in this PhD Thesis work for studies in structural biology and medicinal chemistry for the identification and design of new enzyme inhibitors. In this context, compounds from both natural and synthetic sources with in vitro inhibitory activity against T. cruzi GAPDH were identified by screening assays, improving the chemical diversity of selective modulators of the target. Kinetic and structural studies have demonstrated the non-cooperative behavior between the T. cruzi active sites in the interaction with the NAD+ cofactor, shedding some light on the mechanistic and structural determinants underlying the biochemical recognition phenomenon. Quantitative structure-activity relationships (2D QSAR 2D and 3D QSAR) were successfully created, resulting in statistically significant models with good predictive ability for untested compounds. In addition, molecular modeling and 3D QSAR studies highlighted important structural aspects to assist the design of novel trypanosomatid GAPDH inhibitors. Finally, a structure-based virtual screening approach was employed for the identification of novel inhibitors of T. cruzi GAPDH, consisting of several consecutive hierarchical, fast pharmacophore matching and molecular docking, which afforded 35 inhibitor candidates for the target enzyme. The integration of structural biology and medicinal chemistry studies presented in this PhD Thesis are important contributions in the development of strong scientific basis for the design of new selective and potent inhibitors of GAPDH from T. cruzi, a molecular target of highest priority in our research group.